ПРИМЕНЕНИЕ ПОРИСТЫХ НАНОСТРУКТУР Fe2O3 ДЛЯ ПРЕОДОЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ Российский патент 2020 года по МПК A61K33/26 B82Y5/00 B82Y40/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к медицине, а именно к потенцированию действия антибиотиков и может быть использовано для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, инфицированных множественно-устойчивыми бактериями.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно использование оксидов металлов в медицине, в том числе на основе оксидов железа [Viet Long, N., Minh Thi, C., Yong, Y., Cao, Y., Wu, H., Nogami, M. Synthesis and characterization of Fe-based metal and oxide based nanoparticles: discoveries and research highlights of potential applications in biology and medicine //Recent patents on nanotechnology. – 2014. – Т. 8. – №. 1. – С. 52-61; Long M. et al. Emerging nanoclay composite for effective hemostasis //Advanced Functional Materials. – 2018. – Т. 28. – №. 10. – С. 1704452.].

Известно применение наночастиц на основе оксидов железа для диагностики и лечения опасных опухолей и раковых заболеваний путем адресной доставки лекарств и/или магнитной гипертермии [US5284144 A, опубл. 08.02.1994, US7842281 В2, опубл. 30.11. 2010, US7829140 В1, опубл. 09.11. 2010].

Также наночастицы на основе оксидов железа используются в качестве контрастного средства визуализации и термической абляции при магнитно-резонансной терапии и комплексной терапии [Lodhia J, Mandarano G, Ferris NJ, Eu P, Cowell SF. Development and use of iron oxide nanoparticles (Part 1): Synthesis of iron oxide nanoparticles for MRI. Biomed Imaging Interv J 2010; 6(2): e12; Mandarano G, Lodhia J, Eu P, Ferris NJ, Davidson R, Cowell SF. Development and use of iron oxide nanoparticles (Part 2): The application of iron oxide contrast agents in MRI. Biomed Imaging Interv J 2010; 6(2): e13].

Известен продукт в виде агломератов оксигидроксидов металлов, выбранных из группы, состоящей из Al, Fe, Mg, Ti или их смеси [RU2560432C2, опубл. 20.08.2015]. Предложенные агломераты, в том числе Fe образованы множеством элементов, имеющих размеры от 200 до 500 нм и представляющих собой низкоразмерные складчатые структуры, имеющие складки и грани неправильной формы. Структуры обладают локально высоким уровнем напряженности электрического поля на упомянутых складках, гранях и ребрах граней, составляющим 10⁶-10⁷ В/м. Изобретение обеспечивает получение агломератов оксигидратов, которые могут быть использованы в качестве сорбентов или в качестве средства, обладающего ранозаживляющей и антибактериальной активностью, а также для угнетения пролиферативной активности опухолевых клеток. Продукт также раскрыт в Международной заявке [WO2014189412 опубл. 27.11.2014]. В вышеприведённом раскрыт способ получения оксигидроксида железа (FeOOH). Для получения агломератов низкоразмерных складчатых структур оксигидроксида железа использовали биметаллические наночастицы Fe-Al с примесью алюминия не более 10% масс. Биметаллический нанопорошок Fe-Al с размером частиц около 100 нм получали параллельным электрическим взрывом железной и алюминиевой проволоки в атмосфере азота при соотношении Fe: Al=90:10% масс. 20 г порошка заливали 2000 мл дистиллированной воды и нагревали при постоянном перемешивании до 60°C. Контролировали и поддерживали pH реагирующей смеси на уровне 9,0 раствором аммиака. Реакцию проводили в течение 60 мин. Затем суспензию отфильтровывали, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и сушили при температуре 90°C в течение 4 часов.

Получаемый продукт - композиция оксигидроксида (FeOOH/AlOOH) не оказывает потенцирующего действия по отношению к антибиотикам. В отличие от соединений железа AlOOH является не биорезорбируемым материалом и может накапливаться в организме. Для получения оксигидроксида железа используется дорогостоящий нанопорошок Fe-Al (200 $/кг), полученный электрическим взрывом двух проволочек. К тому же метод получения не обеспечивает полного окисления железа до оксигидроксида железа.

Известен способ получения пористого материала на основе гематита [A FACILE SYNTHESIS OF POROUS HEMATITE NANOMATERIALS AND THEIR FAST SORPTION OF CR (VI) IN WASTEWATER // J. Chil. Chem. Soc, 57, No 4 (2012), С.: 1372-1374]. Пористый наноматериал (a-Fe₂O₃) может быть просто получен из нейтрального раствора аморфного гидроксида железа (III) (Fe (OH)₃) методом выпаривания в открытой кварцевой колбе в вакуумной сушильной печи. Результаты показывают, что полученные частицы a-Fe₂O₃ при 180°C в течение 2 часов или около того имеют почти веретенообразную форму. Каждый из микрошпинделей a-Fe₂O₃ образован множеством ультрадисперсных наночастиц a-Fe₂O₃ и имеет пористую структуру. Приготовленные пористые порошки a-Fe₂O₃ имеют высокую площадь поверхности (~ 78 м²/г) и могут быстро удалять ионы Cr (VI) в сточных водах при комнатной температуре.

