СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СОЛИДНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2025 года по МПК A61K31/365 A61K33/243 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и касается способа лечения злокачественных солидных эпителиальных опухолей, включающего последовательное воздействие на опухолевые клетки модулятором сплайсинга пре-мРНК, выбранным из пладиенолидов, включая природные пладиенолиды или их синтетические производные, и, по меньшей мере, одним повреждающим ДНК средством. К повреждающим ДНК средствам, в частности, относятся алкилирующие антинеопластические соединения, препараты группы платины, ингибиторы топоизомераз, противоопухолевые антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, алкилирующие триазины, радиотерапия.

Модуляторы сплайсинга пре-мРНК, такие как сплайсостатин А, изогинкгетин, мадразин, гербоксидиен (GEX1A), майамицин, различные пладиенолиды, в настоящее время рассматриваются как новый перспективный класс противоопухолевых средств. Так, соединение (8Е, 12Е, 14Е)-7-((4-циклогептилпиперазин-1 -ил)карбонил)окси-3,6,16,21-тетрагидрокси-6,10,12,16,20-пентаметил-18,19-эпокситрикоза-8,12,14-триен-11-олид, также известное как Е7107, является полусинтетическим производным природного соединения пладиенолида D и проходило фазу I клинических испытаний. При этом обнаруженное нежелательное явление, приведшее к потере зрения у двух пациентов, заставило остановить исследование [HONG, D.S. et al. A phase I, open-label, single-arm, dose-escalation study of E7107, a precursor messenger ribonucleic acid (pre-mRNA) splicesome inhibitor administered intravenously on days 1 and 8 every 21 days to patients with solid tumors. Invest. New Drugs, 2014, 32 (3), 436-44; DOI: 10.1007/s10637-013-0046-5]. Примером синтетического производного пладиенолида является (2S,3 S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2Е,4Е)-6-(пиридин-2-ил-гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододек-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1 -карбоксилат (также называемый «(2S,3S,4Е,6S,7R,10R)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((2Е,4Е,6R)-6-(пиридин-2-ил-гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододек-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилат»), также известное как Н3 В-8800. Лекарственный препарат на его основе получил статус орфанного препарата для лечения некоторых видов опухолей гемопоэтической системы с мутациями в генах, кодирующих сплайсинговые факторы [STEENSMA, D.P. et al. Phase I First-in-Human Dose Escalation Study of the oral SF3B1 modulator H3B-8800 in myeloid neoplasms. Leukemia, 2021, 35, 3542-3550; DOI: 10.1038/s41375-021 -01328-9], [SEILER, M. et al. H3B-8800, an orally available small-molecule splicing modulator, induces lethality in spliceosome-mutant cancers. Nat. Med. 2018, 24, 497-504. DOI: 10.1038/nm.4493]. Согласно данным о клинических испытаниях в режиме монотерапии Е7107 и НЗВ-8800 обладают высокой токсичностью, способны тормозить рост опухоли, но не элиминировать ее полностью. Также в отчете о доклинических испытаниях сообщалась, что максимальные изменения в сплайсинге пре-мРНК в образцах пациентов были обнаружены через 4-10 часов после введения НЗВ-8800, а затем нарушения сплайсинга пре-мРНК уменьшились до начального уровня, что указывает на временный ответ опухолевых клеток на модулятор сплайсинга [STEENSMA, D.P. et al. Phase I First-in-Human Dose Escalation Study of the oral SF3B1 modulator Н3В-8800 in myeloid neoplasms. Leukemia, 2021, 35, 3542-3550; DOI: 10.1038/s41375-021-01328-9]. Другими важными модуляторами сплайсинга пре-мРНК, относящимися к производным пладиенолида, являются FD-895, FR901464.

В Европейской заявке ЕР 4149483 А2 (опубл. 22.03.2023; МПК: A61K 31/7088; A61K 38/00; A61K 39/395; A61K 45/00; A61K 48/00; А61Р 35/00) описывается способ повышения эффективности иммунотерапии для лечения онкологических заболеваний, включающий одновременное введение агента, модулирующего сплайсинг пре-мРНК, и иммунотерапевтического агента, такого как ингибитор контрольной точки иммунного ответа.

В патенте США US 11524009 В2 (опубл. 13.12.2022; МПК: A61K 31/05; A61K 31/11; A61K 31/166; A61K 31/343; A61K 31/352; A61K 31/395; A61K 31/404; A61K 31/426; A61K 31/4355; A61K 31/4725; A61K 31/495; A61K 31/496; A61K 31/5355; А61Р 35/00) и заявке Японии JP 2021505526 А (опубл. 18.02.2021; МПК: A61K 31/05; A61K 31/11; A61K 31/167; A61K 31/343; A61K 31/353; A61K 31/357; A61K 31/404; A61K 31/426; A61K 31/4355; A61K 31/4725; A61K 31/496; A61K 31/5377; A61K 45/06; A61K 9/08; A61K 9/10; A61K 9/20; A61K 9/48; А61Р11/00; А61Р35/00; А61Р35/02; А61Р43/00) предложены способы лечения рака, включающие введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного модулятора сплайсинга пре-мРНК и терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора, выбранного из BCL2, BCL2/BCLxL и ингибитора BCLxL.

К уровню техники изобретения относится публикация [WHEELER, Е.С. et al. Splicing modulators impair DNA damage response and induce killing of cohesin-mutant MDS and AML, Sci. Transl. Medicine, 2024, 16 (728); DOI: 10.1126/scitranslmed.ade2774], в которой испытывалась комбинация модулятора сплайсинга Е-7107, цитарабина и доксорубицина для лечения острого миелодиспластического синдрома (МДС) и острой миелоидной лейкемии, несущих мутацию в когезиновом комплексе на модели мыши с подкожным ксенографтом опухоли, полученной от пациента. Мышей последовательно лечили, модулятором сплайсинга Е-7107 (в течение 3 дней), затем цитарабином (в.б., 10 мг/кг, 5 дней) и 3 дня доксорубицином (в.в., 1 мг/кг), в комбинации с цитарабином в дни 4 и 6.

