ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Российский патент 2019 года по МПК A61K9/08 A61K31/704 A61K31/19 A61K47/02 A61P35/00 

Изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения злокачественных новообразований.

Поиск эффективного лечения злокачественных новообразований является одной из главных задач современной медицины. Наиболее распространенным методом терапии, по-прежнему, остается применение ненаправленных противоопухолевых препаратов, влияющих на репликацию ДНК. Одним из широко применяемых препаратов с цитостатическими свойствами является Доксорубицин (лат. Doxorubicinum) - природный антибиотик антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peuceticus var. Caesius. Доксорубицин является одним из наиболее эффективных цитостатических препаратов. Однако применение доксорубицина сопровождается тяжелыми побочными эффектами, такими как дилятационная кардиомиопатия, расстройства со стороны ЖКТ, нефропатия и др. [Volkova М. (2011) Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Curr Cardiol Rev. 2011 Nov; 7(4): 214-220.]. Другие цитостатики -винкристин и цисплатин обладают не менее тяжелым побочным действием, в частности, кумулятивной нейропатией, нефропатией [S. Amptoulach, N. Tsavaris (2010) Neurotoxicity Caused by the Treatment with Platinum Analogues. Chemother Res Pract. 2011; 2011: 843019].

В связи с этим в последнее время активно изучается возможность комбинирования различных фармакологических веществ, обеспечивающих повышение эффективности противоопухолевой терапии и снижение числа побочных эффектов. Ключевым моментом злокачественной трансформации клеток является изменение их энергетического метаболизма [Blot WJ, Tarone RE (2015). "Doll and Peto's quantitative estimates of cancer risks: holding generally true for 35 years. J Natl Cancer Inst. 2015 Mar 3; 107(4).]. Одним из модуляторов клеточного метаболизма является дихлоруксусная кислота, способная переключать метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование путем ингибирования киназы пируватдегидрогеназы [Е D Michelakis, L Webster, and J R Mackey (Br J Cancer. 2008 Oct 7; 99(7): 989-994) Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolic-targeting therapy for cancer]. Поскольку для опухолевых клеток характерно преобладание гликолиза над окислительным фосфорилированием, предположительно, такое переключение метаболизма способно повысить чувствительность опухолевых клеток к гипоксии и действию цитостатиков [Q. Xie, Н- F. Zhang Combination of Taxol® and dichloroacetate results in synergistically inhibitory effects on Taxol-resistant oral cancer cells under hypoxia. Mol. Med. Rep. 2015 Apr; 11(4):2935-40]. Использование ингибиторов энергетического метаболизма опухолевых клеток является новым многообещающим направлением в лечении онкологических заболеваний, основанным на доминировании гликолиза над окислительным фосфорилированием даже в присутствии кислорода, так называемом эффекте Варбурга. [Kolesnik DL1, Pyaskovskaya ON, Yakshibaeva YR, Solyanik GI. Time-dependent cytotoxicity of dichloroacetate and metformin against Lewis lung carcinoma. Exp Oncol. 2019 Mar; 41(1):14-19.]

Ранее описана противоопухолевая композиция, содержащая в качестве действующих компонентов дихлорацетат натрия и теофиллин при соотношении от 1:1 до 10:1 (RU 2463053 С1, 10.10.2012). Известна также противоопухолевая композиция, представляющая собой водный раствор доксорубицина и ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток в массовом соотношении 1:15, где ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток представляет собой смесь полиоксипропиленгексола и полиоксипропиленгликоля. (RU 2680834 С1, 28.02.2019). Среди недостатков модели следует отметить возможность эмболизации сосудов полиоксипропиленгексолом и полиоксипропиленгликолем при необходимости увеличения их содержания в комбинации.

Недавние исследования (Yang CL, Wu ТТ, Qin YT, Qi Y, Sun Y, Kong M, Jiang X, Qin XY, Shen YQ. A facile doxorubicin-dichloroacetate conjugate nanomedicine with high drug loading for safe drug delivery. 6 March 2018 Volume 2018:13 Pages 1281-1293) показали, что использование наночастиц DSPE-PEG₂₀₀₀ с комбинацией доксорубицина и дихлорацетата натрия на культурах клеток обладают повышенной цитотоксической активностью по сравнению с чистым доксорубицином и доксорубицином, конъюгированным с данными наночастицами. Существенным недостатком данной лекарственной формы является использование наночастиц DSPE-PEG₂₀₀₀, поскольку они содержат в себе липидный компонент, который в большинстве случаев запускает активацию макрофагов и последующие аллергические реакции. Кроме того, известна липосомальная форма доксорубицина - Доксил, одним из уже известных недостатков которой являются как аллергические реакции, так и малый срок хранения. Помимо этого, производство наночастиц DSPE-PEG₂₀₀₀ само по себе является дорогостоящим.

Существует так же фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, имеющая в составе ингибитор Р13-киназы на основе имидазопиридина (HS-173) и доксорубицина в качестве активного ингредиента (KR 101925553 (В1), 05.12.2018). Недостатком данной комбинации следует считать, во-первых, возможное возникновение резистентности к компоненту HS-173, как ингибитору PI3K, во-вторых, блок синтеза коллагена, который может привезти к патологиям соединительной ткани.