К недостаткам известного способа можно отнести характеристики получаемого материала, а именно низкая величина удельной поверхности, материал микропористый размер пор 60-100 нм.

Известен способ получения эллипсоидов гематита в гидротермальных условиях [Chengliang Han, Jie Han, Qiankun L,1 and Jingsong Xie Wet // Chemical Controllable Synthesis of Hematite Ellipsoids with Structurally Enhanced Visible Light Property The Scientific World JournalVolume 2013, Article ID 410594, 5 с. http://dx.doi.org/10.1155/2013/410594]. Результаты показали, что продукт был мезопористым α-Fe₂O₃ и имел почти эллиптическую форму. Каждый эллипсоид гематита размером 500 nm на 120 nm (длина осей) был упакован многими наночастицами α-Fe₂O₃ (~20 nm). Значения давления пара в реакционных системах сыграли важную роль в образовании пористых гематитовых эллипсоидов. Оптические тесты показали, что микро/наноструктурированный эллиптический гематит проявлял улучшенные свойства видимого света при комнатной температуре. Образование этих пористых гематитовых эллипсоидов можно объяснить ориентированной сборкой наночастиц α-Fe₂O₃ под давлением пара.

К недостаткам данного способа можно отнести характеристики получаемых материалов, а именно размер получаемых эллипсоидов. Для получения эллипсоидов необходима высокая температура (180°С) и повышенное давление.

Как можно видеть из вышеприведенного уровня техники оксиды и оксигидроксиды металлов разной геометрической формы и размеров используются в медицине при магнитно-резонансоной терапии опухолевых заболеваний, адресной доставки лекарств, а также, как средства, обладающие как адсорбирующим действием, так и ранозаживляющим и антибактериальным действием. Однако ранее в вышеприведенных аналогах не раскрыто такое свойство пористых наноструктур Fe₂O₃ (гематита) как влияние на изменение чувствительности бактерий при контакте с ними и антибиотиками, обусловливая тем самым потенцирование действия антибиотиков различного принципа действия на резистентные штаммы микроорганизмов. Также все еще существует потребность в создании новых способов получения пористых наноструктур Fe₂O₃ с ранее не известными характеристиками и свойствами.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие основано на неожиданном наблюдении, что пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), имеющие удельную поверхность не менее 50 м²/г; положительный дзета-потенциал, у которых отношение объема мезопор к объему микропор больше или равно 2 обладают свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

Таким образом, в основу изобретения поставлена задача разработки способа получения вышеописанных пористых наноструктур Fe₂O₃, обладающих свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

Другой задачей настоящего изобретения является применение вышеописанных пористых наноструктур Fe₂O₃ для преодоления устойчивости (резистентности) бактерий к антибиотикам за счёт повышения чувствительности резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа лечения у субъекта инфицированной раны, позволяющий преодолеть устойчивость к антибиотикам, за счёт обработки раны субъекта эффективным количеством антибиотика, в комбинации или раздельно с эффективным количеством вышеупомянутого Fe₂O₃.

И еще одной задачей настоящего изобретения является разработка продукта, содержащего упомянутый пористый Fe₂O₃ и антибиотик (например, один или более чем один антибиотик), в виде комбинированного препарата для одновременного или последовательного применения в лечении инфицированной раны субъекта.

Технический результат - уменьшение дозы антибиотика, возможность применения низкотоксичных антибиотиков.

Поставленная задача достигается тем, что пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), обладающие свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам, имеют удельную поверхность не менее 50 м²/г и положительный дзета-потенциал и имеют отношение объема мезопор к объему микропор большее или равное 2.

Предпочтительно, что упомянутые структуры имеют удельную поверхность не менее от 120 м²/г, дзета-потенциал, измеренный в воде при 25°С в диапазоне не менее +30 мВ.

Кроме того, они имеют развитую систему мезопор со средним размером в диапазоне от 2 до 50 нм и микропор со средним размером менее 2 нм.

При этом упомянутые пористые наноструктуры Fe₂O₃ имеют размер в диапазоне от 50 до 200 нм и представляют собой эллипсовидные частицы, состоящие из множества фрагментов размером от 2 до 5 нм.

Предлагаемый способ получения вышеописанных пористых наноструктур Fe₂O₃ (гематита), обладающих свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам, включает:

– получение промежуточного металлоорганического золя железа Fe (CH3COO)₃;

– добавление к полученному упомянутому золю железа дистиллированной воды и кипячении его в течение 5-7 часов при атмосферном давлении для полного превращения Fe (CH3COO)₃ в пористые наноструктуры Fe₂O₃;

– проведение охлаждения полученной смеси до комнатной температуры;

– фильтрование осадка;

– промывание водой и сушка при температуре при 120-125°С в течение не менее 3 часов, при которых достигается остановка изменения массы, связанная с удалением адсорбированной воды.

При этом промежуточный металлоорганический золь железа получают путем добавления с постоянным перемешиванием раствора хлорида железа (III) FeCl₃ с концентрацией 1,5±0,01 М к раствору ацетата натрия CH₃COONa с концентрацией 2,2±0,01 М в соотношении 1:1, и последующее перемешивание полученной смеси в течение 15-20 мин.

