ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/522 A61K31/02 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и касается лекарственного средства, предназначенного для лечения различных форм онкологических заболеваний.

Известно, что ранний канцерогенез происходит в гипоксическом микроокружении, при этом метаболизм клеток при опухолевой трансформации, переключаются на анаэробный гликолиз (1). При этом индуцируется фактор HIF (Hypoxia-inducible factor), который, в свою очередь, вызывает индукцию экспрессии нескольких видов транспортеров глюкозы и большинства ферментов гликолиза (2). HIF индуцирует экспрессию киназы пируватдегидрогеназы (PDK) (3). Лактоацидоз способствует опухолевому росту путем ремоделирования-деструкции внеклеточного матрикса, увеличения метастатического потенциала и подвижности клеток и активации ангиогенеза. Хотя в некоторых случаях опухоли васкуляризуются и перестают быть в значительной степени в гипоксических условиях (с возможным сохранением обедненных кислородом зон из-за недостаточности васкуляризации), выбор клетками аэробного гликолиза сохраняется. Это может свидетельствовать о том, что такое изначальное адаптивное метаболическое приспособление обеспечивает выживаемость и селекцию раковых клеток - трансформация в гликолитический фенотип способствует устойчивости к апоптозу (3, 4, 5). Митохондриальный мембранный потенциал и продукция активных форм кислорода (АФК) зависят от цепи переноса электронов (ЭТЦ), деполяризация и возрастание АФК ассоциированы с открыванием пор МТР (6) и высвобождением проапоптотических факторов, в частности, цитохрома С и апоптоз-индуцирующего фактора.

В ряде клеточных линий показана гиперполяризация митохондрий (7) по сравнению с нормальными клетками (8), в ряде других опухолевых линий, по нашим наблюдениям, возможны флуктуации уровня АФК. Снижение поступления пирувата, по-видимому, приводит к падению продукции АФК и закрытию редокс-зависимых каналов, к митохондриальной гиперполяризации и, как следствие, к устойчивости к апоптозу. Необходимо также учитывать, что апоптоз - энергозависимый активный процесс, требующий аденозин трифосфата (АТФ), в этой связи более эффективное энергообеспечение будет также способствовать апоптозу.

Наиболее близким аналогом (прототип) заявленного лекарственного средства является известный (9, 10), проходящий в настоящее время мультицентровые клинические исследования лекарственный препарат Dicloracetate Sodium (DCA) - он же дихлорацетат натрия (ДХА), который используется в качестве средства для лечения лактоацидоза и различных видов опухолевых заболеваний (11). Его противоопухолевая активность в качестве индуктора апоптоза опухолевых клеток доказана в экспериментальных работах (12, 13). Проведенные исследования (14, 15) доказывают индукцию апоптоза ДХА в глиобластоме, в клеточных культурах рака эндометрия, простаты и немел коклеточного рака легких. Кроме того, убедительно доказана способность ДХА индуцировать апоптоз в культурах клеток рака молочной железы. При этом было показано, что в культуре клеток аденокарциномы молочной железы крысы переключение гликолитического фенотипа при воздействии ДХА коррелировало с ингибированием пролиферации без какого-либо увеличения гибели клеток. Согласно опубликованным данным, положительный эффект от применения препарата у 90 больных отмечается в 67% случаев, причем в исследование включались только пациенты с метатастатическими формами рака, у которых традиционные методы терапии были неэффективны.

Известен также применяемый с 1889 года в качестве спазмолитического, бронхолитического, противоастматического, вазодилатирующего, кардиотонического, диуретического, средства препарат теофиллин (метилксантин), проявляющий эффект по активации окислительного фософорилирования и увеличению содержания АТФ (16), а также индуцирующий апоптоз опухолевых клеток, активируя его р53-зависимый механизм (12, 13).

Задача настоящего изобретения заключается в расширении ассортимента эффективных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

Технический результат заключается в повышении эффективности известного лекарственного средства.

Указанный технический результат достигается за счет того, что фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолевых заболеваний на основе дихлорацетата натрия дополнительно содержит теофиллин (далее - ТФ), при этом соотношение дихлорацетата натрия к теофиллину составляет от 1:1 до 10:1.

Такие диапазоны соотношений определяются колебаниями оптимальных терапевтических концентраций действующих активных компонентов. (55-110 ммоль/л для ТФ и 50-520 ммоль/л для ДХА)

Заявленное лекарственное средство (торговая марка - Теохлонал (далее - ТХ)) - представляет собой фармацевтическую композицию (гомогенизированная смесь) из двух активных фармацевтических субстанций - дихлорацетата натрия (ДХА) и теофиллина (ТФ) и, при необходимости, фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ).

