ПРОИЗВОДНЫЕ 5-(4-МЕТАНСУЛЬФОНИЛФЕНИЛ)ТИАЗОЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2013 года по МПК C07D277/24 A61K31/425 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, к которой относится ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к применению соединений, полученных из 5-(4-метансульфонилфенил)тиазола, для получения лекарственного препарата для лечения острых и хронических воспалительных заболеваний или состояний, таких как ревматоидный артрит.

СОСТОЯНИЕ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Иммунология представляет собой научное исследование распознавания «своего» и «не своего». Утрата толерантности к «своему» лежит в основе происхождения аутоиммунных заболеваний. Кроме того, другие состояния, такие как трансплантация, атеросклероз, септические и несептические острые и хронические воспалительные патологии и многие другие заболевания, вплоть до настоящего времени не рассматриваемые как аутоиммунные, проявляют иммунный клеточно-опосредованный патогенный механизм. Активация иммунных воспалительных эффекторных реакций рассматривается большинством авторов как основанная на двух сигналах:

- Сигнал 1 включает триггерное действие рецептора клонального антигена (Т-клеточный рецепторный комплекс TCR-CD3), который распознает когнантный антиген, включенный в молекулы Главного Комплекса ГистоСовместимости (MHC = ГКГС). В бета-клетках внеклеточные растворимые или мембраносвязанные антигены сшивают клональный рецепторный комплекс Иммуноглобулин CD79 (Ig/CD79), доставляя сигнал 1 к секретирующей антитела популяции лимфоцитов.

- Второй сигнал, в дополнение к доставленному антигенами сигналу 1, требуется для того, чтобы избежать толерантность в результате анергии или клональной делеции. Сигнал 2 доставляется костимуляторами, такими как CD86, экспрессированными на поверхности профессиональных антиген-презентирующих клеток (APC), таких как моноциты человека и потомки линии их дифференцировки.

В генетически детерминированных иммунных воспалительных реакциях сигналы опасности промотируются микробиальными и самомодифицируемыми антигенами или митогенами, которые вызывают триггерное действие Образраспознающих Рецепторов (PRR). Пути передачи сигнала PRR, такие как через TLR4 (рецептор для липополисахарида или LPS клеточной стенки грам-отрицательных бактерий) доставляют экспрессию высоких уровней костимуляторных поверхностных молекул (т.е CD80 или CD86). В свою очередь, костимуляторные лиганды CD80-CD86 пришивают CD28 на поверхности Т-клеток-хелперов. Комбинация: сигнал 1 (т.е. сшивание анти-CD3 и антитела) плюс сигнал 2 (т.е. сшивание CD28 посредством специфических антител) экспериментально имитирует естественные условия протекания ярко выраженной воспалительной эффекторной иммунной реакции. Примечательно, что апробированные лекарственные средства, подавляющие иммунную систему, имеют некоторые нарушения правильности действия в ингибировании активации каскадов провоспалительных цитокинов в условиях высоких уровней костимуляции. Последние происходят в аутоиммунных заболеваниях и во многих других тяжелых острых и хронических воспалительных состояниях.

Антиген-презентирующие клетки (APC) являются не только важными в определении класса иммунной реакции для приобретенной иммунной системы, поскольку они сильно влияют на то, существует ли эффекторная (т.е. Т-клетка-хелпер, Th (тиенил), клеточная цитотоксичность, Th, образование антител, В-клетка) реакция или толерантная реакция (в результате анэргии или апоптоза), опосредованная клоном сенсибилизированных клеток. Антиген-презентирующие клетки (APC) также могут сами по себе доставлять эффекторные мгновенные иммунные реакции. Хорошо описанный в документации пример включает продуцирование и высвобождение высоких количеств Фактора Некроза Опухоли Альфа (TNF-альфа) моноцитами у раковых пациентов. У этих пациентов TNF-альфа промотирует усиленные реакцию и активацию эндотелия сосудов, сопровождаемые секрецией Интерлейкина 8 (IL-8) и других провоспалительных цитокинов, а также активных веществ-прокоагулянтов. В общей сложности TNF-альфа промотирует тромбоз и ишемию посредством некроза раковой опухоли, что и дало в результате первоначальное определение кахектин или TNF-альфа. Однако, TNF-альфа представляет собой плейотропный цитокин, участвующий во многих других болезненных состояниях. Существуют устоявшиеся представления того, что в моноцитах липополисахарид может вызывать секрецию громадных количеств TNF-альфа, который дает большой вклад в развитие септического шока. В последнее время продуцирование и секрецию неадекватно больших количеств TNF-альфа рассматривают как терапевтическую мишень в аутоиммунных воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, спондилоартропатии, болезнь Крона, увеит и псориаз. В связи с этим применение анти-TNF-альфа на текущий момент было широко рассмотрено в качестве стратегии современного состояния науки и техники с тем, чтобы справиться с теми заболеваниями, в которых снижение достижимых уровней биоактивного TNF-альфа могло бы внести свой вклад в улучшение состояния пациента.

В этом отношении, число заболеваний, которые могли бы быть побеждены посредством лечения антагонистами TNF-альфа, быстро растет и включает атеросклероз, метаболический синдром, энцефалит, вирусный гепатит, гломерулонефрит, неадекватную воспалительную реакцию на опухоли и септический шок, из числа нескольких прочих.

В дополнение к тому, что продуцируется некоторыми соматическими клетками, существует два главных источника продуцирования TNF-альфа, моноциотов и Т-лимфоцитов. В ходе приобретенной иммунной реакции экспозиция антиген-презентирующих клеток в отношении сигналов опасности в условиях провоспалительных инструктивных сценариев вызывает секрецию IL-12 р70 (гетеродимер, состоящий из фрагментов р35 и р40), являющегося последней костимуляторной молекулой, которая поляризует профиль секреции цитокина, обеспечиваемый активированными Th-клетками по Th-1-типу. Th1-клетки проявляют характерный цитокиновый профиль, в котором секреция интерферон-гамма (IFN-гамма) имеет bona fide (истинное) отображение. Эти клетки секретируют высокие количества и TNF-альфа также.

IFN-гамма, продуцированный Th1-клетками, промотирует многие эффекты, которые могут быть значимыми в понимании воспалительных заболеваний. С одной стороны, он дополнительно активирует моноциты и повышает уровень секреции TNF-альфа посредством данного стимула. С другой стороны, он промотирует более мощный путь передачи сигнала через рецепторы TNF-альфа. В общей сложности, IFN-гамма в дополнение к его собственным непосредственным эффектам, таким как противовирусная активность, повышает экспрессию MHC-II (Главный Комплекс Гистосовместимости) и вносит вклад в воспалительные процессы и в очаги повреждений посредством увеличения так и так сильных эффектов TNF-альфа.

Провоспалительный каскад, инициируемый продуцированием TNF-альфа в моноцитах или IFN-гамма и TNF-альфа в Th-1 клетках, становится амплифицированным через другие провоспалительные цитокиновые пути, такие как IL-8. IL-8, вопреки его подлинному названию, был описан как хемокин, продуцированный макрофагами и другими типами клеток, такими как эпителиальные клетки, и также он синтезируется эндотелиальными клетками и, в связи с этим, также называется CXCL8. Хотя нейтрофильные гранулоциты представляют собой основные клетки-мишени IL-8, существует сравнительно широкий ряд клеток (эндотелиальные клетки, макрофаги, тучные клетки, кератиноциты), тоже реагирующих на этот хемокин. Основной функцией IL-8 является индукция хемотаксиса в его клетках-мишенях (например, в нейтрофильных гранулоцитах). В нейтрофилах также индуцируется ряд клеточно-физиологических реакций, необходимых для миграции и для функции фагоцитоза его мишеней, например, увеличение внутриклеточного Са2+, экзоцитоз (например, высвобождение гистамина), окислительный всплеск. IL-8 может быть секретирован любыми клетками посредством TLR, которые участвуют в генетически детерминированной реакции. Основной функцией IL-8 является рекрутирование нейтрофилов для фагоцитоза антигена, который вызывает триггерное действие TLR образа антигена. В результате перемещения клеток-мишеней IL-8 в эндотелий и другие целевые ткани IL-8 оказывается, таким образом, вовлеченным в амплификацию и в исполнение многих патогенных ролей TNF-альфа, в дополнение к своей роли защиты организма.

Миграция и хоуминг лейкоцитов регулируются не только хемокинами и их рецепторами, но также рядом адгезивных молекул. Среди них селектин CD62L известен в качестве терапевтической мишени для предотвращения миграции лейкоцитов в лимфоузлы, и поэтому его расценивают как критерий классифицирования эффектов in vitro нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID).

Многие молекулы фактора супрессии иммунного ответа и анти-TNF-альфа затрагивают нормальные иммунные механизмы защиты, так как они промотируют цитотоксические эффекты в отношении иммунных клеток или ингибируют пролиферативный механизм, которые лежат в основе клональной экспансии, предшествующей успешно протекающим эффекторным иммунным реакциям.

Учитывая важность TNF-альфа, секретированного межклеточным пространством (либо встроенные в цитоплазматическую мембрану, либо секретированные растворимые формы), было предпринято много усилий для разработки терапевтических средств, которые блокируют взаимодействие внеклеточного TNF-альфа как с TNF-рецептором I типа, так и/или TNF-рецептором II типа. Наиболее релевантные подходы представляли собой применение растворимого TNF-рецептора-приманки, который захватывает TNF-альфа и благодаря длительному времени диссоциации предотвращает провоспалительное взаимодействие лиганда с клеточными рецепторами.

Второй стратегией было получение гуманизированных антител против TNF-альфа человека, либо обычных, либо создаваемых в виде биспецифических одноцепочечных молекул, которые выявляют мишени также, как другие молекулы, релевантные в данном заболевании (т.е. анти-VEGF (ингибитор фактора роста эндотелия сосудов)/анти-TNF-альфа (ингибитор фактора некроза опухоли) в ревматоидном артрите). Несмотря на то, что молекулы, описанные выше, являются антагонистами TNF-альфа, они ограничивают свой механизм действия блокадой внеклеточного секретированного TNF-альфа.

Обширный, но не исчерпывающий перечень мишеней, которые управляют продуцированием и секрецией TNF-альфа, мог бы быть следующим: а) молекулы, управляющие транскрипциональной экспрессией TNF-альфа; b) молекулы, управляющие транспортировкой TNF-альфа-РНК от ядер к цитоплазме и сплайсингом РНК; с) молекулы, направляющие трансляцию TNF-альфа; d) молекулы, регулирующие стабильность TNF-альфа-мРНК; е) молекулы, направляющие везикулы Golgi к мембране, где закреплена поверхностная форма про-TNF-альфа; f) молекулы, такие как TNF-альфа-превращающий фермент (TACE), вовлеченные в секреторный шеддинг TNF-альфа и g) молекулы, регулирующие интернализацию поверхностной формы про-TNF-альфа и передачу его сигнала. Все они относятся к клеточным мишеням продуцирования и секреции TNF-альфа.

Несмотря на различные подходы к разработке терапевтических средств, которые блокируют продуцирование TNF-альфа, было бы весьма желательно найти новые лекарственные средства, которые селективно блокируют не только продуцирование TNF-альфа, но также продуцирование других ключевых провоспалительных цитокинов, например, IFN-гамма.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения формулы (I) показали ряд очень интересных иммунных модулирующих эффектов, потенциально полезных для регулирования патогенеза (развития патологического процесса) острых и хронических воспалительных заболеваний и, следовательно, с возможными клиническими применениями. В частности, соединения, используемые в изобретении, были способны ингибировать продуцирование TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) пациентов, страдающих от хронического воспалительного заболевания, такого как ревматоидный артрит, а также ингибировать секрецию IFN-гамма теми клетками после стимуляции Т-клеток. Кроме того, соединения формулы (I) были способны модулировать профили секреции хемокинов (т.е. IL-8) и регуляторных цитокинов (т.е. IL-10) при биологической реакции, и делать это дифференциальным способом в отношении здорового состояния и болезненного состояния. Все эти иммунные модулирующие эффекты соединений формулы (I) не были связаны ни с каким токсическим эффектом на мононуклеарные клетки из периферической крови, и, кроме того, активация и пролиферативная реакция после митогенной стимуляции не были модифицированы этими соединениями.

Комбинация, только в одной небольшой молекуле, ингибирующих эффектов в отношении нескольких провоспалительных цитокинов, таких как TNF-альфа и IFN-гамма, и возможности модулировать хемокин IL-8 и/или регуляторный цитокин IL-10, поскольку все они имеют важнейшее значение в патофизиологии системных и органоспецифических аутоиммунных нарушений, трансплантации, острых и хронических воспалительных заболеваний, некоторых метаболических и дегенеративных заболеваний и атеросклероза, дает возможность соединениям формулы (I) принадлежать к новой категории иммунных модуляторов для нацеливания на каскад провоспалительных/регуляторных цитокинов и хемокинов при различных потенциально репрограммирующихся уровнях клинической и терапевтической релевантности.

В значительной мере иммунные клетки являются малоподвижными, и поступают в органы для «инспектирования» тканей организма, которые подвергаются инфильтрации в воспаленных состояниях, где они концентрируются в очагах повреждения, распределенных в соответствии с активностью заболевания, с органами-мишенями и с распространением поражения. Поскольку соединения, используемые в изобретении, как ожидают, модулируют некоторый аспект патофизиологического процесса, то для охарактеризовывания ряда рецепторов, эффективности связывания, оккупации рецепторов и концентрации пробы лекарственного препарата может быть использовано изучение с получением изображений. С учетом свойств хоуминга для лейкоцитов обнаружение терапевтической мишени дает информацию и о локализации клеток-мишеней, и о центрах очагов повреждения.

Таким образом, соединения формулы (I) также можно применять в качестве биомаркеров для получения изображений (визуализации) при разработке лекарственных средств, в клинических испытаниях и в индивидуальном подборе лекарственного препарата, что позволяет обеспечить информацию не только о фармакокинетических свойствах, распределении и о дозировке, но также и о релевантных данных по характеристикам индивидуальных реакций в предклинических и клинических испытаниях. Последнее может приводить к определению валидированных, желательных, индивидуальных суррогатных биомаркеров, которые вводят в клиническом испытании для оценки конечных точек пациенту, который нуждается в такой прогностической и индивидуальной оценке эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтической композиции, оптимизированного для технологии получения четкой биовизуализации, известной специалистам в данной области.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I):

в которой

R₁ выбирают из водорода, замещенного или незамещенного С₁-С₆ алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероциклила;

R₂ выбирают из водорода, замещенного или незамещенного С₁-С₆ алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, и N(R'R''), где R' и R'' представляют собой независимо водород или С₁-С₆ алкил; и

R₃ представляет собой С₁-С₆ алкильную радикальную группу,

или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства и/или сольвата, для получения лекарственного препарата для лечения острого или хронического воспалительного заболевания, путем ингибирования продуцирования по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, выбранного из TNF-альфа и IFN-гамма, или путем иммуномодулирования хемокина IL-8 и/или регуляторного цитокина IL-10.

В конкретном аспекте изобретения острое или хроническое воспалительное заболевание выбирают из острого и хронического серопозитивного или серонегативного олигоартрита и полиартрита, спондилоартропатий, гломерулонефрита, колагенопатий, тубулоинтерстициального нефрита, метаболического синдрома, атеросклероза, остеоартрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, интерстициальной легочной болезни, множественного склероза, демиелинизирующего заболевания, менингита, энцефалита, менингоэнцефалита, воспалительных радикулопатий и периферических невропатий, воспалительного заболевания кишечника, цирроза, гепатита, сердечной недостаточности, ишемического заболевания, почечной недостаточности, воспалительного цистита, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, простатита, миокардита, перикардита, увеита, атопического дерматита, экземы, уртикарии, псориаза, розацеи, аллергического ринита, сепсиса, септического шока, мультиорганной недостаточности, системных аутоиммунных заболеваний, таких как системная эритематозная волчанка, васкулит, дерматомиозит, амилоидоз или саркоидоз, органоспецифических аутоиммунных заболеваний, таких как тяжелая псевдопаралитическая миастения, воспаление щитовидной железы или диабет 1 типа, трансплантации органов, инфекционного воспаления, вызванного опухолью после укуса муравья, TNF-альфа-зависимой целлюлярной дегенерации, некроза, апоптоза, реакции трансплантат-против-хозяина, кахексии и аутокринного и паракринного патологического роста клетки.

Такие терапевтические показания являются следствием по меньшей мере аномальной иммунной реакции, иммунной дисрегуляции, иммунного нарушения, иммунного патогенеза, иммунной терапии, иммунной супрессии или иммуномодулирующей биологической реакции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению формулы (I'):

в которой

R₁ выбирают из водорода, замещенного или незамещенного С₁-С₆ алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероциклила; и

R₃ представляет собой С₁-С₆ алкильный радикал,

или к его фармацевтически приемлемой соли, пролекарству и/или сольвату.

В третьем аспекте изобретение направлено на фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы (I'), которое определено выше, или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сольват, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или разбавитель.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I'), которое определено выше, для его применения в качестве лекарственного средства.

Наконец, еще один аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I), которое определено выше, в качестве биомаркера визуализации в технологиях получения визуализации и фармаковизуализации, для обнаружения иммунологических очагов повреждения, клеток-мишеней и молекул-мишеней.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 представлены различные флуоресцентные характеристики выбранных микрочастиц для разработки системы «Cytometric Bead Array» (CBA) для определения цитокинов и других аналитов в биологических жидкостях с использованием мультиплексных технологий анализа.

На фиг.2 показано влияние на продуцирование TNF-альфа в стимулированной липополисахаридом (LPS) культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=10) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку для дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого экспериментального условия.

На фиг.3 показано влияние на продуцирование TNF-альфа в стимулированной липополисахаридом (LPS) или комплексом Т-клеточный рецептор/поверхностные антигены Т-клетки (TCR/CD3+CD28) культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=13) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку для дуплицированных культур клеток, вычисленные в пробах в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого из различных экспериментальных условий.

На фиг.4 показано влияние на продуцирование TNF-альфа в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от пациентов с ревматоидным артритом (n=7) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого из различных экспериментальных условий.

На фиг.5 показано влияние на продуцирование IFN-гамма в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=13) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для указанного экспериментального условия.

На фиг.6 показано влияние на продуцирование IFN-гамма в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от пациентов с ревматоидным артритом (n=8) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого из различных экспериментальных условий.

На фиг.7 показано влияние на продуцирование IL-8 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=13) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого экспериментального условия.

На фиг.8 показано влияние на продуцирование IL-8 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от пациентов с ревматоидным артритом (n=8) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя для каждого экспериментального условия.

На фиг.9 показано влияние на продуцирование IL-10 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=13) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Статистические расхождения не были обнаружены.

На фиг.10 показано влияние на продуцирование IL-10 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от пациентов с ревматоидным артритом (n=8) соединения 12. Колонки представляют среднее значение и стандартную ошибку дуплицированных культур клеток, вычисленные для каждой пробы в различных экспериментальных условиях. Символы «звездочка» представляют статистически достоверную разницу (р<0,05) соответствующих данных в отношении разбавителя.

На фиг.11 показан эффект соединения 12 (а) и разбавителя (b) на пролиферативную реакцию культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров (n=8) в присутствии и в отсутствие стимуляции посредством либо фитогемагглютинина (PHA), PHA плюс IL-2, либо комбинации анти-CD3 (Т3) и анти-CD28 моноклональных антител.