Наиболее близким аналогом является композиция для лечения злокачественных новообразований (RU 2589266 С1, 10.07.2016 - прототип), содержащая цитостатическое вещество фосфэстрол и дихлорацетат натрия, в соотношении от 1:10 до 10:1. Среди ее недостатков следует выделить, во-первых, высокую токсичность фосфэстрола в выбранном диапазоне концентраций, во-вторых, узкую область применения данной комбинации в связи с ее тропностью только к андрогензависимым опухолям.

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы повышения противоопухолевой активности за счет создания новой композиции из широко применяемых противоопухолевых препаратов.

Патентуемая фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований на основе дихлорацетата натрия содержит препарат Доксорубицин-Тева в форме лиофилизата для приготовления инъекционного раствора, при следующем содержании компонентов, мас. %:

дихлорацетат натрия - 1,22-35,7 Доксорубицин-Тева, - 0,028-0,1 раствор натрия хлорида 0,9% - остальное.

Патентуемое изобретение, как и его ближайший аналог, является комбинацией цитостатического вещества и модулятора клеточного дыхания дихлорацетата натрия (ДХА) с использованием в качестве цитотоксического вещества доксорубицина.

Технический результат - повышение противоопухолевой активности за счет эффекта потенцирования дихлорацетатом натрия цитотоксической активности доксорубицина и возможностью использования доксорубицина в более низких дозах.

Мишенью для доксорубицина является топоизомераза II - АТФ-зависимый фермент, отвечающий за удаление неправильно сшитых участков ДНК. Кроме того, известно, что молекулы доксорубицина благодаря своему строению способны индуцировать образование свободных радикалов в клетке (РЛС). Дихлорацетат натрия является неконкурентным ингибитором киназы пируватдегидрогеназы (ПДГ) [Noechel Т.R., Tucker A.D., Robinson С.М., Phillips С., Taylor W., Bungay P.J., Kasten S.A., Roche Т.E., Brown D.G. Regulatory roles of the N-terminal domain based on crystal structures of human pyruvate dehydrogenase kinase 2 containing physiological and synthetic ligands // Biochemistry. - 2006. - Vol. 45. - P. 402-415.].

Ингибирование киназы ПДГ приводит к активации пируватдегидрогеназы и дальнейшему поступлению пирувата в цикл трикарбоновых кислот. Как известно, опухолевые клетки получают энергию путем аэробного гликолиза, являющимся приспособительным механизмом к условиям гипоксии, которая возникает из-за отставания скорости васкуляризации от скорости роста опухолевой массы. При переходе опухолевой клетки на окислительное фосфорилирование в условиях гипоксии, во-первых, снижается выработка АТФ за счет отсутствия кислорода, во-вторых, благодаря включения митохондрий, происходит активный выброс свободных радикалов и активация апоптоза, что, в конечном счете, приводит к гибели опухолевой клетки.

Учитывая пересекающиеся механизмы индукции клеточной гибели для дихлорацетата натрия и доксорубицина, экспериментально оценена эффективность действия комбинации дихлорацетата натрия и доксорубицина на культуре опухолевых клеток КТ-21, HeLa и клеток гепатоцеллюлярной карциномы. В ходе исследования установлено потенцирование дихлорацетатом натрия цитотоксических свойств доксорубицина. Важно отметить, что дихлорацетат натрия как одиночное вещество на изучаемые культуры клеток влияния не оказывал.

Сущность изобретения поясняется на графиках, где:

фиг. 1 - Влияние доксорубицина и доксорубицина в комбинации с ДХА на жизнеспособность клеток линии КТ-21;

фиг. 2 - Влияние доксорубицина и доксорубицина в комбинации с ДХА на жизнеспособность клеток линии HeLa;

фиг. 3 - Влияние доксорубицина и доксорубицина в комбинации с ДХА на жизнеспособность клеток линии гепатоцеллюлярной карциномы.

Оценку цитотоксичности комбинации доксорубицина с дихлорацетатом натрия проводили методом МТТ-теста. Определяли среднюю ингибиторную концентрацию вещества (IC50), при которой доля жизнеспособных клеток составляла 50%. После аппроксимации кривой Доза/Эффект логистической функцией y=c⋅(1-tg((x-a)/b)), где: х - концентрация вещества, показатель IC50 рассчитывали методом наименьших квадратов по коэффициентам a, b и с по формуле IC50=a+b⋅arctg(1-1/2c).

Статистический анализ. В каждом опыте на точку приходилось по 6 лунок для расчета среднеквадратичного отклонения. Опыты выполняли в трех независимых повторах. Для построения таблиц использовали средние значения и доверительный интервал для вероятности Р=95%. Статистическую значимость результатов р оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Взаимодействие лекарственных веществ рассчитывали по методу Чу-Талалаи (Chou-Talalai) в программе CompuSyn.

