Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-60_LysSte134, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка LysSte134, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка LysSte134 и рекомбинантный белок LysSte134, обладающий антибактериальным действием Российский патент 2024 года по МПК C07K14/05 C12N15/70 C12N15/33 C12N1/21 C12R1/19 

Группа изобретений относится к плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134, рекомбинантному штамму бактерий Escherichia coli и белку эндолизину LysSte134, синтезируемому указанным штаммом и обладающему гидролитической активностью относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушающему биопленки, сформированные стафилококками, и может быть использована в биотехнологии, генной и белковой инженерии.

В последние десятилетия лечение пациентов с бактериальными инфекциями часто осложняется множественной лекарственной устойчивостью их возбудителей. Среди этих возбудителей Всемирная организация здравоохранения выделила 12 возбудителей, представляющих глобальную угрозу здоровью человека [1]. Этот список включает в себя 12 бактерий, в том числе возбудителей ESKAPE, и выделяет три категории патогенов в зависимости от их опасности и срочности разработки новых антибактериальных препаратов. Штаммы Staphylococcus aureus, устойчивые к метициллину и ванкомицину (MRSA и VRSA), отнесены к высокоприоритетной группе [2]. Учитывая участившиеся случаи множественной лекарственной устойчивости среди нозокомиальных штаммов Staphylococcus epidermidis [3], и их способность образовывать биопленки [4, 5, 6], требуется оценка антибактериальной активности новых препаратов в отношении как Staphylococcus aureus, так и Staphylococcus epidermidis, а также других коагулазонегативных стафилококков, способных заражать человека.

Бактериофаги - перспективное терапевтическое средство, которое может стать альтернативой или дополнением к антибиотикам. Эти вирусы бактерий могут специфически инфицировать патоген и элиминировать его из организма. В большинстве случаев фаги безопасны для микробиоты пациента и после элиминации возбудителя-мишени выводятся естественным путем, не нарушая функционирования выделительной и иммунной систем [7, 8, 9]. Фаги можно использовать для лечения младенцев, пожилых людей и даже онкологических больных [10, 11, 12]. Несмотря на множество преимуществ, применение бактериофагов имеет ряд ограничений [13, 14], включая необходимость их индивидуального подбора к тому бактериальному штамму, который заразил конкретного пациента.

Фаговые ферменты, способные разрушать клеточные стенки бактерий, имеют преимущества перед бактериофагами [15, 16, 17]. Эти литические ферменты, называемые эндолизинами, имеют более широкий спектр хозяев, чем их родительские фаги, и бактерии не приобретают к ним резистентности. Кроме того, эндолизины обычно демонстрируют высокую биодоступность и хорошую фармакокинетику [18]. Важно отметить, что для их производства могут использоваться стандартизированные биотехнологические методы. Недавно ВОЗ признала фаголитические ферменты перспективными терапевтическими средствами [19]. Примечательно, что эндолизины фагов, инфицирующих грамположительные бактерии, могут гидролизовать пептидогликаны клеточной стенки извне. Это может быть использовано против грамположительных возбудителей и образуемых ими биопленок.

Эндолизин LysSte134 - это белок, имеющий молекулярную массу около 35 кДа, для которого характерна структура, типичная для фаговых эндолизинов; он состоит из двух доменов и относится к надсемейству N-ацетилмурамоил-L-аланина амидаза/пептидогликанов.

Близкими аналогами являются эндолизины бактериофагов, специфичных к определенным штаммам стафилококков, применяемые для борьбы с биопленками Staphylococcus aureus [20], либо активные против мультирезистентных штаммов Staphylococcus aureus [21-29].

Наиболее близким техническим решением - прототипом, является эндолизин Andhra_gp14 бактериофага Andhra, обладающий литической активностью относительно штамма бактерии Staphylococcus epidermidis RP62a. Бактериофаг Andhra выделен из неочищенных сточных вод очистных сооружений Хиллиард Флетчер в Тускалусе, штат Алабама [30]. Эндолизин Andhra_gp14 получают путем трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus рекомбинантной плазмидной ДНК pET28b-His10Smt3-Andhra_gp14, обеспечивающей синтез в клетках Escherichia coli рекомбинантного белка эндолизина Andhra_gp14. При воздействии на живые клетки эндолизин Andhra_gp14 ингибировал рост штаммов Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus intermedius, и не влиял на рост Staphylococcus aureus [30].

Однако для эндолизина бактериофага Andhra способность инфицировать коагулазопозитивных представителей рода Staphylococcus не показана.

Основным преимуществом предлагаемого в настоящей заявке на изобретение эндолизина LysSte134 является сочетание активности против мультирезистентных штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri со способностью разрушать биопленки коагулазоположительных и коагулазоотрицательных представителей рода Staphylococcus, а именно Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, способных вызвать инфекции у человека. Для эндолизина Andhra_gp14 бактериофага Andhra, способность разрушать пепетидогликаны клеточных стенок и биопленки представителей рода Staphylococcus не обнаружена.

