Средство, индуцирующее продукцию интерлейкина-8 Российский патент 2020 года по МПК A61K31/375 A61P43/00 A61P37/02 G01N33/49 

Изобретение относится к области биологии и медицины и представляет собой новое средство, индуцирующее продукцию интерлейкина-8. Средство может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной медицине, фармакологии.

Провоспалительный цитокин интерлейкин-8 является одним из основных цитокинов, который стимулирует миграцию лейкоцитов в очаг инфекции и воспаления и усиливает микробицидную активность нейтрофилов - основного звена первичной (врожденной) иммунной защиты. Интерлейкин-8 (ИЛ-8, interleukin-8, IL-8, chemoattractant CXCL8) относится к группе СХС хемокинов, клетками продуцентами IL-8 являются макрофаги, лимфоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки. Хемокины вовлечены в разнообразные физиологические процессы, которые обеспечиваются балансом между их стимулирующими и супрессирующими эффектами. Нарушение этого баланса способствует развитию патофизиологических процессов и нарушению элиминации патогена, приводящему к активации аутоиммунных реакций [1]. Усиленная продукция провоспалительных цитокинов, в том числе IL-8, способствует защите организма и особенно необходима на начальных фазах воспаления. Установлено также, что повышенная продукция IL-8 при активации механизмов врожденного иммунитета не ослабляет развитие последующих адаптивных процессов долговременной антиген-специфической иммунной защиты [2].

Известен ряд средств, стимулирующих продукцию IL-8.

Сравнительное изучение секреции IL-8 эндотелиальными клетками перевиваемой человеческой линии ECV304, которые инкубировали в присутствии отдельных цитокинов и их сочетаний, показало, что клетки отвечали на инкубацию с TNF-α трехкратным усилением секреции IL-8 [3].

В эксперименте in vitro установлено, что иммуномодуляторы пептидной структуры - ГМДП (глюкозаминилмурамилдипептид) и бестим (гамма-D-глутамил-триптофан натрия) - оказывают выраженное стимулирующее действие на секрецию IL-8 нейтрофильными гранулоцитами [4].

Известно применение раково-эмбрионального антигена для индукции IL-8 в культурах цельной крови женщин с целью выявления предраковых изменений в молочной железе. Высокая продукция IL-8, индуцированная раково-эмбриональным антигеном, и высокий коэффициент отношения уровня индуцированной продукции IL-8 к уровню спонтанной продукции в супернатантах культуры крови установлен у женщин с доброкачественной опухолью - фиброаденомой. При низких значениях этих показателей выявляют предраковые изменения в молочной железе [5].

Показано, что нейтрофильные дефензины (HNP - human neutrophil peptides) индуцируют синтез хемокина IL-8 в моноцитах, макрофагах и в цельной крови человека [6].

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств, индуцирующих продукцию IL-8.

Поставленная задача решается путем применения соли лития и аскорбиновой кислоты - аскорбата лития (LiC₆H₇O₆) в качестве индуктора IL-8.

Различные соли лития применяются в психиатрии и наркологии в качестве нормотимиков (стабилизаторов настроения) [7]. Аскорбат лития известен как антиоксидант, и применяется в экспериментальных исследованиях, ветеринарии, в медицинской практике - как биологическая активная добавка для повышения адаптационных возможностей организма [8].

При этом в патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено указаний на применение аскорбата лития в качестве средства, индуцирующего продукцию IL-8. Способность аскорбата лития индуцировать продукцию интерлейкина-8 впервые обнаружена и доказана экспериментально.

Вновь выявленное свойство аскорбата лития индуцировать продукцию IL-8 может быть использовано в лабораторной практике, в экспериментальных исследованиях, при работе с клеточными культурами; сочетание с известным психостабилизирующим эффектом лития делает аскорбат лития перспективным при разработке новых лекарственных средств широкого спектра, обладающих нормотимическим, антиоксидантным и иммуномодулирующим действием.

Исследование влияния аскорбата лития на продукцию IL-8 в культуре цельной крови человека проводили с использованием набора реагентов «MILLIPLEX MAP «Нитап Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel» (Merck, Германия) по технологии «Luminex хМАР» на мультиплексном анализаторе MAGPIX (Luminex, USA). Спонтанную продукцию IL-8 определяли в супернатантах интактной культуры клеток крови после суточной инкубации при 37°С, индуцированную продукцию IL-8 определяли в супернатантах после суточной инкубации при 37°С культуры клеток крови с добавлением аскорбата лития.

Предлагаемое изобретение осуществляется следующим образом.