Вспомогательными веществами при изготовлении лекарственных препаратов на основе заявленной композиции могут быть, например: а) в таблетках: целлюлоза микрокристаллическая, крахмал картофельный, тальк, стеариновая кислота, титана диоксид, лактоза (сахар молочный), эмульсия кэ 10-16, полисорбат-80; б) в капсулах: кукурузный крахмал, полисорбат-80 (пластификатор), краситель пищевой е 133, краситель пищевой е 17, желатин, в) в суспензии для приема внутрь: сахароза, натрия гидроксид, метилпарагидроксибензоат, этанол 96%, натрия цитрат, кислота лимонная моногидрат, ароматы фруктовые (банана, мандарина, апельсина и пр.), ванилиновая отдушка, малиновая отдушка, эфиры полигликостеариловой кислоты, метилгидроксипропилцеллюлоза, карбомер, натрия цикломат, натрия сахарин, г) в растворе для приема внутрь: лимонной кислоты моногидрат, натрия гидрофосфата дигидрат, натрия хлорид, бензалкония хлорид.

Учитывая действие ДХА, выражающееся в индукции апоптоза при увеличении внутриклеточного содержания пирувата, а также эффект теофиллина (ТФ) по активации окислительного фософорилирования и увеличению содержания АТФ, была исследована проапототическая активность Теохлонала (ТХ - комбинация ДХА и ТФ) на клеточных линиях HeLa и Jurkat, при этом особое внимание уделялось функционированию митохондрий и митохондриальному звену.

Исследования доказали, что противоопухолевая активность ДХА, проявляющаяся в индуцировании апоптоза опухолевых клеток, усиливается при добавлении ТФ, то есть совместное биологическое действие известных (ДХА и ТФ) компонентов композиции обеспечивает синергетический эффект.

Эффективность терапевтического действия композиции существенно превышает действие отдельно взятого ДХА. По данным in vitro ТХ индуцирует гибель опухолевых клеток в диапазоне концентрации 10-32 ммоль/л, в 4-1.2 раз меньшей, концентраций ДХА. Таким образом, ТХ обладает большей эффективностью и позволяет значительно уменьшать терапевтическую дозу, что способствует устранению возможных побочных эффектов (периферическая нейропатия и гепатотоксичность), что является дополнительным техническим результатом.

Кроме того, следует отметить, что по сравнению с препаратами цитостатического антиметаболитного действия (винкристином, метатрексатом) при сходной противоопухолевой активности активные субстанции (ДХА и ТФ) по отдельности, а также их композиция (ТХ) обладают значительно (в сотни раз) более низкой токсичностью (9).

Для пояснения сущности изобретения представлены следующие графические материалы:

- фиг.1 - диаграмма цитотоксичности теофиллина (ТФ), дихлорацетат (ДХА), теохлонала (ТХ). Для наглядности результаты (величины оптического поглощения формазаном) представлены в % от контроля с инверсией шкалы;

- фиг.2 - диаграмма индукции апоптоза препаратами ТФ, ДХА и ТХ;

- фиг.3 - диаграмма эффектов препаратов на линии Hela, выраженные в % от контроля. 24 ч инкубация. Ряд «ДХА и ТЕОФ» соответствует простому суммированию независимого действия ДХА и ТФ;

- фиг.4 - таблица, в которой приведена статистическая значимость различий ТХ с ТФ и ДХА.

Ниже приводятся данные исследований, подтверждающие выводы о более высокой эффективности композиции по сравнению с действием отдельных, входящих в ее состав, компонентов.

Объекты исследования: клеточные линии Т-лимфобластной лейкемии Jurkat (лимфобластоподобная), эпителиоидной карциномы шейки матки HeLa.

Режим воздействия: инкубации в течение 24 часов с дихлорацетатом (отдельно), теофилином (отдельно), теохлоналом (комбинация), индуктором апоптоза (положительным контролем).

Действующие вещества и диапазоны концентраций: теофиллин (ТФ) (0,05-13,42 мМ/л); дихлорацетат (ДХА) (0,25-64 мМ/л); теохлонал (ТХ) (соотношение ДХА и ТФ по массе 4:1).

Оценка цитотоксичности, метаболической активности производилась с использованием МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в окрашенный формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Растворение формазана с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) позволяет осуществить фотометрию и фиксировать изменение оптического поглощения раствора, коррелирующее с метаболической активностью клеточной линии. МТТ-тест является индикатором функции митохондрий в жизнеспособных клетках, нарушение метаболической функции клеток, как правило, сопряжено с последующим снижением их жизнеспособности. В соответствии с этим МТТ-тест может применяться для оценки цитотоксичности какого-либо воздействия на клетки, а также для определения пролиферативной активности.

Полученные данные (фиг.1) подтверждают наличие цитотоксических дозозависимых эффектов у каждого из трех препаратов. При этом, IС₃₅ (индекс концентрации, при которой цитотоксичность составляет 35%) 0,5 мМ/л ТХ составляет около 16 мМ/л, что в 4 раза меньше IС₃₅ (64 мМ/л) для ДХА.

Далее был проведен анализ механизма цитотоксичности - исследование индукции апоптоза указанными препаратами. Для этого клетки инкубировали с препаратами в указанном концентрационном диапазоне, отмывали и инкубировали с зондами пропидий йодид и аннексин V, после чего анализировали на проточном цитометре FACS CALIBUR.