На фиг.12 показано действие соединения 12 на шеддинг CD62L в лимфоцитах (а) и моноцитах (b) культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых волонтеров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В контексте настоящего изобретения следующие термины имеют значение, подробно описанное ниже:

Термин «С_1-6 алкил» относится к радикалу с линейной или разветвленной углеводородной цепью, состоящей из атомов углерода и водорода, не содержащей ненасыщенности, имеющей один-шесть атомов углерода, и которая присоединена к остальной части молекулы посредством одинарной связи, например, к метилу, этилу, н-пропилу, изопропилу, н-бутилу, трет-бутилу, н-пентилу, и т.д. С_1-6 алкильные радикалы могут быть необязательно замещены одним или более заместителями, такими как циклоалкил, арил, гетероциклил, галоген, гидроксигруппа, алкоксигруппа, цианогруппа, аминогруппа, нитрогруппа или алкилтиогруппа.

Термин «циклоалкил» относится к стабильному 3-8-членному кольцевому радикалу, который насыщен или частично насыщен, и который состоит исключительно из атомов углерода и водорода, такому как циклогексил или циклопентил. Если не установлено конкретно иное в описании изобретения, термин «циклоалкил», как подразумевают, включает циклоалкильные радикалы, которые необязательно замещены по меньшей мере одним заместителем, независимо выбранным из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкильного радикала, галогена, гидроксила, -N(R₃)(R₄), где R₃ и R₄ независимо выбирают из водорода и линейного или разветвленного С_1-6 алкильного радикала.

Термин «арил» относится к стабильному 5-8-членному ароматическому кольцевому радикалу, который состоит исключительно из атомов углерода и водорода, такому как фенил или циклооктатетраен. Если не установлено специально иное в описании изобретения, термин «арил», как подразумевают, включает арильные радикалы, которые необязательно замещены по меньшей мере одним заместителем, независимо выбранным из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкильного радикала, галогена, гидроксила, -N(R₃)(R₄), где R₃ и R₄ независимо выбирают из водорода и линейного или разветвленного С_1-6 алкильного радикала.

Термин «гетероциклил» относится к стабильному 3-8-членному кольцевому радикалу, который состоит из атомов углерода и из одного-пяти гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода, и серы. Для целей этого изобретения гетероциклил может быть частично или полностью насыщенным или ароматическим. Примеры таких гетероциклилов включают пирролидин, пиридин, тиофен, фуран, и т.д., но не ограничиваются этим. Если не установлено конкретно иное в описании изобретения, термин «гетероциклил», как подразумевают, включает гетероциклильные радикалы, которые необязательно замещены по меньшей мере одним заместителем, независимо выбранным из группы, состоящей из водорода, С_1-6 алкильного радикала, галогена, гидроксила, -N(R₃)(R₄), где R₃ и R₄ независимо выбирают из водорода и линейного или разветвленного С_1-6 алкильного радикала.

Термин «галоген» относится к брому, хлору, йоду или фтору.

Термин «острый и хронический серопозитивный или серонегативный олигоартрит и полиартрит» относится к заболеваниям с воспалением синовиальной оболочки, захватывающим один или несколько диартродиальных суставов, либо с позитивным, либо с негативным ревматоидным фактором, включая ревматоидный артрит и как первичный, так и вторичный синдром Sjögren.

Термин «спондилоартропатии» относится к воспалительным заболеваниям, связанным с иммунопатологией главного комплекса гистосовместимости у человека, с вовлечением сакро-илеакальных суставов, и/или спинных, и/или периферических суставов, также включая увеит.

Термин «гломерулонефрит» относится к воспалительным очаговым повреждениям в клубочках почек.

Термин «тубуло-интерстициальный нефрит» относится к воспалительным заболеваниям, захватывающим канальцы и интерстициальную ткань почек.

Термин «колагенопатии» относится к системным воспалительным заболеваниям с иммунным развитием патологического процесса, включающим системную эриматозную волчанку (SLE), дерматомиозит и склеродермию.

Термин «воспалительное заболевание кишечника» относится к воспалительным заболеваниям желудочно-кишечного тракта с иммунным развитием патологического процесса, либо с системными признаками, либо без таковых, включающим болезнь Крона и неспецифический язвенный колит.

Термин «обструктивное заболевание легких» относится к бронхиальным заболеваниям либо с обратимым, либо с необратимым снижением объема выдоха (FEV), включающим астму и хроническое обструктивное заболевание легких.

Термин «интерстициальная легочная болезнь» относится к воспалительным заболеваниям, захватывающим интерстициальную ткань легких.

Термин «демиелинизирующие заболевания» относится к воспалительным заболеваниям центральной нервной системы с развитием иммуннопатологическим процессам, провоцирующим лизис миелина, включающим множественный склероз и оптический неврит.

Термин «менингит, энцефалит и менингоэнцефалит» относится к воспалительным заболеваниям оболочек головного мозга и/или других структур центральной нервной системы.

Термин «воспалительные радикулопатии и периферические невропатии» относится к воспалительным заболеваниям периферической нервной системы.

Термин «воспалительный цистит» относится к воспалительным заболеваниям мочевого пузыря.

Термин «доброкачественная гиперплазия предстательной железы» относится к незлокачественной гипертрофии и/или гиперплазии предстательной железы.

Термин «атопический дерматит, экзема и уртикария» относится к аллергическим заболеваниям кожи с развитием иммунопатологического процесса с вовлечением иммуноглобулина Е (IgE) или без вовлечения такового.

Термин «псориаз» относится к реакции гиперкератозной и эритематозной кожи с системным развитием иммунопатологического процесса.

Термин «розацеа» относится к обычному воспалительному состоянию кожи, характеризующемуся эритемой (быстрое изменение цвета и покраснение) в центральной части лица и на щеках, носу или лобной части, реже затрагивающей также шею и грудную клетку.

Термин «аллергический ринит» относится к интермиттирующим (также называемым как сезонные) или персистирующим (также называемым как длительные) воспалительным заболеваниям слизистой оболочки носа с развитием иммунопатологического процесса с реакцией гиперчувствительности.

Термин «сепсис, септический шок и мультиорганная недостаточность» относится к системным воспалительным заболеваниям, обусловленным аномальной иммунной реакцией на микробные агенты и другие этиологические факторы.

Термин «саркоидоз и амилоидоз» относится к идиопатическим иммунологическим заболеваниям с вовлечением в опухолевый процесс органов и/или с вовлечением в опухолевый процесс всего организма и с не вполне определенной этиологией, в которой может быть прослежена аномальная иммунная реакция.

Термин «органоспецифические аутоиммунные заболевания» относится к обусловленному иммунной системой очаговому повреждению органов с неопределенными этиологическими факторами, включающему миастению гравис, тироидит, гипофизит, адреналит и другие заболевания.

Термин «трансплантация органов» относится к предотвращению и лечению отторжения трансплантированных клеток, тканей и органов.

Термин «инфекционное и вызванное развитием опухоли воспаление» относится к аномальным иммунным реакциям, вторичным к микробным агентам или к стимулирующим развитие рака веществам.

Термин «TNF-альфа-зависимая целлюлярная дегенерация, апоптоз или некроз» относится к дегенерации ткани или к омертвению ткани, вызванной посредством TNF-альфа.

Термин «реакция трансплантат-против-хозяина» относится к воспалительным иммунным реакциям, вызванным трансплантированными клетками.

Термин «кахексия» относится к системной анорексии или к нарушению питания и к потере веса, вызванными воспалительными или неопластическими заболеваниями.

Термин «атеросклероз» относится к любому затвердеванию артерий, вторичному к атероме или к аккумулированию в стенках артерий, которые состоят из воспалительных клеток (в основном клетки-макрофаги), и к клеточному детриту, который содержит липиды.

Термин «ишемические заболевания» относится к очаговому повреждению органов, вторичному к сниженным оксигенации ткани и/или кровообращения, включающему сердечную и церебрально-васкулярную ишемию.

Термин «аутокринный и паракринный патологический рост клетки» относится к злокачественным и доброкачественным заболеваниям с использованием клеткой TNF-альфа в качестве цитокина, регулирующего фактор активации и пролиферации для клеток.

Если не указано иное, соединения, используемые в изобретении, как подразумевают, включают соединения, которые различаются только наличием одного или более изотопически обогащенных атомов. Например, соединения, имеющие настоящие структуры за исключением структур с замещением водорода дейтерием или тритием, или с замещением углерода ¹³С- или ¹⁴С-обогащенным углеродом или ¹⁵N-обогащенным азотом, находятся в пределах объема этого изобретения.

Термин «их фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства» относятся к солям, сольватам или пролекарствам, которые при введении реципиенту могут обеспечивать (прямо или непрямо) соединение, такое как соединение, описанное в этом документе. Тем не менее, следует отметить, что фармацевтически неприемлемые соли также попадают в объем изобретения, так как они могут быть полезными в приготовлении фармацевтически приемлемых солей. Соли, пролекарства и производные могут быть приготовлены посредством способов, известных в существующем уровне техники. «Фармацевтически приемлемый» предпочтительно относится к молекулярным частицам и композициям, которые являются физиологически переносимыми и обычно не вызывают аллергической реакции или подобной нежелательной реакции, такой как желудочные расстройства, головокружение и тому подобное, при введении человеку или животному. Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что оно (вещество) одобрено федеральным или государственным агентством по регулированию лекарственных средств и включено в фармакопею США или в другую общепризнанную фармакопею для применения на животных, и в большей степени на людях.

Например, фармацевтически приемлемые соли соединений, описанные ранее в этом документе, синтезируют из ранее описанного соединения, содержащего основное или кислотное звено, посредством общепринятых традиционных химических способов. Такие соли, как правило, получают, например, путем проведения реакции свободных кислотных или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в смеси того и другого. Неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, как правило, являются предпочтительными. Примеры солей присоединения кислоты включают соли присоединения минеральной кислоты, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, нитрат, фосфат, например, и соли присоединения органической кислоты, такие как ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, соль или эфир яблочной кислоты (малат), манделат, метансульфонат и п-толуолсульфонат, например. Примеры солей присоединения основания включают неорганические соли, такие как, например, соли натрия, калия, кальция, аммония, магния, алюминия и лития, и соли органических оснований, таких как этилендиамин, этаноламин, N,N-диалкиленэтаноламин, глюкамин, и соли основных аминокислот, например.

Термин «пролекарство» определяют в этом документе как химическое соединение-производное, которое получено посредством химической модификации, такой как замещение или введение дополнительной химической группы, для того, чтобы изменить (для фармацевтического применения) некоторые из его физическо-химических свойств, таких как растворимость или биологическая усвояемость, например, сложный эфир или простой эфир, полученный из активного соединения, дающий активное соединение сам по себе после введения субъекту. Примеры общеизвестных способов получения пролекарства из данного активного соединения известны, например, специалистам в данной области и могут быть обнаружены в Krogsgaard-Larsen et al., Textbook of Drug Design and Discovery, Taylor & Francis (April 2002). В соответствии с изобретением термин «сольват», как полагают, означает любую форму соединения изобретения, имеющую другую молекулу (наиболее вероятно полярный растворитель), связанную с ним посредством нековалентной связи. Примеры сольватов включают гидраты и алкоголяты, например, метанолят.

Особенно предпочтительными пролекарствами являются пролекарства, повышающие биологическую усвояемость соединений этого изобретения при введении таких соединений пациенту (делая возможным более быстрое всасывание в кровь перорально введенного соединения), или пролекарства, увеличивающие распределение исходного соединения в биологическом пространстве (мозг или лимфатическая система, например) относительно распределения исходного соединения при введении пациенту молекул исходного соединения.

Соединения, используемые в изобретении, могут находиться в кристаллической форме, т.е. в виде полиморфных образцов, либо в форме свободных соединений, либо в форме сольватов (гидраты, например), и полагают, что обе формы находятся в рамках объема настоящего изобретения. Способы сольватации, как правило, известны в данной области. Подходящие сольваты представляют собой фармацевтически приемлемые сольваты. В конкретном варианте осуществления сольват представляет собой гидрат.

Соли, сольваты и пролекарства могут быть приготовлены посредством способов, известных в существующем уровне техники. Следует отметить, что фармацевтически неприемлемые соли, сольваты или пролекарства также включены в объем изобретения, так как они могут быть полезными в приготовлении фармацевтически приемлемых солей, сольватов или пролекарств.

Соединения формулы (I) или их соли или сольваты предпочтительно находятся в фармацевтически приемлемой форме или в практически чистой форме. Фармацевтически приемлемую форму понимают, в частности, как имеющую фармацевтически приемлемый уровень чистоты, исключающий обычные фармацевтические добавки, такие как разбавители и эксципиенты, и без включения какого-либо вещества, рассматриваемого как токсичный при обычных уровнях дозировки. Уровни чистоты для лекарственного средства составляют предпочтительно выше 50%, более предпочтительно выше 70%, и еще более предпочтительно выше 90%. В предпочтительном варианте осуществления он составляет выше 95% соединения формулы (I), или его солей, сольватов или пролекарств.

Используемые в изобретении соединения, показанные формулой (I), описанные выше, могут включать энантиомеры в зависимости от присутствия хиральных центров или изомеры в зависимости от присутствия кратных связей (например, Z, E). Индивидуальные изомеры, энантиомеры, диастереоизомеры и их смеси находятся в рамках объема настоящего изобретения.

В конкретном варианте осуществления для его применения в технологиях получения визуализации и фармаковизуализации, или при вытеснении этих технологий, в качестве биомаркеров в разработке лекарственного средства, в клинических испытаниях, и в индивидуальном подборе лекарственного препарата, соединение формулы (I) может быть помечено флуоресцентными или люминесцентными метками или флажками, с введением маркеров любым способом, известным специалистам в данной области.

В конкретном варианте осуществления изобретения R₁ является замещенным или незамещенным С₁-С₆ алкилом. Предпочтительно R₁ представляет собой метил.

В другом конкретном варианте осуществления R₂ представляет собой водород, замещенный или незамещенный С₁-С₆ алкил, замещенный или незамещенный циклоалкил. Предпочтитлеьно, R₂ является замещенным или незамещенным циклоалкилом. Более предпочтительно, R₂ представляет собой циклопентил.

В дополнительном другом конкретном варианте осуществления R₃ представляет собой метил.

В другом еще более конкретном варианте осуществления, соединение формулы (I), используемое в настоящем изобретении, выбирают из следующих соединений:

или их фармацевтически приемлемой соли, пролекарства и/или сольвата.

Соединения формулы (I), используемые в настоящем изобретении, могут быть получены посредством доступных методик синтеза. Например, они могут быть приготовлены способом, который обобщенно описан в следующей схеме:

Этот способ, во-первых, включает реакцию этерификации соединения 4-R₃-тиофенилуксусной кислоты для получения метилового сложноэфирного производного. Упомянутая реакция может быть выполнена с использованием метилирующего агента, такого как MeI, в присутствии соли, такой как NaHCO₃, или с использованием МеОН в качестве метилирующего агента в присутствии кислотной среды.

На следующей стадии метиловое сложноэфирное производное, необязательно без какого-либо очищения, окисляют по атому серы с использованием окисляющего агента, например оксона, и таким образом получают сульфонсодержащее соединение из соединения, содержащего тиоэфирную группу.

Последующее галогенирование посредством агента, такого как NBS (N-бромсукцинимид), приводит к образованию галогенида в α-положении сложноэфирной группы. Циклоприсоединение этого соединения посредством различных тиоамидов при нагревании дает в результате R₁-замещенный 5-(4-R₃-сульфонилфенил)тиазол-4-ол с высокой степенью чистоты.

Тиоамиды, используемые для циклоприсоединения, получают из амидов, соответствующих реагенту Lawesson, что описано публикациях журналов: J. Med. Chem. (34) 2158-2165, 1991 и J. Org. Chem. (65), 13, 3973, 2000. Упомянутые тиоамиды включают соединения, где R₁ выбирают из водорода, замещенного или незамещенного С₁-С₆ алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероциклила, что определено выше.

Введение радикальной группы R₂ через гидроксильную группу может быть выполнено способом, известным специалисту в данной области, и в частности, в получении соединения формулы (I), используемого в настоящем изобретении. В конкретном варианте осуществления, гидроксильную группу подвергают реакции с галогенидом формулы R₂-Hal, предпочтительно R₂-Br, с обеспечением соединения формулы (I).

Все реагенты, используемые в упомянутых реакциях, являются коммерчески доступными.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы (I'):

в которой

R₁ выбирают из водорода, замещенного или незамещенного С₁-С₆ алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероциклила; и

R₃ представляет собой С₁-С₆ алкильную радикальную группу,

или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство и/или сольват.

В конкретном варианте осуществления R₁ представляет собой замещенный или незамещенный С₁-С₆ алкил. Предпочтительно, R₁ представляет собой метил.

В другом конкретном варианте осуществления R₃ представляет собой метил.

В другом конкретном варианте осуществления используют соединение формулы (I') изобретения, которое выбирают из следующего:

или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство и/или сольват.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие новое соединение формулы (I') настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или разбавитель для введения пациенту.

В конкретном варианте осуществления для его введения при предупреждении и/или при лечении острых или хронических воспалительных заболеваний, соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и/или сольваты будут составлены в подходящую фармацевтическую композицию, в терапевтически эффективном количестве, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, адъювантами и/или разбавителями.

Термин «носитель, адъювант и/или разбавитель» относится к молекулярным частицам или веществам, с которыми вводят активный ингредиент. Такие фармацевтические носители, адъюванты или разбавители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как водные жидкости и масла, включая масла, полученные из нефти, или масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п., эксципиенты, разрыхлители, смачивающие реагенты или разбавители. Подходящие фармацевтические носители описал E.W. Martin в «Remington's Pharmaceutical Sciences».

Фармацевтические композиции могут быть введены любым подходящим способом введения, например, пероральным, парентеральным (например, подкожным, интраперитонеальным, внутривенным, внутримышечным, и т.д.), ректальным способом введения, и т.д., обычно перорально в случае хронической природы заболевания, которое должно быть вылечено.

В конкретном варианте осуществления упомянутые фармацевтические композиции могут находиться в фармацевтической форме для перорального введения, либо в твердой, либо в жидкой форме. Иллюстративные примеры фармацевтических форм для перорального введения включают таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии, и т.д., и могут содержать традиционные эксципиенты, такие как связующие вещества, разбавители, разрыхлители, скользящие вещества, смачивающие вещества, и т.д., и могут быть изготовлены общепринятыми способами. Фармацевтические композиции также могут быть адаптированы для их парентерального введения в форме, например, стерильных, лиофилизированных продуктов, суспензий или растворов в подходящей лекарственной форме; в этом случае упомянутые фармацевтические композиции будут включать подходящие эксципиенты, такие как буферные растворы, поверхностно-активные вещества, и т.д. В любом случае, эксципиенты будут выбраны в соответствии с фармацевтической формой введения. Обзор различных фармацевтических форм для введения лекарственных средств и их изготовления может быть представлен в «Tratado de Farmacia Galénica» by C. Fauli I Trillo, 10^th Edition, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Для его применения в терапии, соединение формулы (I) предпочтительно будет находиться в фармацевтически приемлемой или практически чистой фармацевтической форме, т.е. соединение формулы (I) имеет фармацевтически приемлемый уровень чистоты, исключающий фармацевтически приемлемые эксципиенты, и не включает вещество, рассматриваемое как токсичное при стандартных уровнях дозировки. Уровни чистоты для соединения формулы (I) составляют предпочтительно выше 50%, более предпочтительно выше 70%, более предпочтительно выше 90%. В предпочтительном варианте осуществления они составляют выше 95%.

