СПОСОБ ОБРАБОТКИ КУЛЬТУРЫ STAPHYLOCOCCUS AUREUS КИСЛОРОДОСОДЕРЖАЩИМ ГАЗОМ ИЗ ПОРТАТИВНОГО ОЗОНАТОРА Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A61L2/20 A61L101/10 C12R1/445 

Область техники, к которой относится изобретение

Заявляемое изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано в лабораториях и ветеринарных клиниках как способ для стерилизации.

Уровень техники

Известен способ озонирования физиологического раствора, путем барботирования физиологического раствора озонокислородной смесью с концентрацией озона на выходе из озонатора от 3 до 10 мг/л. Способ осуществляют следующим образом: генератор озона подключают к источнику кислорода и в электросеть, устанавливают на панели прибора концентрацию озона в озонокислородной смеси и экспозицию. В пробку вставляют длинную иглу, доходящую до дна флакона, и короткую иглу, не доходящую до поверхности раствора, к длинной игле присоединяют поливинилхлоридную трубку от выхода аппарата, к короткой игле присоединяют деструктор озона, включают аппарат и проводят барботирование в течение до 10 мин. Готовый раствор применяют внутривенно или для обработки ран. Приготовление раствора предполагает достаточно высокие концентрации озона в растворе - до 6 мг/л (см. «Озонотерапия. Внутренние болезни» О.В. Масленников, К.Н. Конторщикова, Н. Новгород, 2003 г., с. 39).

Недостатком способа является быстрый распад озона. Концентрация озона в физиологическом растворе при комнатной температуре через 5 мин снижается на 17%, через 10 мин - на 29%, через 15 мин - на 37%, через 20 мин на 43%, через 25 мин - на 46%, а спустя 30 мин - наполовину. После приготовления раствор должен быть использован в кратчайшие сроки.

Способ озонирования физиологического раствора, включающий барботирование физиологического раствора озоно-кислородной смесью с концентрацией озона на выходе из озонатора от 3 до 10 мг/л, отличающийся тем, что проводят двухэтапную обработку физраствора, при этом после завершения барботирования физраствора озоно-кислородной смесью во флакон с озонированным физиологическим раствором дополнительно вводят озоно-кислородную смесь под повышенным давлением от 1,5 до 2,9 атм с концентрацией озона от 6 до 10 мг/л (см. пат. RU 2289413).

Недостатком данного способа также является быстрый распад озона и трудоемкость метода.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ обработки культур озоном. Проводились исследования с шестью бактериальными штаммами с использованием различных концентраций озона в озоно-кислородной смеси (О₃/О₂) для определения минимально эффективной дозы. Бактериальные штаммы высевали на кровяной агар в чашки Петри при концентрации микробных клеток 1×10⁵ на чашку. Озон вырабатывался медицинским генератором озона. Прибор был оснащен кислородным регулятором потока, в котором кислородный поток проходит через стеклянный цилиндр и подвергается воздействию электрического разряда диэлектрического барьера с контролируемой энергией и напряжением. Конечным продуктом является газовая смесь О₃/О₂, в которой концентрация озона регулируется за счет изменения потока кислорода и напряжения от электродов. Такие культуры как Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa высевали на кровяной агар в чашках Петри и инкубировали аэробно при температуре 35±2°С в течение 18-24 часов. Стандартизированный инокулят данных культур был приготовлен с использованием прямого пересева колоний с кровяного агара. Пересев был осуществлен по стандарту мутности «0,5 McFarland» (1 к 2×10⁸ КОЕ/мл) с использованием фотометрического устройства (колориметра). Суспензию разбавляли 1:1000 в стерильном физиологическом растворе, в результате получали пробирку, содержащую приблизительно 10 КОЕ/мл. Затем 10 мл этой суспензии высевали на подготовленные чашки Петри с кровяным агаром. Первоначально агаровые пластинки с высеянной культурой экспонировали в течение 60 мин. В последствии было выяснено, что минимальная доза и время необходимые для полного предотвращения бактериального роста Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa составляет 20 мкг/мл в течение 5 мин. Затем применяли меньшую концентрацию 15 мкг/мл в течение 5 мин. на шести бактериальных культурах: Escherichia coli, Staphylococcus aureus неустойчивый к оксациллину, Staphylococcus aureus устойчивый к оксациллину, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Эксперименты повторяли для каждой культуры по 4 раза и оценивали результаты (Effect of low-dose gaseous ozone on pathogenic bacteria / Belchor Pontes, Ana Maria Cattani Heimbecker, Glacus de Souza Brito, Silvia F Costa, Inneke M van der Heijden, Anna S LevinEmail author and Samir Rasslan // BMC Infectious Diseases. - 2012. - №12. - P. 358).