При времени кипячения менее 5 часов не достигается полной конверсии Fe(CH₃COO)₃ в Fe₂O₃ и удаления образующейся уксусной кислоты (CH₃COOH). Большее время кипячения – более 7 часов приводит к перекристаллизации наноструктур Fe₂O₃ и уменьшению величины удельной поверхности.

Поставленная задача достигается также тем, что пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), имеющие величину удельной поверхности не менее 50 м²/г, положительный дзета-потенциал и отношение объема мезопор к объему микропор большее или равное 2, применяют в качестве средства преодоления устойчивости (резистентности) бактерий к антибиотикам, за счёт повышения чувствительности резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

При меньших значениях величины удельной поверхности эффективность преодоления резистентности будет уменьшаться, так как при меньших значениях удельной поверхности снижается количество активных поверхностных центров, отвечающих за адсорбционные и ионообменные свойства пористых наноструктур Fe₂O₃.

При отрицательных значениях дзета-потенциала будет снижаться эффективность преодоления устойчивости, что связано с уменьшением адсорбционной способности по отношению к анионным молекулам, в том числе, бета-лактамазы.

Другая задача достигается тем, что предлагаемый способ преодоления устойчивости, к, по меньшей мере, одному антибиотику в отношении как грамположительной, так и грамотрицательной бактерии, включает приведение бактерии в контакт c вышеописанными пористыми наноструктурами вместе с антибиотиком.

Кроме того, бактерия представляет собой грамотрицательную и выбрана из родов Pseudomonas, и Escherichia, предпочтительно, где бактерия представляет собой одну из Pseudomonas aeruginosa, E.coli, которые устойчивы к одному или более антибиотикам, выбранным из пенициллина, метициллина, нитроцефина, грамицидина, гентамицина, цефтриаксона, цефтазидима, ампициллина; или представляет собой их клинический штамм или клинический изолят.

Кроме того, бактерия представляет собой грамположительную и выбрана из рода S. aureus и представляет собой клинический штамм или клинический изолят MRSA, которые устойчивы к одному или более антибиотикам, выбранным из пенициллина, метициллина, нитроцефина, грамицидина, ванкомицина, сультасина и ампициллина.

При том, что антибиотик выбран из β-лактамов, аминогликозидов, катионных полипептидов, тетрациклинов, полипептидных антибиотиков и хинолонов, предпочтительно из β-лактамов (пенициллина, метициллина, ампициллина, нитроцефина цефтриаксона, цефтазидима), катионных полипептидов (грамицидина) и аминогликозидов (гентамицина), а также комбинированного препарата сультасина на основе ампициллина и сульбактама.

Предпочтительно упомянутые структуры используют для лечения у субъекта инфицированной раны, позволяющие преодолеть устойчивость к антибиотикам как за счёт обработки раны субъекта эффективным количеством антибиотика, так и введения субъекту антибиотика, например, внутримышечно в комбинации или раздельно с эффективным количеством упомянутого Fe₂O₃.

Еще одна задача достигается тем, что предлагаемый в настоящем изобретении продукт содержит пористые наноструктуры вышеописанного оксида железа Fe₂O₃ (гематит) и, по меньшей мере, один антибиотик в виде комбинированного препарата для одновременного или последовательного применения для преодоления устойчивости к антибиотику вышеперечисленных бактерий, где упомянутые структуры имеют величину удельной поверхности не менее 120 м²/г, соотношение объем мезопор/объем микропор не мене 2 и дзета-потенциал в воде при 25°С не менее +30 мВ.

Синтезированные пористые наноструктуры оксида железа Fe₂O₃ (гематит) предназначены для лечения поверхностных ран, инфицированных резистентными штаммами бактерий. Лечение осуществляется с применением антибиотиков, при этом использование наноструктур Fe₂O₃ позволяет значительно снизить минимальные действующие концентрации лекарственных препаратов.

Потенцирование действия антибиотиков предлагаемыми пористыми наноструктурами оксида железа Fe₂O₃ (гематит) происходит за счет изменения чувствительности бактерий к антибиотикам. Изменение чувствительности обусловлено несколькими факторами, а именно: за счет изменения мембранного потенциала бактерий в присутствии наноструктур Fe₂O₃, связанного с перераспределения ионов вблизи бактериальной мембраны, в том числе изменения кислотности; ингибирования ферментов разрушающих антибиотики за счет адсорбции на поверхности наноструктур; за счет блокирования рецепторов, отвечающих за выработку ферментов, расщепляющих антибиотики, вызванного изменением потенциала бактериальной мембраны в присутствие наноструктур.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 – Изображения наноструктур Fe₂O₃, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии при различном увеличении: (а) ПЭМ-изображение и (б) ПЭМ-изображение высокого разрешения наноструктур Fe₂O₃.

Фиг. 2 – Рентгенограмма образца наноструктур Fe₂O₃. Основные рефлексы соответствуют Fe₂O₃-гематит.

Фиг. 3 – Изотерма адсорбции-десорбции азота (а) и распределение пор по размерам наноструктур Fe2O3 (б)

Фиг. 4 – Дзета-потенциал наноструктур Fe₂O₃.

