СПОСОБ ДЕСТРУКЦИИ БИОПЛЁНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA КОМБИНАЦИЕЙ ОЗОНА С ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА Российский патент 2023 года по МПК A61L2/16 A61L2/20 A61L9/15 

Изобретение относится к способам для дезинфекции или стерилизации материалов или предметов, в частности к области дезинфекции изделий медицинского назначения.

Уровень техники

Большинство микроорганизмов существуют в естественных условиях в виде надклеточных структур, обозначаемых как «биопленки». Они формируются на различных типах поверхностей, включая металл, пластик, силикон, поливинилхлорид и других материалах, получивших широкое распространение и во внутрибольничной среде. Такая форма сосуществования микроорганизмов имеет свои законы взаимодействия [2]. В результате чего их устойчивость к действию факторов окружающей среды, в том числе к дезинфектантам и антибиотикам, повышается в сотни и даже тысячи раз, что вызывает сложность борьбы с ними особенно на изделиях медицинского назначения, имеющих сложную конфигурацию [5, 12, 14].

Одним из важнейших и распространенных возбудителей нозокомиальных инфекций является Pseudomonas aeruginosa, при этом у данного микроорганизма отмечается самый высокий процент к пленкообразованию [3, 6].

К настоящему моменту существует множество методов борьбы с биопленками, в числе самых распространенных стоит использование различных ферментов. Тем не менее поиск наиболее эффективных средств и композиций, вызывающих деструкцию биопленок, остается актуальным и перспективным.

Озонирование является экологически чистой и эффективной технологией в борьбе с микробным загрязнением том числе, представленным биопленками [1, 9, 11, 13]. В результате действия озона происходит не только гибель планктонных клеток, но и деструкция самой биопленки [4]. Известно, что увлажнение или сочетанное использование озона с жидкостями, потенцирует губительное действие на бактерии [1].

В результате разрушения озоном матричной структуры биопленки и ее пространственной дезорганизации, открывается прямой доступ дезинфицирующих веществ к самим бактериальным клеткам биопленки, что в свою очередь может демонстрировать повышение эффективности дезинфекции при таком сочетании.

Аналоги

Известен способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородсодержащим газом из портативного озонатора, включающий высев культуры Staphylococcus aureus в стерильной зоне на среду в чашках Петри и обработку кислородсодержащим газом в течение 5 мин с помощью трубки озонатора на расстоянии 1 см от поверхности агара (Патент RU 2709720 от 19.12.2019, Бюл. №35, «Способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородосодержащим газом из портативного озонатора» / Беляев В.А. и др.). Недостатками данного способа являются необходимость использования трубки малого диаметра, утечка озона из-за отсутствия герметичности чашки Петри и как следствие быстрый распад озона, что не позволяет использовать этот метод для более продолжительной обработки. Данный способ направлен на оценку чувствительности конкретного штамма к озону и не предполагает оценку воздействия озона на биопленки.

Известен способ стерилизации пластиковых предметов медицинского назначения озонкислородной или озонвоздушной смесью с концентрацией озона 2-3%. со скоростью 2-4 л/ч в течение 1-30 мин (Патент RU 2075976 от 24.03.1992 «Способ стерилизации пластиковых предметов медицинского назначения» / Покровский А.Г. и др.). Данный способ имеет следующие недостатки: высокую трудоемкость, необходимость отслеживания концентрации озона в смеси воздуха, длительность инкубирования и визуальный метод оценки результатов стерильности.

