Способ моделирования внутрибрюшного синегнойного инфекционного процесса Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 C12Q1/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии, может быть использовано для разработки терапевтических мероприятий по подавлению инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.

Уровень техники

Известен способ, в котором мышей заражали внутрибрюшинно, инфекционная доза микобактерий варьировала в зависимости от иммуногенности используемых штаммов и способов введения возбудителя и составляла в разных экспериментах от 10³ до 10⁵ КОЕ в 0,2 мл суспензии на мышь (см. Разработка модели хронической туберкулезной инфекции и ее использование для отбора перспективных вакцинных штаммов Mycobacterium Tuberculosis / Шрамко Павел Александрович // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск-2012. 24 с.).

Рассмотренный способ характеризуется следующими недостатками: широкое варьирование доз, отсутствие данных о проведении опытов с другими штаммами и над другими видами животных.

Известен паравертебральный внутрибрюшинный парацентез, который является удобным и надежным методом внутрибрюшинной инъекции у кроликов. Шестьдесят новозеландских кроликов были рандомизированы в обычные и модифицированные группы для внутрибрюшинных инъекций с помощью обычного и паравертебрального доступа соответственно. В обычной группе место инъекции находилось на брюшной стенке на 3-4 см латерально от пупка с двух сторон, а в модифицированной группе - дорзально на уровне L5/L6 на 3-4 см латерально от средней линии. Успех с одной пункцией был достигнут у 13 из 20 кроликов в обычной группе, а остальные потребовали, как минимум две пункции. При использовании модифицированного подхода одна попытка была успешной, что показало значительную разницу между двумя группами (Р<0,01). Диссекция брюшной полости показала, что место инъекции с измененным подходом было далеко от жизненно важных органов и крупных сосудов с меньшей перитонеальной гиперемией и экссудацией (Intraperitoneal injection via а paravertebral approach in rabbits / T. Lv, R. Ling, Z. Pan, Y. Liang, C. Shi, X. Huang // Journal of Southern Medical University. - 2014. - №34(4). - P. 538-540).

Рассмотренный способ характеризуется следующими недостатками: проведение сложной хирургической манипуляции, а также низкий процент возможности выполнения парацентеза.

Известен способ, в котором крысам однократно внутрибрюшинно инъецировали 5 различных изолятов условно-патогенных бактерий. Крыс заражали суточными взвесями агаровых культур грамположительных Staphylococcus aureus (St. aureus), Streptococcus pyogenes, серовар A (Str. pyogenes) и грамотрицательных Proteus vulgaris (P. vulgaris), Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa), Klebsiella oxytoca (K. oxytoca) в концентрациях 10⁸ микробных клеток/мл стафилококка и стрептококка и 10⁷ - протея, синегнойной палочки и клебсиеллы. Эти 5 изолятов бактерий выбрали в связи с их наиболее частым присутствием в перитонеальном экссудате при разлитом гнойном перитоните. Количество микробных клеток в 1 мл взвеси подсчитывали под микроскопом в счетной камере Горяева. Через 24, 48 и 72 ч после инъекций по 4 особи из каждой экспериментальной группы выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. (Уровни бактерицидных белков в крови и перитонеальном экссудате у крыс при моделировании гнойного и асептического перитонита / В.А. Зурнаджьянц, Э.А. Кчибеков, А.В. Коханов, А.А. Мусагалиев, А.Н. Деточкин, М.Ю. Воронкова // Астраханский медицинский журнал. - Т. 14. №2. - 2019. - С. 42-50.

Рассмотренный способ характеризуется следующими недостатками: заражение культурами проводилось только на крысах, выявление особенностей инфекционного процесса учитывается только при изменении уровня бактерицидных белков в крови и перитонеальном экссудате.

Известен способ внутрибрюшинного введения Pseudomonas aeruginosa для получения модели внутрибрюшинной инфекции у мышей. При этом лечение смоделированной инфекции колистином отдельно или в сочетании с рифампицином или меропенемом начинали через 1 ч после заражения. Биолюминесцентную визуализацию in vivo применяли динамически через 0 ч и через 2 и 5 ч после обработки. Количество бактерий ex vivo в образцах печени, почек, селезенки, легких и крови также определяли через 5 ч после обработки (см. Activity of colistin alone or in combination with rifampicin or meropenem in a carbapenem-resistant bioluminescent Pseudomonas aeruginosa intraperitoneal murine infection model / Y. Cai, D. Yang, J. Wang, R. Wang // The journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2018. - №1; 73 (2). - P. 456-461).