Недостатками данного способа является невысокая концентрация микробных клеток в посеве (10⁵ КОЕ/мл), низкая концентрация озона в газовой смеси, отсутствие возможности использования медицинского озонатора в условиях ветеринарных клиник.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является изучение бактерицидного действия кислородсодержащим газом, вырабатываемой портативным озонатором в условиях «in vitro» на примере Staphylococcus aureus.

Техническим результатом изобретения является отсутствие роста Staphylococcus aureus на мясо-пептоном агаре в чашках Петри.

Технический результат достигается с помощью способа обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, в котором проводят высевание культуры Staphylococcus aureus в стерильной зоне на среду в чашках Петри и обработку кислородсодержащим газом в течение 5 минут, отличающийся тем, что культуру предварительно засевают с помощью бактериальной петли в пробирки с мясо-пептонным агаром, культивируют в термостате при температуре 37±2°C в аэробной среде в течение 24 часов, после чего осторожно смывают ее физиологическим раствором и доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10 млрд по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, затем градуированной пипеткой высевают 0,1 мл полученной культуры на мясо-пептонный агар в чашки Петри, соблюдая стерильность вносят трубку озонатора на расстоянии 1 см от поверхности агара, затем чашки Петри помещают в термостат суховоздушный, поддерживающий температуру 37(±1)°С на 20 часов.

Сущность способа обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, включающий высевание культуры Staphylococcus aureus в стерильной зоне на среду в чашках Петри и обработку кислородсодержащим газом в течение 5 минут, при этом, культуру предварительно засевают с помощью бактериальной петли в пробирки с мясо-пептонным агаром, культивируют в термостате при температуре 37±2°С в аэробной среде в течение 24 часов, после чего осторожно смывают ее физиологическим раствором и доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10 млрд по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, затем градуированной пипеткой высевают 0,1 мл полученной культуры на мясо-пептонный агар в чашки Петри, соблюдая стерильность вносят трубку озонатора на расстоянии 1 см от поверхности агара, затем чашки Петри помещают в термостат суховоздушный, поддерживающий температуру 37(±1)°С на 20 часов.

Краткое описание чертежей и их материалов

На фиг. 1 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, пассажирование культуры Staphylococcus aureus на мясо-пептонный агар в пробирках.

На фиг. 2 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, посев культуры на мясо-пептонный агар.

На фиг. 3 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, обработка кислородсодержащим газом культуры Staphylococcus aureus из портативного озонатора в стерильной зоне.

На фиг. 4 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, результаты обработки кислородсодержащим газом Staphylococcus aureus в чашках Петри при 1 минуте.

На фиг. 5 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, результаты обработки кислородсодержащим газом Staphylococcus aureus в чашках Петри при 2 минутах.

На фиг. 6 дан способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, результаты обработки кислородсодержащим газом Staphylococcus aureus в чашке Петри при 5 минутах.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора.

Культуру Staphylococcus aureus, выделили от больного животного с предварительным диагнозом «Стафилококкоз верхних дыхательных путей».

Пример 1. Культуру предварительно засевают с помощью бактериальной петли в пробирки с мясо-пептонным агаром, культивируют в термостате при температуре 35±2°С в аэробной среде в течение 18 часов. Ресуспендируют культуру Staphylococcus aureus физиологическим раствором. В стерильной зоне пастеровской пипеткой набирают культуру (Рис. 1). Доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 5 млрд по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, затем градуированной пипеткой высевают 0,3 мл полученной культуры на мясо-пептонный агар в чашки Петри (Рис. 2) в стерильной зоне (между двумя горящими спиртовками). Подключают портативный озонатор (патент №2661232) к сети питания. Включают прибор. Приоткрывают чашку Петри, вносят трубку озонатора на расстоянии 3 см и производят круговые движения по всей поверхности в течение 1 минуты (Рис. 3). Обработанную кислородсодержащим газом чашку Петри помещают в термостат суховоздушный, поддерживающий температуру 30(±1)°С на 10 часов.