Фиг. 5 – графики и изображения показывают преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe2O3 в концентрации 1 мг/мл в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Фиг. 6 – графики показывают преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Фиг. 7 – графики и изображения показывают преодоление устойчивости синегнойной палочки (P. aeruginosa) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с AlOOH в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Фиг. 8 – графики показывают преодоление устойчивости синегнойной палочки (P. aeruginosa) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe2O3 (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Фиг. 9 – графики и изображения показывают преодоление устойчивости кишечной палочки (E. coli) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Фиг. 10 – графики показывает преодоление устойчивости кишечной палочки (E. coli) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Фиг. 11 – (сравнительный пример) показывает преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃ (ГТС) – полученных гидротермальным синтезом по примеру 7 с низкой удельной поверхностью: отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ (ГТС) в концентрации 1 мг/мл (зеленая кривая); б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл (фиолетовая кривая); в – слабая противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (ГТС) с концентрацией 1 мг/мл в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл) – синяя кривая.

Фиг. 12 - (сравнительный пример) показывает преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур гетита – полученных по примеру 8: отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами гетита в концентрации 1 мг/мл (зеленая кривая); б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл (фиолетовая кривая); в – слабая противомикробная активность при применении наноструктур гетита с концентрацией 1 мг/мл в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл) – синяя кривая.

Синтезированные наноструктуры предназначены для лечения поверхностных ран, инфицированных резистентными штаммами бактерий. Лечение осуществляется с применением антибиотиков, при этом использование наноструктур Fe₂O₃ позволяет значительно снизить минимальные действующие концентрации лекарственных препаратов.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для подтверждения технического результата в экспериментах in vitro были использованы эллипсовидные пористые структуры оксида железа Fe₂O₃ (Фиг. 1) с высокой удельной поверхностью 126 м²/г (Фиг. 3) и дзета-потенциалом +35,8 мВ (Фиг. 4), с соотношением объем мезопор/объем микропор равным 2,48, далее «наноструктуры Fe₂O₃».

Для синтеза вышеописанных наноструктур Fe₂O₃ была использована методика с использованием промежуточного металлоорганического золя железа. В стеклянную колбу объемом 500 мл помещали 100 мл раствора CH₃COONa с концентрацией 2,2 М. К раствору, при постоянном перемешивании, добавляли 100 мл раствора FeCl₃ с концентрацией 1,5 М и перемешивали в течение 15-20 мин. Затем смесь нагревали до кипения и кипятили в течение 6 ч при постоянном перемешивании с обратным холодильником. К образовавшемуся золю добавляли 100 мл дистиллированной воды и кипятили в течение 6 ч. Далее охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, отфильтровывали образовавшийся осадок, промывали дистиллированной водой (не менее 1000 мл) и сушили при 120°С в течение 4 ч. В результате были получены эллипсовидные наноструктуры со средним размером 125 нм, состоящие из фрагментов со средним размером 3,5 нм (Фиг. 1). По составу наноструктуры Fe₂O₃ соответствуют фазе гематита (Фиг. 2). По данным адсорбции-десорбции азота, наноструктуры Fe₂O₃ имеют петлю гистерезиса в области капиллярной конденсации, что свидетельствует о мезопористой структуре образца. Средний размер мезопор – 17.1 нм, объём мезопор – 0,234 см³/г, микропор – менее 2 нм, объём микропор – 0,094 см³/г. Соотношение объема мезопор к объему микропор составило 2,48. Величина удельной поверхности, рассчитанная методом БЭТ (Брунауэр-Эммет-Теллер) составила 126 м²/г (Фиг. 3). Дзета-потенциал наноструктур Fe₂O₃ измеренный в воде при температуре 25 °С и рН7 составляет 35,8 мВ (Фиг. 4).

Пример 1. Преодоление устойчивости к пенициллину G метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру MRSA без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру MRSA в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того, в лунки добавляли антибиотик пенициллин G в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальными культурами, находящимися в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и пенициллином G по отдельности. Кинетику роста бактерий в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На фиг. 5 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры MRSA в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Пример. 2 Преодоление устойчивости к ампициллину метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру MRSA без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру MRSA в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того, в лунки добавляли антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальными культурами, находящимися в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и ампициллином по отдельности. Кинетику роста бактерий в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На Фиг. 6 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры MRSA в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Пример 3. Преодоление устойчивости к пенициллину G синегнойной палочки (P. aeruginosa)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру P. aeruginosa без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру P. aeruginosa в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того, в лунки добавляли антибиотик пенициллин G в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальной культурой P. aeruginosa, находящейся в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и пенициллином G по отдельности. Кинетику роста бактерий P. aeruginosa в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На фиг. 7 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры P. aeruginosa в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости синегнойной палочки (P. aeruginosa) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Пример 4 Преодоление устойчивости к ампициллину синегнойной палочки (P. aeruginosa)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру P. aeruginosa без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру P. aeruginosa в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того в лунки добавляли антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальной культурой P. aeruginosa, находящейся в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и ампициллином по отдельности. Кинетику роста бактерий P. aeruginosa в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На фиг. 8 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры P. aeruginosa в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости синегнойной палочки (P. aeruginosa) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Пример 5 Преодоление устойчивости к бензилпенициллину кишечной палочки (E. coli)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру E. coli без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру E. coli в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того в лунки добавляли антибиотик пенициллин G в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальной культурой E. coli, находящейся в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и пенициллином G по отдельности. Кинетику роста бактерий P E. coli в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На фиг. 9 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры E. coli в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости кишечной палочки (E. coli) к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe2O3 в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл; в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл).