Публикация, посвященная лечению острой Т-клеточной лимфобластной лейкемии, описывает синергию ингибиторов SF3B1 с ингибиторами СНЕК2 и химиотерапевтическими агентами [HAN, С.et al. SF3B1 homeostasis is critical for survival and therapeutic response in T cell leukemia, Sci. Adv., 2022, 8 (3); DOI: 10.1126/sciadv.abj8357].

Прототипом предлагаемого изобретения можно считать публикацию [ANUFRIEVA, K.S. et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of premRNA splicing in cancer cells. Genome Med., 2018, 10:49; DOI: 10.1186/s13073-018-0557-у]. Авторами статьи показано, что пладиенолид В повышает чувствительность опухолевых клеток к цисплатину. Опухолевые клетки различных линий обрабатывали сублетальными дозами пладиенолида В в течение 2 дней, а затем обрабатывали их цисплатином. Результаты оценивали, используя тест МТТ. Для использованной комбинации наблюдалась синергия in vitro благодаря уменьшенной эффективности восстановления ДНК в опухолевых клетках. В исследовании использовались человеческие клетки, образующие солидные злокачественные опухоли эпителиального происхождения, такие как аденокарцинома яичника (SKOV3), аденокарцинома протоков молочной железы (MCF7), колоректальный рака (НТ29), аденокарцинома шейки матки (HeLa), карцинома легкого (А549), печеночноклеточная карцинома (HepG2), а также глиобластома (U87MG).

Аналоги предлагаемого изобретения, в основном, нацелены на лечение узкого спектра опухолей, например, только гематологические опухоли; опухоли без предсуществующей устойчивости к химиотерапии; опухоли, несущие определенные мутации. При этом неизбежны токсические эффекты, обусловленные высокими дозами применяемых средств - как модулятора сплайсинга пре-мРНК, так и ДНК-повреждающего средства.

Успехи в разработке противоопухолевых препаратов привели к тому, что в настоящее время большинство видов злокачественных опухолей в той или иной мере чувствительны к химиотерапии и поддаются лекарственному воздействию. Тем не менее, у большинства онкологических больных, особенно при раке яичника, время от окончания лечения до прогрессирования заболевания составляет обычно не более 8-12 месяцев [Xiao, L., Tang, J., Li, W. et al. Improved prognosis for recurrent epithelial ovarian cancer by early diagnosis and 125I seeds implantation during suboptimal secondary cytoreductive surgery: a case report and literature review. J Ovarian Res, 2020, 13, 141; DOI:10.1186/s13048-020-00744-2]. Возникновение резистентности опухолей к химиотерапии является одной из причин неудовлетворительных результатов лечения онкологических больных.

Поскольку химиотерапия остается основным способом лечения злокачественных новообразований, в настоящее время существует большое многообразие методов лечения опухолевых заболеваний, отличающихся различными видами мутаций. При этом наблюдается явный недостаток более универсальных методов, которые можно было бы успешно применить при разных мутациях и выявленной резистентности к лекарственным препаратам. Главной задачей настоящего изобретения является разработка нового способа лечения солидных злокачественных опухолей млекопитающего независимо от их мутационного статуса и предсуществующей устойчивости к предполагаемой химиотерапии, лишенного недостатков, связанных с чрезмерно высокой токсичностью предлагаемых препаратов или со снижением лекарственной чувствительности опухолей. Дополнительная задача изобретения - расширение арсенала технических средств лечения опухолевых заболеваний млекопитающего.

Раскрытие сущности изобретения

Решение задачи изобретения было успешно достигнуто тем, что на опухолевые клетки последовательно воздействовали средством, модулирующим сплайсинг пре-мРНК, в дозе значительно ниже терапевтической и далее средством, вызывающим повреждение ДНК, также в дозе значительно ниже терапевтической. Для достижения технических результатов указанную процедуру повторяют не менее 4 раз с определенным интервалом. В ходе проведенных исследований авторы впервые обнаружили наличие оптимального терапевтического окна для применения повреждающего ДНК средства - не менее суток после введения модулятора сплайсинга пре-мРНК. Хотя некоторые предыдущие исследования предлагали комбинировать ингибиторы сплайсинга с различными агентами, такими как ингибиторы протеасом, ингибиторы CHEK2, а также с несколькими агентами, повреждающими ДНК, для лечения лейкемии или миеломы, предлагаемый способ лечения характеризуется тем, что повышает чувствительность опухоли к ДНК-повреждающим агентам, и при этом показывает эффективность для различных линий опухолевых клеток, независимо от типа опухоли или статуса мутаций в факторах сплайсинга.

Предлагаемое изобретение может быть использовано для лечения солидных опухолей млекопитающих, представляющих собой злокачественные опухоли эпителиального происхождения, включая рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой или прямой кишки, рак легкого, рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичников, холангиокарциному. В качестве модулятора сплайсинга пре-мРНК может использоваться Е7107, FD-895, FR901464, Н3В-8800, гербоксидиена (GEX1A), майамицина, пладиенолида В, пладиенолида D, сплайсостатина А, изогинкгетина, мадразина и другие. Повреждающее ДНК средство может быть выбрано из алкилирующих антинеопластических средств, платинирующих агентов, ингибиторов топоизомераз, противоопухолевых антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, алкилирующих триазинов, а также радиотерапии.

К достигнутым техническим результатам предложенного способа относятся низкая цитотоксичность по отношению к неопухолевым клеткам, отсутствие снижения чувствительности к предлагаемой комбинации, не зависимо от развития устойчивости к ингибиторам сплайсинга, а также реализация изобретением своего назначения, связанного с расширением арсенала технических средств лечения опухолевых заболеваний.

Авторами было проведено исследование эффективности совместного действия низких доз модулятора сплайсинга РНК (пладиенолида В) и низких доз традиционных химиотерапевтических противоопухолевых лекарственных препаратов на клеточной линии аденокарциномы яичника SKOV3. При этом был получен ряд результатов, некоторые из которых оказались неожиданными для специалиста.