Задачей изобретения является получение рекомбинантного эндолизина, обладающего расширенным антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных различными представителями рода Staphylococcus.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134, и на основе нее такого штамма бактерий Escherichia coli, которые обеспечивают синтез рекомбинантного эндолизина LysSte134, обладающего гидролитической активностью относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушающего биопленки, сформированные Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, который может быть использован как потенциальный антибактериальный агент.

Указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-60_LysSte134, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli рекомбинантного белка эндолизина LysSte134 бактериофага vB_SepP_134, который обладает антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, имеющая молекулярную массу 2,66 МДа, размер 4316 п.о., и содержащая в соответствии с физической и генетической картой плазмиды pQE-60_LysSte134, приведенной на фиг. 1, фрагмент плазмидной ДНК, включающий искусственный ген, кодирующий эндолизин LysSte134 бактериофага vB_SepP_134 и С-концевой олигопептид GSRSHHHHHH, имеющий суммарный размер 924 п. о. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и плазмидный вектор pQE-60, обеспечивающий эффективную транскрипцию и экспрессию указанного искусственного гена, кодирующего рекомбинантный белок LysSte134 бактериофага vB_SepP_134, который состоит из следующих элементов:

- сайта инициации репликации ColE1 из плазмиды pBR322;

- промотора бактериофага Т5/элемент 1ас-оператора;

- генетических маркеров: AMPr - ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации клеток Escherichia coli;

- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: Xho I-2, Nco I-114, BamHI - 1007, XbaI - 2019.

Указанный технический результат достигается также тем, что трансформацией штамма Escherichia coli Ml 5 рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134 получен штамм бактерий Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 - продуцент рекомбинантного эндолизина LysSte134 бактериофага vB_SepP_134, обладающего антибактериальным действием.

Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный белок эндолизин LysSte134 бактериофага vB_SepP_134 с молекулярной массой 35 кДа, обладающий антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, состоящий из эндолизина LysSte134 бактериофага vB_SepP_134 с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH, и имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pQE-60_LysSte134, кодирующего рекомбинантный эндолизин LysSte134 (SEQ ID NO 1), а также аминокислотная последовательность рекомбинантного эндолизина LysSte134 (SEQ ID NO 2) приведены в перечне последовательностей.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Генно-инженерными методами получают плазмиду pQE-60_LysSte134, несущую ген, кодирующий рекомбинантный белок LysSte134, содержащий эндолизин бактериофага vB_SepP_134 с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевой олигопептид GSRSHHHHHH. Последовательность ДНК, кодирующую эндолизин бактериофага vB_SepP_134 с 1 по 297 аминокислотный остаток, получают на основе ДНК бактериофага vB_SepP_134, обладающего литической активностью относительно бактерий Staphylococcus epidermidis 2058.

Клетки Escherihia coli M15 трансформируют сконструированной плазмидой pQE-60_LysSte134 и выращивают в течение ночи. Ночную культуру (1/100) засевают в свежую среду LB с ампициллином (50 мкг/мл). Синтез белка индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,1 мМ в тот момент, когда культура достигает средне-логарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растят 16 часов при 12°С, после чего собирают центрифугированием при 3000 g. Индуцированные клетки Escherihia coli M15/pQE-60_LysSte134 используют для очистки рекомбинантного белка LysSte134, являющего эндолизином бактериофага vB_SepP_134 с помощью аффинной хроматографии. В результате получают рекомбинантный эндолизин LysSte134 бактериофага vB_SepP_134, имеющий молекулярную массу около 35 кДа, состоящий из эндолизина с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH, обладающего гидролитической активностью относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушающего биопленки, сформированные Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pQE-60_LysSte134 являются:

а) плазмидный вектор pQE-60 («QIAGEN», США), обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего белок LysSte134, являющийся эндолизином бактериофага vB_SepP_134, и его экспрессию под контролем позднего промотора Т5.

б) фрагмент ДНК, кодирующий белок LysSte134, являющийся эндолизином бактериофага vB_SepP_134, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы ДНК бактериофага vB_SepP_134 и олигонуклеотидных праймеров:

endolysin_StE134_1U

5'GGGAACCATGGGAATGAAAAATATTTATTCАААССАСATTAAAGG3' и endolysin_StE134_1L

5'GGGATGGATCCGTCААССТССААТТТТССССAAAGA3', соответствующих 5'- и 3'-концам ДНК, кодирующей белок LysSte134, и обеспечивающих наличие в амплификационном фрагменте сайтов рестрикции NcoI и BamHI, соответственно.

Полученная в результате плазмида pQE-60_LysSte134 (фиг. 1) характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 2,66 МДа и размер 4316 п.о.;

- кодирует рекомбинантный белок LysSte134, являющийся эндолизином бактериофага vB_SepP_134 и состоящий из эндолизина с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH;

- состоит из следующих элементов:

а) фрагмента ДНК, размером 924 п.о., содержащего ген, кодирующий эндолизин LysSte134 бактериофага vB_SepP_134 и олигопептид GSRSHHHHHH.