Терапевтически эффективное количество соединения формулы (I), которое должно быть введено, как правило, будет зависеть, среди прочих факторов, от индивидуума, который должен быть подвергнут лечению, от тяжести заболевания, испытываемого упомянутым индивидуумом, от выбранного способа введения, и т.д. По этой причине дозы, упомянутые в этом изобретении, должны рассматриваться лишь как методические рекомендации для специалиста в данной области, и последний должен скорректировать дозы в соответствии с вышеупомянутыми переменными параметрами. Тем не менее, соединение формулы (I) может быть введено однократно или несколько раз в день, например, 1, 2, 3 или 4 раза в день, в обычном общем суточном количестве, составляющем от 0,1 до 1000 мг/кг массы тела в день, предпочтительно 10 мг/кг массы тела в день.

Соединение формулы (I), его фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и/или сольваты, а также фармацевтические композиции, содержащие их, могут быть использованы вместе с другими дополнительными лекарственными средствами, полезными в лечении острых и хронических воспалительных заболеваний. Упомянутые дополнительные лекарственные средства могут составлять часть той же самой фармацевтической композиции или, альтернативно, могут быть обеспечены в форме отдельной композиции для ее одновременного или неодновременного введения с фармацевтической композицией, содержащей соединение формулы (I), или его фармацевтически приемлемую соль, пролекарство или сольват.

В рамках объема настоящего изобретения выражение «острое и хроническое воспалительное заболевание» относится к любому заболеванию, расстройству или состоянию, которое является результатом активации и вовлечения в развитие патологического процесса воспалительных/иммунных клеток и воспалительного цитокинового каскада при условии, в котором аномальная костимуляция представляет собой развитие патологического процесса. Численно преобладающие вовлеченные клетки представляют собой воспалительные/иммунные клетки, такие как моноциты, макрофаги, антиген-презентирующие клетки (APC), Т-клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры (NK), плазматические клетки, гранулоциты и тучные клетки, или комбинации вышеупомянутых клеточных субпопуляций, «затянутых» в развитие заболеваний, предложенных для лечения.

Термин «цитокин» относится к секретированному белку, который оказывает влияние на функции других клеток, в особенности, когда это связано с модулированием взаимодействий между клетками иммунной системы или между клетками, вовлеченными в воспалительную реакцию. Упомянутые цитокины представляют собой TNF-альфа (α-фактор некроза опухоли), IFN-гамма (интерферон-γ), хемокин IL-8 (интерлейкин-8), и регуляторный цитокин IL-10 (интерлейкин-10). Продуцирование IL-10 вызывается высокими уровнями TNF-альфа и промотирует негативную обратную связь при продуцировании TNF-альфа, на блокаду транскрипции провоспалительных цитокинов.

В конкретном аспекте изобретения острое или хроническое воспалительное заболевание выбирают из острых и хронических серопозитивных или серонегативных олигоартрита и полиартрита, спондилоартропатий, гломерулонефрита, колагенопатий, тубулоинтерстициального нефрита, метаболического синдрома, атеросклероза, остеартрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, интерстициальной легочной болезни, множественного склероза, демиелинизирующего заболевания, менингита, энцефалита, менингоэнцефалита, воспалительных радикулопатий и периферических невропатий, воспалительного заболевания кишечника, цирроза, гепатита, сердечной недостаточности, ишемического заболевания, почечной недостаточности, воспалительного цистита, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, простатита, миокардита, перикардита, увеита, атопического дерматита, экземы, уртикарии, псориаза, розацеи, аллергического ринита, сепсиса, септического шока, мультиорганной недостаточности, системных аутоиммунных заболеваний, таких как системная эритематозная волчанка, васкулит, дерматомиозит, амилоидоз или саркоидоз, органоспецифических аутоиммунных заболеваний, таких как тяжелая псевдопаралитическая миастения, воспаление щитовидной железы (тироидит) или диабет 1 типа (инсулинит), трансплантации органов, инфекционного воспаления, вызванного опухолью после укуса муравья, TNF-альфа-зависимой целлюлярной дегенерации, некроза, апоптоза, реакции трансплантат-против-хозяина, кахексии и аутокринного и паракринного патологического роста клетки.

В предпочтительном варианте осуществления острое или хроническое воспалительное заболевание представляет собой серопозитивный или серонегативный хронический полиартрит, более предпочтительно это заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ лечения острого или хронического воспалительного заболевания, который включает введение пациенту, который нуждается в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), которое определено выше, или фармацевтической композиции, содержащей его.

Термин «лечение» или «лечить» в контексте описания этого изобретения означает введение соединения с составом в соответствии с изобретением для предотвращения, частичного снятия симптомов или устранения заболевания или одного или более симптомов, сопутствующих упомянутому заболеванию. «Лечение» также включает предотвращение, частичное снятие симптомов или устранение физиологических последствий заболевания.

Термин «частично снимать симптомы» в контексте этого изобретения, как понимают, означает любое улучшение ситуации подвергнутого лечению пациента - как по субъективной оценке (ощущения или что-либо похожее на ощущения пациента), так и по объективной оценке (измеренные параметры).

Другой аспект изобретения относится к применению соединения формулы (I), которое определено выше как биомаркер для визуализации в технологиях получения визуализации и фармаковизуализации, для обнаружения иммунологических очагов повреждения, клеток-мишеней и молекул-мишеней.

Технология фармаковизуализации расширяет возможности биомаркеров, получаемые с помощью быстро растущего комбинирования соответствующих предклинических (молекулярное, целлюлярное, органное и относящееся к целому животному отслеживание и исследование подтверждения концепции и механизмов, оценка эффективности, и т.д.) и клинических (манипуляции, относящиеся к консервативному лечению) технологий визуализации in vivo, в дополнение к тем ценным информационным данным, вырабатываемым соединениями, описанными в этом документе и используемыми в качестве лекарственных препаратов.

Настоящее изобретение дополнительно разъясняют ниже посредством примеров. Это разъяснение не должно быть никоим образом интерпретировано как ограничение объема изобретения, поскольку он определен в пунктах формулы.

Примеры

Синтез

Пример 1. Синтез метилового сложного эфира (4-метилтиофенил)уксусной кислоты

1,82 г (10 ммоль) 4-метилтиофенилуксусной кислоты растворяют в 30 мл диметилформамида (DMF), и затем добавляют 1,34 г (16 ммоль) NaHCO₃; взбалтываемую смесь перемешивают в течение приблизительно 15 минут. Далее, добавляют 1,9 мл ICH₃ при поддерживании взбалтывания при комнатной температуре в течение 24 часов. По истечении этого времени смесь выливают на воду/лед. В тот момент, когда осаждение не происходит, добавляют простой эфир и экстрагируют. Органическую фазу промывают водой и после сушки над ангидридом сульфата натрия органическую фазу концентрируют в роторном испарителе, получая 1,92 г (9,7 ммоль. выход 97%) бесцветного масла, для которого спектроскопические данные подтверждают ожидаемую структуру. Этот продукт будет использован в следующей стадии способа синтеза без очистки, так как он дает единственное пятно в анализе методом тонкослойной хроматографии (TLC) (элюирование смесью дихлорметан/метанол 9/1).

¹Н ЯМР (CDCl₃): 7,2 (с, 4Н), 3,7 (с, 3Н), 3,5 (с, 2Н), 2,4 (с, 3Н CH₃S).

¹³С ЯМР (CDCl₃): 171,5, 136,9, 130,4, 129,4, 126,4, 51,6, 40,2, 15,5.

Пример 2. Синтез метилового сложного эфира (4-метилсульфонилфенил)уксусной кислоты

Раствор оксона 30,7 г (50 ммоль) в 80 мл воды добавляют по каплям к раствору 3,4 г (17,3 ммоль) соединения, полученного в примере 1, в 100 мл метанола, поддерживая реакцию на водно/ледяной бане. Сразу же после добавления взбалтывание продолжается в течение 5 часов с обеспечением достижения температуры комнатного уровня. Затем часть растворителя концентрируют при пониженном давлении и осажденное твердое вещество фильтруют с промыванием водой с повтором. После сушки это твердое вещество весит 3 г. Водную фазу после фильтрации экстрагируют дихлорметаном, органическую фазу промывают водой, сушат над ангидридом сульфата натрия и концентрируют в роторном испарителе с получением на 1 г больше продукта, чем ожидали, а именно 4 г на выходе (17 ммоль, 100%-й выход). Это твердое вещество плавится с разложением при 57°С, и его чистота составляет 99% по методу высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Спектроскопические данные подтверждают ожидаемую структуру:

¹Н ЯМР (CDCl₃): 7,9 (д, 2Н), 7,5 (д, 2Н), 3,7 (с,с 3+2Н), 3,1 (с, 3Н).

¹³С ЯМР (CDCl₃): 170,80, 140,13, 139, 130,33, 127,63, 52,31, 44,49, 40,82.

Пример 3. Синтез метилового сложного эфира бром-(4-метилсульфонилфенил)уксусной кислоты

20 г (87,62 ммоль) сложного эфира растворяют в 300 мл тетрахлорида углерода; затем порциями добавляют 19 г (105 ммоль) N-бромсукцинимида, 2 г (12,18 ммоль) азобисизобутиронитрила и 0,1 мл брома. Реакционную смесь греют при 80°С в течение 3 часов и затем охлаждают, отфильтровывают и промывают дихлорметаном. Фильтрат промывают водой и затем соляным раствором. Раствор сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют в вакууме, что дает 28 г масла, которое очищают флэш-хроматографией с использованием смеси гептан/этилацетат (1/1) в качестве элюента. Концентрирование более чистых фракций дает 19,63 г (72,94% выхода) бромпроизводного соединения.

Температура плавления (mp): 81,8-83,3°С.

¹Н ЯМР (CDCl₃), δ: 7,9 (д, 2Н), 7,75 (д, 2Н), 5,4 (с, 1Н), 3,8 (с, 3Н), 3,1 (с, 3Н).

¹³С ЯМР (CDCl₃), δ: 168,0 (С); 141,6 (С), 141,1 (С); 129,8 (СН); 127,8 (СН); 53,7 (СН); 44,7 (СН₃) и 44,2 (СН₃) м.д.

Пример 4. Синтез 2-метил-5-(4-метилсульфонилфенил)тиазол-4-ола

16,7 г (54,3 ммоль) сложного эфира, полученного в примере 3, растворяют в 400 мл толуола, затем добавляют 19 мл пиридина и 4,08 г (54,34 ммоль) тиоамида. Реакционную смесь греют при 80°С (температура бани) при взбалтывании в течение 2 часов. Далее смесь оставляют охлаждаться и осажденное твердое вещество отфильтровывают, промывают водой (2×50 мл) и затем простым эфиром (2×30 мл). Продукт сушат в вакууме, что дает 7 г (26 ммоль, выход 47,86%) твердого вещества в виде мази/крема, плавящегося при 216-226°С.

Спектроскопические данные подтверждают структуру ожидаемого продукта.

¹Н ЯМР (ДМСО-d₆), δ: 11,8 (с, 1Н), 7,8 (м, 4Н), 3,1 (с, 3Н), 2,6 (с, 3Н) м.д.

¹³С ЯМР (ДМСО-d₆): 162,9 (С); 159,4 (С), 146,2 (С); 143,0 (C); 128,0 (СН); 126,1 (СН); 104,4 (С); 44,2 (СН₃); 19,9 (СН₃) м.д.

Пример 5. Синтез 4-циклопентилокси-5-(4-метилсульфонилфенил)-2-метилтиазола

7,0 г (26 ммоль) гидрокситиазола, полученного в примере 4, и 8,8 г (63,67 ммоль) карбоната калия растворяют в 200 мл диметилформамида. Циклопентилбромид 14 мл (130 ммоль), добавляют по каплям. Реакционную смесь греют при 80°С в течение 3 часов и затем охлаждают, выливают на смесь лед/вода и экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают водой (3×100 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, что дает 12 г сырого материала, который кристаллизуют из смеси гептан/простой эфир (1/1). Очищение продукта методом флэш-хроматографии с использованием смеси гептан/этилацетат (2/1) в качестве элюента дает 6,7 г (19,85 ммоль, 76,39% выхода) соединения 12.

Температура плавления: 124,6-125,2°С.

¹Н ЯМР (CDCl₃), δ: 7,9 (дд, 4Н), 5,4 (м, 1Н), 3,0 (с, 3Н), 2,6 (с, 3Н), 1,7-2,0 (м, 8Н) м.д.

¹³С ЯМР (CDCl₃), δ: 162,6 (С); 159,5 (С), 138,3 (С); 137,1 (С); 128,1 (СН); 126,8 (СН); 109,1 (С); 83,7 (СН); 45,0 (СН3); 33,5 (СН₂); 24,1 (СН₂); 20,4 (СН₃) м.д.

Биологические пробы

Материалы и способы

1. Субъекты

Исследование проводят на гепаринизированной периферической крови, полученной посредством пункции из вены у здоровых волонтеров и у пациентов с ревматоидным артритом.

Здоровые волонтеры являются донорами крови в условиях текущего контроля в рамках больничной практики.

Пациенты с ревматоидным артритом, включенные в это исследование, соответствуют диагностическим критериям Американского Колледжа Ревматологии и показывают клинически активное заболевание к моменту времени визита-включения, будучи подвергнутыми лечению в течение по меньшей мере 6 месяцев посредством 20 мг/неделя орально Methrotexate. Степень активности заболевания определяют, как изложено ниже: а) индекс активности заболевания по шкале DAS28≥3,2 и/или b) 6 или более набухших суставов и 6 или более болезненных суставов. В качестве критериев невключения рассматривают следующее: а) страдать от активных инфекционных заболеваний на момент визита-включения; b) страдать от онкологических заболеваний перед включением; с) страдать от другого системного или органоспецифического аутоиммунного заболевания, которое не вступило в стадию полной ремиссии по меньшей мере за один год до визита-включения; d) страдать от серьезного состояния почек, сердца или печени, не связанного с изменениями на тех уровнях, вызываемыми ревматоидным артритом как основным заболеванием; е) страдать серьезным ухудшением общего статуса вследствие состояния, не связанного с основным заболеванием; f) получить лечение кортикостероидами, иммунодепрессантами, цитостатическими или любыми другими лекарственными средствами с известной активностью в отношении иммунной системы в течение года до визита-включения за исключением упомянутых доз Methrotexate; 7) быть беременной или в состоянии послеродового периода в момент визита-включения.

Исследование одобрено Комитетом по Исследованиям Университета Алкала, Мадрид, Испания.

2. Материалы

- Планшеты для выращивания культуры ткани, 96-луночные плоскодонные с крышкой для низкого испарения образца, (353073 Falcon, Becton Dickinson Labware, Franlklin Lakes, 07417-1886, NJ, USA).

- Нестерильные планшеты, 96-луночные с V-образным дном (Greiner, Soria Greiner, Madrid, España).

- Одноразовые пипетки Пастера (Brand, Alemania).

- Пипетки серии Pipetman Р переменного объема на 20, 200, 1000 и 5000 мкл (Gilson, Francia).

- Мультипипетка Eppendorf 4780 (Hamburg, Germany).

- Стерильные наконечники Eppendorf (Hamburg, Germany).

- Стерильные наконечники из чистого пропилена (Daslab, Madrid, Spain).

- Стерильные пластиковые пробирки на 5 и 10 мл (Daslab, Madrid, Spain).

- Стерильные центрифужные пробирки на 15 и 50 мл (BD Falcon, Franklin Lakes, USA).

- Полистирольные пробирки на 5 мл для цитометра (устройства для подсчета клеток) (BD Falcon, Franklin Lakes, USA).

- Пробирки с гепарином на 10 мл для забора крови (Venojet, Terumo Europe, Belgium).

- Пробирки на 10 мл для забора плазмы крови (BD Vacutainer, Plymouth, UK).

- Устройство для заполнения пипеток, плюс пробоотборное устройство Pipetboy (Flow Lab., Germany).

- Стерильные фильтры 22 мкм Millex-GS (Millipore, Molshein, France).

- Хрустальное покровное стекло (Hirschman, Germany).

- Счетная камера Neubauer (Saaringia, Germany).

- Бокс с вертикальным ламинарным потоком Herasafe HS12 (Heraeus, Germany).

- Печь-инкубатор для клеточных культур с регулированием подачи СО₂ Heracell 150 (Heraeus, Germany).

- Охлаждаемая центрифуга Beckman. Multifuge 3SR (Heraeus, Germany).

- Морозильная камера -70°С (Selecta, Tarrasa, Spain).

- Микроскоп Olympus CHS-2 (Olympus, Tokyo, Japan).

- Проточный цитометр, представляющий собой многопараметровую систему, FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View USA), с программным обеспечением и анализатором BD Cellquest Pro v.5.5.1.

- Проточный цитофлуориметр-биоанализатор BD FACS Array.

- Счетчик для ферментного иммуноанализа (Titertek Multiscan Plus, Flow laboratories).

- Счетчик для определения активности бета-излучения Beckman.

3. Реагенты, использованные в разделении и идентификации клеточных субпопуляций

- Сыворотка Apiroserum в физиологическом растворе хлорида натрия (SSF) (Ibys, Madrid, Spain).

- Препарат Lymphoprep (Ficoll-Hypaque, Nyegaard Co, Oslo, Norway).

- Краситель Трипановый Синий Blue Trypan (Flucke AG., Buchs SG., Germany).

- Жидкость для цитометра FACS FLOW на основе фосфатом забуференного физиологического раствора (Becton Dickinson).

- Буферный раствор HEPES (Reactivos de Sigma y Panreac).

- Метил-³Н тимидин (³[H]-Т). Специфическая активность 60 Ки/ммоль (American Radiochemicals, ITISA, Madrid, Spain).

- Моноклональные антитела, используемые в исследовании методами иммунофлуоресценции и проточной цитометрии:

Таблица 1 Моноклональные антитела, используемые в исследовании CD* Ac Mo Клеточная субпопуляция Субкласс Флуорохром 62L SK11 Лейкоциты. L-Selectin IgG2a Фикоэритрин (PE) *Определено в «7th Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens»

4. Реагенты, используемые для культивирования клеточных культур

- Полная среда, изготовленная на основе среды RPMI-1640 (Cambrex BioSciences B4800 Verviers, Belgium), дополненной 1% 200 мМ раствора L-глутамина и 25 мМ буферного раствора Hepes (Flow Lab., Irvine, California, USA).

- Фетальная бычья сыворотка (FCS) (Gibco, Grand Island, NY, USA).

- Культуральная среда: используют полную среду путем добавления 10% FCS. Комплемент удаляют из всей сыворотки путем нагревания до 57°C в течение 45 минут.

- Фитогемагглютинин М (PHA) (Sigma Ref#L-8902, Lot#115K4132, Sigma, Madrid, Spain).

- LPS (липополисахарид) (клетки E. coli 0111: штамм B4, InvivoGene, San Diego CA92121, USA).

- Смесь антибиотиков. Смесь ампициллина натрия 10 мг/мл (Britapen, Beecham A., Toledo, Spain), сульфата гентамицина 1,6 мг/мл (Tamadit Lab., Dr. Esteve SA., Madrid, Spain) и амфотерицина В 0,5 мкг/мл (Fungizona, Squibb, Esplugues, Barcelona, Spain) добавляют в культуральную среду.

- Анти-CD3 моноклональное антитело (Orthoclone OKT3, Orthopharmaceutical Corporation, Raritan, NJ, USA).

- Анти-CD28 моноклональное антитело (Clon 15E8, Menarini, Madrid, Spain).