Известен способ обработки культур озоном (см. Effect of low-dose gaseous ozone on pathogenic bacteria / Belchor Pontes, Ana Maria Cattani Heimbecker, Glacus de Souza Brito, Silvia F Costa, Inneke M van der Heijden, Anna S LevinEmail author and Samir Rasslan // BMC Infectious Diseases. - 2012. - №12. - P. 358 [8]). Данный способ основан на двухэтапных исследованиях на восьми бактериальных штаммах (кишечная палочка - АТСС: 25922, Staphylococcus aureus, устойчивый к оксациллину - АТСС: 29213, Staphylococcus aureus, чувствительный к оксациллину - АТСС: 25923, Enterococcus faecalis, устойчивый к ванкомицину - АТСС: 51299, БЛРС, продуцирующие Klebsiella pneumoniae, чувствительные только к карбапенемам - клинический изолят от больного, Acinetobacter baumannii, устойчивый к карбапенему - клинический изолят от больного, Acinetobacter baumannii, чувствительный только к карбапенему - АТСС: 19606, Pseudomonas aeruginosa, чувствительна к имипенему и меропенему - АТСС: 27853) с использованием различных концентраций озона в озоно-кислородной смеси (О₃/O₂). На первом этапе определялась минимально эффективная доза О₃/O₂, на втором осуществлялась оценка его бактерицидной активности при применении к различным бактериальным штаммам. Озон вырабатывался медицинским генератором озона при подаче чистого медицинского кислорода. Прибор был оснащен кислородным регулятором потока, в котором кислородный поток проходит через стеклянный цилиндр и подвергается воздействию электрического разряда диэлектрического барьера с контролируемой энергией и напряжением. В результате образуется газовая смесь О₃/О₂, в которой концентрация озона регулируется за счет изменения потока кислорода и напряжения от электродов. Чистые культуры высевали на кровяной агар в чашках Петри при концентрации микробных клеток 1×10⁵ на чашку, инкубировали аэробно при температуре 35±2°С в течение 18-24 часов. Стандартизированный инокулят данных культур был приготовлен с использованием прямого пересева колоний с кровяного агара. Пересев был осуществлен по стандарту мутности «0,5 McFarland» (1 к 2×10⁸ КОЕ/мл) с использованием фотометрического устройства (колориметра). Суспензию разбавляли 1:1000 в стерильном физиологическом растворе, в результате получали пробирку, содержащую приблизительно 10⁵ КОЕ/мл. Затем 10 мкл этой суспензии высевали на подготовленные чашки Петри с кровяным агаром. Первоначально агаровые пластинки с высеянной культурой экспонировали в течение 60 мин. В последствии было выяснено, что минимальная доза смеси озона и время, необходимые для полного предотвращения бактериального роста Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa составляет 20 мкг/мл в течение 5 мин. Затем применяли меньшую концентрацию 15 мкг/мл в течение 5 мин на шести бактериальных культурах: Escherichia coli, Staphylococcus aureus неустойчивый к оксациллину, Staphylococcus aureus устойчивый к оксациллину, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Эксперименты повторяли для каждой культуры по 4 раза и оценивали результаты. При анализе данного способа можно отметить следующие недостатки: сложное техническое устройство, необходимость отдельно подавать чистый медицинский кислород, низкая концентрация озона в газовой смеси, невысокая концентрация микробных клеток в посеве и отсутствие апробации на биопленках.

Известен способ оценки влияния озона на культуры Pseudomonas aeruginosa путем воздействия озонированным физиологическим раствором различных концентраций на бактериальные взвеси (Патент RU 2289812 от 20.12.2006, Бюл. №35, «Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора» / Кувакина Н.А. и др.). Данный способ направлен на изучение влияния озона на активно делящиеся клетки, без учета покоящихся и малоактивных форм микроорганизмов в структуре биопленки. Кроме того, данный способ имеет большую трудоемкость и продолжительность.

Также известен способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора (Патент RU 2425888 от 10.08.2011, Бюл. №22, «Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора» / Карпунина Т.И. и др.) на сформированные биопленки различных культур, выделенных от больных, путем сравнительного анализа состояния сформированных бактериями биопленок до и после воздействия на них озонированного и неозонированного физиологического раствора.