Для оценки действия комбинации ДХА и доксорубицина клеточная линия КТ-21 выращивалась в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0,1 мМ смеси заменимых аминокислот (все Gibco Invitrogn Ltd, Paisley, UK) при температуре 37°C и 5%-й продувке СО₂. Пересев клеток, согласно стандартам, осуществлялся через день. Для непосредственного определения цитотоксичности исследуемых веществ, клетки КТ-21 культивировались до состояния конфлуэнтности, затем отмывались фосфатно-солевым буфером (Gibco Invitrogn Ltd, Paisley, UK). Далее путем трипсинизации и последующей отмывкой полной средой DMEM клетки переводились из монослоя в суспензию. После подсчета клеток в камере Горяева, отбиралось необходимое количество суспензии для рассадки на 96-луночные планшеты по 7000 клеток/лунку. Затем в среду вносились лекарства - отдельно доксорубицин (диапазон концентраций 0-172 мкМ), отдельно дихлорацетат натрия (диапазон концентраций 0-83 М), отдельно комбинация ДХА и доксорубицина с последующими убываниями концентраций в 1/3. В каждом опыте на точку приходилось по 6 лунок для расчета среднеквадратичного отклонения. После 48-часовой культивации клеток инкубационная среда сливалась и заменялась свежей с добавлением МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в концентрации 5 мг/мл. Планшет выдерживали в течение 1 часа в инкубаторе. Затем среда с МТТ сливалась, в лунки планшета добавлялся ДМСО (диметилсульфоксид) для растворения кристаллов формазана, и далее производилось определение оптической плотности в каждой лунке.

Полученные результаты обрабатывались в программе Excel, где среднюю ингибиторную концентрацию рассчитывали по формуле IC50=a+b⋅arctg(1-1/2c) после аппроксимации кривой Доза/Эффект логистической функцией y=c⋅(1-tg((x-a)/b)), где: х - концентрация вещества, методом наименьших квадратов по коэффициентам a, b и с.

Опыты выполняли в трех независимых повторах. Для построения таблиц использовали средние значения и доверительный интервал для вероятности Р=95%. Статистическую значимость результатов р оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Взаимодействие лекарственных веществ рассчитывали по методу Чу-Талалаи (Chou-Talalai) в программе CompuSyn.

Пример 1. Влияние доксорубицина (кривая 2) и доксорубицина в комбинации с ДХА (кривая 1) на жизнеспособность клеток линии КТ-21 (фиг. 1). Показатель IC50 доксорубицина в комбинации снижается на 36% относительно чистого вещества. Показатель IC50 доксорубицина и доксорубицина в комбинации составляет 0,25 мкмоль/л и 0,16 м кмоль/л соответственно. Приведенные данные являются достоверными. Оценка синергизма методом Чу-Талалаи показала наличие эффекта потенцирования (индекс комбинирования CI<0).

Пример 2. Влияние доксорубицина (кривая 2) и доксорубицина в комбинации с ДХА (кривая 1) на жизнеспособность клеток линии HeLa (фиг. 2). Концентрации полумаксимального ингибирования доксорубицина и доксорубицина в комбинации равны, соответственно 0,8 мкмоль/л и 0,5 мкмоль/л, при этом IC50 доксорубицина в комбинации снижается на 37,5%. Рассчитанный индекс комбинирования показал также наличие потенцирования, как и на клетках линии КТ-21.

Пример 3. Влияние доксорубицина (кривая 2) и доксорубицина в комбинации с ДХА (кривая 1) на жизнеспособность клеток линии гепатоцеллюлярной карциномы (фиг. 3). Концентрации полумаксимального ингибирования доксорубицина и доксорубицина в комбинации равны, соответственно 0,4 мкмоль/л и 0,22 мкмоль/л, при этом IC50 доксорубицина в комбинации снижается на 46,34%. Рассчитанный индекс комбинирования также указывает на эффект потенцирования, как и в примерах 1 и 2.

Приведенные примеры обосновывают достижение технического результата, а именно: повышение противоопухолевой активности за счет эффекта потенцирования дихлорацетатом натрия цитотоксической активности доксорубицина и возможностью использования доксорубицина в более низких дозах.

Используемые компоненты являются доступными. Дихлорацетат натрия выпускается фирмой Sigma Aldrich (Германия). Доксорубицин-Тева в форме лиофилизата для приготовления инъекционного раствора выпускается фирмой Фармахеми Б.В., Нидерланды.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции для лечения злокачественных новообразований, содержащей 1,22-35,7 мас.% дихлорацетата натрия, 0,028-0,1 мас.% препарата Доксорубицин-Тева в форме лиофилизата для приготовления инъекционного раствора и остальное 0,9%-ный раствор натрия хлорида. Изобретение обеспечивает повышение противоопухолевой активности за счет эффекта потенцирования дихлорацетатом натрия цитотоксической активности доксорубицина с возможностью использования доксорубицина в более низких дозах. 3 пр., 1 табл., 3 ил.

Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований на основе дихлорацетата натрия, отличающаяся тем, что содержит препарат Доксорубицин-Тева в форме лиофилизата для приготовления инъекционного раствора, при следующем содержании компонентов, мас.%:

дихлорацетат натрия 1,22-35,7

Доксорубицин-Тева 0,028-0,1 раствор натрия хлорида 0,9% остальное