5. Получение биологических образцов

a) Венозная кровь: Мононуклеарные клетки получают из венозной крови, которую собирают посредством пункции из вены, находящейся спереди от локтевого сустава. Забирают пятьдесят мл крови и хранят в пробирках с литий-гепарином (антикоагулянт) (Venojet), дополнительно разбавляют физиологическим раствором 1/1 (об./об.), где все манипуляции выполняют в стерильных условиях.

b) Сбор субпопуляций клеток человека. Для выделения PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови) оставшиеся компоненты крови разделяют посредством градиента плотности Ficoll. Этот способ основан на различиях плотности клеток крови. В 50-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую разбавленную и гепаринизированную кровь, осторожно помещают 15 мл буферного раствора Ficoll-Hipaque (плотность 1,077 г/мл). После 45 минут центрифугирования (400×g) получают три слоя (эритроциты, Ficoll и плазма), разделенные двумя поверхностями раздела: PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови) содержатся в слое, размещенном между разбавленной плазмой и Ficoll. Он может быть собран путем отсасывания посредством пипетки Пастера. Клетки, таким образом полученные, повторно суспендируют в простом физиологическом растворе хлорида натрия (SSF) и центрифугируют (300×g в течение 10 минут); супернатант отбрасывают (процесс промывания) и клеточный пеллет повторно суспендируют в среде RPMI-1640, дополненной 10% PBS.

6. Определение количества клеток и изучение жизнеспособности

Во всех суспензиях клеток концентрацию клеток и их жизнеспособности определяют с использованием красителя Blue Trypan, разведенного до 0,1%, и путем подсчета клеток под микроскопом с использованием камеры с сеткой Нейбауэра. Процентное содержание живых клеток устанавливают по способности исключать окрашивание. Эксперимент продолжают только тогда, когда жизнеспособность клеток составляет выше 95%.

7. Количественное определение цитокинов в сыворотке с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)

Для того чтобы количественно оценить концентрацию цитокинов в сыворотке, забираемую кровь хранят в пробирках как с антикоагулянтом, так и без такового (сбор осуществляют посредством пункции из вены, находящейся спереди от локтевого сустава, соответственно). Кровь оставляют коагулировать при комнатной температуре в лаборатории, с дополнительным разделением сыворотки центрифугированием (600×g в течение 20 минут). Супернатант собирают, фильтруют, делят на аликвоты и хранят при -70°С. Анализ концентраций для различных цитокинов выполняют посредством использования серийно выпускаемых наборов, описанных в Таблице 2.

Таблица 2 Серийно выпускаемые наборы для ELISA, используемые в этом исследовании Цитокин Чувствительность метода при количественной оценке в супернатантах (пг/мл) Единица измерения массы белков (РМ) (кДа) Компания TNF-альфа 3,83 пг/мл 17 Bender

Супернатанты размораживают до комнатной температуры и наносят на соответствующий антицитокин путем фиксирования их на дне планшета и путем инкубирования их в течение различного времени. Впоследствии выполняют промывки, и добавляют вещества, рекомендованные соответствующей компанией, для того, чтобы сделать возможным протекание колориметрической реакции, пропорционально количеству цитокина, присутствующего в супернатанте. Результаты анализируют с помощью ридера для ферментного иммуноанализа Multititer Plus (Tiertec Multiscan Plus, Flow Laboratories). Эти результаты сравнивают со стандартной кривой, полученной для известных концентраций каждого цитокина, который предоставлен компанией.

Анализ стандартных кривых и последующую интерполяцию выполняют с помощью версии 4.1 (Biometallics, Inc.) программного обеспечения Delta Soft II на компьютере Macintosh Apple. Концентрации цитокинов переводят в молярные для того, чтобы вычислить молекулярные соотношения в каждом случае и число растворимых молекул.

8. Анализ иммунофенотипа

Используют метод прямой иммунофлуоресценции одного цвета посредством моноклональных антител, меченных фикоэритрином (PE). Фикоэритрин представляет флуоресцентное вещество, возбуждаемое лазерным лучем на длине волны 488 нм, где длина волны испускания лазерного луча составляет 570 нм, и оно является детектируемым и легко различимым с помощью проточного цитометра. Посредством использования антитела, описанного в Таблице 1, проводят прямое мечение: мечение PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови): процесс заключается в мечении с использованием 96-луночных планшетов с V-образным дном лунок. В каждую лунку помещают 5×10⁴ клеток и после этого их подвергают центрифугированию при 400×g в течение 5 минут. После промывания клетки повторно суспендируют и добавляют 5 мкл соответствующего моноклонального антитела. Клетки вновь повторно суспендируют и планшет инкубируют в темноте в течение 20 минут при 4°С. Впоследствии добавляют 150 мкл PBS и проводят две промывки. В итоге проводят повторное суспендирование в 150 мкл PBS и собирают клетки в пробирку цитометра, с добавлением PBS для доведения конечного объема до 0,3 мл.

Для подсчета проточный цитометр FACSCalibur, оснащенный аргоновым лазером, настроенным на 488 нм, используют для того, чтобы инициировать флуоресценцию фикоэритрина. Оборудование наряду с флуоресцентными каналами также обеспечивает информацию о размере (FSC = параметры прямого светорассеяния) и о клеточном разнообразии (SSC = параметры бокового светорассеяния).

В качестве негативного контроля используют исследование клеток без мечения и клеток, иначе и иррелевантно меченных моноклональными антителами аналогичных изотипов, в сравнении с клетками, используемыми в исследовании (IgG1-FITC PE и TC, IgG2a-FITC, PE, TC).

9. Клеточные культуры и функциональные исследования

Общие условия для культуры клеток: все клеточные культуры делают в стерильных условиях в камере с вертикальным ламинарным потоком с использованием либо стерильных одноразовых материалов, либо материалов, стерилизуемых этиленоксидом или в приборе-стерилизаторе. Культуры поддерживают в печи-инкубаторе при 37°С в условиях 5% СО₂ и 95%-й относительной влажности.

10. Исследование пролиферации посредством ³[H]-тимидина

Подвергнутые стимуляции митогенами лимфоциты испытывают бластогенез и процесс клеточной дифференцировки. Способ, используемый для количественной оценки клеточной пролиферации представляет собой анализ инкорпорации ³[H]-тимидина в ДНК, de novo-синтезированную, и испускание бета-излучения из высушенных экстрактов клеточных культур (к которым добавлено меченное тритием основание) детектируют до тех пор, пока оно не завершится и до сбора клеток из культуры. В различных экспериментах, выполненных для изучения пролиферации, очищенные клеточные препараты инкубируют в 96-луночных плоскодонных микропланшетах при концентрациях 5×10⁴ клеток/лунка (конечный объем 200 мкл) в присутствии различных концентраций разнообразных митогенов с трехкратным повторением проведения эксперимента и на протяжении 4 дней культивирования.

Реакция на специфический стимул зависит от плотности и от изучаемого типа клеток, а также от продолжительности культивирования и от концентрации митогенного вещества.

За двадцать - двадцать четыре часа до завершения культивирования клеток, в каждую лунку добавляют 1 микроКи ³[Н]-тимидина; культуры клеток собирают путем отсасывания через стеклянный фильтр с использованием сборщика культуры специфических клеток.

Синтез ДНК выражают в числах импульсов в минуту (с.p.m.). Каждый анализ выполняют с трехкратным повторением проведения эксперимента, с отбрасыванием тех данных, которые различаются больше, чем на 10% от усредненной по трем значениям величины, поскольку они могут указывать на техническую ошибку или на загрязнение/примесь в культуре клеток. Культивирования проводят с постоянным количеством клеток в лунке, а также с постоянным объемом, равным 200 мкл. Все митогены и цитокины сначала испытывают путем получения кривых зависимости «доза-реакция» и зависимости «время-реакция».

11. Анализ для аналитического определения посредством количественной многопараметровой проточной цитометрии (BD™ Cytometric Bead Array (CBA-анализ с помощью Системы для определения цитокинов и других аналитов в биологических жидкостях))

Протокол СВА-анализа осуществляют, следуя в соответствии с инструкциями производителя. Отбор микрочастиц проводят, следуя краткому изложению на фиг.1. В конце концов отбирают те микрочастицы, которые показывают небольшой риск перекрывания спектров.

Номер по каталогу и экспериментальная серия для каждого реагента, используемого для этой экспериментальной разработки, показаны в Таблицах 3 и 4. Получение данных по пробам проводят с помощью Системы Биоанализатора BD FACS Array (FACSArray, Becton Dickinson, San José, CA, USA), и анализ результатов выполняют с помощью программного обеспечения FCAP Array (Becton Dickinson) на компьютере PC.

Кратко, экспериментальный протокол состоит из предварительной промывки планшета посредством буферного раствора для промывки Wash Buffer. После декантации смесь микрочастиц-ловушек повторно суспендируют в вихревой мешалке. Стандарты и пробы добавляют в адекватном разбавлении. После инкубирования при постоянном перемешивании в течение 1 часа добавляют реагент для детектирования РЕ и инкубируют повторно в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывки сбор данных осуществляют на проточном цитометре.

Таблица 3 Система c использованием мультиплексных технологий Multiplex Flex Set анализа растворимых белков человека посредством набора реагентов для CBA-анализа Реагент Номер по каталогу Экспериментальная серия   Набор исходных буферных растворов (на 500 тестов) 558265 95098   Раствор для разведения 51-90003992 86192   Раствор для разведения гранул-ловушек 51-90003804 90262   Раствор для разведения реагента для детектирования 51-90003993 95811   Буферный раствор для промывки 51-90003798 85964   Гранула А1 для установки прибора 51-90003855 87987   Гранула А9 для установки прибора 51-90003858 95933   Гранула F1 для установки прибора 51-90003851 89231   Гранула F9 для установки прибора 51-90003854 94229   Гранула F1 для установки прибора с использованием РЕ 51-9005038 94498   PE-детектор позитивного контроля 51-9005065 92154   Наборы реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set     Чувствительность IL-8 (A9) 558277 85109 1,2 пг/мл IL-10 (В7) 558274 97196 0,13 пг/мл TNF-α (D9) 558273 85106 0,7 пг/мл INF-γ (E7) 558269 81562 1,8 пг/мл

Таблица 4 Экспериментальные серии реагентов, включенные в разработку набора реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set Реагент Стандарт Микрочастицы-ловушки Флуоресцентный реагент (РЕ) IL-8 (A9) 84854 87670 77948 IL-10 (B7) 70333 96280 95934 TNF-α (D9) 65908 87667 77264 IFN-γ (E7) 80390 87664 77136

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Результаты экспериментальных испытаний представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего и ошибок при оценке среднего, в соответствии с типом распределения.

Для статистического анализа, характер распределений в первую очередь анализируют с использованием сопоставления с критерием нормальности Shapiro-Whilk. Непараметрическое сопоставление по критерию Mann-Whitney U используют для выполнения сравнений. Во всех случаях оценивают уровни значимости менее, чем 5% (р<0,05).

Статистический анализ выполняют с помощью программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS Inc. Hadquarters, 233 S. Wacker Drive, 11^th floor. Chicago, Illinois 60606).

Результаты исследований иммуномодулирующих эффектов соединения 12

Иммуномодулирующие эффекты соединения 12 в отношении продуцирования TNF-альфа, IFN-гамма и других цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) у здоровых волонтеров и пациентов с ревматоидным артритом

Пример 6. Эффекты соединения 12 в отношении продуцирования TNF-альфа

Сначала исследуют эффекты соединения 12 в отношении продуцирования TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) здоровых волонтеров в присутствии или в отсутствие липополисахарида (LPS). PBMC (5×10⁴ клеток/лунка, 200 мкл) от 10 здоровых волонтеров культивируют одновременно в двух экспериментах в планшетах для выращивания тканевой культуры, 96-луночных, плоскодонных с крышкой для низкого испарения (353072 Falcon, Becton Dickinson labware, Franklin Lakes, USA; 07417-1886 NJ) в полной среде (среда RPMI-1640 c глутамином Cat BE-12-70F, Cambrex Biosciences, B4880 Verviers, Belgium), дополненной фетальной бычьей сывороткой (origin USA, Gibco ref. 26140-079) и растворителем как таковым с концентрацией 10^-6 М или дополненной соединением 12 с концентрацией 10^-6 или 10^-7 М, в присутствии и в отсутствие LPS (10 микрог/мл; Е. coli LPS 0111:штамм В4 InvivoGene, San Diego CA92121 USA) в течение 24 часов. Супернатант культур замораживают при -20°С, и концентрацию TNF-альфа количественно оценивают с помощью видоспецифического ELISA-теста (твердофазный иммуноферментный анализ для количественного определения альфа-фактора некроза опухоли: анализ для количественного определения TNF-альфа человека ELISA BM S223/4TEUCE, Bender Med System Inc., Burlinghane CA 94010).

Фиг.2 показывает, что наличие соединения 12 в культуре, в концентрациях 10^-6 и 10^-7 М снижает статистически значимым образом концентрацию TNF-альфа, которую количественно определяют в супернатанте культуры стимулированных липополисахаридом моноклональных клеток периферической крови (р<0,05). Кроме того, соединение 12, при концентрации 10^-6 М также уменьшает спонтанное продуцирование TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови.

Таблица 5 Продуцирование TNF-альфа здоровыми волонтерами. Результаты указаны в виде значений медианы ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=10 Продуцирование TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М Питательная среда 1118,00±800,00 551,60±324,17 (0,009) 1121,00±100,48 (0,114) Липополисахарид (10 мкг/мл) 3084,63±450,00 1064,91±52,82 (0,005) 1938,00±487,74 (0,028)

Иммуномодулирующие эффекты соединения 12 дополнительно охарактеризовывают по продуцированию панели цитокинов моноклональными клетками периферической крови либо после стимуляции моноцитов любым липополисахаридом, либо после активации лимфоцитов комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. Это исследование проводят в присутствии или в отсутствие титрованных доз соединения 12 в культурах моноклональных клеток периферической крови, полученной от здоровых волонтеров и от пациентов с ревматоидным артритом.

Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клетки/лунка) от 13 здоровых волонтеров культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией растворителя (10^-6 М), или соединением 12 с концентрацией 10^-6 М или 10^-7 М, в присутствии и в отсутствие липополисахарида (LPS) (10 мкг/мл) в течение 24 часов. Супернатант культур замораживают при -20°С и проводят количественное определение с помощью биоанализатора BD FACS Array (проточный цитофлуориметр) (BD Biosciences Cat No. 340128, San Diego CA 92121) с использованием специфических реагентов для одновременного анализа концентрации указанных цитокинов (CBA Flex Multiplex Set (BD™ Cytometric Bead Array, CBA: IL-8, IL-10, TNF-альфа и IFN-гамма) Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Diego CA 92121).

Присутствие соединения 12 в культуре, в концентрациях 10^-6 и 10^-7 М снижает продуцирование TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови здоровых волонтеров, стимулированное липополисахаридами, статистически значимым образом (р<0,05) (фиг.3). В противоположность этому, ни секреция TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови, стимулированная анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами, ни спонтанная секреция TNF-альфа (которая наблюдается в отсутствие экзогенного стимула) не подвергается модифицированию посредством соединения 12.

Таблица 6 Продуцирование TNF-альфа у здоровых волонтеров. Результаты указаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=13 Продуцирование TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 163,84 ± 30,00 148,31 ± 50,00 (0,422) 197,81 ± 40,00 (0,249) 168,49 ± 16,00 (0,65) Липополисахарид (10 мкг/мл) 923,93 ± 160,00 602,12 ± 100,00 (0,002) 746,84 ± 125,00 (0,046) 738,81 ± 100,00 (0,055) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 435,81 ± 60,00 334,21 ± 63,00 (0,116) 404,11 ± 97,00 (0,753) 355,62 ± 65,00 (0,422)

В другом эксперименте моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 7 пациентов с ревматоидным артритом культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) (Orthoclon OKT3, Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan NJ, USA) + анти-CD28 (1/3×10⁵) (Clon 15E8, Menarini, Madrid, Spain) моноклональных антител, в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°C и определяют количество, а именно концентрацию TNF-альфа, с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием набора реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации того цитокина, следуя инструкциям производителя.

В стимулированных липополисахаридом моноклональных клетках периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом продуцирование TNF-альфа значительно ингибируется соединением 12 при концентрации 10^-6 М (р<0,05) (фиг.4). Присутствие соединения 12 в культуре не ингибирует ни спонтанное продуцирование TNF-альфа, ни продуцирование TNF-альфа, получаемое после стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами, в моноклональных клетках периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом.

Таблица 7 Продуцирование TNF-альфа у пациентов с ревматоидным артритом. Результаты указаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=7 Продуцирование TNF-альфа моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 M 10^-7 M 10^-8 M Питательная среда 100,64 ± 40,00 177,32 ± 95,00 (0,735) 191,33 ± 80,00 (0,735) 131,95 ± 85,00 (0,735) Липополисахарид (10 мкг/мл) 700,39 ± 180,00 383,75 ± 75,00 (0,05) 626,57 ± 150,00 (0,237) 683,40 ± 120,00 (0,499) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 648,72 ± 90,00 532,07 ± 80,00 (0,31) 568,47 ± 97,00 (0,612) 695,81 ± 79,00 (0,398)

Пример 7. Эффект соединения 12 в отношении продуцирования IFN-гамма

Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 13 здоровых волонтеров культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°С, и определяют концентрацию IFN-гамма с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием наборов реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации IFN-гамма, следуя инструкциям производителя.

Соединение 12 при концентрации 10^-6 М значительно ингибирует продуцирование IFN-гамма в моноклональных клетках периферической крови от здоровых волонтеров, либо стимулированное липополисахаридом, либо стимулированное анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (р<0,05) (фиг.5).

Таблица 8 Продуцирование IFN-гамма здоровыми волонтерами. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=13 Продуцирование IFN-гамма моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 M 10^-7 M 10^-8 M Питательная среда 283,78 ± 90,00 189,72 ± 40,00 (0,279) 296,28 ± 90,00 (0,807) 279,16 ± 60,00 (0,807) Липополисахарид (10 мкг/мл) 860,42 ± 105,00 649,61 ± 120,00 (0,011) 919,53 ± 130,00 (0,552) 1049,85 ± 230,00 (0,382) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 11802,22 ± 1300,00 7927,17 ± 1003,00 (0,019) 11552,08 ± 1600,00 (0,917) 10254,66 ± 1500,00 (0,196)

Спонтанная секреция IFN-гамма моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров не изменяется под действием соединения 12.

Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°C и оценивают концентрацию IFN-гамма с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием наборов реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации IFN-гамма, следуя инструкциям производителя.

Присутствие соединения 12 в концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М значительно снижает продуцирование IFN-гамма моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом при индуцировании стимуляцией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (р<0,05) (фиг.6). Соединение 12 не изменяет ни спонтанную секрецию IFN-гамма, ни индуцированную липополисахаридами секрецию IFN-гамма моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров.

Таблица 9 Продуцирование IFN-гамма пациентами с ревматоидным артритом. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=8 Продуцирование IFN-гамма моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 M 10^-7 M 10^-8 M Питательная среда 145,49 ± 28,00 193,68 ± 45,00 (0,779) 203,72 ± 50,00 (0,208) 235,10 ± 60,00 (0,674) Липополисахарид (10 мкг/мл) 461,14 ± 85,00 205,26 ± 46,00 (0,484) 146,50 ± 33,00 (0,208) 248,73 ± 35,00 (0,889) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 8406,18 ± 1000,00 5115,27 ± 600,00 (0,05) 6411,71 ± 700,00 (0,05) 7122,07 ± 950 (0,017)

Пример 8. Эффекты соединения 12 в отношении продуцирования интерлейкина 8 (IL-8)

Эффект соединения 12 в отношении продуцирования IL-8 моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров дополнительно исследуют, как в присутствии, так и в отсутствие стимуляции липополисахаридом и анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 13 здоровых волонтеров культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие, либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°C и оценивают концентрацию IL-8 с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием наборов реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации IL-8, следуя инструкциям производителя.

При концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М соединение 12 значительно ингибирует спонтанное продуцирование IL-8 (р<0,05) (фиг.7). Значительное ингибирование продуцирования IL-8, индуцированного анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами, наблюдают при действии соединения 12 в концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М. Тем не менее, никаких эффектов в отношении продуцирования IL-8 не наблюдают под стимуляцией моноклональных клеток периферической крови липополисахаридом.

Таблица 10 Продуцирование IL-8 здоровыми волонтерами. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=13 Продуцирование IL-8 моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 72814,17 ± 10647,16 45634,31 ± 6311,13 (0,016) 53732,66 ± 7952,75 (0,006) 57773,60 ± 6667,57 (0,087) Липополисахарид (10 мкг/мл) 173877,36 ± 8474,49 168467,15 ± 9656,96 (0,807) 162075,59 ± 10258,41 (0,249) 169609,11 ± 9060,90 (0,861) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 107008,56 ± 8351,21 99779,72 ± 20000 (0,311) 97968,61 ± 10220,21 (0,055) 92989,29 ± 8463,47 (0,028)

Также исследуют эффект в отношении продуцирования IL-8 моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом. Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°С и оценивают концентрацию IL-8 с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием наборов реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set, специфичных для определения концентрации IL-8, следуя инструкциям производителя.

Присутствие соединения 12 в культуре в концентрациях 10^-6 М и 10^-8 М значительно модифицирует индуцированное липополисахаридом продуцирование IL-8 моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом, при этом не модифицирует ни спонтанное продуцирование IL-8, ни продуцирование IL-8, индуцированное комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител (фиг.8). В общей сложности результаты указывают на то, что модуляция IL-8 посредством соединения 12 могла бы интересным образом показать отчетливо различимые характеры модуляции при различных состояниях здоровья и определенных заболеваний.

Таблица 11 Продуцирование IL-8 пациентами с ревматоидным артритом. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=8 Продуцирование IL-8 моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 57877,64 ± 11143,52 98012,08 ± 8395,97 (0,208) 96498,50 ± 10784,62 (0,161) 93977,67 ± 9247,38 (0,123) Липополисахарид (10 мкг/мл) 150759,65 ± 22966,06 185536,78 ± 22000,00 (0,012) 174156,23 ± 13385,66 (0,208) 184541,37 ± 21500,00 (0,012) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 118017,97 ± 21116,00 124576,09 ± 14605,02 (0,263) 109607,00 ± 18310,15 (0,889) 121587,88 ± 16117,25 (0,575)

Пример 9. Эффекты соединения 12 в отношении продуцирования интерлейкина 10 (IL-10)

Эффекты соединения 12 в отношении продуцирования IL-10 моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров и пациентов с ревматоидным артритом исследуют при наличии и в отсутствие стимуляции липополисахаридом и комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. Моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 13 здоровых волонтеров культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 в концентрации 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов.

С другой стороны, моноклональные клетки периферической крови (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивируют в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой большой концентрацией (10^-6 М), и соединением 12 в концентрации 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживают при -20°С, и оценивают концентрацию IL-10 с помощью биоанализатора BD FACS Array с использованием наборов реагентов для CBA-анализа с использованием мультиплексных технологий Flex Set, специфичных для определения концентрации IL-10, следуя инструкциям производителя.

Соединение 12 не показывает никаких эффектов в отношении продуцирования IL-10 моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров при наличии и в отсутствие обоих изучаемых стимулов (фиг.9). Однако присутствие соединения 12 в культуре в концентрации 10^-8 М значительно модулирует в сторону увеличения продуцирование IL-10 после стимуляции моноклональных клеток периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом посредством липополисахарида (р<0,05). Соединение 12 не вызывает значительных эффектов ни в отношении спонтанного продуцирования IL-10, ни в отношении продуцирования IL-10 после стимуляции моноклональных клеток периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител (фиг.10).

Таблица 12 Продуцирование IL-10 здоровыми волонтерами. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Соответственные значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=13 Продуцирование IL-10 моноклональными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 490,46 ± 87,16 559,06 ± 112,20 (0,753) 609,10 ± 108,74 (0,701) 578,66 ± 106,20 (0,861) Липополисахарид (10 мкг/мл) 2342,20 ± 3 84,02 2420,68 ± 455,50 (0,507) 2392,99 ± 427,86 (0,507) 2389,63 ± 366,01 (0,701) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 1042,64 ± 162,36 1239,47 ± 251,24 (0,507) 1132,69 ± 213,32 (0,382) 1122,51 ± 211,03 (0,507)

Таблица 13 Продуцирование IL-10 пациентами с ревматоидным артритом. Результаты показаны в виде значений среднего ± стандартная ошибка для секретированного цитокина. Статистически значимые результаты указаны жирным шрифтом, где их соответствующие значения р (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия) заключены в скобки n=8 Продуцирование IL-10 моноклональными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 452,69 ± 107,47 682,50 ± 113,65 (0,674) 798,92 ± 144,46 (0,401) 468,14 ± 65,80 (0,263) Липополисахарид (10 мкг/мл) 2388,64 ± 300,00 2787,12 ± 416,91 (0,069) 2597,85 ± 513,19 (0,327) 3000,00 ± 400,00 (0,025) Анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 836,39 ± 189,09 976,96 ± 187,99 (0,484) 805,41 ± 141,23 (1,000) 872,06 ± 150,87 (0,674)

Другие эффекты соединения 12 в отношении клеток иммунной системы

Пример 10. Эффект соединения 12 в отношении пролиферативной реакции моноклональных клеток периферической крови (PBMC)

Эффект соединения 12 в отношении пролиферативной реакции моноклональных клеток периферической крови от здоровых волонтеров (n=8) исследуют при наличии и в отсутствие стимуляции фитогемагглютинином (PHA) (10 мкг/мл); фитогемагглютинином (2 мкг/мл), дополненным экзогенным IL-2 (25 МЕ/мл), и комбинацией анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1:320000) моноклональных антител.

Моноклональные клетки периферической крови культивируют в течение 4 дней (50000 клеток на лунку) при 37°C и в атмосфере 5% СО₂ (инкубатор для выращивания клеточной и тканевой культуры HERA Cell 150, Thermoscientific, Thermoelectron, 63505 Lagenselbold, GE) в полной культуральной среде. Условия для стимуляции культуры клеток представляют собой отсутствие или наличие фитогемагглютинина (PHA Sigma Ref#L-8902, Madrid, Spain) (10 мкг/мл); фитогемагглютинина (2 мкг/мл) с добавкой экзогенного IL-2 (25 МЕ/мл) (рекомбинантный IL-2 человека, Macrolin, Chiron Iberica, экспериментальная серия #SA753228/4, Madrid, Spain) и комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1:320000) моноклональных антител. В течение последних 8 часов культивирования добавляют метил-³Н-тимидин (метил-³Н-тимидин с активностью 60 Ки/моль American Radiochemical, ITISA, Madrid, Spain). Клетки собирают на стекловолоконные мембраны и помещают в сцинтилляционную среду (1450-441 Meltilex А, de Wallac Oy, Ref# 1450-441). Проводят количественное определение ДНК-инкорпорированной радиоактивной метки с использованием счетчика бета-частиц Wallac Oy. Для контроля за жизнеспособностью клеток в культурах клеток, проводят наблюдения через микроскоп (Zeiss Axiovert 40CFL, Karl Zeiss Microimagen GmbH, Göttingen, Germany) за плотностью и морфологией культур клеток в присутствии среды, без других сигналов, для того, чтобы обнаружить и количественно определить возможные митогенные действия изучаемых молекул непосредственно на моноклональные клетки периферической крови, и анализируют жизнеспособность клеток после инкубации.

Присутствие соединения 12 в культуре клеток незначительно модифицирует пролиферативную реакцию моноклональных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии разнообразных митогенных изучаемых стимулов (фиг.11а и 11b).

Пример 11. Эффект соединения 12 в отношении шеддинга («слущивания» с клетки и диффундирования из клетки в среду культивирования) CD62L в моноклональных клетках периферической крови

Исследуют эффект соединения 12 в отношении шеддинга CD62L в лимфоцитах и моноцитах моноклональных клеток периферической крови от здоровых волонтеров.

В присутствии соединения 12 в концентрации 10^-6 М, шеддинг CD62L (CD62L - фикоэритрин (PE), клон BD SK11 Cat No. 341012, BD Biosciences) значительно увеличивается (р<0,05). Следует отметить, что такое снижение среднего геометрического значения интенсивности флуоресценции (MFI) РЕ-метки CD62L-PE, детектируемой после шеддинга CD62L, селективно происходит в лимфоцитах, а в моноцитах не наблюдается значимой разницы (фиг.12a и 12b).

Таблица 14 Среднее геометрическое значение интенсивности флуоресценции экспрессии поверхностного CD62L в лимфоцитах. Значения р соответствуют данным относительно разбавителя для каждого экспериментального условия n=10 Лимфоциты
(Среднее + стандартная ошибка)/статистическая значимость   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М MFI (Среднее геометрическое интенсивности флуоресценции) (p) 112,68±13,57 90,01±8,93 (0,47) 116,90±11,02 (0,333)

Таблица 15 Среднее геометрическое значение интенсивности флуоресценции экспрессии поверхностного CD62L в моноцитах. Значения р соответствуют данным относительно разбавителя для каждого экспериментального условия n=10 Моноциты
(среднее + стандартная ошибка)/статистическая значимость   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М MFI (Среднее геометрическое интенсивности флуоресценции) (p) 65,34±8,06 63,90±8,52 (0,721) 72,30±10,21 (0,878)

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Характеристика соединений 1-18.

Соединение 1.

¹H-NMR (CDCl₃): 8.0 (m, 6H), 7.5 (m, 3Н), 5.2 (m, 1H), 3.1 (s, 3H), 2.1-1.2 (m, aprox. 14H).

¹³C-NMR (CDl₃): 162.5, 160.2, 137.8, 136.8, 133.2, 130.4, 128.9, 127.7, 126.6, 125.8, 109.5, 78.7,44.6, 32.1, 29.6, 25.5, 23.6.

Соединение 2.

¹H-NMR (CDCl₃): 8.0 (s, 6H), 7.5 (m, 3H), 4.6 (t, 2H), 3.1 (s, 3H), 1.9 (m, 2H), 1.1 (t, 3H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 162.43, 160.82, 137.64, 136.86, 133.13, 130.39, 128.90, 127.70, 126.56, 125.72, 70.69, 44.56, 31.52, 19.24, 13.82.

Соединение 3.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.9 (m, 4H), 5.5 (m, 1H), 3.2 (s, 3H), 3.0-2.9 (q, 2H), 2.0-1.6 (m, 8H), 1.4 (t, 3H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 168.8, 159.1, 138.0, 136.5, 127.6, 126.3, 108.2, 83.2, 44.5, 33.0, 27.5, 23.6, 13.5.

Соединение 4.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.9 (m, 4H), 4.5 (t, 2H), 3.1 (s, 3H), 2.7 (s, 3H), 1.8 (m, 2H), 1.5 (m, 2H), 1.0 (t, 3H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 162.1, 159.6, 137.7, 136.6, 127.6, 126.4, 107.6, 70.6, 44.5, 31.5, 19.9, 19.1, 13.7.

Соединение 5.

¹H-NMR (CDCl₃): 8.3 (m, 1H), 8.0 (s, 4H), 7.6-7.3 (m, 3H), 4.9 (dd, 1H), 4.5 (dd, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.1 (s, 3H), 2.9 (m, 1H), 2.8 (m, 1H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 158.94, 157.85, 137.65. 136.99, 131.77, 130.94, 130.63, 129.95, 127.84, 127.06, 111.38, 71.09, 50.01, 44.84, 44.59.

Соединение 6.

¹H-NMR (CDC₃): 7.9 (m, 4H), 4.1 (s, 3H), 3.1 (s, 3H), 2.9 (m, 1H), 2.2 (m, 1H), 1.8-1.2 (m, 8H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 172.94, 159.84, 137.94, 136.67, 127.69, 126.55, 106.79, 57.75, 44.63, 42.94, 33.16, 25.89, 25.71.

Соединение 7.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.9 (m, 4H), 4.8 (dd, 1H), 4.4 (dd, 1H), 3.4 (m, 1H), 3.0 (s, 3H), 2.9 (m, 1H), 2.8 (m, 1H), 2.7 (s, 3H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 165. 137.32, 137.15, 130.7, 127.79, 126.80, 108.50, 71.14, 50.05, 44.67, 44.60, 19.91.

Соединение 8.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.8 (s, 4H), 5.4 (m, 1H), 3.0 (s, 3H), 2.8 (m, 1H), 2.1-1.2 (m, aprox. 18H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 172.7, 159.0, 138.2, 136.4, 127.6, 126.3, 107.6, 83.0, 44.5, 42.8, 33.0, 25.8, 25.6, 23.6.

Соединение 9.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.9 (m, 4H), 4.8 (dd, 1H), 4.4 (dd, 1H), 3.5 (m, 1H), 3.1 (s, 3H), 2.9 (m, 2H), 2.8 (m, 1H), 2.2-1.2 (m, aprox. 10 H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 172.98, 158.4, 137.6, 137, 127.7, 126.7, 71.0, 50.0, 44.8, 44.5, 42.8, 33.0, 33.0, 25.8, 25.6.

Соединение 10.

¹H-NMR (CDCl₃): 7.9 (s, 4H), 5.5 (s, 1H), 3.2 (m, 1H), 3.0 (s, 3H), 1.9 (m, 9H), 1.4 (dd, 6H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 173.6, 159.1, 138.2, 136.5, 127.6, 126.3, 107.8, 83.1, 44.5, 33.6, 33.0, 23.7, 22.5.

Соединение 11.

¹H-NMR (CDCl₃): 11.8 (s, 1H) 7.8 (m, 4H) 3.1 (s, 3H) 2.6 (s, 3H) ppm.

¹³C-NMR (CDCl₃): 162.9 (С); 159.4 (С); 146.2 (С); 143.0 (С); 128.0 (СН); 126.1 (СН); 104.4 (С); 44.2 (СН₃); 19.9 (СН₃) ppm.

Соединение 12.

¹H-NMR (CDCl₃): .9 (dd, 4H), 5.4, (m, 1H), 3.0, (s, 3H), 2.6, (s, 3H), 1.7-2.0 (m, 8H) ppm.

¹³C-NMR (CDCl₃): 162.6 (С); 159.5 (С); 138.3 (С); 137.1 (С); 128.1 (СН); 126.8 (СН); 109.1 (С); 83.7 (СН); 45.0 (СН₃); 33.5 (СН₂); 24.1 (CH₂); 20.4 (СН₃) ppm.

Соединение 14.

¹H-NMR (CDCl₃): 1.6-2.1 (m, 8H); 3.1 (s, 3H); 5.5-5.6 (m, 1H); 7.4 (m, 1H): 7.8-7.9 (m, 4H); 8,1-8.3 (m, 1H); 8.6-8. ((m, 1H); 9.0-9.1 (m, 1H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 23.30, 32.71, 44.09, 83.31, 110.16, 126.90, 127.35, 127.58, 130.30, 130.35, 136.78, 146.14, 149.98, 158.15, and 160.17.

Соединение 15

¹H-NMR (CDCl₃): 1.6-2.1 (m, 8H); 3.1 (s, 3Н); 5.5-5.6 (m, 1H); 7.1 (dd, 1H): 7.4 (d, 1H); 7.5 (d, 1H);; 7.9 ((m, 4H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 23.32, 32.68, 44.14, 83.17, 125.94, 127.28, 127.60, 127.81, 136.35, and 159.50.

Соединение 16.

¹H-NMR (CDCl₃): 1.6-2.1 (m, 8H); 3.1 (s, 3Н); 5.5-5.7 (m, 1H); 7.4 (m, 1H): 7.4-7.5 (m, 3H); 7.8-8.0 (m, 6H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 23.81, 33.20, 44.61, 83.48, 109.53, 125.81, 126.55, 127.74, 128.94, 130.41, 133.27, 136.89, 137.81, and 160.41.

Соединение 17.

¹H-NMR (CDCl₃): 1.6-2.1 (m, 8H); 3.1 (s, 3Н); 5.5-5.6 (m, 1H); 7.3-7.5 (m, 3H); 7.9-8.0 (m, 4H); 8.3-8.4 (m, 1H).

¹³C-NMR (CDCl₃): 23.84, 33.22, 44.62, 83.32, 126.71, 127.06, 127.76, 130.12, 130.44, 130.90, 131.28, 131.78, 137.17, 137.69, 157.62 and 159.61.

Соединение 18.

¹H-NMR (CDCl₃): 1.6-2.1 (m, 8H); 3.1 (s, 3H); 5.5-5.7 (m, 1H); 7.3-7.4 (d, 2H); 7.8-8.0 (m, 6H).

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Результаты исследования иммунных модулирующих эффектов соединений 4, 5, 6, 9, 10, 12, 15, 16 и 17.

Иммунные модулирующие эффекты в отношении продуцирования TNF-альфа, IFN-гамма и других цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) у здоровых волонтеров пациентов с ревматоидным артритом.

Пример 6. Влияние соединений 5 и 12 на продуцирование TNF-альфа

Сначала исследовали влияние соединений 5 и 12 на продуцирование TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) здоровых волонтеров в присутствии или в отсутствие липополисахарида (LPS). РВМС (5×10⁴ клеток/лунка, 200 мкл) от здоровых волонтеров культивировали одновременно в двух экспериментах в планшетах для выращивания тканевой культуры, 96-луночных, плоскодонных с крышкой для низкого испарения (353072 Falcon, Becton Dickinson labware, Franklin Lakes, USA; 07417-1886 NJ) в полной среде (среда RPMI-1640 с глутамином Cat BE-12-70F, Cambrex Biosciences, В4880 Verviers, Belgium), дополненной фетальной бычьей сывороткой (производства USA, Gibco ref. 26140-079) и только растворителем с концентрацией 10^-6 М или растворителем с указанным соединением с концентрацией 10^-6 М, 10^-7 М или 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие LPS (10 мкг/мл; LPS из штамма Е. coli 0111:В4 InvivoGene, San Diego CA92121 USA) в течение 24 часов. Супернатант культур замораживали при -20°C, и проводили количественное определение концентрации TNF-альфа при помощи видоспецифического ELISA-теста (твердофазный иммуноферментный анализ для количественного определения альфа-фактора некроза опухоли: анализ для количественного определения TNF-альфа человека ELISA BM S223/4TEUCE, Bender Med System Inc., Burlinghane CA 94010).

Таблица 5. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 5. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование TNF-альфа в РВМС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 141,4±277,2 847,15±20,7 (0,893) 2б3,2±140,72 (0,225) 736,2±265 (0,893) LPS (10 мкг/мл) 500,3±226,9 742±228,88 (0,893) 256,9±146,49 (0,043) 679,1±279,1 (0,500)

Как показано в Таблице 5, наличие соединения 5 в культурах при концентрации 10^-7 М статистически значимо снижает Продуцирование TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). На Фиг.2 показано, что наличие соединения 12 в культуре при концентрациях 10^-6 М и 10^-7 М статистически значимо уменьшает концентрацию TNF-альфа, количественно определенную в супернатанте культуры стимулированных LPS мононуклеарных клеток периферической крови (p<0,05). Кроме того, соединение 12 при концентрации 10^-6 М также уменьшает спонтанное Продуцирование TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови.

Таблица 6. Продуцирование TNF-альфа у здоровых волонтеров в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=10 Продуцирование TNF-альфа в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М Питательная среда 1118,00±800,00 551,60±324.17 (0,009) 1121,00±100,48 (0,114) LPS (10 мкг/мл) 3084,63±450,00 1064,91±52,82 (0,005) 1938,00±487,74 (0,028)

Иммуномодулирующие эффекты соединения 12 были дополнительно охарактеризованы по продуцированию панели цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови либо после стимуляции моноцитов липополисахаридами, либо после активации лимфоцитов комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. Это исследование проводили в присутствии или в отсутствие титрованных доз соединения 12 в культурах РМВС, полученных от здоровых волонтеров и от пациентов с ревматоидным артритом.