Способ заключается в том, что биопленки, сформированные бактериями в полистироловых планшетах обрабатывали озонированным и неозонированным физиологическим раствором в течение 10 мин. После чего планшеты промывали и окрашивали биопленки 1% водным раствором генцианвиолета в течение 45 минут. Состояние пленок определяли по интенсивности окрашивания содержимого лунок красителем, который элюировали 96% спиртом и определяли оптическую плотность элюата на спектрофотометре. Все эксперименты проводили не менее чем в 3-кратных повторностях и полученные результаты сравнивали между собой и устанавливали достоверные различия между ними (р<0,05). Недостатками данного способа являются: одномоментная оценка структурной целостности биопленки без учета сохранения жизнеспособности клеток, отсутствие доказанного влияния озона при указанных условиях на биопленку культуры Pseudomonas aeruginosa.

Задача

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа деструкции биполенок, основанного на потенцировании антибактериальных свойств озона за счет использования его комбинации с раствором пероксида водорода.

Новизна заключается в использовании комбинации озона с 3% раствором перекиси водорода для деструкции биопленок культуры клеток Pseudomonas aeruginosa.

Технический результат

Техническим результатом изобретения является деструкция биопленки Pseudomonas aeruginosa, полученной в лунках полистироловых планшетов путем обработки комбинацией озона и пероксида водорода. Указанный результат достигается воздействием в течение 120 минут комбинации озона и 3% раствора пероксида водорода на полистироловые планшеты, содержащие сформированную биопленку Pseudomonas aeruginosa.

Сущность изобретения

Сущностью предлагаемого изобретения является воздействие комбинации озона с раствором пероксида водорода на биопленки культуры клеток Pseudomonas aeruginosa с целью деструкции. Биопленки чистой культуры формировались в полистироловых планшетах, одновременно заливались 3% раствором пероксида водорода и помещались в дезинфекционную камеру с производительностью по озону не менее 15 г/ч на 120 минут. Контрольные образцы заливались перекисью водорода и подвергались воздействию обычного атмосферного воздуха. После экспозиции все образцы инкубировались сутки, и затем производилась оценка планктонных клеток и плотности самой биопленки.

Использовались сформированная биопленка культуры клеток Pseudomonas aeruginosa, 3% раствор пероксида водорода (Йодные технологии и маркетинг, Россия), стерильный полистироловый планшет (Медполимер, Россия), денситометр Densi-La-Meter (Erba, Чехия), LB-бульон, планшетный фотометр Multiscan FC (Thermo Scientific, США), 0,9% раствор хлорида натрия, фосфатно-солевой буфер, 0,1% раствор генциана фиолетового, 95% этанол, дезинфекционная камера объемом 40 л, подключенная двумя воздуховодами к озонатору Ozonbox Air-15 (Россия) с производительностью 15 г/ч.

Осуществление изобретения

Исследуемый материал с подозрением на наличие Pseudomonas aeruginosa культивируется на колумбийском агаре с бараньей кровью 24 часа при 37°С. Полученная впоследствии чистая культура идентифицируется доступным общепринятым способом (биохимическим, масс-спектрометрическим, генотипическим и др.). Для получения биопленки из суточной культуры Pseudomonas aeruginosa готовится суспензия в LB-бульоне и инкубируется 24 часа в полистироловых планшетах при 37°С. Затем планктонные клетки трижды отмываются стерильным раствором хлорида натрия. В лунки с готовой биопленкой добавляется по 200 мкл 3% раствор пероксида водорода, помещается в дезинфекционную камеру объемом 40 л, подключенную двумя воздуховодами к озонатору Ozonbox Air-15 (Россия) с производительностью 15 г/ч на 120 минут. Аналогично готовятся контрольные пробы, содержащие физиологический раствор вместо 3% раствора пероксида водорода, а также образцы, содержащие физиологический раствор или 3% раствора пероксида водорода, помещаемые в воздушную атмосферу. Затем содержимое лунок подвергается аспирации, трижды промывается стерильным 0,9% раствором хлорида натрия и добавляется 200 мкл LB-бульона, и планшет инкубируется 24 часа при 37°С. После этого измеряется оптическая плотность при 620 нм на планшетном фотометре для оценки выхода планктонных клеток. Затем удаляется жидкая фаза и трижды отмываются лунки фосфатно-солевым буфером и заливаются 0,1% раствором генциана фиолетового. После 15 минутной экспозиции краситель удаляется, планшет промывается в ванночке с водой, просушивается, и в лунки добавляется по 200 мкл 95% этанола для экстракции связанного красителя. Через 10 минут жидкая фракция переносится в новый планшет и измеряется оптическая плотность при 540 нм на планшетном фотометре. (O'Toole GA. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp.2011 Jan 30;(47): 2437. doi: 10.3791/2437. PMID: 21307833; PMCID: PMC3182663 [10]).