б) плазмидного вектора pQE-60, обеспечивающего эффективную транскрипцию полученного гена, кодирующего рекомбинантный белок LysSte134 бактериофага vB_SepP_134, и его экспрессию;

- содержит:

а) сайт инициации репликации ColE1 из плазмиды pBR322;

б) промотор бактериофага Т5/элемент lас-оператора;

в) генетические маркеры: AMPr - ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации клеток Escherichia coli;

г) искусственный ген, кодирующий белок LysSte134, являющийся эндолизином бактериофага vBSepP134, с 1 по 297 аминокислотный остаток, и С-концевой олигопептид GSRSHHHHHH;

д) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющими следующие координаты: Xho I (2), Nco I (114), BamHI (1007), XbaI (2019).

Для получения штамма-продуцента рекомбинантного белка LysSte134 бактериофага vB_SepP_134 компетентные клетки бактерий Escherichia coli M15 (F, Ф80ΔlасМ15, thi, lac, mtl^-, recA⁺, KmR) трансформируют сконструированной плазмидой pQE-60_LysSte134. Полученный таким образом штамм Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на агаре "Difko" - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6.8 до 7.0.

Устойчивость к антибиотику. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (200 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pQE-60_LysSte134 и к канамицину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием в штамме M15 плазмиды pREP4, несущей ген устойчивости к канамицину и кодирующей репрессор транскрипции.

Штамм Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 обеспечивает индуцируемый изопропилтиогалактозидом синтез рекомбинантного белка LysSte134. Индикацию экспрессии осуществляют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Уровень экспрессии определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси-11250 с использованием программного обеспечения Alfalmage, поставляемого с прибором Alphalmager (Alfalnnotech, США).

Таким образом, впервые получена плазмидная ДНК и штамм-продуцент, обеспечивающие продукцию в бактериальных клетках Escherichia coli рекомбинантного эндолизина LysSte134, состоящего из эндолизина с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH, обладающего гидролитической активностью относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушающего биопленки, сформированные Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами, представленными на фигурах с 1 по 6:

Фиг. 1. Общая схема структурной организации плазмиды pQE-60_LysSte134 (физическая карта). LysSte134 - ген, кодирующий рекомбинантный эндолизин LysSte134, Т5 - промотор фага Т5, AmpR- ген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции.

Фиг. 2. Электрофоретический анализ лизатов клеток Escherichia coli в 12,5% полиакриламидном геле с SDS. Дорожки: 1 - белковый маркер; 2 - культура клеток исходного штамма Escherichia coli M15, индуцированная ИПТГ (изопропилтиогалактозид); 3 - культура клеток Escherichia coli M15/pQE-60, индуцированная ИПТГ; 4 - культура клеток Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134, индуцированная ИПТГ. Слева приведены величины молекулярных весов в кДа.

Фиг. 3. Электрофоретический анализ клеточных и белковых фракций Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 в 12,5% полиакриламидном геле с SDS. Дорожки: 1 - белковый маркер; 2 - лизат клеток Escherichia coli M15/pQE-60, индуцированных ИПТГ; 3 - фракция растворимых белков цитоплазмы из клеток Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134, индуцированных ИПТГ; 4 - фракция телец включения из клеток Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134, индуцированных ИПТГ; 5 - элюат 50 мМ имидазолом с хроматографической колонки с Ni-NTA агарозой с нанесенной фракцией растворимых белков цитоплазмы из клеток Escherichia coli M15/pQE-60JLysSte134, индуцированных ИПТГ; 6, 7 - элюат 300 мМ имидазолом с той же колонки, последовательные фракции, 7 - элюат 500 мМ имидазолом с той же колонки. Слева приведены величины молекулярных весов в кДа.

Фиг. 4. Зимографический анализ гидролитических свойств эндолизина LysSte134 относительно клеточных стенок Staphylococcus. Дорожки: М -белковый маркер; 1 - Staphylococcus aureus КЭМТК 675, 2 - Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, 3 - Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058, 4 - Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, 5 - Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753, 6 - Staphylococcus warneri КЭМТК 2062. Нанесено по 2 мкг эндолизина LysSte134 в каждый из гелей. Слева приведены величины молекулярных весов в кДа.

Фиг. 5. Анализ антибактериальной активности эндолизина LysSte134 в отношении планктонных культур Staphylococcus aureus КЭМТК 1685 (А), Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043 (Б), Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058 (В), Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 (Г) и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062 (Д). К клеткам Staphylococcus добавляли эндолизин LysSte134 (100 мкг/мл) в R-буфере (50 мМ Tris-HCl; рН 8,0), содержащем СаСl₂, MgSO₄, ZnCl₂ либо NiSO₄ в различных концентрациях или без солей металлов, и инкубировали в течение двух часов при 37°С, после чего аликвоты суспензий высевали на LB агар. Подсчет колоний проводили на следующий день. Клеточные культуры, содержащие только СаСl₂, MgSO₄, ZnCl₂ либо NiSO₄ без добавления эндолизина LysSte134 использовали в качестве контроля. Эксперименты проводились в трех повторах.