Результат 1. Комбинация пладиенолида В и традиционных химиотерапевтических противоопухолевых лекарственных средств обладает синергетическим эффектом.

Чтобы протестировать эффективность совместного действия модулятора сплайсинга пре-мРНК пладиенолида В и традиционных химиотерапевтических противоопухолевых лекарственных препаратов была проведена серия экспериментов на клеточной линии аденокарциномы яичника SKOV3 (как в прототипе). В качестве терапевтических средств были выбраны следующие: цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, темозоломид, этопозид, доксорубицин, 5-фторурацил, гемцитабин, паклитаксел, гефитиниб. Первоначально было проведено определение концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) для каждого химиопрепарата с помощью МТТ-теста. Результаты МТТ теста с данными IC50 представлены на Фиг. 1.

Далее было проведено определение концентрации модулятора сплайсинга пре-мРНК (пладиенолида В), которая бы не обладала значительным цитотоксическим эффектом. Для этого, клетки SKOV3 рассаживали в 96-ти луночные планшеты в количестве 5000 клеток на лунку, инкубировали с различными концентрациями пладиенолида В в течение 48 часов и проводили МТТ тест с последующем определением значения IC20 (Фиг. 2). Было установлено, что IC50 для пладиенолида В составляет 5,04 нМ, а при концентрации пладиенолида В 1,56 нМ более 80% клеток оставались жизнеспособными. В последующих экспериментах была использована данная концентрация.

Далее было проведено сравнение одновременного и последовательного режимов добавления к клеткам пладиенолида В и известного противоопухолевого агента. Имея в распоряжении диапазон эффективных концентраций всех необходимых для исследования химиопрепаратов, была проведена серия МТТ тестов с последовательным или одновременным добавлением к клеткам SKOV3 модулятора сплайсинга пре-мРНК пладиенолида В с фиксированной концентрацией 1,56 нМ и каждого из традиционных химиопрепаратов. Схема экспериментов показана на Фиг. 3. В случае одновременной инкубации, к клеткам SKOV3 препараты добавляли одновременно и оценивали их цитотоксичность через 48 часов. В случае последовательной инкубации, клетки SKOV3 предварительно инкубировали с пладиенолидом В (1,56 нМ) в течение 48 часов, а затем заменяли клеткам среду на свежую порцию среды, содержащей раститровку одного из традиционных химиопрепаратов и через 48 часов проводили МТТ тест. В качестве контроля вместо пладиенолида В клетки предварительно инкубировали с ДМСО (DMSO) в аналогичных концентрациях, так как пладиенолид В растворен в ДМСО. Результаты МТТ теста и концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) для каждого препарата продемонстрированы на Фиг 4. Как видно из полученных результатов (Фиг. 4), модулятор сплайсинга пре-мРНК пладиенолид В усиливает чувствительность клеток SKOV3 к большинству протестированных препаратов исключительно в режиме последовательного добавления препаратов. При этом наилучший эффект наблюдается при комбинации пладиенолида В с повреждающими ДНК средствами. В Фиг. 4 представлены концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) каждого из традиционных химиопрепаратов в режиме монотерапии и комбинированной терапии. Наиболее выраженное изменение чувствительности после предварительной инкубации с пладиенолидом В наблюдалось для цисплатина, темозоломида, доксорубицина, 5-фторурацила и гемцитабина.

Для каждой комбинации были вычислены: индекс комбинации (CI, %), индекс снижения дозы (DRI), а также доля опухолевых клеток, погибших при инкубации с комбинациями препаратов (FA, %), оценка модели нулевой эффективности взаимодействия (ZIP score). Полученные индексы собраны в матрицу (Фиг. 5). Индекс комбинации (CI, %) отражает степень взаимодействия лекарственного препарата в зависимости от суммарного эффекта, где на синергизм указывает: CI<1; на аддитивный эффект: CI=1; а на антагонизм: CI>1 (Фиг. 5В-Г). Индекс снижения дозы (DRI) компонентов комбинации, который позволяет оценить, насколько доза каждого из препаратов в синергетической комбинации может быть снижена при данном уровне эффекта по сравнению с дозой каждого из препаратов, взятых по отдельности, показан на Фиг. 5Д-З. Оценка модели нулевой эффективности взаимодействия (ZIP score) отражает взаимосвязь лекарственного взаимодействия через сравнение изменения эффективности (эффекта при определенном уровне дозы) кривых доза-реакция между отдельными монопрепаратами и их комбинациями (Фиг. 5И-К). Исходя из результатов, видно, что комбинация обладает синергетическим эффектом в режиме последовательного добавления, начиная с концентрации 0,78 нМ пладиенолида В, однако, наиболее выраженные значимые показатели наблюдались при концентрации 1,56 нМ.

Результат 2. Комбинация пладиенолида В и цисплатина приводит к гибели опухолевых клеток, устойчивых к пладиенолиду В или цисплатину.

Чтобы протестировать эффективность патентуемой комбинации в отношении опухолей с предсуществующей устойчивостью к цисплатину, была получена клеточная линия SKOV3 с устойчивостью к цисплатину (Фиг. 6А). Затем для данной клеточной линии была проверена эффективность предлагаемой комбинированной терапии. Резистентные к цисплатину клетки SKOV3 предварительно инкубировали с пладиенолидом В (1,56 нМ) в течение 48 часов, после чего заменяли клеткам среду на свежую порцию среды, содержащей раститровку цисплатина и через 48 часов проводили МТТ тест. В качестве контроля вместо пладиенолида В клетки предварительно инкубировали с ДМСО в аналогичных концентрациях. Было установлено, что прединкубация с пладиенолидом В резистентных к циспалтину опухолевых клеток снижает IC50 цисплатина в 2 раза по сравнению с эффектом цисплатина в монорежиме (Фиг. 6Б). Следовательно, инкубация клеток с пладиенолидом В возвращает клеткам чувствительность к цисплатину. Таким образом, предложенная нами комбинация препаратов может быть использована для лечения опухолей, имеющих устойчивость к цисплатину, что является частой проблемой в клинике, особенно при раке яичников.