Результаты обрабатываются с использованием пакета Excel 2010 (Microsoft, США) с расчетом средней арифметической, ошибкой средней арифметической, а также определением уровня достоверности отличий с использованием критерия Стьюдента.

Для оценки степени деструкции биопленки Pseudomonas aeruginosa нами сравнивались фактические значения плотности самой биопленки и планктонных клеток с контрольными образцами в зависимости от различного вида действующего фактора: 3% раствора пероксида водорода, озона и комбинации озона с 3% раствором пероксида водорода. Как видно из фигуры 1 при одинаковой экспозиции в 120 минут максимальное деструктивное действие на биопленку оказала комбинация озона с 3% раствором пероксида водорода, плотность биопленки по сравнению с контрольными образцами снизилась на 83%, при этом выхода планктонных клеток не было зарегистрировано. При воздействии 3% раствором пероксида водорода эта плотность снизилась лишь на 38,9%, а при обработке одним озоном на 64,8%, что свидетельствует о совместном потенцировании эффекта комбинации озона с 3% раствором пероксида водорода с целью деструкции биопленки Pseudomonas aeruginosa и высокой эффективности предлагаемого способа.

Пример 1

В городской клинической больнице в отделении реанимации и интенсивной терапии с целью профилактики ВБИ стерильным тампоном были взяты смывы с ингаляционных трубок на наличие неферментирующих бактерий. Материал был доставлен в микробиологическую лабораторию, где был осуществлен посев на ГРМ-агар № 9. После суточной инкубации при 37°С была получена бактериальная культура, формирующая пигментированные зелено-синим цветом крупные колонии со специфическим запахом. С помощью набора тестов для биохимической идентификации микроорганизм был определен как Pseudomonas aeruginosa. Из культуры была приготовлена суспензия в питательном бульоне, которую инкубировали при 37°С в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета. После этого лунки трижды промыли стерильным 0,9% раствором хлорида натрия, в опытные лунки добавляли 3% раствор пероксида водорода и помещали планшет на 2 часа в дезинфекционную камеру, подключенную к озонатору Ozonbox Air-15, контрольные находились в обычных условиях. После этого лунки промывали стерильным 0,9% раствором хлорида натрия, заливали в лунки 200 мкл питательного бульона и инкубировали сутки при при 37°С с последующей оценкой плотности биопленки. Установлено, что биопленка была разрушена на 95% после обработки комбинацией озона и пероксида водорода, что позволило рекомендовать данный способ обработки как одного из возможных способов дезинфекции ингаляционных трубок для разрушения биопленок и предотвращения ВБИ.

Пример 2

У пациента М. наблюдалась открытая раневая инфекция предплечья с наличием некротической ткани. Стерильным тампоном был отобран образец с хирургического инструментария, которым производилась резекция некротических масс. И тампон был помещен в стерильный тупфер с транспортной средой Стьюарта. Материал был доставлен в микробиологическую лабораторию в течение двух часов, после чего был осуществлен посев на колумбийский агар с бараньей кровью. После суточной инкубации при 37°С была получена бактериальная культура, формирующая пигментированные крупные колонии с четкой зоной гемолиза и специфическим запахом. С помощью метода MALDI-ToF микроорганизм был идентифицирован как Pseudomonas aeruginosa с достоверностью 99,9%. Из культуры была приготовлена суспензия в питательном бульоне, которую инкубировали при 37°С в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета. После этого лунки трижды промыли стерильным 0,9%о раствором хлорида натрия, в опытные лунки добавляли 3% раствор пероксида водорода и помещали планшет на 2 часа в дезинфекционную камеру, подключенную к озонатору Ozonbox Air-15, контрольные находились в обычных условиях. После этого лунки промывали стерильным 0,9% раствором хлорида натрия, заливали в лунки 200 мкл питательного бульона и инкубировали сутки при 37°С с последующей оценкой плотности биопленки. Установлено, что биопленка была разрушена на 89% после обработки комбинацией озона и пероксида водорода, что позволило рекомендовать данный способ обработки как одного из возможных способов дезинфекции инструментария после контакта с данным микроорганизмом.