Фиг. 6. Образцы биопленок Staphylococcus aureus КЭМТК 1685 (А), Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043 (Б), Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 (В) и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062 (Г). 1 - образцы биопленок, на которые нанесен 0,9% NaCl; 2 и 3 - образцы биопленок соответственно через 0,5 и 3 часа после нанесения эндолизина LysSte134.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения оно иллюстрируется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Способ конструирования плазмиды pQE-60_LysSte134.

В качестве источника гена, кодирующего белок LysSte134 бактериофага VB_SepP_134, была использована геномная ДНК бактериофага VB_SepP_134. Амплификацию гена, кодирующего белок LysSte134 бактериофага VB_SepP_134, проводят методом ПНР с использованием Taq-ДНК-полимеразы («Fermentas»). Для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего белок LysSte134, в реакционную смесь добавляют олигонуклеотиды endolysin_StE134_1U

5'GGGAACCATGGGAATGAAAAATATTTATTCАААССACATTAAAGG3' и endolysin_StE134_1L 5'GGGATGGATCCGTCААССТСААТТТТССССAAAGA3', соответствующие 5'- и 3'- концам ДНК, кодирующей белок LysSte134 и обеспечивающие в амплификационном фрагменте наличие сайтов рестрикции NcoI и ВаmHI соответственно. Реакцию проводят в амплификаторе «GeneAmp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 2 минуты при 94°С; 30 циклов - 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 50°С, 1 минута 40 секунд при 72°С; заключительная стадия - 10 минут при 72°С. Продукт аплификации, кодирующий белок LysSte134, расщепляют ферментами рестрикции NcoI и ВаmHI в реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8.5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 mM DTT и по 5 ед. активности соответствующих ферментов. Аналогично ведут обработку рестриктазами ДНК векторной плазмиды pQE-60. Реакцию ведут 2 часа при 37°С. После этого ПЦР-фрагмент и линеаризованный вектор очищают электрофоретически в 1% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора GeneJET™ Gel Extraction Kit («Fermentas») в соответствии с рекомендациями производителя. В стандартном буфере проводят лигирование. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli M15. С помощью рестрикционного анализа и полимеразной цепной реакции отбирают клоны, содержащие вставку нужного размера. Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают как pQE-60_LysSte134. Схема плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134 (физическая карта) представлена на фиг. 2.

Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантного белка LysSte134 стафилококкового бактериофага VB_SepP_134 продукта плазмиды pQE-60_LysSte134.

Клетки Escherichia coli M15 трансформируют полученной плазмидой pQE-60_LysSte134. Клетки Escherichia coli M15, трансформированные плазмидой pQE-60_LysSte134, растят ночь при 37°С. Ночную культуру засевают в свежую среду LB с ампициллином (50 мкг/мл). Синтез РНК-полимеразы индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,1 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растят ночь при 12°С, после чего собирают центрифугированием при 3000 g и анализируют методом электрофореза по Лэммли в 12,5% SDS-полиакриламидном геле (ПААГ) [31]. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 2, показывают наличие в индуцированной культуре клеток Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 дополнительного белка с молекулярной массой около 35 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе рекомбинантного белка LysSte134 (дорожка 4), который отсутствует в контрольном лизате индуцированных клеток Escherichia coli M15/pQE-60 (дорожка 3) и клеток исходного штамма Escherichia coli M15 (дорожка 2).

Пример 3. Очистка рекомбинантного белка LysSte134 из клеток Е. coli M15/pQE-60_LysSte134.

Эндолизин LysSte134 получают из цитоплазматической фракции индуцированных бактериальных клеток в результате аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Sigma, США) согласно инструкции производителя. Индуцированные клетки Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 осаждают центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в 1/10 от исходного объема буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, и разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. Полученную суспензию центрифугируют при 16000 g в течение 10 минут, после чего переносят супернатант, представляющий собой раствор цитоплазматических белков, в чистую пробирку.

На хроматографическую колонку, содержащую 1 мл Ni-NTA агарозы (Sigma, США) и уравновешенную буфером А, содержащим 50 мМ Na-фосфатный буфер рН 8.0, 300 мМ NaCl, 5 мМ Трис-HCl, наносят 6 мл цитоплазматической фракции индуцированных клеток со скоростью потока 1 мл/мин. Колонку промывают 20 мл буфера А, после чего проводят предварительную элюцию неспецифически сорбирующихся белков E.coli 20 мл буфера А, содержащего дополнительно 50 мМ имидазола. Рекомбинантный пептид элюируют 10 мл буфера А, содержащего 300 мМ имидазола. Проводят дополнительную элуцию 10 мл буфера А, содержащего 500 мМ имидазола Полученные белковые фракции диализуют против 50 мМ Трис-HCl рН 7.5, 300 мМ NaCl, (две смены по 18 ч при 5°С). Таким образом получают рекомбинантный эндолизин LysSte134 в растворимой форме, очищенный от других белков Escherichia coli, и анализируют электрофорезом в 12,5% ПААГ с SDS по Лэммли [31], приготавливая образцы для нанесения на гель в присутствии 2-меркаптоэтанола. Пример электрофоретического анализа приведен на фиг. 3.