Рассмотренный способ имеет ряд существенных недостатков. В частности, отсутствие дозы и объема вводимой культуры.

Наиболее близким изобретением к описываемому способу по технической сущности является способ создания экспериментальной септической синегнойной инфекции. Мышам вводили внутрибрюшинно подготовленные культуры P. aeruginosa, в дозах от 1×10⁶ КОЕ/мышь до 4×10⁶ КОЕ/мышь. Объем вводимой культуры составил 0,5 мл на мышь. Количество мышей в каждой группе составляло 6 животных. После заражения проводили ежесуточно мониторинг продолжительности жизни мышей (критерий - смертность). Также определяли количество бактерий, высеваемых из органов зараженных животных. Материалом для посева для определения количества псевдомонад при септической инфекции служили смывы из брюшной полости (перитониальные лаважи), селезенка, а также кровь. Метод определения динамики гибели животных. Ежедневно после заражения 2 раза в день, утром и вечером, проводили наблюдения за состоянием животных и фиксировали сроки падежа экспериментальных животных.

Мышей, переживших инфекцию, умерщвляли цервикальной дислокацией. Кровь отбирали путем кардиальной пункции и помещали в пробирки, содержащие 100 единиц гепарина натрия. Перитонеальные смывы получали введением в брюшную полость 5 мл стерильного физиологического раствора. Селезенки гомогенизировали с помощью гомогенизатора SilentcrusherM в 1 мл физиологического раствора, полученные гомогенаты центрифугировали 10 мин при 800 об/мин (центрифуга 5415 D Eppendorf) для удаления грубых остатков тканей. Затем готовили серии 10-кратных разведений исходной суспензии гомогенатов селезенок в физиологическом растворе, и 500 мкл каждого разведения помещали на чашку Петри, покрытую цитрамидным агаром. Аналогично готовили серии 10-кратных разведений в физиологическом растворе образцов крови и перитониальных лаважей. Чашки Петри инкубировали при 37°С и через 24 часа культивирования производили подсчет колоний. Концентрацию псевдомонад в органах выражали числом КОЕ в 1 мл.

Рассмотренный способ имеет ряд недостатков, основными из которых является: широкое варьирование доз, отсутствие информации о времени после инфицирования, когда регистрировались первые клинические признаки патологии, о способе получения и вирулентности данного штамма, отсутствие данных о проведении опытов над другими видами животных.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения являлась разработка такого способа моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, который прост в исполнении, позволяет быстро создать необходимую концентрацию микробных клеток в брюшной полости лабораторных животных.

Техническим результатом изобретения является создание технически простой и высокопроизводимой модели внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, приводящая к перитониту.

Технический результат достигается с помощью способа моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, в котором производят внутрибрюшинное введение суточной взвеси культуры Pseudomonas aeruginosa, при этом культуру Pseudomonas aeruginosa получают путем смыва с плотной питательной среды 0,85%-ным физиологическим раствором, причем объем вводимой культуры кроликам составляет 2 мл, доводят концентрацию в 1 мл до 10 микробных клеток по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, клинические признаки инфицирования отмечаются через 24-32 часа после введения Pseudomonas aeruginosa.

Сущность способа моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, включающий внутрибрюшинное введение суточной взвеси культуры Pseudomonas aeruginosa, при этом культуру Pseudomonas aeruginosa получают путем смыва с плотной питательной среды 0,85%-ным физиологическим раствором, причем объем вводимой культуры кроликам составляет 2 мл, доводят концентрацию в 1 мл до 10⁸ микробных клеток по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, клинические признаки инфицирования отмечаются через 24-32 часа после введения Pseudomonas aeruginosa.

Краткое описание чертежей и их материалов

На фиг. 1, дан способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, содержание тест-микроба в организме животных, таблица 1.

На фиг. 2, дан способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, количество погибших и выживших животных при инфицировании культурой Pseudomonas aeruginosa, таблица 2.

На фиг. 3, дан способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, культура Pseudomonas aeruginosa, выделенная из перитонеальной жидкости, рисунок 1.

На фиг. 4, дан способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, культура Pseudomonas aeruginosa, выделенная из жидкостей и тканей животных, рисунок 2.

На фиг. 5, дан способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, культура Pseudomonas aeruginosa, выделенная из печени, рисунок 3.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса.

Название штамма: Pseudomonas aeruginosa №453, номер штамма 190158, полученный из института Хирургии им. А.В. Вишневского, г. Москва.