Список литературы

1. Бессмертная, И.А. Использование озона для стерилизации оборудования пищевых производств / И.А. Бессмертная // Инновации в технологии продуктов здорового питания: IV Всероссийская научная конференция: сборник научных трудов, Калининград, 24 мая 2017 года / И.М. Титова (отв. ред.). - Калининград: ФГБОУ ВО «Калининградский государственный технический университет», 2017. - С. 127-132. - EDN YRSWNG.

2. Габриэлян Н.И., Горская Е.М., Романова Н.И., Цирульникова О.М. Госпитальная микрофлора и биопленки. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012; 14 (3): 83-91. https://doi.org/10.15825/1995-1191-2012-3-83-91

3. Инфекции, связанные с образованием биопленок / И.Н. Петухова, Н.В. Дмитриева, З.В. Григорьевская [и др.] // Злокачественные опухоли. - 2019. - Т. 9. - №3S1. - С. 26-31. - DOI 10.18027/2224-5057-2019-9-3s1-26-31. - EDN OVRDJZ

4. Можно ли лечить озоном биопленочные бактериальные инфекции? / Г.А. Бояринов, Л.В. Бояринова, А.С. Гордецов [и др.] // Биорадикалы и антиоксиданты. - 2018. - Т. 5. - №3. - С. 162-173. - EDN YLAKRN.

5. Мусаелян, А.Г. Биопленочные инфекции / А.Г. Мусаелян // Бюллетень медицинских интернет-конференций. - 2017. - Т. 7. - №1. - С. 269-271. - EDN YHCDZX. Петрухина, М.И. Эпидемиологическое значение бактериальных пленок / М.И. Петрухина, Г.В. Ющенко, Н.Г. Политова // Журнал МедиАль. - 2015. - №3 (17). С. 9-17. - EDN UZPXAB.

6. Роль биопленок Pseudomonas aeruginosa в развитии эндогенных инфекций / И.А. Мележик, Н.В. Яворская, В.В. Шепелевич, В.Н. Кокозей // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. - 2013. - №3. - С. 8. - EDN RFNAIL.

7. Bialoszewski D, Pietruczuk-Padzik A, Kalicinska A, Bocian Е, Czajkowska М, Bukowska В, Tyski S. Activity of ozonated water and ozone against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Med Sci Monit. 2011 Nov; 17 (11): BR339-344. doi: 10.12659/msm.882044. PMID: 22037737; PMCID: PMC3539485

8. Fontes B, Cattani HeimbeckerAM, de Souza Brito G, Costa SF, van der Heijden IM, Levin AS, Rasslan S. Effect of low-dose gaseous ozone on pathogenic bacteria. BMC Infect Dis. 2012 Dec 18;12:358. doi: 10.1186/1471-2334-12-358. PMID: 23249441; PMCID: PMC3541223

9. Marino M, Maifreni M, Baggio A, Innocente N. Inactivation of Foodborne Bacteria Biofilms by Aqueous and Gaseous Ozone. Front Microbiol. 2018 Aug 28; 9: 2024. doi: 10.3389/fmicb.2018.02024. PMID: 30210486; PMCID: PMC6120990. (24)

10. O'Toole GA. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. 2011 Jan 30; (47): 2437. doi: 10.3791/2437. PMID: 21307833; PMCID: PMC3182663

11. Panebianco F, Rubiola S, Chiesa F, Civera T, Di Ciccio PA. Effect of Gaseous Ozone on Listeria monocytogenes Planktonic Cells and Biofilm: An In Vitro Study. Foods. 2021 Jun 26; 10 (7): 1484. doi: 10.3390/foodsl0071484. PMID: 34206833; PMCID: PMC8306814.