Затем была смоделирована ситуация, когда в процессе лечения опухолевые клетки могут выработать устойчивость к пладиенолиду В. Для этого, была получена клеточная линия SKOV3, устойчивая к пладиенолиду В (Фиг. 7А-Б). Неожиданно оказалось, что опухолевые клетки, устойчивые к пладиенолиду В, сохраняют чувствительность к цисплатину. Это было показано с помощью МТТ теста. Установлено, что значение IC50 родительской клеточной линии к цисплатину составляло 8,8 мкМ (Фиг. 1), тогда как значение IC50 для резистентной к пладиенолиду В линии было 0,47 мкМ (Фиг. 7В). Таким образом, можно говорить, что адаптированные к подавленной функции SF3B1, резистентные опухолевые клетки проявляли повышенную чувствительность к цисплатину.

Результат 3. Комбинация пладиенолида В и цисплатина приводит к гибели опухолевых клеток по апоптозному пути из-за повреждения ДНК.

Для верификации эффективности комбинации препаратов была проведена оценка уровня повреждения ДНК и количественная оценка уровня активации апоптоза и некроза в опухолевых клетках SKOV3 с помощью метода ДНК-комет и проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на Фиг. 8. Было обнаружено статистически значимое увеличение ДНК разрывов под действием комбинации препаратов по сравнению с монорежимами (Фиг. 8А). Количество клеток с апоптозом после добавления только пладиенолида В увеличилось незначительно по сравнению с необработанным контролем. Однако клетки SKOV3, обработанные комбинацией препаратов, демонстрировали наиболее высокий уровень раннего и позднего апоптоза, более 80% клеток оказались апоптотирующими. По сравнению с клетками, обработанными только цисплатином, количество апоптотирующих клеток увеличилось в три раза (Фиг. 8Б). Таким образом, комбинация пладиенолида В и цисплатина приводит к увеличению гибели опухолевых клеток через апоптоз.

Результат 4. Комбинация пладиенолида В и цисплатина наиболее эффективна при последовательном воздействии на опухолевые клетки, с интервалом между препаратами 48 часов.

Для определения условий, при которых предложенная выше комбинация средств будет работать максимально эффективно, были протестированы различные периоды выдержки опухолевых клеток SKOV3 с пладиенолидом В до добавления цисплатина, а именно 0, 6, 9, 12, 24, 48, 72 и 96 часов. Клетки выдерживали с фиксированной концентрацией пладиенолида В (1,56 нМ) указанное время, затем клеткам заменяли среду на среду, содержащую различные концентрации цисплатина, и, согласно ранее указанной схеме (Фиг. 3), инкубировали с химиопрепаратом 48 часов, далее проводили МТТ тест. За ноль часов брали точку, когда пладиенолид В добавляли к клеткам одновременно с цисплатином. В качестве контроля использовали ДМСО. Результаты МТТ тестов продемонстрированы на Фиг. 9. Было установлено, что наибольшее увеличение чувствительности опухолевых клеток к цисплатину происходит после 48 часов прединкубации клеток с пладиенолидом В до добавления цисплатина: IC50 снизилась в 11,6 раз. Таким образом, было выбрано оптимальное время выдержки опухолевых клеток с пладиенолидом В перед добавлением цисплатина (48 часов), после которого клетки становятся наиболее чувствительными к последующему действию химиопрепарата.

Также было проведено исследование клеточного цикла под действием пладиенолида В и цисплатина в комбинации и в монорежиме. Цисплатин приводил к аресту клеток в S-фазе клеточного цикла, необходимой для эффективной репарации ДНК. Однако нами было выявлено, что прединкубация опухолевых клеток с низкой дозой пладиенолида В в течение 48 часов приводила к аресту клеток в S-фазе клеточного цикла, по сравнению с контролем. Однако последующее добавление цисплатина к данным клеткам не обеспечивало ареста в S-фазе, что нарушает эффективную репарацию ДНК (Фиг. 10). Таким образом установлено, что комбинация препаратов предотвращает остановку опухолевых клеток в S-фазе, необходимой для репарации ДНК. Также стоит обратить внимание, что необходим временной люфт между первым и вторым препаратом, и цисплатин лучше всего срабатывает, когда опухолевые клетки под действием пладиенолида В находятся, преимущественно, в S-фазе клеточного цикла (Фиг. 10).

Результат 5. Комбинация пладиенолида В и цисплатина обладает низкой токсичностью в отношении нормальных клеток организма человека.

Во избежание возможного побочного действия на нормальные клетки организма выбранная нами комбинация препаратов была протестирована на нормальных неиммортализованных клетках - фибробластах, полученных из кожи человека и клеточной линии нормального эпителия фаллопиевых труб (FT282). По результатам МТТ теста (Фиг. 11) было установлено, что комбинация цисплатина с пладиенолидом В неэффективна для нормальных клеточных линий. Следовательно, предложенная нами комбинация не увеличивает чувствительность нормальных клеток к традиционному химиопрепарату.

Результат 6. Комбинация пладиенолида В и цисплатина повышает чувствительность клеток рака яичника, отражающих различные подтипы данной опухоли, и также эффективна для других типов рака.

Далее предложенная нами комбинация препаратов была протестирована на нескольких опухолевых клеточных линиях рака яичника, отражающих различные подтипы данной опухоли (серозный рак яичника (OVCAR3), цистаденокарцинома яичника (MESOV), светлоклеточный рак яичника (TOV21G), эндометриоидный рак яичника (TOV112D)), а также рака печени человека (Hep G2), колоректального рака человека (НТ-29), рака молочной железы человека (MDA-MB-231), рака яичника (ID8), колоректального рака мыши СТ26 - при одновременном и последовательном добавлении препаратов по указанной ранее схеме (Фиг. 3). Результаты МТТ теста представлены на Фиг. 12 и 13. Было установлено, что чувствительность опухолевых клеток к цисплатину увеличилась для всех клеточных линий при последовательном добавлении препаратов как минимум в два раза. Таким образом, предложенная нами комбинация препаратов работает на всех протестированных типах солидных опухолей.