Определение концентрации рекомбинантного эндолизина LysSte134 в препаратах проводят по методу Брэдфорда [32]. Для построения калибровочной кривой используют бычий сывороточный альбумин (Serva, США). Определение концентрации белка показывает, что общий выход составляет около 15 мг из 1 л культуры клеток Escherihia coli.

Пример 4. Оценка гидролитических свойств рекомбинантного белка LysSte134.

Проверку активности рекомбинантного эндолизина LysSte134 проводят методом зимографии. Выделяют ряд образцов клеточных стенок, содержащих пептидогликан из штамма Staphylococcus aureus КЭМТК 675, а также штаммов стафилококков, обладающих устойчивостью к двум и более антибиотикам из разных групп: Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058, Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062.

Выделение клеточной стенки проводят согласно методике Fukushima Т., et al [33]. Бактериальную культуру растят до стационарной фазы (ОD₆₀₀=1-1.5) в 1 л питательной среды LB при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 10000 g. Осадок ресуспендируют в 8 мл 4 М LiCl и кипятят на водяной бане 15 минут. Полученную суспензию центрифугируют при 11000 g в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в 5 мл деионизованной воды Millies и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 30 минут, и снова центрифугируют при 11000 g в течение 10 минут. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 10 мл 4% SDS и кипятят на водяной бане 15 минут. Полученную суспензию центрифугируют 10 минут при 11000 g, при комнатной температуре. Полученный осадок ресуспендируют в 10 мл 1М NaCl и вновь центрифугируют (10 минут, 11000 g). Последнюю процедуру повторяют еще 1-2 раза, до обесцвечивания осадка. Осадок ресуспендируют в 2-3 мл деионизованной воды Milli-Q, полученную суспензию центрифугируют 10 минут при 11000g. Промывку повторяют два раза. Осадок ресуспендируют в 1-2 мл воды milli-Q; добавляют азид натрия до итоговой концентрации 0,02% и хранят при 4°С. Для оценки концентрации измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре. OD₅₄₀=1.0 соответствует концентрации клеточной стенки 1 мг/мл.

Электрофоретический анализ проводят в 12,5% ПААГ с 0,1% SDS по Лэммли, в разделяющий гель добавляют пептидогликан клеточной стенки бактерий до концентрации 0.1 мг/мл, лизирующий буфер для нанесения образцов готовят без добавления DTT. После проведения электрофореза гель осторожно отмывают в воде milli-Q, переносят в 30-40 мл ренатурирующего буфера (25 мМ трис-НС1, 1% Triton Х-100, рН 7.2) и инкубируют при 37°С в течение 1-2 часов. После чего гель окрашивают в растворе метиленового синего (0.01% (w/v) и 0.01% КОН в деионизованной воде) и отмывают в деионизованной воде.

Результаты (фиг.4) подтвердили, что эндолизин LysSte134 проявляет гидролитическую активность в отношении клеточных стенок Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, в том числе и штаммы, обладающие устойчивостью к двум и более антибиотикам из разных классов.

Пример 5. Исследование антибактериальных свойств рекомбинантного белка LysSte134 на планктонных культурах.

Антибактериальную активность эндолизина LysSte134 оценивают в сравнении с планктонными культурами Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus aureus КЭМТК 1733, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058, Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062 путем подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) после их инкубации с эндолизином.

Клеточные культуры представителей рода Staphylococcus культивируют до среднелогарифмической фазы роста и осаждают при 4000 g в течение пяти минут. Собранные клетки промывают и суспендируют в R-буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl; рН 8,0; клеточную суспензию разбавляют до титра 10⁷ КОЕ/мл. Рекомбинантный белок эндолизин LysSte134 разбавляют в буфере R или буфере R, содержащем СаСl₂, MgSO₄, ZnCl₂ или NiSO₄ при концентрациях 1 мкМ или 5 мкМ. В качестве контроля используют клетки без LysSte134. Независимо 100 мкл клеточных суспензий смешивают с LysSte134 в концентрации 25 мкг/мл в 96-луночных планшетах и инкубируют при 37°С в течение 2 часов. Аликвоты этих суспензий высевают на агаризованную среду LB. Подсчет колоний проводят на следующий день

Результаты (фиг. 5 (А-Д)) подтвердили, что обработка клеток Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043 или Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058 эндолизином LysSte134 (25 мкг/мл) приводит к 50-кратному снижению их КОЕ. А обработка клеток Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062 приводит к 10-кратному снижению их КОЕ. При обработке Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043 или Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2058 эндолизином LysSte134 в присутствии ZnCl_h в концентрациях 1 мкМ и 5 мкМ литическая активность эндолизина LysSte 134 в отношении этих штаммов увеличивалась в 100 и 1000 раз, соответственно. При обработке Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062 эндолизином LysSte 134 в присутствии ZnCl₂ в концентрациях 1 мкМ и 5 мкМ литическая активность эндолизина LysSte 134 в отношении этих штаммов увеличивалась в 10 и 100 раз, соответственно.