Пример 6. Преодоление устойчивости к ампициллину кишечной палочки (E. coli)

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве отрицательного контроля использовали культуру E. coli без добавления антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Бактериальную культуру E. coli в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. Кроме того, в лунки добавляли антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальной культурой E. coli, находящейся в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ и ампициллином по отдельности. Кинетику роста бактерий E. coli в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. На Фиг. 10 приведены кинетические кривые роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости кишечной палочки (E. coli) к ампициллину при применении наноструктур Fe₂O₃: а – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ в концентрации 1 мг/мл; б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл;в – выраженная противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (1 мг/мл) в комбинации с ампициллином (50 мкг/мл).

Пример 7. Сравнительный пример

Для подтверждения технического результата предлагаемых в настоящем изобретении наноструктур Fe₂O₃ в сравнении с другими подобными структурами в экспериментах in vitro были использованы трехмерные структуры гематита с низкой удельной поверхностью 32 м²/г и дзета-потенциалом в воде при 25°С равным +24 мВ (далее – наноструктуры Fe₂O₃ (ГТС)).

Структуры синтезировали в гидротермальных условиях (ГТС) при 200°С, в течение 6 часов: в дистиллированную воду объемом 500 мл, помещали 5 г эллипсовидных пористых наноструктур Fe₂O₃. Суспензию обрабатывали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и переливали в автоклав гидротермального синтеза с тефлоновой вставкой. Автоклав плотно закрывали, нагревали до 200°С и выдерживали в течение 12 часов. Далее, после остывания автоклава до комнатной температуры, продукты реакции отфильтровывали с помощью вакуумного насоса и сушили при 120°С в течение 2 часов.

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве положительного контроля брали культуру без антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Культуры микроорганизмов в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры Fe₂O₃ (ГТС) в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. После инкубирования в микропланшетах при 37°С в течение различных промежутков времени (0, 1, 2, 3 ч) в лунки добавляли антибиотик в определенной концентрации, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальными культурами, находящимися в контакте с наноструктурами Fe₂O₃ (ГТС) и антибиотиками по отдельности. Кинетику роста бактерий в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. Количество живых бактерий определяли путем посева культур на плотный питательный агар в чашки Петри после инкубирования при 37°С в течение 24 часов. Выводы: показано, что синтезированные в гидротермальных условиях при 200°С, в течение 12 часов наноструктуры Fe₂O₃ (ГТС) с величиной удельной поверхности 32 м²/г и дзета-потенциалом в воде при 25°С равным +24 мВ оказывают менее выраженное действие на бактерии, вызывающее преодоление их устойчивости к антибиотикам.

На фиг. 11 приведены кинетические кривые роста бактериальных культур в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости MRSA к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур Fe₂O₃ (ГТС) с низкой удельной поверхностью, полученных в гидротермальных условиях при 200°С, в течение 12 часов (ГТС): отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами Fe₂O₃ (ГТС) в концентрации 1 мг/мл (зеленая кривая); б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл (фиолетовая кривая); в – слабая противомикробная активность при применении наноструктур Fe₂O₃ (ГТС) с концентрацией 1 мг/мл в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл) – синяя кривая.

Пример 8. Сравнительные пример

Для подтверждения технического результата предлагаемых в настоящем изобретении наноструктур Fe2O3 в сравнении с другими подобными структурами в экспериментах in vitro были также использованы микропористые структуры гетита с высокой удельной поверхностью 312 м²/г, размером пор менее 2 нм, с соотношением объем мезопор / объем микропор 0,24 и дзета-потенциалом в воде при 25 °С равным +32 мВ (далее – наноструктуры гетита).

Наноструктруры гетита синтезировали следующим образом в стакан объемом 250 мл помещали 50 раствора FeCl₃ с концентрацией 0,5 М. При постоянном перемешивании добавляли небольшими порциями (по 3-5 мл) 1 М раствор NH₄OH до создания рН≈9-10. Между введением каждой порции выдерживали 5 минут для наступления равновесия. Затем полученный осадок отфильтровывали, промывали до нейтральной реакции фильтрата и высушивали при 120°С в течении 2 часов.

Бактериальный рост оценивали в 96-луночных микропланшетах (объем лунки 300 мкл) по изменению оптической плотности бактериальной суспензии при λ=620 нм. В качестве положительного контроля брали культуру без антибактериальных агентов. Оптическую плотность определяли при помощи планшетного спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США). Культуры микроорганизмов в концентрации 10⁵ КОЕ/мл помещали в жидкую питательную среду, содержащую наноструктуры гетита в концентрации 1 мг/мл, при которой ингибирующий эффект (эффект подавления роста клеток) отсутствует. После инкубирования в микропланшетах при 37°С в течение различных промежутков времени (0, 1, 2, 3 ч) в лунки добавляли антибиотик в определенной концентрации, при которой ингибирующий эффект также отсутствует. Параллельно проводили контрольные исследования с бактериальными культурами, находящимися в контакте с наноструктурами гетита и антибиотиками по отдельности. Кинетику роста бактерий в лунках оценивали по изменению оптической плотности среды относительно контроля. Количество живых бактерий определяли путем посева культур на плотный питательный агар в чашки Петри после инкубирования при 37°С в течение 24 часов.