Кроме того, были протестированы шесть первичных клеточных культур, полученных из асцитов пациентов с раком яичника (Таблица 1). Было установлено, что комбинация работает на большинстве первичных клеточных культур (Фиг. 14).

Результат 7. Комбинация НЗВ-8800 и цисплатина обладает синергетическим эффектом.

Был протестирован аналог пладиенолида В, Н3В-8800, который проходит I/II фазу клинических испытаний и может быть перспективным препаратом для онкотерапии (см. раздел «Уровень техники»). Для клеток SKOV3 была подобрана концентрация препарата, при которой оставалось около 80% жизнеспособных клеток. Клетки инкубировали с Н3В8800 в течение 48 часов, а затем добавляли цисплатин, в качестве контроля использовали ДМСО. Результаты МТТ теста представлены на Фиг. 15. Чувствительность клеток к цисплатину, после прединкубации с Н3В-8800, повысилась в 5 раз, что соответствует результатам, полученным для пладиенолида В.

Таким образом комбинация с предварительной обработкой опухолевых клеток модуляторами сплайсинга пре-мРНК на основе пладиенолидов делает их чувствительными к ДНК повреждающим агентам.

Верификация предложенной комбинации в экспериментах на мышах.

Результат 8. Циклическая комбинированная терапия пладиенолидом В и цисплатином обладает выраженным терапевтическим эффектом in vivo по сравнению с монотерапией.

Основным этапом исследования была апробация предложенной нами последовательной комбинации модулятора сплайсинга пре-мРНК и цисплатина на экспериментальных животных с подкожными опухолями СТ26, экспрессирующими флуоресцентный белок eqFP650 (Фиг. 16). Для снижения токсических эффектов от цисплатина, доза подбиралась таким образом, чтобы терапевтический эффект от монорежима был минимальным. Для цисплатина тестировали две дозы: 2,5 мг/кг и 5 мг/кг. Согласно литературным данным, эти дозы не оказывает существенного воздействия на рост опухоли [Glorieux, С. et al. Cisplatin and gemcitabine exert opposite effects on immunotherapy with PD-1 antibody in K-ras-driven cancer, J. Adv. Res., 2022, 40, 2022, 109-124; DOI:10.1016/j.jare.2021.12.005], [Li, CY., Anuraga, G., Chang, C.P. et al. Repurposing nitric oxide donating drugs in cancer therapy through immune modulation. J. Exp.Clin. Cancer Res. 2023, 42 (22). DOI:10.1186/s13046-022-02590-0]. В группах с комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином животным вводили пладиенолид В внутрибрюшинно (1 мг/кг), затем через 24 часа цисплатин (5 мг/кг или 2,2 мг/кг), цикл повторяли 1 раз (с последующим введением только цисплатина 3 раза) или 4 раза с интервалом 24 или 48 часов после последней дозы цисплатина в зависимости от дня недели (Фиг. 16). В результате лечения было неожиданно установлено, что снижение скорости опухолевого роста наблюдалось, в группах с комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином с повторением цикла (пладиенолид В+цисплатин) 4 раза. Оказалось весьма неожиданным, что наиболее сильная тенденция в ингибировании скорости роста опухоли in vivo наблюдалась для мышей в группе с цикличной комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином при более низкой дозе (2,5 мг/кг) цисплатина по сравнению с группой цикличной комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином с высокой дозой цисплатина (5 мг/кг) и цисплатином в монорежиме (5 мг/кг или 2,2 мг/кг) (Фиг. 17). Стоит отметить, что один цикл лечения пладиенолидом В и цисплатином с последующим введением только цисплатина (вместо минимум четырех), не отличался по терапевтическому эффекту от цисплатина в монорежиме (Фиг. 17). Также цисплатин и пладиенолид В в монорежиме не тормозили скорость роста опухолей по сравнению с контрольными опухолями (Фиг. 17).

Для оценки эффективности изобретенного нами способа лечения в циклическом режиме был проведен детальный патоморфологический анализ и было установлено, что во всех группах опухолей, подвергавшихся лечению, наблюдались дистрофические изменения, клеточная гибель (кариопикноз, кариорексис и апоптотические тельца), сморщивание клеток, повреждение ядер и заметный ядерный полиморфизм по сравнению с контрольными опухолями. Также стоит отметить, что опухоли, подвергавшиеся лечению комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином, проявляли наиболее выраженный ядерный полиморфизм (Фиг. 18А). Для оценки индивидуальной реакции на противоопухолевую терапию, был проведен подсчет митотических фигур в опухолях у разных экспериментальных групп животных. Опухоли с циклической комбинированной терапией пладиенолидом В и цисплатином, показали значительное снижение митотической активности опухолевых клеток, по сравнению с монорежимами исследуемых препаратов и однократной последовательной обработкой пладиенолидом В, затем цисплатином (как в прототипе), а также контрольными опухолями (Фиг. 18Б). Таким образом, данный результат свидетельствует о более длительной выживаемости и низкой вероятности развития отдаленных метастазов.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности применения данной циклической комбинированной терапии модулятором сплайсинга пре-мРНК и цисплатином в клинической практике.

Таким образом, было установлено, что предложенный нами способ лечения, осуществляемый в циклическом последовательном режиме, эффективен для лечения злокачественных солидных эпителиальных опухолей млекопитающих. Полученные результаты как на клеточных линиях, так и первичных культурах, свидетельствуют об универсальности способа. Важно отметить, что выбранная комбинация препаратов не меняет чувствительность к цисплатину неопухолевых клеток, что может позволить снизить цитотоксичность терапии и возможные побочные эффекты, и делает данную комбинацию в циклическом режиме перспективной для применения в клинической практике.