РМВС (5×10⁴ клетки/лунка) от 13 здоровых волонтеров культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией растворителя (10^-6 М) и соединением 12 с концентрациями 10^-6 М и 10^-7 М, в присутствии и в отсутствие LPS (10 мкг/мл) в течение 24 часов. Супернатант культур замораживали при -20°C и проводили количественное определение при помощи биоанализатора BD FACSArray (проточный цитофлуориметр) (BD Biosciences Cat No. 340128, San Diego CA 92121) с использованием специфических реагентов для одновременного анализа концентрации указанных цитокинов (СВА Flex Multiplex Set (BD™ Cytometric Bead Array, CBA: IL-8, IL-10, TNF-альфа и IFN-гамма) Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Diego CA 92121).

Присутствие соединения 12 в культуре в концентрациях 10^-6 М и 10^-7 М статистически значимо снижает продуцирование TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05) (фиг.3). В противоположность этому, ни секреция TNF-альфа мононуклеарными клетками периферической крови, стимулированными анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами, ни спонтанная секреция TNF-альфа (которая наблюдается в отсутствие экзогенного стимула) не подвергается модифицированию посредством соединения 12.

Таблица 7. Продуцирование TNF-альфа у здоровых волонтеров в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=13 Продуцирование TNF-альфа в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 1б3,84±30,00 148,31±50,00 (0,422) 197,81±40,00 (0,249) 168,49±16,00 (0,65) LPS (10 МКГ/МЛ) 923,93±160,00 602,12±100,00 (0,002) 746,84±125,00 (0,046) 738,81±100,00 (0,055) анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 435,81±60,00 334,21±63,00 (0,116) 404,11±97,00 (0,753) 355,62±65,00 (0,422)

В другом эксперименте РМВС (5×10⁴ клеток на лунку) от 7 пациентов с ревматоидным артритом культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) и соединением 12 с концентрациями 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М в присутствии и в отсутствие либо LPS (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) (Orthoclon OKT3, Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan NJ, USA) с анти-CD28 (1/3×10⁵) (Clon 15E8, Menarini, Madrid, Spain) моноклональных антител, в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C и проводили количественное определение концентрации TNF-альфа при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set (Becton Dickinson), специфического для определения указанного цитокина, следуя инструкциям производителя.

В стимулированных LPS мононуклеарных клетках периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом соединение 12 статистически значимо ингибирует Продуцирование TNF-альфа при концентрации 10^-6 М (p<0,05) (фиг.4). Присутствие соединения 12 в культуре не ингибирует ни спонтанное продуцирование TNF-альфа, ни продуцирование TNF-альфа, получаемое после стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами в мононуклеарных клетках периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом.

Таблица 8. Продуцирование TNF-альфа у пациентов с ревматоидным артритом в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=7 Продуцирование TNF-альфа в РМВС у пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 100,64±40,00 177,32±95,00 (0,735) 191,33±80,00 (0,735) 131,95±85,00 (0,735) LPS (10 МКГ/МЛ) 700,39±180,00 383,75±75,00 (0,05) 626,57±150,00 (0,237) 683,40±120,00 (0,499) анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 648,72±90,00 532,07±80,00 (0,31) 568,47±97,00 (0,612) 695,81±79,00 (0,398)

Помимо этого, изучали влияние соединения 12 на продуцирование TNF-альфа изолированными моноцитами, очищенными от РВМС, полученных от 9 здоровых волонтеров, в присутствии и в отсутствие LPS. РВМС, полученные от каждого здорового волонтера, изолировали, и их моноциты очищали, используя метод автоматизированной иммуномагнитной сепарации (MACS). 10⁸ РВМС суспендировали в полной среде в стерильных пластиковых пробирках на 5 мл инкубировали при 4°C с магнитными бусинами, покрытыми антителами к CD14 (CliniMACS CD14 Reagent, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, D-51429), и помещали в сепаратор клеток AutoMACS™ (Miltenyi Biotec) для очистки субпопуляции CD14⁺ РВМС, обычные моноциты. Чистоту изолированных моноцитов проверяли в цитометрических полистироловых пробирках на 5 мл, используя прямую иммунофлуоресценцию и многоцветный анализ в проточной цитометрии после окрашивания в 5 мл пробирках FITC-меченными CD3- и РЕ-меченными CD14-специфическими антителами. Количественную оценку поверхностного распределения указанных поверхностных рецепторов Т (CD3) и моноцитов (CD14) осуществляли, используя анализатор FACScalibur™ (Becton Dickinson). Результаты анализа получали, используя программное обеспечение FlowJo FlowCytometer Software (Tree Star, OR, USA). Чистота CD3^-CD14⁺ моноцитов, изолированных из РВМС, как правило, превышала 98% живых клеток; моноциты отбирали согласно характерным для них свойствам прямого светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SCC), которые позволяют определять четко различимые кластеры моноцитов и остаточных лимфоцитов (Фиг.5). Моноциты (1,25×10⁵ клеток на лунку, 5 мл) культивировали на планшетах для выращивания тканевой культуры, 6 лунок, плоскодонных с крышкой для низкого испарения (353046 Falcon, Becton Dickinson), в полной среде, дополненной фетальной бычьей сывороткой и только растворителем с концентрацией 10^-6 М или растворителем с соединением 12 с концентрацией 10^-6, в присутствии и в отсутствие 10 мкг/мл LPS, в течение периода времени, указанного в экспериментах по определению кинетических характеристик. При этом в экспериментах по определению кинетических характеристик (см. Фиг.6 и 7) сохраняли как супернатант, так и клетки для измерения величины экспрессии продукта гена TNF-альфа на уровне мРНК в клетках и на уровне белка в супернатантах. Супернатант замораживали при -20°C, и проводили определение концентрации секретированного белка TNF-альфа при помощи биоанализатора BD FACSArray (Becton Dickinson) с использованием реагентов BD TNF-альфа СВА (Becton Dickinson Biosciences-Pharmingen), следуя инструкциям производителя, как указано выше. Прикрепленные клетки моноцитов извлекали из планшет при помощи скребка для извлечения клеток (3010 Costar, Cambridge MA 02139, USA), и сразу выделяли клеточную мРНК, полученную мРНК квантировали, затем проводили обратную транскрипцию и, используя количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (Q-ПЦР), измеряли уровень экспрессии мРНК гена TNF-альфа в системе 7900 НТ Fast Real-Time Q-PCR (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA). На Фиг.5 показано, что в этом эксперименте с привлечением 9 здоровых волонтеров использовали фракцию, сильно обогащенную моноцитами (98,30±0,17%), целью которого было определение кинетических характеристик экспрессии мРНК TNF-альфа и секреции белка в этой субпопуляции РВМС. Как и следовало ожидать, на Фиг.6 показано, что в моноцитах человека, стимулированных LPS, in vitro наблюдается сильная индукция экспрессии мРНК TNF-альфа (в 48,35±17,46 раз, p<0,001), с экспрессией, находящейся фактически на начальном уровне для которой в начальной точке (0 час.) в условиях ex vivo, и очень ранней активацией экспрессии гена с максимумом, согласно кинетическому профилю, через 2,5 часа и неустойчивой быстро уменьшающейся транскрипцией настолько, что через 24 часа количество мРНК гена TNF-альфа снижается до начального уровня (квадраты на Фиг.6). В случае отсутствия стимулирования липополисахаридами экспрессия гена TNF-альфа не активизируется и количество мРНК, специфичных для TNF-альфа, в этой in vitro системе остается на ех vivo начальном уровне (ромбы на Фиг.6). В частности, соединение 12 статистически значимо уменьшало стимулированную LPS пиковую индукцию мРНК гена TNF-альфа в очищенных моноцитах, полученных от здоровых волонтеров, измеренную с использованием набора для оценки уровня экспрессии TaqMan® Gene Expression Assays, специфичного для TNF-альфа человека, в системе 7900 НТ Fast Real-Time Q-PCR (33,72±15,88%, p<0,01) (треугольники на Фиг.6). Более того, уменьшение величины экспрессии гена TNF-альфа на уровне мРНК было статистически значимым через 5 и 8 часов после стимуляции очищенных моноцитов LPS (27,14±9,07%, p<0,01; и 36,45±11,58%, p<0,01, соответственно). Было сделано заключение, что соединение 12 статистически значимо уменьшает стимулированную LPS индукцию мРНК гена TNF-альфа в моноцитах, очищенных из РВМС, полученных от здоровых волонтеров, и что эти изменения в индукции происходят без модификации пиковых кинетических характеристик усиления и ослабления модуляции экспрессии генного продукта TNF-альфа в течение всего исследования. Согласно наблюдению самого низкого уровня экспрессии гена TNF-альфа в не стимулированных LPS моноцитах человека и высокой скорости индукции мРНК, секреция белка TNF-альфа, в отсутствие соединения 12, инициируется быстро с временной задержкой, необходимой для завершения биологического процесса трансляции мРНК в белок, его процессирования, секреции и выделения в культуральные среды, с сохранением ожидаемого пикового продуцирования через 8 часов после стимуляции липополисахаридами очищенных из РВМС моноцитов в контрольных культурах (квадраты на Фиг.7). В культуре моноцитов в присутствии только носителя в качестве растворителя и в отсутствие LPS и соединения 12 не наблюдалась активизация секреции TNF-альфа (ромбы на Фиг.7). В частности, соединение 12 статистически значимо уменьшало количество секретированного белка TNF-альфа, стимулированного LPS, на пике его продуцирования (8 ч) в очищенных моноцитах, полученных от здоровых волонтеров, измеренное с использованием набора реагентов СВА, специфичных для TNF-альфа человека, в биоанализаторе FACSArray (31,52±14,38%, p<0,01) (треугольники на Фиг.7). Как было показано выше для кинетических характеристик индукции мРНК TNF-альфа, уровни секретированного белка TNF-альфа были ниже во всех временных точках определения кинетических характеристик продуцирования после стимуляции культуры в точке 0 час. Действительно, результаты статистического анализа показали, что соединение 12 также вызывает статистически значимое ингибирование секреции белка TNF-альфа моноцитами, очищенными из стимулированных LPS мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров, через 2,5 часа, 5 часов и 24 часа (45,56±16,25%, p<0,01; 41,33±13,37%, p<0,01; и 51,17±15,62%, соответственно). Поскольку приведенные свидетельствуют, что соединение 12 статистически значимо ингибирует экспрессию генного продукта TNF-альфа как на уровне мРНК, так и на уровне белка в моноцитах, очищенных из РВМС от 9 здоровых доноров, было проведено исследование на наличие статистически значимой корреляции между величиной ингибирования индукции мРНК гена TNF-альфа и индуцированным соединением 12 снижением уровня секретируемого белка TNF-альфа, которую определяли при помощи регрессионного анализа в соответствующих пиках экспрессии. В частности, в очищенных моноцитах была обнаружена статистически значимая корреляция между иммуномодуляторными эффектами соединения 12 в отношении экспрессии генного продукта TNF-альфа в мРНК и секретированного белка (r²=0,7952). Приведенные выше результаты, рассматриваемые в совокупности, показывают, что ингибирование соединением 12 индукции на уровне мРНК гена TNF-альфа в стимулированных LPS очищенных моноцитах является механизмом, который является важной частью иммуномодулирующих эффектов соединения 12 на ингибирование секреции TNF-альфа.

Пример 7. Влияния соединений 4, 5, 6, 9, 10, 12, 15, 16 и 17 на продуцирование IFN-гамма.

РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от здоровых волонтеров культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной только растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) или растворителем с тестируемым соединением с концентрациями 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо LPS (10 мкг/мл), либо комбинацией анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1/3×10⁵), в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C, и проводили количественное определение концентрации IFN-гамма при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации IFN-гамма, следуя инструкциям производителя.

Таблица 9. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 16. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М

Питательная 94,5±24,5 45,46±6,89 50,2±5,2 44,3±3,56 среда   (0,043) (0,043) (0,043) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 68,38±4 69,77±10,34 -     (0,043) (0,043)   анти-CD3 (12,5 нг/мл) 2566±1819,3 1075±1239,04 1691±1921,2 - + анти-CD28 (1/3×10⁵)   (0,043) (0,138)  

Соединение 16 при концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0.05). Более того, при концентрации 10^-6 оно ингибировало продуцирование IFN-гамма, индуцированное анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (p<0,05). При концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М оно статистически значимо ингибировало спонтанную секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 10. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 4. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 94,5±24,5 56,38±9,98 (0,080) 74,51±10,75 (0,225) 57,54±2,59 (0,080) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 67,82±4,62 (0,043) 45,24±1,29 (0,043) 46,25±3,45 (0,043) анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 1084±672,2 (0,043) 2622±1283,57 (0,686) 3797±775,88 (0,500)

Соединение 4 при концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Более того, при концентрации 10^-6 М оно также статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма, индуцированное анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (p<0,05). Оно не изменяло статистически значимым образом спонтанную секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров.

Таблица 11. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 5. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 94,5±24,5 34,8±2,9 30,21±5,64 49,7±60 среда   (0,043) (0,043) (0,500) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 32,56±2,42 35,33±12,15 81,4±37,9     (0,043) (0,043) (0,500) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   1934±1002,79 1320±803,97 1528±1271,3 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,043) (0,080) (0,500)

Соединение 5 при концентрациях 10^-6 М и 10^-7 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Более того, при концентрации 10^-6 М оно также статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма, индуцированное анти-CD28 и анти-Cd0 моноклональными антителами (p<0,05). При концентрациях 10^-6 М и 10^-7 М оно также ингибировало спонтанную секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 12. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 6. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 94,5±24,5 70,98±6,37 55,7±18,4 77,44±15,5 среда   (0,080) (0,043) (0,043) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 80,6±6,89 104,2±20,1 82,8±16,2     (0,043) (0,080) (0,080) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   850±2396,16 1471±2031,5 3282±2584,7 +анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,500) (0,893) (0,255)

Соединение 6 при концентрации 10^-6 М статистически значимо ингибировало Продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Оно статистически значимо ингибировало спонтанную секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров при концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М (p<0,05).

Таблица 13. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 9. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^'6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 94,5±24.5 75,80±12,86 (0,080) 66,20±9,80 (0,043) 45,50±9,20 (0,043)

LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 62,60±24,88 (0,138) 46,80±15,10 (0,080) 61,00±12,10 (0,080) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   701,00±1877,04 1176,00±1954,90 2764,00±1281,70 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,138) (0,500) (0,686)

Соединение 9 при концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М статистически значимо ингибировало спонтанное продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от 5 здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 14. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 10. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^"6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 94,5±24,5 84,15±29,43 113,32±21,96 126,10±33,60 среда   (0,225) (0,500) (0,686) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 66,20±15,91 124,88±20,47 114,60±27,40     (0,080) (0,080) (0,043) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   1345±1379,13 1841±2135,94 2149±1224,50 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,043) (0,893) (0,225)

Соединение 10 при концентрации 10^-8 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Более того, при концентрации 10^-6 М оно также статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови, стимулированными анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (p<0,05). Соединение 10 не приводило к изменению спонтанной секреции IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров.

Таблица 15. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 17. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 94,5±24,5 20,60±22,80 75,15±15,44 67,40±13,80 среда   (0,080) (0,043) (0,138) LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 33,10±22,20 124,88±20,47 90,00±43,90     (0,080) (0,080) (0,500) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   2389±2480,70 2721±1241,75 1238±1237,60 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,893) (0,500) (0,345)

Соединение 17 при концентрации 10^-7 М статистически значимо ингибировало Продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от 5 здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Оно статистически значимо ингибировало спонтанную секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров при концентрации 10^-7 М.

Таблица 16. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 15. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная среда 94,5±24,5 78,60±1,60 (0,225) 119,52±5,88 (0,893) 89,40±18,80 (0,893)

LPS (10 мкг/мл) 115±25,1 73,30±7,80 (0,043) 90,49±24,35 (0,225) 41,70±14,00 (0,043) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   2490±1654,30 3831±1547,58 3165±1514,10 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 2566±1819,3 (0,345) (0,686) (0,686)

Соединение 15 при концентрации 10^-8 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от 5 здоровых волонтеров, стимулированное LPS (p<0,05). Оно статистически значимо не изменяло спонтанную или стимулированную CD3+CD28 антителами секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров.

Таблица 17. Продуцирование IFN-гамма в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=13 Продуцирование IFN-гамма в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 283,78±90,00 189,72±40,00 29б,28±90,00 279,16±60,00 среда   (0,279) (0,807) (0,807) LPS (10 860,42±105,00 649,61±120,00 919,53±130,00 1049,85±230,00 мкг/мл)   (0,011) (0,552) (0,382) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   7927,17±1003,00 11552,08±1600,00 10254,66±1500,00 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 11802,22±1300,00 (0,019) (0,917) (0,196)

Соединение 12 при концентрации 10^-6 М статистически значимо ингибировало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, либо стимулированное липополисахаридом, либо стимулированное анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (p<0,05) (фиг.8).

Соединения 12 не приводило к изменению спонтанной секреции IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров.

РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) и соединением 12 с концентрациями 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1/3×10⁵) антител, в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C, и проводили количественное определение концентрации IFN-гамма при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set, специфичных для определения концентрации IFN-гамма, следуя инструкциям производителя.

Присутствие соединения 12 в концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М статистически значимо уменьшало продуцирование IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом, индуцированное стимуляцией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами (p<0,05) (фиг.9). Соединение 12 не приводило к изменению ни спонтанной секреции IFN-гамма, ни секрецию IFN-гамма мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, индуцированной LPS.

Таблица 18. Продуцирование IFN-гамма у пациентов с ревматоидным артритом в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=8 Продуцирование IFN-гамма в РМВС пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 145,49±28,00 193,68±45,00 203,72±50,00 235,10±60,00 среда   (0,779) (0,208) (0,674) LPS (10 461,14±85,00 205,26±46,00 146,50±33,00 248,73±35,00 мкг/мл)   (0,484) (0,208) (0,889)

анти-CD3 (12,5 нг/мл)   5115,27±600,00 6411,71±700,00 7122,07±950 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 8406,18±1000,00 (0,05) (0,05) (0,017)

Пример 8. Влияние соединений 5, 6, 12 и 16 на продуцирование интерлейкина 8 (IL-8).

Влияние соединений 5, 6, 12 и 16 на продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров исследовали дополнительно, как в присутствии, так и в отсутствие стимуляции липополисахаридом (LPS) и анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами. РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от здоровых волонтеров культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной только растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) или растворителем с указанным соединением в концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахаридов (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1/3×10⁵) антител, в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C и проводили количественное определение концентрации IL-8 при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set, специфичных для определения концентрации IL-8, следуя инструкциям производителя.