Выводы: показано, что синтезированные наноструктуры гетита с высокой удельной поверхностью 312 м²/г, размером пор менее 2 нм, с соотношением объем мезопор / объем микропор 0,24 и дзета-потенциалом в воде при 25°С равным +32 мВ оказывают менее выраженное действие на бактерии, вызывающее преодоление их устойчивости к антибиотикам.

На фиг. 12 приведены кинетические кривые роста бактериальных культур в жидкой питательной среде, оцененные по изменению оптической плотности суспензии в течение 24 ч инкубации, показывающие преодоление устойчивости MRSA к бензилпенициллину (пенициллину G) при применении наноструктур гетита с с высокой удельной поверхностью 312 м²/г, размером пор менее 2 нм, с соотношением объем мезопор / объем микропор 0,24 и дзета-потенциалом в воде при 25 °С равным +32 мВ, полученных осаждением щелочью из раствора FeCl₃: отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с наноструктурами гетита в концентрации 1 мг/мл (зеленая кривая); б – отсутствие ингибирующего эффекта при инкубировании только с пенициллином G в концентрации 50 мкг/мл (фиолетовая кривая); в – слабая противомикробная активность при применении наноструктур гетита с концентрацией 1 мг/мл в комбинации с пенициллином G (50 мкг/мл) – синяя кривая.

Пример 9. Исследование в экспериментах in vivo преодоления устойчивости бактерий с использованием элипсовидных пористых структур оксида железа Fe₂O₃ с высокой удельной поверхностью, использованных в экспериментах in vitro (далее – наноструктуры Fe₂O₃)

В качестве экспериментальных животных использованы самцы белых крыс породы “Vistar” весом от 254 до 346 г. При этом животные были разделены на 2 группы по 5 самцов в группе.

Первая группа: лечение одной раны проводилось наноструктурами Fe₂O₃, другая рана не подвергалась лечению.

Вторая группа: лечение ран проводилось внутримышечным введением пенициллина, при этом одна из ран также обрабатывалась наноструктурами Fe₂O₃.

В асептических условиях после двукратной обработки зоны вмешательства 70% спиртом, на предварительно депилированной коже подлопаточной области животных, формировали круглое сквозное отверстие диаметром 1,0 см. В качестве обезболивания использовался раствор кетамина путем внутримышечного его введения из расчета 0,3 мг на 1 кг веса. После наступления наркотического сна, крысу укладывали на бок и формировали модельные раны: контрольная (левая) и опытная (правая).

Далее дно и края ран инфицировали 24-часовой взвесью клинического штамма MRSA - суспензия бактерий в физиологическом растворе хлорида натрия приготовленная по оптическому стандарту мутности МакФарланда с концентрацией бактерий 1×10⁹ КОЕ/мл. Процедуру инфицирования ран проводили путем однократного их орошения 1,0 мл приготовленной суспензии бактерии с обязательным глухим хирургическим сшиванием краев, который создавал и обеспечивал благоприятные условия для успешного их инфицирования.

Далее на 3 сутки после инфицирования и сшивания краев ран проводили удаление шовных материалов и приступали к лечению.

При этом инфицированные MRSA контрольные раны не подвергали местному лечению, а опытные раны лечили с применением образцов наноструктур Fe₂O₃. У первой группы экспериментальных животных местное лечение ран проводили без применения антибиотиков. У третьей группы местное лечение дополняли системным ежедневным внутримышечным введением раствора пенициллина в течении 7 суток (10 мг/кг 1 раз в сутки). При этом к лечению ран приступали на 3 сутки от начала исследования и инфицирования ран.

Местное лечение опытных ран 1 группы экспериментальных животных проводили путем равномерного нанесения на ее поверхность микроложки (~2 мг) наноструктур Fe₂O₃ по схеме: 1-4 сутки ежедневно, далее через день. При этом контрольные раны не подвергали местному лечению. Местное лечение опытных ран 2–й группы животных проводили также с равномерным нанесением на ее поверхность микроложки (~2 мг) наноструктур Fe₂O₃ по схеме: 1-4 сутки ежедневно и далее через день с внутримышечным введением раствора пенициллина из расчета 10 мг/кг веса 1 раз в сутки. При этом контрольные раны этих групп также не подвергали местному лечению и использовались для сравнения динамики заживления пенициллином. В процессе проведения исследования изучали общее состояния животных, проводили микробиологическое исследование поверхности ран, оценивали состояния и течения регенераторных процессов.

Особенности течения раневого процесса и динамику регенераторных изменений оценивали по таким показателям как: наличие и характер воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищение ран от гнойного экссудата и некротических тканей, начала появление и характер грануляций, сроки начала эпителизации и закрытие ран (ЗР в %). Показатель ЗР рассчитывали, как процентное отношение разницы исходного размера раны и текущего размера к исходному размеру раны.