Данный способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора не позволяет оказывать бактерицидного действия получаемого газа, насчитывается большое количество колоний (их количество составило 511 штук). Это объясняется высокой концентрацией микробных клеток (в 1 мл до 5 млрд) при низком содержании озона (массовой концентрацией озона на выходе менее 15 мг/куб.м; производительность по озону менее 1 г/час).

Пример 2. Проводят аналогично примера №1, но культивируют в термостате при температуре 36±2°C в аэробной среде в течение 20 часов, доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 7 млрд по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, затем градуированной пипеткой высевают 0,2 мл полученной культуры на мясо-пептонный агар в чашки Петри в стерильной зоне (между двумя горящими спиртовками). Вносят трубку озонатора на расстоянии 2 см и производят круговые движения по всей поверхности в течение 2 минут. Обработанную кислородсодержащим газом чашку Петри помещают в термостат суховоздушный, поддерживающий температуру 35(±1)°С на 15 часов.

В рассмотренном способе обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим тазом рост бактерий снизился, количество колоний уменьшилось, но не прекратилось (их количество составило 143 штуки). Это объясняется высокой концентрацией микробных клеток (в 1 мл до 7 млрд) и недостаточным временем воздействия кислородсодержащим газом, в результате, концентрация озона ниже минимально подавляющей концентрации (массовая концентрациея озона на выходе менее 33 мг/куб.м; производительность по озону менее 3 г/час).

Пример 3. Проводят аналогично примера №1, но культивируют в термостате при температуре 37±2°С в аэробной среде в течение 24 часов, доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10 млрд по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, затем градуированной пипеткой высевают 0,1 мл полученной культуры на мясо-пептонный агар в чашки Петри в стерильной зоне (между двумя горящими спиртовками). Вносят трубку озонатора на расстоянии 1 см и производят круговые движения по всей поверхности в течение 5 минут. Обработанную кислородсодержащим газом чашку Петри помещают в термостат суховоздушный, поддерживающий температуру 37(±1)°С на 20 часов.

Данный способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора позволяет оказывать бактерицидное действие на микроорганизмы (бактерицидная эффективность составила 99,9%). Это объясняется массовой концентрацией озона на выходе не менее 70 мг/куб.м; производительность по озону не менее 8 г/час.

Таким образом, пример 3 является оптимальным. Рассмотренный способ способствует бактерицидному действию кислородсодержащего газа, вырабатываемого портативным озонатором в условиях «in vitro» на примере Staphylococcus aureus.

Предлагаемое изобретение по сравнению с другими способами физической стерилизации имеет следующие преимущества:

- отсутствие роста культуры Staphylococcus aureus на мясо-пептоном агаре в чашках Петри;

- меньшее время стерилизации;

- нет необходимости в удалении следов стерилизующего агента с инструментов и оборудования промывкой в стерильной воде или длительной аэрацией стерильным воздухом;

- нет необходимости в утилизации реагентов.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам физической стерилизации в лабораториях и ветеринарных клиниках. Предложен способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора. Способ включает обработку кислородсодержащим газом Staphylococcus aureus, высеянных на чашках Петри, путем внесения трубки озонатора на расстоянии 1 см от поверхности агара, при этом массовая концентрация озона на выходе не менее 70 мг/куб.м и производительность по озону не менее 8 г/час. Способ обеспечивает бактерицидное действие кислородсодежащего газа в отношении культуры Staphylococcus aureus. 6 ил., 3 пр.

Способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, включающий высевание культуры Staphylococcus aureus в стерильной зоне на среду в чашках Петри и обработку кислородсодержащим газом в течение 5 мин, отличающийся тем, что в чашки Петри вносят трубку озонатора на расстоянии 1 см от поверхности агара, при этом массовая концентрация озона на выходе не менее 70 мг/куб.м и производительность по озону не менее 8 г/ч.