Краткое описание чертежей

Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фиг. 1-18.

Фиг. 1 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования химиопрепаратов для клеток SKOV3.

Фиг. 2 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования пладиенолида В для клеток SKOV3.

Фиг. 3 - Дизайн эксперимента одновременного или последовательного добавления пладиенолида В и традиционного химиопрепарата к клеткам SKOV3 для определения наиболее перспективной комбинации.

Фиг. 4 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования одновременного (А, В, Д, Ж, И, Л, Н, П, С, У) или последовательного (Б, Г, Е, З, К, М, О, Р, Т, Ф) добавления пладиенолида В (Пл-Б) и одного из традиционных химиопрепаратов к клеткам SKOV3.

Фиг. 5 - Матрица синергии последовательного добавления пладиенолида В и цисплатина для клеток SKOV3. Процент опухолевых клеток, погибших при инкубации с комбинацией препаратов (FA, %) (А, Б); индекс комбинации (CI, %) (В, Г), где CI<1 - синергия; CI=1 - аддитивный эффект; CI>1 - антагонизм; индекс снижения дозы (DRI) (Д, Е, Ж, З); оценка модели нулевой эффективности взаимодействия (ZIP score) для одновременного (И) и последовательного (К) добавлений.

Фиг. 6 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования цисплатина: А - для резистентной к цисплатину (серая линия) и чувствительной к цисплатину (черная линия) клеточных линий SKOV3; Б - для последовательного добавления пладиенолида В и цисплатина к устойчивым к цисплатину клеткам SKOV3 (пладиенолид В - черная линия; ДМСО - серая линия).

Фиг. 7 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования пладиенолида В (А, Б) и цисплатина (В): А - дозозависимая кривая пладиенолида В для чувствительной к пладиенолиду В клеточной линии SKOV3; Б - дозозависимая кривая пладиенолида В для резистентной к пладиенолиду В клеточной линии SKOV3; В - дозозависимся кривая цисплатина для резистентной к пладиенолиду В клеточной линии SKOV3.

Фиг. 8 - Количественная оценка повреждений ДНК методом ДНК-комет (А) и активации апоптоза и некроза в клетках SKOV3 (Б) при обработке комбинацией пладиенолида-Б и цисплатина и монопрепаратами.

Фиг. 9 - Влияние различного времени прединкубации опухолевых клеток SKOV3 с пладиенолидом В (Pl-В) на чувствительность к последующему добавлению цисплатина.

Фиг. 10 - Анализ клеточного цикла опухолевой линии SKOV3 после обработки комбинацией пладиенолида В и цисплатина и препаратами по отдельности.

Фиг. 11 - Влияние комбинации пладиенолида В и цисплатина на жизнеспособность фибробластов (А) и клеток линии нормального эпителия фаллопиевых труб (Б).

Фиг. 12 - Влияние одновременной комбинации пладиенолида В и цисплатина на жизнеспособность различных клеточных линий солидных злокачественных опухолей.

Фиг. 13 - Влияние последовательной комбинации пладиенолида В и цисплатина на жизнеспособность различных клеточных линий солидных злокачественных опухолей.

Фиг. 14 - Влияние одновременного и последовательного режимов комбинации пладиенолида В и цисплатина на жизнеспособность первичных клеточных линий рака яичника (А - пациент 1; Б - пациент 2; В - пациент 3; Г - пациент 4; Д - пациент 5; Е - пациент 6). Пациент 1 - рак яичников, стадия 3, без лечения; Пациент 2 - рак яичников, стадия 3, рецидив после лечения; Пациент 3 - серозный рак яичника 4 стадия, без лечения; Пациент 4 - рак яичников, стадия 3, рецидив после лечения; Пациент 5 - рак яичников, стадия 3, без лечения; Пациент 6 - рак яичников, стадия 4, без лечения).

Фиг. 15 - Определение концентрации полумаксимального ингибирования цисплатина для одновременного (А) и последовательного (Б) добавления Н3В8800 и цисплатина к опухолевым клеткам рака яичника SKOV3.

Фиг. 16 - Дизайн эксперимента in vivo лечения экспериментальных опухолей СТ26 в режиме циклически повторяющейся последовательной комбинации пладиенолида В и цисплатина или препаратами по-отдельности.

Фиг. 17 - Скорость роста опухолей СТ26 в группах: PL-B+CPx4 - пладиенолид В (1 мг/кг), затем через 24 часа цисплатин (5 мг/кг (черная линия) или 2,5 мг/кг (серая линия)), цикл повторяли 4 раза; PL-B+CPx1 - пладиенолид В (1 мг/кг), затем через 24 часа цисплатин (2,5 мг/кг), цикл повторяли 1 раз (с последующим введением только цисплатина 3 раза); CP - цисплатин (5 мг/кг (черная линия) или 2,5 мг/кг (серая линия)); Pl-В - пладиенолид В (1 мг/кг); Control - инъекция физраствора.

Фиг. 18 - Патоморфологический анализ опухолей СТ26 в группах: PL-B+CPx4 -пладиенолид В (1 мг/кг), затем через 24 часа цисплатин (2,5 мг/кг), цикл повторяли 4 раза; PL-B+CPx1 - пладиенолид В (1 мг/кг), затем через 24 часа цисплатин (2,5 мг/кг), цикл повторяли 1 раз (с последующим введением только цисплатина 3 раза); CP - цисплатин (2,5 мг/кг); Pl-В - пладиенолид В (1 мг/кг); Control - физраствор. А - патоморфологические изображения; Б - Анализ единичных фигур митозов.