Результаты проведенных исследований по данным анализа показателей общего состояние животных свидетельствуют, о том, что у большинства из них (80%) первые 2-3 суток при удовлетворительном общем состоянии отмечали некоторое снижение двигательной активности, связанное с нанесенными им травмами, а также результатом успешного инфицирования ран с занесением в организм инфекционного агента и развитием гнойно–воспалительного процесса. Дальнейшее наблюдение за динамикой этих показателей свидетельствуют о постепенном восстановлении исходной двигательной активности спустя 2-3 суток от начала эксперимента. Подтверждением такой положительной динамики явилась и тенденция увеличения веса животных на 8-12 % от исходных данных, начиная с 5 суток и до конца исследования. Данный факт был обусловлен купированием воспроизведенного гнойно-воспалительного процесса местным применением наноструктур Fe₂O₃, снижением степени интоксикации организма, очищением ран от гнойного экссудата и некротических масс, дополнительным характером обезболивающего их влияния на раневой процесс. Такая положительная динамика течения была лучше отмечена у экспериментальных животных 2 группы, когда местное лечение комбинировалась внутримышечным применением пенициллина.

В группе животных, у которых местное лечение ран проводилось с применением наноструктур Fe₂O₃, на 3-5 сутки наблюдения наличие отека, гиперемии, припухлости и местной гипертермии окружающих тканей, а также свободного гнойного экссудата обнаружены не были. Однако раны у данной группы животных покрывались толстой коричневой коркой со следами оксида железа, иногда выступающие над окружающей кожной поверхностью и плотно прилипающих ко дну и ее краям. При удалении последних были отмечены неровные очертания (фестончатые) краев ран, чистое глубокое дно и без наличия кровотечения. Размеры ран в эти сроки наблюдения составили 1,1×0,8 cм, что было больше на 10,2 % по сравнению с исходными размерами опытных ран контрольной группы исследуемых животных. При этом показатели контрольных ран (без лечения) не претерпевали существенных изменений.

В группе животных где лечение инфицированных ран проводилось местным применением наноструктур Fe₂O₃ в сочетании с антибиотиком в течении 3-5 суток наблюдения в динамике течения раневого процесса существенных изменений не происходили и размеры ран оставались на уровне 1,05-1,1 см (при исходном 10 мм), а индекс ЗР составлял -10%. При этом опытные раны были покрыты коричневой коркой со следами оксида железа, выступающие у некоторых над окружающей поверхностью кожного покрова и плотно прилипших с их дном. Если на 2-3 сутки наблюдения после удаления корок глубокое дно ран у большинства из них оставались покрытыми сероватым налетом, а края имели неровные очертания, то к 5 суткам визуализировалось неглубокое чистое дно с отсутствием кровотечения, с ровными краями ран со следами свежих грануляций, исходящих преимущественно со дна.

Полная эпителизация опытных и контрольных ран животных первой группы на 6 сутки были отмечены только у 2 животных, в то же время у остальных опытных ран размер сохранялся в пределах 4,4 мм, а у контрольных он был равен 4,6 мм. При этом у некоторых из них еще сохранялись признаки продуктивного воспалительного процесса с наличием легкой гиперемии краев ран, но чистого дна, покрывающего грануляционной тканью. Следовательно индекс ЗР в опытной группе составлял 56%, а в контрольной 54%. При этом раны покрывались корками (следы оксида железа). В опытной группе они были выраженными и отличались ярким коричневым цветом по сравнению с ранами контрольных групп. К указанному сроку все раны имели чистое дно ровные края и отмечалось начало формирования грануляционной ткани, исходящее преимущественно со дна.

На 8 сутки у всех животных сохранялось наличие соответствующих ран, покрытых корками. Причем процесс коркообразования был наиболее выражен в опытных, где для лечения ран использовались наноструктуры Fe₂O₃. Средний размер ран к указанному сроку наблюдения в группе опытных составлял 2,6 мм, а в контрольных он был равен 3,1 мм. Индекс ЗР у опытных и контрольных ран составляли 74% и 69%, соответственно.

Дальнейшие наблюдения за ранами животных показали, что на 10 сутки у ран, подвергавшихся лечению наноструктурами Fe₂O₃ в комбинации с пенициллином, было отмечено их полное заживления. В группе, где лечение проходило без антибиотика, первыми эпителизировались опытные раны (12 сутки), а в 13-14 сутки контрольные. В ходе визуального наблюдения над опытными ранами было отмечено, что наноструктуры Fe₂O₃ при контакте с инфекционным агентом и его производными (гнойный экссудат, гнойный налет и некротические массы) обладают мощным адсорбирующим действием. Наноструктуры Fe₂O₃ оптимизируют процессы тканевой регенерации, оказывая позитивное влиянии на соединительнотканную ткань.

Таким образом, при лечении ран лабораторных животных, инфицированных метициллин-резистентным золотистым стафилококком (MRSA), пористыми наноструктурами Fe₂O₃ в комбинации с пенициллином (внутримышечное введением раствора пенициллина дозой 10 мг/кг 1 раз в сутки), ранозаживление происходит быстрее, чем при лечении наноструктурами и пенициллином по отдельности. На 8 сутки лечения индексе заживления раны (ЗР) при лечении наноструктуры Fe₂O₃ и пенициллином составил 74 %, при лечении только пенициллином индекс ЗР составил 69%, при лечении только наноструктурами ЗР составил 54%. Быстрое заживление обусловлено подавлением жизнеспособности патогенной микрофлоры за счет изменения чувствительности MRSA к пенициллину в присутствие наноструктур Fe₂O₃. Данные потенцирующего действия приведены в таблице 1.