Готовятся стоковые растворы аскорбата лития и препарата сравнения - карбоната лития - в удобной для дальнейшей работы концентрации на физиологическом растворе. Цельную кровь разводят 1:1 полной средой RPMI-1640 с добавлением гентамицина; определенный объем разведенной крови вносят в лунки культурального планшета (24-Well, Eppendorf). Для получения индуцированной продукции IL-8 в параллельные лунки дополнительно вносят стоковые растворы аскорбата лития и соли сравнения карбоната лития до конечной концентрации Li+1,2 ммоль/л; пробы инкубируют в течение суток при 37°С в CO2 - инкубаторе. Параллельно в тех же условиях инкубируют клетки крови в той же среде для получения спонтанной продукции IL-8. После инкубации осторожно отбирают супернатанты, разливают по аликвотам и хранят в низкотемпературной камере при -80°С до исследования. Уровень продукции IL-8 определяют по его концентрации в супернатантах суточных культур клеток крови.

Пример 1. Супернатант суточной культуры образца периферической крови человека (№13-14): концентрация IL-8 в нагрузочной пробе с аскорбатом лития - 31,82 pg/ml; концентрация IL-8 в нагрузочной пробе с карбонатом лития - 11,27 pg/ml; концентрация IL-8 в контрольной пробе (спонтанная продукция) - 8,91 pg/ml.

Оценку влияния солей лития на продукцию IL-8 провели на образцах периферической крови человека, взятой из вены (выборка N=24). В качестве препарата сравнения использовали карбонат лития, лекарственные средства на основе которого чаще всего применяются в медицине.

Статистический анализ полученных данных проводили по критерию Манна-Уитни, определяли медиану (Me), квартили (Q1; Q3) и достоверность различия р.

Результаты представлены в таблице.

Из таблицы видно, что внесение в культуру клеток крови аскорбата лития, в отличие от соли сравнения карбоната лития, приводило к выраженному усилению продукции интерлейкина-8, и его концентрация в супернатантах нагрузочных проб с аскорбатом лития (индуцированная продукция IL-8) достоверно превышала соответствующий показатель как в контрольных пробах - спонтанная продукция IL-8 - (p₁=0,0010), так и в пробах с карбонатом лития (р₂=0,0036). Отношение медианы уровня индуцированной аскорбатом лития продукции IL-8 к медиане уровня спонтанной продукции составляет 2,52.

Таким образом, впервые выявлено новое свойство аскорбата лития, характеризующее его как средство, индуцирующее продукцию IL-8, что позволит расширить арсенал индукторов данного цитокина.

Список литературы

1. Москалев А.В., Рудой А.С., Апчел В.Я. Хемокины, их рецепторы и особенности развития иммунного ответа. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2017, 2 (58). С. 182-187. https://elibrary.ru/item.asp?id=29729031).

2. Меняйло М.Е., Малащенко В.В., Шмаров В.А., Газатова Н.Д., Тодосенко Н.М., Мелащенко О.Б., Гончаров А.Г., Селедцов В.И. Прямое влияние интерлейкина-8 на активацию Т-клеток. Российский иммунологический журнал 2016; 10(2): 174-178. https://elibrary.ru/item.asp?id=26741491).

3. Соколов Д.И., Кузнецова С.А., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р., Шейкин Ю.А., Фрейдлин И.С. Цитокиновая регуляция экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 и продукции хемокина IL-8 эндотелиальными клетками. Медицинская иммунология. 2000, Т2, №1. С. 25-33. https://elibrary.ru/item.asp?id=913 0688

4. Нестерова И.В., Синельникова Б.Ю., Швыдченко И.Н. Пептидная регуляция продукции интерлейкина-8 нейтрофильными гранулоцитами в эксперименте in vitro. Иммунология. 2006. Т. 27. №5. С. 274-278. https://elibrary.ru/item.asp?id=9432003

5. Патент (ru) №2623857. Способ выявления предраковых изменений в молочной железе. Аутеншлюс А.И., Кунц Т.А., Карпухина К.В., Михайлова Е.С., Вараксин Н.А. Заявка: №2016125024/ 22.06.2016; опубл. 29.06.2017 Бюл. №19.

6. Чалый Ю.В., Нашкевич Н.Н. Ингибирующий эффект антагонистов рецептора Р2Х7 на продукцию интерлейкина-8 макрофагами человека в ответ на действие нейтрофильных α-дефензинов. Журнал Белорусского государственного университета. Биология. 2017. №2. С. 25-30. https://elibrary.ru/item.asp?id=36665614

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 16-е изд. М.: Новая Волна, 2017. 1200 с. ISBN 978-5-7864-0287-3.

8. Громова О.А., Торшин И.Ю., Сардарян И.С., Остренко К.С., Пронин А.В., Стельмащук Е.В., Хаспеков Л.Г. Аскорбат лития улучшает адаптацию к стрессу на моделях in vitro и in vivo. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2016. №3. С. 13-20. https://elibrary.ru/item.asp?id=28790807

Изобретение относится к области биологии и медицины. Предложено применение кристаллического аскорбата лития общей формулы LiС₆Н₇О₆ в качестве средства, индуцирующего продукцию интерлейкина-8. Изобретение расширяет арсенал индукторов интерлейкина-8 и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной медицине, фармакологии. 1 табл., 1 пр.

Применение аскорбата лития общей формулы LiC₆H₇O₆ в качестве средства, индуцирующего продукцию интерлейкина-8.