Таблица 19. Продуцирование IL-8 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 16. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IL-8 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 80961±2255 65232±29577 53645±304б7 55043±29843 среда   (0,138) (0,043) (0,080) LPS (10 мкг/мл) 119800±23353 66988±29703 65232±32229 60278±33874     (0,138) (0,138) (0,225) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   59496±26929 56850±28160 59496±26425 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 90653±16263 (0,345) (0,686) (0,345)

Соединение 16 заметно уменьшало продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от 5 доноров во всех условиях стимуляции и при всех концентрациях тестируемого соединения. Более того, при концентрации 10^-7 М также наблюдалось статистически значимое ингибирование спонтанной секреции IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 20. Продуцирование IL-8 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 5. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IL-8 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 80961±2255 48453±25626 62698±28354 58275±28788 среда   (0,043) (0,138) (0,138) LPS (10 мкг/мл) 119800±23353 51626±33558,86 59886±33157 58725±32519     (0,043) (0,138) (0,138) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   70202±27558 62698±27532 61072±27502 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 90653±16263 (0,500) (0,686) (0,686)

Соединение 5 заметно уменьшало продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от 5 доноров во всех условиях стимуляции и при всех концентрациях тестируемого соединения. Более того, при концентрации 10^-6 М уровень ингибирования достигал статистически значимого как при спонтанной, так и при индуцированной LPS секреции IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 21. Продуцирование IL-8 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 6. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IL-8 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 80961±2255 56528±20562,02 680623±21088 115156±17433 среда   (0,043) (0,225) (0,500) LPS (10 мкг/мл) 119800±23353 120889±18073 120889±19096 120889±19725     (0,345) (0,345) (0,225) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   67547±16971 73902±16943 65317±19671 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 90653±16263 (0,893) (0,500) (0,500)

Соединение 6 заметно уменьшало Продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от 5 доноров как при стимуляции CD3+CD28 антителами при всех концентрациях тестируемого соединения, так и в условиях спонтанного высвобождения. Более того, в условиях спонтанного высвобождения при концентрации 10^-6 М наблюдалось статистически значимое ингибирование спонтанной секреции IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров (p<0,05).

Таблица 22. Продуцирование IL-8 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=13 Продуцирование IL-8 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^- М 10^-8 М Питательная 72814,17±10647,16 45634,31±6311,13 53723,66±7952,75 57773,60±6667,57 среда   (0,016) (0,006) (0,087) LPS (10 мкг/мл) 173877,36±8474,49 168467,15±9656,96 162075,59±10258,41 169609,11±9060,90     (0,807) (0,249) (0,861) анти-CD3 (12,5 нг/мл) 107008,56±8351,21 99779,72±20000 97968,61±10220,21 92989,29±8463,47 + анти-CD28 (1/3×10⁵)   (0,311) (0,055) (0,028)

При концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М соединение 12 статистически значимо ингибировало спонтанное продуцирование IL-8 (p<0,05) (фиг.10). Статистически значимое ингибирование продуцирования IL-8, индуцированного анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами, наблюдали в присутствии соединения 12 в концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М. Тем не менее, при стимуляции липополисахаридом никакое влияние на продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови не наблюдалось. Также исследовали влияние на продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом. РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) и соединением 12 с концентрациями 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1/3×10⁵) антител, в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C, и проводили количественное определение концентрации IL-8 при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set, специфичных для определения концентрации IL-8, следуя инструкциям производителя.

Присутствие соединения 12 в культуре в концентрациях 10^-6 М и 10^-8 М статистически значимо модулировало индуцированное липополисахаридом продуцирование IL-8 мононуклеарными клетками периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом, при этом не модифицировало ни спонтанное продуцирование IL-8, ни продуцирование IL-8, индуцированное комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител (фиг.11). Полученные результаты, рассматриваемые в совокупности, указывают на то, что модуляция IL-8 посредством соединения 12 может демонстрировать отчетливо различимые характеры модуляции при различных состояниях здоровья и определенных заболеваний.

Таблица 23. Продуцирование IL-8 у пациентов с ревматоидным артритом. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих р значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=8 Продуцирование IL-8 в РМВС от пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 M 10^-7 M 10^-8 M Питательная 57877,64±11143,52 98012,08±8395,97 96498,50±10784,62 93977,67±9247,38 среда   (0,208) (0,161) (0,123) LPS (10 150759,65±22966,06 185536,78±22000,00 174156,23±13385,66 184541,37±21500,00 мкг/мл)   (0,012) (0,208) (0,012) анти-CD3 (12,5         нг/мл) + 118017,97±21116,00 124576,09±14605,02 109607,00±18310,15 121587,88±16117,25 анти-CD28 (1/3×10⁵)   (0,263) (0,889) (0,575)

Пример 9. Влияние соединений 5, 12 и 16 на Продуцирование интерлейкина 10 (IL-10).

Влияние соединений 5, 12 и 16 на Продуцирование IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров и пациентов с ревматоидным артритом (соединение 12) исследовали при наличии и в отсутствие стимуляции липополисахаридом и комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от здоровых волонтеров культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной только растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 M) или растворителем с указанным соединением в концентрациях 10^-6 M, 10^-7 М и 10^-8 M, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) + анти-CD28 (1/3×10⁵), в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали, и проводили количественное определение концентрации IL-10 при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием набора реагентов СВА Flex Set (Becton Dickinson), специфичных для определения концентрации IL-10, следуя инструкциям производителя.

Таблица 24. Продуцирование IL-10 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 16. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IL-10 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 367,64±188 328±266 418±238 307±271 среда   (0,225) (0,138) (0,686) LPS (10 мкг/мл) 425±314 494±337 486±351 441±376     (0,686) (0,225) (0,138) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   317±297 432±255 379±237 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 366±217 (0,138) (0,043) (0,043)

Добавление соединения 16 в культуры не модифицировало спонтанное и индуцированное LPS Продуцирование IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров. Во всех этих линиях, при концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М наблюдалось статистически значимое усиление или уменьшение секреции IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированной комбинацией CD3 и CD28 моноклональных антител, что сильно отличается от статистически значимого ингибирования продуцирования INF-гамма, наблюдаемого в тех же условиях многофакторного анализа, которое было статистически значимым при концентрации 10^-6 (p<0,05).

Таблица 25. Продуцирование IL-10 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 5. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=5 Продуцирование IL-10 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 367,64±187,5 299,60±240,8 333,40±211,71 339,10±420,30 среда   (0,893) (0,500) (0,893) LPS (10 мкг/мл) 424,9±313,9 427,20±310,49 402,35±370,67 441,30±505,40     (0,500) (0,686) (0,686) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   418,00±196,46 391,45±241,22 394,30±390,40 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 365,50±217 (0,893) (0,043) (0,345)

Добавление соединения 5 в культуры приводило к минимальным изменениям в уровнях продуцирования IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от 5 доноров, которые представляли собой достаточно небольшое увеличение со случайным уменьшением уровней секретируемых цитокинов при всех концентрациях тестируемых соединений при продуцировании, либо стимулированном LPS, либо индуцированном комбинацией CD3 и CD28 антител. Во всех этих линиях, при концентрации 10^-7 М секреция IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров, стимулированная комбинацией CD3 и CD28 антител, была увеличена (p<0,05).

Таблица 26. Продуцирование IL-10 в РМВС у здоровых волонтеров в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=13 Продуцирование IL-10 в РМВС от здоровых волонтеров (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М

Питательная 490,46±87,16 559,06±112,20 609,10±108,74 578,66±106,20 среда   (0,753) (0,701) (0,861) LPS (10 мкг/мл) 2342,20±384,02 2420,68±455,50 (0,507) 2392,99±427,86 (0,507) 2389,63±366,01 (0,701) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   1239,47±251,24 1132,69±213,32 1122,51±211,03 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 1042,64±162,36 (0,507) (0,382) (0,507)

С другой стороны, РВМС (5×10⁴ клеток на лунку) от 8 пациентов с ревматоидным артритом культивировали в двух экспериментах в 200 мкл полной среды, дополненной растворителем с самой высокой концентрацией (10^-6 М) и соединением 12 с концентрациями 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М, в присутствии и в отсутствие либо липополисахарида (10 мкг/мл), либо комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1/3×10⁵), в течение 24 часов. Супернатанты культур замораживали при -20°C, и проводили количественное определение концентрации IL-10 при помощи биоанализатора BD FACSArray с использованием наборов реагентов CBA Flex Set, специфичных для определения концентрации IL-10, следуя инструкциям производителя.

Таблица 27. Продуцирование IL-10 в РМВС у пациентов с ревматоидным артритом в присутствии соединения 12. Для секретируемого цитокина результаты указаны в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). n=8 Продуцирование IL-10 в РМВС у пациентов с ревматоидным артритом (пг/мл)   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М Питательная 452,69±107,47 682,50±113,65 798,92±144,46 468,14±65,80 среда   (0,674) (0,401) (0,263) LPS (10 2388,64±300,00 2787,12±416,91 2597,85±513,19 3000,00±400,00 мкг/мл)   (0,069) (0,327) (0,025) анти-CD3 (12,5 нг/мл)   976,96±187,99 805,41±141,23 872,06±150,87 + анти-CD28 (1/3×10⁵) 836,39±189,09 (0,484) (1,000) (0,674)

Соединение 12 не продемонстрировало никакого влияния на продуцирование IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови от здоровых волонтеров при наличии и в отсутствие обоих изучаемых стимулов (фиг.12). Однако присутствие соединения 12 в культуре при концентрации 10^-8 М статистически значимо усиливало продуцирование IL-10 после стимуляции липополисахаридом мононуклеарных клеток периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом посредством (p<0,05). Соединение 12 не обладало статистически значимым влиянием ни на спонтанное продуцирование IL-10, ни на продуцирование IL-10 после стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови от пациентов с ревматоидным артритом комбинацией анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител (фиг.13).

Другие типы действия на клетки иммунной системы

Пример 10. Влияние соединений 4, 5, 6, 9, 12 и 16 на пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови

Изучали влияние соединений 4, 5, 6, 9, 12 и 16 на пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в присутствии и в отсутствие стимуляции 10 мкг/мл фитогемагглютинином (РНА); 2 мкг/мл РИА с добавкой экзогенных IL-2 (25 мкг/мл) и комбинацией анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1:320000) моноклональных антител.

Мононуклеарные клетки периферической крови культивировали в течение 4 дней (50000 клеток на лунку) при 37°C и в атмосфере 5% CO₂ (инкубатор для выращивания клеточной и тканевой культуры HERA Cell 150, Thermoscientific, Thermoelectron, 63505 Lagenselbold, GE) в полной культуральной среде. Стимуляцию культур выполняли в отсутствии и в присутствие 10 мкг/мл фитогемагглютинина (РНА Sigma Ref #L-8902, Madrid, Spain); 2 мкг/мл РНА плюс добавка экзогенных IL-2 (25 мкг/мл, Human recombinant IL-2, Macrolin, Chiron Iberica, batch #SA753228/4, Madrid, Spain) и комбинации анти-CD3 (12,5 нг/мл) и анти-CD28 (1:320000) моноклональных антител. В течение последних 8 часов культивирования добавляли метил ³H-тимидин (метил-³H-тимидин с активностью 60 Ки/моль American Radiochemical, ITISA, Madrid, Spain). Клетки собирали на стекловолоконные мембраны и помещали в сцинтилляционную среду (1450-441 Meltilex A, de Wallac Оу, Ref# 1450-441). Проводили количественное определение ДНК-инкорпорированной радиоактивной метки с использованием счетчика бета-частиц Wallac Oy. Для контроля за жизнеспособностью клеток в культурах, используя микроскоп (Zeiss Axiovert 40CFL, Karl Zeiss Microimagen GmbH, Gottingen, Germany), проводили наблюдение за плотностью и морфологией клеточных культур в присутствии среды, без других сигналов, с целью обнаружения и количественного определения возможных митогенных действий изучаемых молекул непосредственно на мононуклеарные клетки периферической крови, и анализировали жизнеспособность клеток после инкубации.

Таблица 28. Пролиферативная реакция мононуклеарных клеток периферической крови от 6 здоровых волонтеров на указанные стимулы в присутствии или в отсутствии титрованного количества соединения 16 (далее - лекарственное вещество). Результаты поглощения метил-³H-тимидина представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (cpm: число импульсов в мин). Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом (отсутствуют в этой таблице) с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). F-30125-RR   10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М 10^-9 М 10^-10 М Питательная среда Разбавит. 4173±750 3134±731 1075±559 786±781 421±1395 лекарств. вещество 2355±668 2101±1006 1932±421 2040±287 2456±212     (0,249) (0,917) (0,463) (0,345) (0,345) РНА-Р (10 мкг/мл) Разбавит. 132842±12078 133400±16114 149886±21502 151690±17207 125060±15270 лекарств. вещество 101935±16298 150870±19554 148142±19742 142231±12403 151052±16849     (0,753) (0,463) (0,917) (0,600) (0,075) РНА-Р (2 мкг/мл) + Разбавит. 75594±7429 92185±11446 85481±9600 87486±9689 72575±7773 лекарств. вещество 71695±8080 95472±8034 85565±9363 92553±8892 96128±9283 IL-2 (25 Ед./мл)   (0,463) (0,463) (0,753) (0,753) (0,075) ТСЕ (отношение Разбавит. 107000±13172 177461±25149 174961±24024 178210±23219 165498±25428 лекарств. вещество 100537±17868 181500±28947 189561±27195 170159±19945 183824±23708 бус./кл.2:1)   (0,917) (0,116) (0,463) (0,917) (0,173)

Соединение 16, присутствующее в культуре клеток, не модифицировало статистически значимо пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии разнообразных митогенных изучаемых стимулов (Таблица 28). Известно, что высокие дозы IL-10 оказывают ингибирующее воздействие на пролиферацию, индуцированную комбинацией CD3 и CD28 антител, указывая на то, что модуляция уровней IL-1 не является основным механизмом, действующим в различных экспериментальных условиях, исследованных в данной работе. Оно не является иммунносуппрессивным соединением, которое оказывает негативное действие на Т клеточную пролиферацию, аналогичное действию многих обычных иммуносуппрессоров.

Таблица 29. Пролиферативная реакция мононуклеарных клеток периферической крови от 6 здоровых волонтеров на указанные стимулы в присутствии или в отсутствии титрованного количества соединения 4 (далее - лекарственное вещество). Результаты поглощения метил-³H-тимидина представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (cpm: число импульсов в мин). Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом (отсутствуют в этой таблице) с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). F-30217-RS   10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М 10^-9 М 10^-10 М Питательная среда Разбавит. 4173±750 3134±731 1075±559 786±781 421±±1395 лекарств. 3184±2296 2652±1544 2577±1162 2830±1015 2528±417   вещество (0,345) (0,753) (0,116) (0,116) (0,345) РНА-Р (10 мкг/мл) Разбавит. 132842±12078 133400±16114 149886±21502 151690±17207 125060±15270 лекарств. вещество 98922±11888 112615±13048 112835±12645 122504±13667 118979±9448     (0,463) (0,173) (0,173) (0,173) (0,917) РНА-Р (2 мкг/мл) + Разбавит. 75594±7429 92185±11446 85481±9600 87486±9689 72575±7773 лекарств. вещество 70821±4932 7б154±6307 72169±6899 86532±6706 77816±5686 IL-2 (25 Ед./мл)   (0,463) (0,173) (0,345) (0,917) (0,463) ТСЕ (отношение Разбавит. 107000±13172 177461±25149 174961±24024 178210±23219 165498±25428 лекарств. вещество 113360±18427 183187±22197 173897±20637 159689±22900 182127±19440 бус./кл. 2:1)   (0,753) (0,600) (0,753) (0,463) (0,600)

Соединение 4, присутствующее в культуре клеток, не модифицировало статистически значимо пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии разнообразных митогенных изучаемых стимулов (Таблица 29). Оно не является иммунносуппрессивным соединением, которое оказывает негативное действие на Т клеточную пролиферацию, аналогичное действию многих обычных иммуносуппрессоров.

Таблица 30. Пролиферативная реакция мононуклеарных клеток периферической крови от 6 здоровых волонтеров на указанные стимулы в присутствии или в отсутствие титрованного количества соединения 5 (далее - лекарственное вещество). Результаты поглощения метил-³H-тимидина представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (cpm: число импульсов в мин). Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом (отсутствуют в этой таблице) с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). F-30218-RS   10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М 10^-9 М 10^-10 М Питательная среда Разбавит. 4173±750 3134±731 1075±559 786±781 421±1395 лекарств. вещество 2828±391 2474±581 2896±615 2328±962 2680±731     (0,116) (0,753) (0,075) (0,249) (0,345) РНА-Р (10 мкг/мл) Разбавит. 132842±12078 133400±16114 149886±21502 151690±17207 125060±15270 лекарств. вещество 78622±12398 131549±11837 151166±15659 147416±11912 147352±15286     (0,116) (0,753) (0,753) (0,345) (0,075) РНА-Р (2 мкг/мл) + Разбавит. 75594±7429 Э2185±11446 85481±9600 87486±9689 72575±7773 лекарств. вещество 45222±6660 78290±6748 79679±5527 83402±4557 83135±4607 IL-2 (25 Ед./мл)   (0,075) (0,173) (0,345) (0,345) (0,173) ТСЕ (отношение Разбавит. 107000±13172 177461±25149 174961±24024 178210±23219 165498±25428 лекарств. вещество 57761±15198 157875±19319 184083±21986 183725±21655 171383±19208 Оус./кл. 2:1)   (0,028) (0,600) (0,753) (0,249) (0,917)

Соединение 5, присутствующее в культуре, только при максимальной тестируемой дозе 10^-6 М, статистически значимо ингибировало пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови от 6 здоровых волонтеров при стимуляции комбинацией CD3 и CD28 антител (p<0,05; Таблица 30). Этот признак отличает его от других структурно родственных соединений, которые, тем не менее, имеют сходные структурные и функциональные признаки.

Таблица 31. Пролиферативная реакция мононуклеарных клеток периферической крови от 6 здоровых волонтеров на указанные стимулы в присутствии или в отсутствие титрованного количества соединения 6 (далее - лекарственное вещество). Результаты поглощения метил-³H-тимидина представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (cpm: число импульсов в мин). Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом (отсутствуют в этой таблице) с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). F-30230-RS   10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М 10^-9 М 10^-10 М Питательная среда Разбавит. 4173±750 3134±731 1075±559 786±781 421±1395 лекарств. вещество 2432±411 2388±388 2252±217 2144±164 2478±223     (0,173) (0,463) (0,173) (0,345) (0,345) РНА-Р (10 мкг/мл) Разбавит. 132842±12078 133400±16114 149886±21502 151690±17207 125060±15270 лекарств. вещество 111292±13373 123389±10812 123872±12805 123708±12430 124177±3284     (0,753) (0,753) (0,345) (0,345) (0,753) РНА-Р (2 мкг/мл)+ Разбавит. 75594±7429 92185±11446 85481±9600 87486±9689 72575±7773 лекарств. вещество 75230±4053 84630±7105 83203±7576 74878±9183 72810±10656 IL-2 (25 Ед./мл)   (0,753) (0,345) (0,753) (0,463) (0,249) ТСЕ (отношение Разбавит. 107000±13172 177461±25149 174961±24024 178210±23219 165498±25428 лекарств. вещество 102354±16275 164461±17856 177780±20099 178703±19511 166529±18415 бус./кл. 2:1)   (0,600) (0,917) (0,345) (0,345) (0,463)

Соединение 6, присутствующее в культуре клеток, не модифицировало статистически значимо пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии любого из указанных стимулов (p<0,05; Таблица 31). Оно не является иммунносуппрессивным соединением, которое оказывает негативное действие на Т клеточную пролиферацию, аналогичное действию многих обычных иммуносуппрессоров.