Пример 6. Разрушение рекомбинантным эндолизином LysSte134 биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri.

Наличие у эндолизина LysSte 134 гидролитической активности в отношении биопленок, сформированных стафилококками, показывают на примере биопленок, образованных штаммами стафилококков, обладающих устойчивостью к двум и более антибиотикам из разных групп: Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062.

Биопленки получают на поверхности покровных стекол, помещенных в чашки Петри. Клетки суспендируют в 200 мкл стерильного раствора 0,9 М NaCl до концентрации 10⁹ КОЕ/мл. Полученную суспензию добавляют в 10 мл питательной среды LB, тщательно перемешивают и вносят в чашку Петри, на дне которой находятся предварительно простерилизованные покровные стекла. Для формирования биопленки на покровных стеклах закрытую чашку инкубируют в течение 2-5 суток при 37°С. По истечении необходимого для роста биопленки времени покровные стекла с биопленкой изымают из среды LB. Качество биопленок контролируют микроскопией (Zeiss Axio Imager А2, Carl Zeiss, Германия). На полученные биопленки наносят по 50 мкл эндолизин LysSte 134 с концентрацией 0,1 мг/мл, в контрольный образец - стерильный раствор 0,9 М NaCl, и инкубируют 3 часа при температуре 37°С. Результаты эксперимента оценивают после окрашивания биопленок метиловым фиолетовым под микроскопом Zeiss Axio Imager А2 (Carl Zeiss, Германия).

На контрольных образцах биопленок, сформированных Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062, на которые наносят физиологический раствор, обширный матрикс биопленки плотно заполнен бактериями, окрашенными метиловым фиолетовым (фиг.6 (А-Г)).

В образцах биопленок, сформированных Staphylococcus aureus КЭМТК 1685, Staphylococcus epidermidis КЭМТК 2043, Staphylococcus haemolyticus КЭМТК 3753 и Staphylococcus warneri КЭМТК 2062, на которые наносят эндолизин LysSte 134 наблюдаются остатки матрикса биопленок, в котором еще располагается некоторое количество стафилококков. Однако по сравнению с контрольным образцом это количество незначительно.

Таким образом, получены плазмидная ДНК и бактериальный штамм-продуцент, обеспечивающие экспрессию рекомбинантного эндолизина LysSte 134, имеющего молекулярную массу около 35 кДа, состоящего из эндолизина LysSte 134 с 1 по 297 аминокислотный остаток и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH, включающий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2), кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Рекомбинантный эндолизин LysSte 134 бактериофага VB_SepP_134 обладает антибактериальной активностью за счет гидролитической активности относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушения биопленки коагулазоположительных и коагулазоотрицательных представителей рода Staphylococcus, а именно Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, способных вызывать инфекцию у человека.

Источники научно-технической и патентной информации

1. De Oliveira, D.M.P.; Forde, В.М.; Kidd, T.J.; Harris, P.N.A.; Schembri, M.A.; Beatson, S.A.; Walker, M.J. Antimicrobial Resistance in ESKAPE Pathogens. // Clin. Microbiol. Rev., 2020, 33, e00181-19.

2. Tacconelli, E.; Carrara, E.; Savoldi, A.; Harbarth, S.; Mendelson, M.; Monnet, D.L.; Carmeli, Y. Discovery, research, and development of new antibiotics: The WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. // Lancet Infect. Dis., 2018, 18, 318-327.

3. Bardasheva, A.; Tikunov, A.; Kozlova, Y.; Zhirakovskaia, E.; Fedorets, V.; Fomenko, N.; Kalymbetova, Т.; Chretien, S.; Pavlov, V.; Tikunova, N.; Morozova, V. Antibiotic Resistance and Pathogenomics of Staphylococci Circulating in Novosibirsk, Russia. // Microorganisms, 2021, 9(12), 2487.

4. Becker, K.; Heilmann, C; Peters, G. Coagulase-Negative Staphylococci. // Clin. Microbiol. Rev., 2014, 27, 870-926.

5. Otto, M. Staphylococcus epidermidis Pathogenesis. // Methods Mol. Biol., 2014, 1106, 17-31.

6. Paharik, A. E.; Horswill, A. R. The Staphylococcal Biofilm: Adhesins, Regulation, and Host Response. // Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 2016, 50, 529-566.