Из полученных данных (фиг.2) следует, что:

1) В диапазонах концентраций 10-32 ммоль/л (что соответствует суточной дозе с учетом биодоступности) ТХ достоверно эффективнее индуцирует апоптоз, чем ДХА в 1,74 раза при 16 мМ/л и в 1,2 при 32 мМ/л;

2) ТХ достоверно эффективнее индуцирует апоптоз чем ТФ в 1,72 раза при 16 мМ/л и в 2,14 при 64 мМ/л.

Выводы на основании проведенных исследований:

- IС₃₅ Теохлонала в ~4 раза меньше соответствующих пороговых концентраций дихлорацетата и теофиллина.

- основным механизмом индукции клеточной гибели ТХ и ДХА следует считать индукцию апоптоза, при этом в диапазоне концентраций 10-32 мМ/л ТХ достоверно эффективнее ДХА и ТФ.

Полученные данные позволяют утверждать о наличии цитотоксического эффекта для всех трех препаратов, статистически значимыми являются действие ДХА в диапазоне концентраций 0,5-64 мМ/л (р<0,05); ТФ 0,42-13,42 мМ/л (р<0,05); ТХ 10-32 мМ/л (р<0,05). Теохлонал обладает минимальной их всех веществ IC₇₅ 0,5 мМ/л, превосходя по своему действию ДХА (IC₇₅ около 4 мМ/л) и теофиллин (IC₇₅ в диапазоне 1,68-3,35 мМ/л).

Кроме того, эффект теохлонала превосходит простое суммирование действия ДХА и теофиллина (см. фиг.3) различия рядов «ДХА и ТФ» и «ТХ»), т.е. компоненты теохлонала обладают синергетическим эффектом при одновременном действии. В таблице (фиг.4) приведена статистическая достоверность различия ДХА, ТФ и ТХ: различия достоверны для концентрации ДХА 0,5-16 мМ/л (р<0,05) и ТФ 0,1-1,68 мМ/л (р<0,05).

Таким образом, Теохлонал обладает специфичным механизмом индукции клеточной гибели, имеет большую эффективность по сравнению с ДХА и ТФ и позволяет значительно уменьшать терапевтическую дозу, что способствует устранению возможных побочных эффектов.

Ниже приведены конкретные примеры заявленной фармацевтической композиции, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением вышеуказанного технического результата, и описаны способы их получения.

Пример 1.

Таблетки 0,5 (покрытые оболочкой) при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 49,0 - теофиллин 49,0 - вспомогательные вещества   (целлюлоза микрокристаллическая,   крахмал картофельный, тальк, стеариновая   кислота, титана диоксид, лактоза, эмульсия   кэ 10-16, полисорбат-80) остальное

Пример 2.

Таблетки 0,5 (покрытые оболочкой) при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 78,4 - теофиллин 19,6 - вспомогательные вещества   (целлюлоза микрокристаллическая,   крахмал картофельный, тальк;   стеариновая кислота, титана диоксид,   лактоза, эмульсия кэ 10-16, полисорбат-80) остальное

Пример 3.

Капсулы 0.5 при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 89,0 - теофиллин 9,0 - вспомогательные вещества   (кукурузный крахмал, полисорбат-80   (пластификатор), краситель пищевой е   133, краситель пищевой е 17, желатин) остальное

Пример 4.

Водный раствор Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г/мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 65,4 - теофиллин 32,6 - вспомогательные вещества   (лимонной кислоты моногидрат,   натрия гидрофосфата дигидрат,   натрия хлорид, бензалкония хлорид) остальное

Пример 5.

Суспензия Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г /мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 78,4 - теофиллин 19,6 - вспомогательные вещества   (эфиры полигликостеариловой кислоты,   метилгидроксипропилцеллюлоза, карбомер,   натрия цитрат, кислота лимонная моногидрат,   ванилиновая отдушка, малиновая отдушка,   натрия цикломат, натрия сахарин,   консерванты: кислота сорбиновая, натрия бензоат) остальное

Пример 6.

Суспензия Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г/мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 89.1 - теофиллин 8,9 - вспомогательные вещества (сахароза,   натрия гидроксид,   метилпарагидроксибензоат, этанол 96%,   карбомер, лимонная кислота, аромат банана) остальное

Пример 7.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций: 1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 50,0 - теофиллин 50,0

Пример 8.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций: 1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 75,0 - теофиллин 25,0

Пример 9.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций:

1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия 90,9 - теофиллин 9,1

Использованная литература.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и касается средства, предназначенного для лечения различных форм онкологических заболеваний. Средство обладает повышенной эффективностью и содержит в качестве действующих компонентов дихлорацетат натрия и теофиллин при соотношении от 1:1 до 10:1. 9 пр., 4 ил.

Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолевых заболеваний на основе дихлорацетата натрия, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит теофиллин, при этом отношение дихлорацетата натрия к теофиллину составляет от 1:1 до 10:1.