Осуществление изобретения

Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование клеточных линий

Клеточные линии рака яичника человека SKOV3 (АТСС, НТВ-77), MESOV (АТСС, CRL-3272), TOV-112D (АТСС, CRL-11731D), TOV-21G (АТСС, CRL-11730), А2780 (Sigma, 93112519), HEY (Cellosaurus, CVCL_0297), клеточную линию рака печени человека Hep G2 (АТСС, НВ-8065), клеточную линию колоректального рака человека НТ-29 (АТСС, НТВ-38), клеточную линию рака молочной железы человека MDA-MB-231 (АТСС, НТВ-26) и клеточную линию мышиного рака яичника ID8 (Sigma, SCC145) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Клеточную линию рака яичника человека OVCAR3 (АТСС, НТВ-161) и клеточную линию колоректального рака мыши СТ26 (АТСС, CRL-2638) культивировали в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Первичные культуры фибробластов кожи человека и hTERT-иммортализованные эпителиальные клетки, выделенные из фаллопиевой трубы женщины-донора FT282 (АТСС, CRL-3449) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% (по объему) эмбриональной телячьей сыворотки, 1% - незаменимых аминокислот (Панэко, №: Ф115/100'), 2 мМ глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Все клетки культивировали в виде адгезионных культур, при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 5% CO2 при 100% влажности. Работа велась в асептических условиях, регулярно проводилось тестирование клеточных культур на микоплазменное заражение.

Пример 2. Получение резистентных клеток SKOV3

Устойчивые к цисплатину клетки SKOV3 были получены из родительской клеточной линии SKOV3 по шестимесячному протоколу. Первоначально клетки культивировали при концентрации цисплатина IC10 в течение 48 часов, затем 72 часа в обычной среде, чтобы обеспечить рост выживших клеток. Этот процесс проводился многократно. Концентрацию цисплатина постепенно увеличивали до IC15, IC20 и, в конечном счете, достигли IC50 через шесть месяцев. Аналогичным образом, устойчивые к пладиенолиду В клетки SKOV3 из родительской клеточной линии SKOV3 были получены в течение четырех месяцев. Начинали культивировать клетки при концентрации пладиенолида В IC10, затем клетки культивировали при IC15. Впоследствии концентрация пладиенолида В была увеличена до IC20, а в конечном итоге до концентрации IC50 для родительской клеточной линии.

Пример 3. МТТ-тест для проверки цитотоксичности комбинаций

Клетки рассаживали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток на лунку в 100 мкл среды для культивирования. Через 12 часов к клеткам добавляли пладиенолид В (Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, cat. #sc-391691) или ДМСО и разные концентрации ДНК-повреждающего алкилирующего агента (цисплатин (Тева, Израиль), оксалиплатин (Тева, Израиль) или карбоплатин (BIOCAD, Россия), темозоломид (Sigma, США, Кат №85622-93-1)); ингибитора топоизомераз (этопозид (Sigma, США, Кат №33419-42-0) или доксорубицин (Тева, Израиль)); антиметаболита (5-фторурацил (Sigma, США, Кат №51-21-8) или гемцитабин (Эбеве, Австрия)) или препарата, не затрагивающего структуру ДНК: блокатор деполяризации микротрубочек (паклитаксел (Тева, Израиль)) или ингибитор тирозинкиназ (гефитиниб (Sigma, США, Кат №184475-35-2)), после чего клетки инкубировали в течение 48 часов (режим одновременного добавления). При режиме последовательного добавления клетки сначала прединкубировали с пладиенолидом В или ДМСО в течение 48 часов, а далее клеткам заменяли среду на свежую, содержащую разные концентрации каждого из указанных выше препаратов, и инкубировали в течение 48 часов. Через указанные промежутки времени в каждую лунку добавляли по 10 мкл реактива МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) и инкубировали 3 часа при температуре 37°С в термостате. Далее из лунок удаляли среду, содержащую МТТ и добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Колориметрическое измерение производили с помощью планшетного ридера AMR-100 (Allsheng, Китай) при длине волны 565 нм. Значения поглощения для каждого тестируемого образца нормализовали на среднее значение для соответствующего ДМСО контроля. Схема эксперимента представлена на Фиг 1.

Пример 4. Расчет величин IC20 и IC50

IC20 и IC50 рассчитывали по данным МТТ-теста с использованием программного обеспечения GraphPad Prism путем перевода значений концентраций препаратов в логарифмические значения и применения нелинейной регрессии.

Пример 5. Оценка синергетического эффекта

Синергетический эффект комбинаций пладиенолида В и химиотерапевтического агента (цисплатина, карбоплатина, доксорубицина, этопозида или гемцитабина) оценивали методом нулевой эффективности взаимодействия (ZIP, Zero-Interaction Potency) с помощью пакета языка программирования R SynergyFinder R/Bioconductor. Входные данные были преобразованы функцией ReshapeData и далее анализировались со следующими параметрами, рекомендованными разработчиками: impute = TRUE, impute_method = NULL, Noise = TRUE. Комбинации лекарственных средств, которые имели балл синергии ZIP более 10, являются синергетическими.

Пример 6. Количественная оценка уровня апоптоза и некроза

Клетки SKOV3 рассаживали в 6-ти луночный планшет по 150 тысяч клеток на лунку. После того, как клетки прикрепились, к ним добавляли либо пладиенолид В (1,56 нМ), либо соответствующее количество ДМСО в качестве контроля. Через 48 часов клеткам меняли среду на свежую, содержащую 10 мкМ цисплатина и инкубировали еще 24 часа. Затем клетки открепляли (причем в исследование брали как живые, так и погибшие (открепившиеся) клетки) и обрабатывали согласно протоколу производителя теста «CellEvent Caspase-3/7 Green Flow Assay Kit» (Invitrogen, С10427). К собранным клеткам сначала добавляли реагент, детектирующий каспазную активность: флуоресцентный ДНК-связывающий краситель, конъюгированный с пептидом, расщепляющимся клеточными каспазами 3/7, активируемыми при апоптозе. В результате, краситель может связываться с ДНК клетки. На втором этапе добавляли флуоресцентный краситель SYTOX, избирательно проникающий только в некрозные клетки. После окраски клетки анализировали на проточном цитофлуориметре Acea NovoCyte 3000 в каналах FITC и PerCP. Перед работой настраивали компенсацию на приборе с помощью проб, окрашенных либо Caspase 3/7, либо SYTOX. Полученные данные анализировали в программе NovoFlow: выставляли соответствующее гейтирование, выделяя популяции клеток.