7. Morozova, V.V.; Vlassov, V.V.; Tikunova, N.V. Applications of Bacteriophages in the Treatment of Localized Infections in Humans. // Front. Microbiol., 2018, 9, 1696.

8. Petrovic Fabijan, A.P.; Lin, R.C.Y.; Ho, J.; Maddocks, S.; Ben Zakour, N.L.; Iredell, R. Safety of bacteriophage therapy in severe Staphylococcus aureus infection. // Nat. Microbiol., 2020, 5, 465-472.

9. Z.; Majewska, J.; Milczarek, M.; Owczarek, В.; Dabrowska, K. Circulation of Fluorescently Labelled Phage in a Murine Model. // Viruses, 2021, 13, 297.

10. Chanishvili, N. Bacteriophages as Therapeutic and Prophylactic Means: Summary of the Soviet and Post-Soviet Experiences. // Curr. Drug Deliv., 2016, 13, 309-323.

11. Schooley, R.T.; Biswas, В.; Gill, J.J.; Hernandez-Morales, A.; Lancaster, J.; Lessor, L.; Barret, J.J. Development and Use of Personalized Bacteriophage-Based Therapeutic Cocktails To Treat a Patient with a Disseminated Resistant Acinetobacter baumannii Infection //published correction appears in Antimicrob Agents Chemother. Antimicrob. Agents Chemother., 2017, 61, e00954-17.

12. Chan, B.K.; Turner, P.E.; Kim, S.; Mojibian, H.R.; Elefteriades, J.A.; Narayan, D. Phage treatment of an aortic graft infected with Pseudomonas aeruginosa. // Evol. Med. Public. Health, 2018, 2018, 60-66.

13. Vlassov, V.V.; Tikunova, N.V.; Morozova, V.V. Bacteriophages as Therapeutic Preparations: What Restricts Their Application in Medicine. // Biochemistry, 2020, 85, 1350-1361.

14. Stacey, H.J.; De Soir, S.; Jones, J.D. The Safety and Efficacy of Phage Therapy: A Systematic Review of Clinical and Safety Trials. // Antibiotics, 2022,30, 1340.

15. Gondii, V.S.; Harjai, K.; Chhibber, S. Endolysins as Emerging Alternative Therapeutic Agents to Counter Drug-Resistant Infections. // Int. J. Antimicrob. Agents, 2020, 55, 105844.

16. Abdelrahman, F.; Easwaran, M.; Daramola, O.; Ragab, S.; Lynch, S.; Oduselu, T.J.; Khan, F.M.; Ayobami, A.; Adnan, F.; Torrents, E.; et al. Phage-Encoded Endolysins. // Antibiotics, 2021, 10, 124.

17. Murray, E.; Draper, L.A.; Ross, R.P.; Hill, C. The Advantages and Challenges of Using Endolysins in a Clinical Setting. Viruses 2021, 13, 680.

18. Harhala, M.A.; Gembara, K.; Nelson, D.C.; Miernikiewicz, P.; Dabrowska, K. Immunogenicity of Endolysin PlyC. // Antibiotics, 2022, 11, 966.

19. WHO. 2020 Antibacterial Agents in Clinical and Preclinical Development; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2021; 76p.

20. Патент ЕР, 2200442, МПК C07K14/005, опубл. 30.06.2010 г.

21. Патент RU, 2792679, МПК C12N7/00, опубл. 23.03.2023 г.

22. Патент RU, 2715694, МПК А61Р31/04, опубл. 02.03.2020 г.

23. Патент KR, 20170087770, МПК С07К14/005, опубл. 31.07.2017 г.

24. Патент CN, 106636050, МПК А61К38/51, опубл. 10.05.2017 г.

25. Заявка US, 2016090584, МПК C12N9/80, опубл. 31.03.2016 г.

26. Заявка US, 2015247138, МПК А61К38/47, опубл. 03.09.2015 г.

27. Межд. заявка WO, 2014039436, МПК А61К38/46, опубл. 13.03.2014 г.

28. Межд. заявка WO, 2010036408, МПК А61К38/47, опубл. 1.04.2010 г.

29. Патент US 93 82298, МПК С07К14/31, опубл. 05.07.2016 г.

30. Cater, K.; Dandu, V.S.; Ban, S.M.; Lackey, K.; Everett, G.F.; Hatoum-Aslan, A. A Novel Staphylococcus Podophage Encodes a Unique Lysin with Unusual Modular Design. // mSphere, 2017, 2, e00040-17 (прототип)

31. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

32. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. - 1976. - V.72. - P. 248-254.