Таблица 32. Пролиферативная реакция мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров на указанные стимулы в присутствии или в отсутствие титрованного количества соединения 9 (далее - лекарственное вещество). Результаты поглощения метил-³H-тимидина представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (cpm: число импульсов в мин). Статистически значимые результаты отмечены жирным шрифтом (отсутствуют в этой таблице) с указанием (в круглых скобках) соответствующих p значений (данные относительно разбавителя для каждого экспериментального условия). F-40221-RS   10^-6 М 10^-7 М 10^-8 М 10^-9 М 10^-10 М Питательная среда Разбавит. 4173±750 3134±731 1075±559 786±781 421±1395 лекарств. вещество 3902±412 2145±287 2432±231 2785±248 2477±229     (0,846) (0,249) (0,249) (0,345) (0,345) РНА-Р (10 мкг/мл) Разбавит. 132842±12078 133400±16114 149886±21502 151690±17207 125060±15270 лекарств. вещество 91169±14336 122456±24310 143737±10540 146143±7862 143807±10375     (0,345) (0,173) (0,345) (0,600) (0,345) РНА-Р (2 мкг/мл)+ Разбавит. 75594±7429 92185±11446 85481±9600 87486±9689 72575±7773 лекарств. вещество 69428±9105 75861±16776 83875±8722 88996±5048 93063±7327 IL-2 (25 Ед./мл)   (0,917) (0,173) (0,917) (0,917) (0,116) ТСЕ Разбавит. 107000±13172 177461±25149 174961±24024 178210±23219 165498±25428 (отношение лекарств. 100958±19317 140678±29168 162960±20292 164158±16818 166529±21592 бус./кл. 2:1) вещество (0,917) (0,345) (0,753) (0,345) (0,600)

Соединение 9, присутствующее в культуре клеток, не модифицировало статистически значимо пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии любого из указанных стимулов (p<0,05; Таблица 32). Оно не является иммунносуппрессивным соединением, которое оказывает негативное действие на Т клеточную пролиферацию, аналогичное действию многих обычных иммуносуппрессоров.

Соединение 12, присутствующее в культуре клеток, незначительно модифицирует пролиферативную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров в отсутствие и при наличии разнообразных митогенных изучаемых стимулов (фиг.14a и 14b).

Пример 11. Влияние соединения 12 на шеддинг ("слущивание" с клетки и диффундирования из клетки в среду культивирования) CD62L в мононуклеарных клетках периферической крови

Исследовали влияние соединения 12 на шеддинг CD62L в лимфоцитах и моноцитах мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых волонтеров.

В присутствии соединения 12 в концентрации 10^-6 М шеддинг CD62L (CD62L - фикоэритрин (РЕ), клон BD SK11 Cat No. 341012, BD Biosciences) увеличивался статистически значимо (p<0,05). Следует отметить, что такое снижение среднего геометрического значения интенсивности флуоресценции (MFI) РЕ-метки CD62L-PE, детектируемой после шеддинга CD62L, селективно происходит в лимфоцитах, при этом в моноцитах не наблюдаются статистически значимые отличия (фиг.15a и 15b).

Таблица 33. Среднее значение интенсивности флуоресценции экспрессии CD62L на поверхности лимфоцитов, p значения соответствуют данным относительно разбавителя для каждого экспериментального условия. n=10 Лимфоциты (среднее значение ± стандартная ошибка)/статистическая значимость   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М MPI (среднее значение 112,68±13,57 90,01±8,93 116,90±11,02 интенсивности флуоресценции) (p)   (0,47) (0,333)

Таблица 34. Среднее значение интенсивности флуоресценции экспрессии CD62L на поверхности моноцитов, p значения соответствуют данным относительно разбавителя для каждого экспериментального условия. n=10 Моноциты (среднее значение ± стандартная ошибка)/статистическая значимость   Разбавитель 10^-6 М 10^-7 М MFI (среднее значение 65,34±8,0б 63,90±8,52 72,30±10,21 интенсивности флуоресценции) (p)   (0,721) (0,878)

Пример 12 Мышиная эндотоксемия; Пероральная активность соединения 12 в отношении TNF-α на уровне сыворотки крови

Использовали самцов мышей CD1, весивших от 30 до 35 г и содержавшихся в стандартных условиях, свободных от конкретных патогенов. Животным давали только (в течение 14-16 часов; по 12 животных в группе; по 6 животных в клетке = 500 см²) питательный раствор сахарозы (8%) и NaCl (0,2%) в неограниченном количестве. Пероральную обработку тестируемым веществом проводили, используя суспензию (носитель: Твин 80 0,1% - NaCl 0,9%), в объемном отношении 10 мл/кг. Через час у мышей индуцировали эндотоксемию внутрибрюшинной инъекцией липополисахаридов из Escherichia coli серотипа 055:В5 (Sigma L-2880) дозой 1 мг/кг и объемном отношении 10 мл/кг, растворенных в стерильном физрастворе. Через 90 минут после (i.p.) инъекции LPS под анестезией изофлураном отбирали 0,5-0,8 мл крови посредством кардиальной пункции; образец крови центрифугировали (6000 об/мин, 10 мин, 4°C), брали 2 образца сыворотки и хранили при -70°C до измерения концентрации TNF-α (EIA: Mouse TNF/TNFSF1A Quantikine от R&D Systems). Полученные результаты суммированы в Таблице 35 и на Фиг.16.

Таблица 35.   TNF-α (пкг/мл) продукт разбавитель ROLIPARM Соединение 12 Доза (способ введения) [10 мл/кг] (р.о.) 5 мл/кг (р.о.) 100 мл/кг (р.о.) 200 мл/кг (р.о.) n 10 9 8 7 среднее значение 3211,85 696,83 1386.51 956,42 стандартная ошибка 517,53 65.70 233,06 109,06 Ингибирование (%) -- 78,30 56,83 70,35 p (однофакторный дисперсионный анализ) -- p<0,001 p<0,01 p<0,01

В этой экспериментальной модели мышиной эндотоксемии, индуцированной LPS (i.p.) от Е. coli, введенное перорально соединение 12 показало активность при дозах 100 и 200 мг/кг/10 мл; оно статистически значимо снижало уровни TNF-α в сыворотке крови по сравнению с группой, которой вводили наполнитель.

Пример 13 Противоартритная активность соединения 12 в мышиной модели артрита, индуцированного коллагеном

Использовали самцов мышей DBA/1J, которых в течение 8 недель содержали в адекватных условиях. На день 0 животных иммунизировали 100 мкг бычьего коллагена типа II, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (1/1), инъецированного подкожно в основание хвоста. Через 16 дней после первичной иммунизации мышей бустировали описанным ранее способом, но в этот раз эмульсией коллагена с неполным адъювантом Фрейнда (1/1). Через 19 и 29 дней животным вводили i.p. 40 мкг LPS (Е. coli 0111:B4). Фармакологическую обработку начинали на день 20 и проводили ежедневно в течение практически одного месяца. Индекс артрита оценивали три раза в неделю, используя систему двойного измерения: толщину всей лапы (измеряли при помощи штангенциркуля) и клиническую шкалу оценки каждой конечности (визуальная оценка по шкале от 0 до 4). В конце исследования брали образцы сыворотки для определения уровня IL-6 (EIA от BD Biosciences). Полученные результаты суммированы в таблице 36 и на фиг.17.

Таблица 36 обработка пустой контроль дексаметазон соединение 12 дозой мг/кг     2 (i.p.) 100 (i.p.) 300 (P.O.) n 4 12 12 12 12 Средняя толщина (мм)     1,94^** 2,30^* 2,35^* % восстановления 2,10 2,59 132,65 51,02 48,96 Клинический     0^¥¥ 0,2188^¥ 0,2404 показатель % восстановления 0 0,3854 100 43,23 37,62 IL-6 (пкг/мл) 9,37 49,13 1,86^** 48,01 26,13^{* *}p<0,05, ^**p<0,01 однофакторный дисперсионный анализ vs контроль ^¥p<0,05, ^¥¥p<0,0'L критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis) vs контроль

В мышиной модели артрита, индуцированного коллагеном, соединение 12, введенное с концентрациями 100 мг/кг (i.p.) и 300 мг/кг (р.о.), продемонстрировало статистически значимую противоартритную активность.

Пример 14 Мышиный гепатит, индуцированный конканавалином А: Пероральная активность соединений 4 и 12

Использовали самцов мышей CD1, весивших от 30 до 40 г и содержавшихся в стандартных контролируемых условиях. Проводили эксперименты двух типов: целью одного из них было определение уровней ALT (аланинаминотрансферазы) и AST (аспартатаминотрансферазы) в сыворотке, а целью другого была оценка уровней TNF-α в сыворотке. Почечное нарушение индуцировали внутривенной (i.v.) инъекцией конканавалина А (ConA) дозой 12,5 мг/кг (5 мл/кг), а обработку лекарственным веществом выполняли за 24 и 1 час перед введением ConA (n=12). Образцы крови получали через 20 часов (тип 1 эксперимента) или 2 часа (тип 2 эксперимента) после i.v. введения ConA. В качестве соединений сравнения использовали ролипрам (р.о.) и дексаметазон (i.p), при этом соединения 12 (соединение F80002RR) и 4 (соединение F30217RS) вводили перорально.

Тип 1 эксперимента (определение трансаминазы)

Тип 2 эксперимента (определение TNF-α)

Образцы крови (0,5-0,8 мл) извлекали посредством кардиальной пункции под анестезией изофлураном, затем их центрифугировали (6000 об/мин; 10 мин; 4°C) для получения образцов сыворотки, которые хранили в замороженном виде при -70°C до момента проведения анализа. Все данные выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (SD), при этом статистический анализ проводили в отношении обоих параметров, используя t-критерий Стьюдента и сравнения контроля с данными, полученными при обработке. Значение p, не превышавшее уровень 0,05, считалось статически значимым. Для определения сывороточной трансаминазы использовали ферментативный колориметрический метод (SPINREACT cat. n°1001171 y 1001161), а для измерения уровней TNF-α использовали коммерческий набор ELISA (R&D Systems Quantikine Mouse TNFa cat. MTAOO). Оба анализа проводили в микропланшетах, считывание которых выполняли, используя мультимодальный спектрофотометр BioTek (Power Wave XS).

- Соединение 12 (F80002RR)

  ALT (Ед./л) Пустой Разбавитель, i.v. Контроль ConA, i.v. F80002RR (мг/кг, р.о.) Ролипрам Дексам. 50 100 200 300 5 мг/кг, p.o. 1 мг/кг, i.p. Среднее значение SD 23,14 1,26 176,78 59,30 181,93 76,02 126,21 57,70 82,15 17,25 71,06 16,62 60,08 12,64 33,67 4,41   p 0,86236441 0,63201135 0,22423383 0,02712721 0,059306602 0,013760116 Ингибирование % 0 28,61 53,53 59,80 66,01 80,95         * * * Среднее значение SD AST (Ед./л) 109,28 19,03 324,40 61,50 279,73 67,52 255,94 54,65 186,14 23,65 167,58 26,65 244,73 53,43 167,05 21,69   p 0,68833845 0,45077958 0,05329672 0,03220382 0,378986653 0,028190458 Ингибирование % 13,77 21,1 42,62 48,34 24,56 48,51       * *   * Среднее значение TNF-α (пкг/мл) 0 887,93 498,81 617,54 439,86 376,15 184,99 99,64

3D 0 153,40 26,41 67,51 30,86 38,71 18,73 8,37   p 0,02124108 0,12234748 0,00960371 0,00415262 0,000195383 5,08838Е-05   Ингибирование % 43,82 30,45 50,46 57,64 79,17 88,78     *   ** ** *** ***

Соединение 4 (F30217RS)

  ALT (Ед./л) Пустой Разбавитель, i.v. Контроль ConA, i.v. F80002RR 50 (мг/кг, р.о.) Ролипрам 5 мг/кг, р.о. Дексам. 1 мг/кг, i.p. Среднее значение SD 46,432,98 135,0821,28 70,1316,87 59,7913,12 38,183,56   p 0,040273066 0,013582164 0,000322506 Ингибирование % 48,08 55,74 71,73   * * *** Среднее значение SD AST (Ед./л) 90,6515,72 209,2028,31 125,6811,09 140,4018,33 101,029,05   p 0,012420707 0,054755042 0,001629995 Ингибирование % 39,92 32,89 51,71   * * ** Среднее значение SD TNF-α (пкг/мл) 00 387,4445,09 576,32132,14 220,2621,22 123,7133,39   p 0,189837275 0,002862159 0,000108949 Ингибирование % 0 43,15 68,07

Введенное перорально соединение 12 показало защитное действие от повреждения печени у мышей, индуцированного ConA, со статистически значимым уменьшением уровней TNF-α в сыворотке при р.о. дозе 50 мг/кг и уменьшением уровней трансаминазы в сыворотке при р.о. дозе 200 мг/кг. Соединение 4, введенное перорально дозой 50 мг/кг, уменьшало уровни ALT и AST в сыворотке, однако этой дозе не наблюдалось никаких изменений в уровнях TNF-α в сыворотке.

Пример 15 Действие перорально введенного соединения 12 на диабет типа I у мышей, индуцированный многочисленным введением низких доз стрептозотоцина (MLDS).

Использовали самцов мышей CD1, весивших от 30 до 40 г и содержавшихся в стандартных контролируемых условиях. Диабет индуцировали повторными i.p. введениями в течение 5 календарных дней стрептозотоцина (STZ) дозой 40 мг/кг (10 мл/кг). Обработку лекарственным веществом (т=12) проводили ежедневно с понедельника по пятницу, начиная со дня введения STZ в течение 3 недель. Тестируемый продукт вводили р.о. дозой 100 мг/кг (10 мл/кг), а NECA (5'-N-этилкарбоксамидоаденозин) использовали в качестве стандарта, который вводили i.p. дозой 50 мг/кг (10 мл/кг). Уровни глюкозы в сыворотке измеряли каждую неделю натощак. Для каждой экспериментальной группы вычисляли выраженное в процентах увеличение уровней глюкозы в сыворотке, по отношению к уровню глюкозы на неделе 1. За статистический уровень значимости по отношению к положительному контролю принимали p<0,05 (t-критерий Стьюдента). В конце эксперимента дополнительно к образцам сыворотки также собирали образцы поджелудочной железы. Уровни глюкозы в сыворотке измеряли ферментативным колориметрическим методом (Glucose-TR, Spinreact), а цитокины (IL-6, TNF-α) определяли в гомогенатах поджелудочной железы, используя коммерчески доступные наборы ELISA (Becton Dickinson, R&D Systems). Все определения проводили в микропланшетах, считывание которых выполняли, используя мультимодальный спектрофотометр BioTek (Power Wave XS).

- % увеличения глюкозы в сыворотке:

  Нет диабета(отрицательный контроль) Диабет (положительный контроль) Соединение 12 (F80002RR) NECA 100 мг/кг, р.о. 50 мкг/кг, i.p. W2 vs W1 3,64 217,98 р vs контроль 131,06 0,069888374 78,05 0,00540722 W3 vs W1 23,38 220,82 р vs контроль 149.97 0,060734332 123,30 0,022356845 W1 = неделя 1; W2 = неделя 2; W3 = неделя 3

  Нет диабета (отрицательный контроль) Диабет (положительный контроль) Соединение 12 (F80002RR) NECA IL-6 Питательная 57,05 75,21 43,96 51,25 (пкг/мг белка) среда ее 6,74 5,08 8,3 8,83   р vs контроль 0,0044 0,0290 IL-1β (пкг/мг Питательная среда 54,66 83,27 52,00 55,66 белка) ее 8,59 4,43 10,97 8,68   p vs контроль 0,0156 0,0103

На второй и третьей неделях обработки соединением 12 уменьшился повышенный уровень глюкозы в сыворотке, индуцированный STZ на неделе 1, что ограничило пределы статистической значимости. Действие соединения 12 привело к явному восстановлению увеличенных под воздействием диабетогенного агента (STZ) уровней цитокинов, обнаруженных в контрольных гомогенатах панкреатической железы (IL-6 и IL-1-бета).

Изобретение относится к применению соединений формулы (I), где R₁ выбирают из C₁-C₆ алкила, необязательно замещенного циано, незамещенного C₃-C₈циклоалкила, фенила, необязательно замещенного галогеном, и незамещенного 3-8-членного гетероциклила, содержащего один гетероатом, выбранный из азота и серы; R₂ выбирают из С₁-С₆ алкила, необязательно замещенного 3-членным гетероциклилом, содержащим один гетероатом кислорода, и незамещенного С₃-С₈циклоалкила, и R₃ представляет собой C₁-C₆ алкильный радикал, для получения лекарственного средства для лечения острого или хронического воспалительного заболевания посредством ингибирования продуцирования по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, выбранного из TNF-альфа и IFN-гамма, или посредством иммуномодулирования хемокина IL-8 и/или регуляторного цитокина IL-10. Изобретение также относится к соединениям формулы (I') и фармацевтической композиции на их основе. Технический результат - производные 5-(4-метансульфонилфенил)тиазола для лечения острых и хронических воспалительных заболеваний или состояний. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 51 табл., 12 ил., 25 пр.

1. Применение соединения формулы (I):

в которой R₁ выбирают из C₁-C₆ алкила, необязательно замещенного циано, незамещенного C₃-C₈циклоалкила, фенила, необязательно замещенного галогеном, и незамещенного 3-8-членного гетероциклила, содержащего один гетероатом, выбранный из азота и серы;
R₂ выбирают из C₁-C₆ алкила, необязательно замещенного 3-членным гетероциклилом, содержащим один гетероатом кислорода, и незамещенного C₃-C₈циклоалкила, и
R₃ представляет собой C₁-C₆ алкильный радикал,
для получения лекарственного средства для лечения острого или хронического воспалительного заболевания посредством ингибирования продуцирования по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, выбранного из TNF-альфа и IFN-гамма, или посредством иммуномодулирования хемокина IL-8 и/или регуляторного цитокина IL-10.

2. Применение соединения формулы (I), определенной в п.1, для получения лекарственного средства для лечения острого или хронического воспалительного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, рассеянного склероза, гепатита, сепсиса, септического шока, системной эритематозной волчанки, или диабета 1 типа.

3. Применение по п.2, где воспалительное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

4. Применение по п.1 или 2, где R₁ представляет собой незамещенный C₁-C₆ алкил, в частности метил.

5. Применение по п.1 или 2, где R₂ представляет собой незамещенный C₃-C₈циклоалкил, в частности циклопентил.

6. Применение по п.1 или 2, где R₃ представляет собой метил.

7. Применение по п.1 или 2, где соединение формулы (I) выбирают из следующих соединений:
 

8. Соединение формулы (I'):

в которой R₁ выбирают из C₁-C₆ алкила, необязательно замещенного циано, незамещенного C₃-C₈циклоалкила, фенила, необязательно замещенного галогеном, и незамещенного 3-8-членного гетероциклила, содержащего один гетероатом, выбранный из азота и серы; и
R₃ представляет собой C₁-C₆ алкильный радикал.

9. Соединение по п.8, где R₁ представляет собой незамещенный C₁-C₆ алкил, в частности метил.

10. Соединение по п.8, которое выбирают из следующего:

11. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы (I') по любому из пп.8-10, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или разбавитель, предназначенная для лечения острого или хронического воспалительного заболевания посредством ингибирования продуцирования по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, выбранного из TNF-альфа и IFN-гамма, или посредством иммуномодулирования хемокина IL-8 и/или регуляторного цитокина IL-10.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, предназначенная для лечения острого или хронического воспалительного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, рассеянного склероза, гепатита, сепсиса, септического шока, системной эритематозной волчанки или диабета 1 типа.

13. Соединение формулы (I') по любому из пп.8-10, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства для лечения острого или хронического воспалительного заболевания посредством ингибирования продуцирования по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, выбранного из TNF-альфа и IFN-гамма, или посредством иммуномодулирования хемокина IL-8 и/или регуляторного цитокина IL-10.

14. Соединение формулы (I') по п.13, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства для лечения острого или хронического воспалительного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, рассеянного склероза, гепатита, сепсиса, септического шока, системной эритематозной волчанки или диабета 1 типа.