Пример 7. Метод ДНК-комет

Клетки SKOV3 обрабатывали пладиенолидом В, цисплатином или их комбинацией в течение 24 часов. Далее проводили электрофорез, отбирая по 3000 клеток от каждого образца, в соответствии с инструкциями Тревиджена (каталожный номер 4250-050-K). Изображения ДНК-комет были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ts2 (Nikon, Япония), а последующая количественная оценка проводилась с использованием программного обеспечения CometScore 2.0.

Пример 8. Анализ клеточного цикла

Для оценки клеточного цикла клетки SKOV3 обрабатывали пладиенолидом В, цисплатином или их комбинацией, затем фиксировали 70%-ным охлажденным на льду этанолом, постоянно слегка помешивая, инкубировали при -20°С не менее 2 часов, промывали 3 мл PBS и инкубировали в буфере PBS, содержащем 0,1% Triton Х-100 с добавлением 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл) (Invitrogen, №62248), в течение 30 минут. Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре NovoCyte (ACEA Biosciences), с программным обеспечением NovoExpress (ACEA Biosciences, Сан-Диего, США).

Пример 9. Оценка противоопухолевой эффективности циклического способа лечения опухолей с помощью пладиенолида В и цисплатина в экспериментах на животных

Клетки СТ26, стабильно экспрессирующие ближний инфракрасный флуоресцентный белок eqFP650 (FP731, Evrogen), вводили подкожно мышам Balb/c (возраст 12-14 недель) в суспензии (250*10³ в PBS). Рост опухоли контролировали три раза в неделю в течение 3,5 недель. Объемы опухолей рассчитывали по формуле V=(длина × ширина^2) х 3,14/6. На 10-й день опухолевого роста, когда диаметр опухоли достигал ~5-7 мм, начинали терапию. Мышей рандомизировали в когорты в зависимости от схемы лечения (n=5 на группу) и препараты вводили внутрибрюшинно. Мыши были разделены на следующие когорты: «Pl-В+СР» - группа мышей, получавших комбинацию пладиенолида В (1 мг/кг) и цисплатина (5 мг/кг или 2,5 мг/кг): через 24 ч после инъекции пладиенолида В вводили цисплатин. Этот цикл повторяли 4 раза с 1 или 2 днями отдыха между циклами в течение 2 недель (было 4 инъекции пладиенолида В и 4 инъекции цисплатина); «СР» - группа мышей, получавших цисплатин (5 мг/кг или 2,5 мг/кг) 2 раза в неделю в течение 2 недель (4 инъекции цисплатина); «Pl-В» - группа мышей, получавших пладиенолид В (1 мг/кг) 2 раза в неделю в течение 2 недель (было 4 инъекции пладиенолида В), «control» - группа контрольных мышей, которым вводили солевой раствор вместо препаратов 2 раза в неделю в течение 2 недель. На 25-й день роста опухоли проводили флуоресцентную визуализацию всего тела мышей на системах биоимиджинга LumoTrace FLUO (Абисенс, Россия) и IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, США). Выбритых животных анестезировали и визуализировали с помощью возбуждающего диода 590 нм и длинноволнового фильтра 655 нм с временем экспозиции 3000 мс для LumoTrace FLUO и с использованием фильтра с возбуждением 605 нм и 660 нм проходящим фильтром с временем экспозиции 30 мс для IVIS Spectrum.

На 25-й день роста опухоли, после эвтаназии мышей, каждую опухоль препарировали, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, заливали в парафин и делали срезы для гистопатологического исследования. Четырехмикронные срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином. Изображения структуры опухоли были получены с помощью микроскопа Leica Aperio АТ2 и проанализированы с помощью Aperio ImageScope. Для подсчета числа митозов каждый срез выбирали случайным образом, исследовали 12 полей зрения на срез и подсчитывали все фигуры митоза в каждом поле под световым микроскопом при увеличении х 400. Количество митозов выражали как количество митозов на мм² опухоли.

Пример 10. Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Все эксперименты были проведены в трех повторах. Статистический анализ выполнялся в среде языка программирования R. Размер выборки определялся на основе наших предыдущих исследований и опыта авторов. Никакие единичные данные не были исключены из анализа.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения злокачественной солидной эпителиальной опухоли у млекопитающего. Лечение осуществляют циклически: через 24 ч после инъекции модулятора сплайсинга пре-мРНК, выбранного из пладиенолидов, млекопитающему вводят повреждающее ДНК средство, выбранное из алкилирующих антинеопластических средств, платинирующих агентов, ингибиторов топоизомераз, противоопухолевых антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков. Этот цикл повторяют 4 раза с 1 или 2 днями отдыха между циклами в течение 2 недель. Способ обеспечивает низкую цитотоксичность, отсутствие снижения чувствительности к предлагаемой комбинации и расширение арсенала технических средств лечения опухолевых заболеваний за счет совместного применения модулятора сплайсинга пре-мРНК и повреждающего ДНК средства по оригинальной схеме. 3 з.п. ф-лы, 18 ил., 1 табл., 10 пр.

1. Способ лечения злокачественной солидной эпителиальной опухоли у млекопитающего комбинацией модулятора сплайсинга пре-мРНК, выбранного из пладиенолидов, и повреждающего ДНК средства, выбранного из алкилирующих антинеопластических средств, платинирующих агентов, ингибиторов топоизомераз, противоопухолевых антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, отличающийся тем, что лечение осуществляют циклически: через 24 ч после инъекции модулятора сплайсинга пре-мРНК млекопитающему вводят повреждающее ДНК средство; этот цикл повторяют 4 раза с 1 или 2 днями отдыха между циклами в течение 2 недель.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пладиенолиды выбраны из Е7107, Н3В-8800, пладиенолида В или пладиенолида D.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что злокачественная солидная эпителиальная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак толстой или прямой кишки, рак легкого, рак желудка, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичников или холангиокарциному.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.