33. Fukushima, Т.; Sekiguchi, J. Zymographic Techniques for the Analysis of Bacterial Cell Wall in Bacillus. // Methods Mol Biol. 2016, 1440, 87-98.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Перечень последовательностей LysSte134+.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-04-16">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-04-16</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-04-16</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и

фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии

наук (ИХБФМ СО РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Chemical Biology and Fundamental

Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (ICBFM

SB RAS)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК

pQE-60_LysSte134, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка

LysSte134, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент

рекомбинантного белка LysSte134 и рекомбинантный белок LysSte134,

обладающий антибактериальным действием</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>924</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..924</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgggaatgaaaaatatttattcaaaccacattaaaggtcaaaagttaa

caagtcaaaaacctagtattgacggggttgtcattcataatgattatggaagtatgacacctagtcaata

tttaaattggttatatcgtcgtgaacaaacaggtgaatatgtaaatggttgggcttctgtttatattaat

cgtaatgaggtattatggtatcaccctacaaattttgttgagtggcattgtggcaataattacgcaaata

gtcatttaatgggttttgagataactcaaagttttccaggatttatatcagatgaaacatttatgaaaaa

tgaagaagcagcatttaaagttgtagccgatgtgatgaaatcttataatttacctatcaatcgtgaaaca

gttaatttacatcgtaaatacttttcaacgtcttgtcctcatcgtagttgggatatacacgtaggcgtta

atgaaccaaatacacgagcaaatcaactaaaattgattgattactttatttctcgtattaaacattatgc

aaacggtggtaaaacacctgacaaaccacaagtcagtgataaaaaatacattaaatataattggcatggt

acatttacagcacataaaacaaatacattaccgattgtacctagatataattatggtatgagtgcaaaag

aggttgaaaaagattcatatatacaacctaatgagtatgtacctttttatcaaatcattaaagataagca

agctaaattatggtggattaagtttaaatacgttaaaaaaggttcaagtgacaaatatttctatatgcca

ataggtcatattgaagataaacaagaaaaaattaaaaatgaaaaaaatctttggggaaaattggaggttg

acggatccagatctcatcaccatcaccatcactaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>307</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..307</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MGMKNIYSNHIKGQKLTSQKPSIDGVVIHNDYGSMTPSQYLNWLYRREQ

TGEYVNGWASVYINRNEVLWYHPTNFVEWHCGNNYANSHLMGFEITQSFPGFISDETFMKNEEAAFKVVA

DVMKSYNLPINRETVNLHRKYFSTSCPHRSWDIHVGVNEPNTRANQLKLIDYFISRIKHYANGGKTPDKP

QVSDKKYIKYNWHGTFTAHKTNTLPIVPRYNYGMSAKEVEKDSYIQPNEYVPFYQIIKDKQAKLWWIKFK

YVKKGSSDKYFYMPIGHIEDKQEKIKNEKNLWGKLEVDGSRSHHHHHH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный белок эндолизин LysSte134 с молекулярной массой 35 кДа, обладающий антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, состоящий из эндолизина LysSte134 и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH и имеющий размер 307 а.о. и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Также предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-60_LysSte134, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli указанного рекомбинантного белка эндолизина LysSte134 и штамм бактерий Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 - продуцент указанного рекомбинантного белка эндолизина LysSte134, полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15 указанной рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134. Изобретение обеспечивает эффективный синтез рекомбинантного эндолизина LysSte134, обладающего гидролитической активностью относительно пептидогликанов клеточных стенок и разрушающего биопленки представителей рода Staphylococcus. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

1. Рекомбинантный белок эндолизин LysSte134 с молекулярной массой 35 кДа, обладающий антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, состоящий из эндолизина LysSte134 и С-концевого олигопептида GSRSHHHHHH и имеющий размер 307 а.о. и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-60_LysSte134, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli рекомбинантного белка эндолизина LysSte134 по п. 1, обладающего антибактериальным действием путем лизиса клеточных стенок и разрушения биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, имеющая молекулярную массу 2,66 МДа, размер 4316 п.о., и содержащая в соответствии с физической и генетической картой плазмиды pQE-60_LysSte134, приведенной на фиг. 1, фрагмент плазмидной ДНК, включающий искусственный ген, кодирующий эндолизин LysSte134 и С-концевой олигопептид GSRSHHHHHH, имеющие суммарный размер 924 п.о. и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и плазмидный вектор pQE-60, обеспечивающий эффективную транскрипцию и экспрессию указанного искусственного гена, кодирующего рекомбинантный белок LysSte134, который состоит из следующих элементов:

- сайта инициации репликации ColE1 из плазмиды pBR322;

- промотора бактериофага Т5/элемент lас-оператора;

- генетических маркеров: AMPr - ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации клеток Escherichia coli;

- уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющих следующие координаты: Xho I (2), Nco I(114), BamH I (1007), XbaI (2019).

3. Штамм бактерий Escherichia coli M15/pQE-60_LysSte134 – продуцент рекомбинантного эндолизина LysSte134 по п. 1, обладающего гидролитическим действием по отношению к клеточным стенкам Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri и в отношении биопленок, сформированных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus warneri, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pQE-60_LysSte134 по п. 2, полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15 рекомбинантной плазмидной ДНК pQE-60_LysSte134 по п. 2.