12. Robbins JB, Fisher CW, Moltz AG, Martin SE. Elimination of Listeria monocytogenes biofilms by ozone, chlorine, and hydrogen peroxide. J Food Prot. 2005 Mar; 68 (3): 494-8. doi: 10.4315/0362-028x-68.3.494. PMID: 15771172. (27)

13. Shelobolina ES, Walker DK, Parker AE, Lust DV, Schultz JM, Dickerman GE. Inactivation of Pseudomonas aeruginosa biofilms formed under high shear stress on various hydrophilic and hydrophobic surfaces by a continuous flow of ozonated water. Biofouling. 2018 Aug; 34 (7): 826-834. doi: 10.1080/08927014.2018.1506023. Epub 2018 Oct 12. PMID: 30311502

14. Tachikawa M, Yamanaka K. Synergistic disinfection and removal of biofilms by a sequential two-step treatment with ozone followed by hydrogen peroxide. Water Res. 2014 Nov 1;64:94-101. doi: 10.1016/j.watres.2014.06.047. Epub 2014 Jul 9. PMID: 25043797

Патенты:

1. Патент №2709720 C1, Российская Федерация, МПК C12N 1/20, A61L 2/20, A61L 101/10. Способ обработки культуры Staphylococcus aureus кислородосодержашим газом из портативного озонатора: №2018128262: заявл. 01.08.2018: опубл. 19.12.2019 / В.А. Беляев, И.И. Науменко, Е.В. Светлакова [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет". - EDN YVLGZB.

2. Патент №2075976 С1, Российская Федерация, МПК A61L 2/20. Способ стерилизации пластиковых предметов медицинского назначения: №5033949/13: заявл. 24.03.1992: опубл. 27.03.1997 / А.Г. Покровский, О.А. Плясунова, Н.Н. Кабальнова [и др.]; заявитель Институт органической химии Уфимского научного центра РАН. - EDN OOAIRL.

3. Патент №2289812 С2, Российская Федерация, МПК G01N 33/48, C12Q 1/18. Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора (ОФР): №2004126457/15: заявл. 31.08.2004: опубл. 20.12.2006 / Н.А. Кувакина, С.И. Пылаева, С.П. Перетяган, А.А. Стручков; заявитель Ассоциация Российских Озонотерапевтов АРО. - EDN KSMGCF.

4. Патент №2425888 С1, Российская Федерация, МПК C12Q 1/18. Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора: №2010110825/10: заявл. 22.03.2010: опубл. 10.08.2011 / Т.И. Карпунина, М.В. Кузнецова, Н.В. Николаева [и др.]; заявитель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию". - EDN DBSVDP.

Изобретение относится к способу деструкции биопленок Pseudomonas aeruginosa комбинацией озона с перекисью водорода, заключающемуся в том, что воздействуют на биопленки, сформированные бактериями в полистироловых планшетах, комбинацией озона одновременно в сочетании с 3% раствором пероксида водорода в дезинфекционной камере с производительностью по озону не менее 15 г/ч и времени экспозиции 120 минут. Изобретение обеспечивает деструкцию биопленки Pseudomonas aeruginosa, полученной в лунках полистироловых планшетов путем обработки комбинацией озона и пероксида водорода. 2 пр., 1 ил.

Способ деструкции биопленок Pseudomonas aeruginosa комбинацией озона с перекисью водорода, заключающийся в том, что воздействуют на биопленки, сформированные бактериями в полистироловых планшетах, комбинацией озона одновременно в сочетании с 3% раствором пероксида водорода в дезинфекционной камере с производительностью по озону не менее 15 г/ч и времени экспозиции 120 минут.