Пример №1.

Культуру предварительно засевают с помощью бактериальной петли в пробирки с мясо-пептонным агаром, культивируют в термостате при температуре 37±2°С в аэробной среде в течение 24 часов. Ресуспендируют культуру Pseudomonas aeruginosa физиологическим раствором. В стерильной зоне пастеровской пипеткой набирают культуру. Доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10⁶ по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке. Животное держат вниз головой, чтобы внутренности брюшной полости опустились к диафрагме. Укол делают в нижней трети, слева от белой линии живота. Место инъекции дезинфицируют, берут складку кожи и вводят в нее иглу, поворачивают под прямым углом и быстрым толчком прокалывают брюшную стенку. Объем вводимой культуры кроликам составляет 5 мл. Клинические признаки инфицирования отмечаются через 4-5 дня после введения штамма.

У кроликов отсутствовал отказ от воды и корма, частота пульса и число дыхательных движений в пределах физиологической нормы. К четвертым-пятым суткам количество колоний в перитонеальной жидкости, в печени, желчном пузыре, крови и сердце незначительно (таб. 1). Процент выживших животных на 4-5 сутки после заражения составляет 100% (таб. 2).

Пример №2.

Выполняется аналогично примеру 1, но доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10⁷ по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, объем вводимой культуры кроликам составляет 3 мл. клинические признаки инфицирования отмечаются через 3-4 дня после введения штамма.

К третьим суткам у животных отмечалось угнетение общего состояния, незначительное повышение температуры тела. Культура Pseudomonas aeruginosa, выделенная из жидкостей и тканей животных (рис. 2 - вид справа). Количество колоний в перитонеальной жидкости составило 9450±70 КОЕ (рис. 1), в печени 1740±222, желчном пузыре 1260±200, крови 7500±632, сердце 900±67 (таб. 1). На 3 сутки пало 1 животное, процент выживших животных на 4-5 сутки после заражения составляет 90% (таб. 2).

Пример №3.

Выполняется аналогично примеру 1, но доводят концентрацию микробных клеток в 1 мл до 10⁸ по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, объем вводимой культуры кроликам составляет 2 мл, клинические признаки инфицирования отмечаются через 24-32 часа после введения штамма.

Через 24 часа у животных отмечалось угнетение общего состояния, повышение температуры тела, частота пульса и число дыхательных движений было увеличено, сильная болезненность брюшной стенки. Культура Pseudomonas aeruginosa, выделенная из жидкостей и тканей животных (рис. 2 - вид слева). В перитонеальной жидкости, в печени (рис. 3), желчном пузыре, крови, в сердце наблюдается сплошной рост синегнойной палочки (таб. 1). В 1 сутки пало 2 животных, на 2 сутки - 3 животных, на 3 сутки - 1 животное. Процент выживших животных после заражения составляет 40% (таб. 2).

Таким образом, оптимальным является пример 3. Рассмотренный способ предрасполагает развитию внутрибрюшинного инфекционного процесса, который прост в исполнении, позволяет быстро создать необходимую концентрацию микробных клеток в брюшной полости лабораторных животных.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества: создана технически простая и высоко воспроизводимая модель внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, приводящая к перитониту.

Изобретение относится к микробиологии, может быть использовано для разработки терапевтических мероприятий по подавлению инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa. Раскрыт способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, включающий внутрибрюшинное введение суточной взвеси культуры Pseudomonas aeruginosa. При этом культуру Pseudomonas aeruginosa получают путем смыва с плотной питательной среды 0,85%-ным физиологическим раствором, причем объем вводимой культуры кроликам составляет 2 мл, доводят концентрацию в 1 мл до 10⁸ микробных клеток по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, клинические признаки инфицирования отмечаются через 24-32 часа после введения Pseudomonas aeruginosa. Изобретение обеспечивает создание технически простой и высоко воспроизводимой модели внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса. 5 ил., 3 пр.

Способ моделирования внутрибрюшинного синегнойного инфекционного процесса, включающий внутрибрюшинное введение суточной взвеси культуры Pseudomonas aeruginosa, отличающийся тем, что культуру Pseudomonas aeruginosa получают путем смыва с плотной питательной среды 0,85%-ным физиологическим раствором, причем объем вводимой культуры кроликам составляет 2 мл, доводят концентрацию в 1 мл до 10⁸ микробных клеток по стандарту мутности Тарасевича в стерильной пробирке, клинические признаки инфицирования отмечаются через 24-32 часа после введения Pseudomonas aeruginosa.