Таблица 1

Сутки лечения после роспуска швов Показатель закрытия раны, % 1 группа 2 группа левая рана (без лечения) правая рана (лечение наноструктурами Fe₂O₃) левая рана (лечение внутримышечными инъекциями пенициллина) правая рана (комбинированное лечение пенициллином и наноструктурами Fe₂O₃) 3 0 0 0 0 6 12 54 21 56 8 32 69 43 74 10 65 85 77 100 12 88 100 100 - 14 100 - - -

Группа изобретений относится к медицине, а именно к потенцированию действия антибиотиков, и может быть использована для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, инфицированных множественно-устойчивыми бактериями. Для этого применяют пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), обладающие свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам, характеризующиеся тем, что они имеют удельную поверхность не менее 120 м²/г; дзета-потенциал, измеренный в воде при 25°С, не менее +30 мВ, и отношение объема мезопор к объему микропор, большее или равное 2. Группа изобретений относится также к способу получения указанных пористых наноструктур Fe₂O₃ (гематита), их применению в качестве средства преодоления устойчивости (резистентности) бактерий к антибиотикам и к продукту, содержащему указанные пористые наноструктуры Fe₂O₃ и, по меньшей мере, один антибиотик в виде комбинированного препарата. Группа изобретений обеспечивает возможность использования низкотоксичных антибиотиков и позволяет уменьшить дозу антибиотика при лечении ран, инфицированных множественно-устойчивыми бактериями, за счет повышения чувствительности резистентных штаммов бактерий к антибиотикам. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 9 пр.

1. Пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), обладающие свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам, характеризующиеся тем, что они имеют удельную поверхность не менее 120 м²/г; дзета-потенциал, измеренный в воде при 25°С не менее +30 мВ, и отношение объема мезопор к объему микропор, большее или равное 2.

2. Пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит) по п. 1, отличающиеся тем, что они имеют развитую систему мезопор с размером от 2 до 50 нм и микропор с размерами менее 2 нм.

3. Пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит) по п. 1, отличающиеся тем, что имеют размер в интервале от 50 до 200 нм и состоят из множества фрагментов размером от 2 до 5 нм.

4. Способ получения пористых наноструктур Fe₂O₃ (гематита), обладающих свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам, характеризующийся тем, что он включает:

– получение металлоорганического золя железа Fe(CH₃COO)₃;

– добавление к полученному упомянутому золю дистиллированной воды и кипячение его в течение 5 – 7 часов при атмосферном давлении;

– проведение охлаждения полученной смеси до комнатной температуры;

– фильтрование осадка;

– промывание водой и сушка при температуре при 120-125°С в течение не менее 3 часов.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что металлоорганический золь железа получают путем добавления с постоянным перемешиванием раствора хлорида железа (III) FeCl₃ с концентрацией 1,5±0,01 М к раствору ацетата натрия CH₃COONa с концентрацией 2,2±0,01 М в соотношении 1:1, последующего перемешивания полученной смеси в течение 15-20 мин, затем смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 6 ч при постоянном перемешивании с обратным холодильником.

6. Применение пористых наноструктур Fe₂O₃ (гематит) по пп. 1-3 в качестве средства преодоления устойчивости (резистентности) бактерий к антибиотикам за счёт повышения чувствительности резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что упомянутые наноструктуры используют в качестве средства преодоления устойчивости (резистентности) как грамположительной, так и грамотрицательной бактерии к антибиотикам.

8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что бактерия представляет собой грамотрицательную и выбрана из родов Pseudomonas или Escherichia, предпочтительно, где бактерия представляет собой одну из Pseudomonas aeruginosa или E. coli, которые устойчивы к одному или более антибиотикам, выбранным из пенициллина, метициллина, нитроцефина, грамицидина, гентамицина, цефтриаксона, цефтазидима, ампициллина; или представляет собой их клинический штамм или клинический изолят.

9. Применение по п. 7, отличающееся тем, что бактерия представляет собой грамположительную и выбрана из рода S. aureus и представляет собой клинический штамм или клинический изолят MRSA, которые устойчивы к одному или более антибиотикам, выбранным из пенициллина, метициллина, нитроцефина, грамицидина, ванкомицина, сультасина и ампициллина.

10. Применение по п. 7, отличающееся тем, что антибиотик выбран из β-лактамов, аминогликозидов, катионных полипептидов, тетрациклинов, полипептидных антибиотиков и хинолонов, предпочтительно из β-лактамов (пенициллина, метициллина, ампициллина, нитроцефина цефтриаксона, цефтазидима), катионных полипептидов (грамицидина) и аминогликозидов (гентамицина), а также комбинированного препарата сультасина на основе ампициллина и сульбактама.

11. Применение по п. 6, отличающееся тем, что упомянутые наноструктуры используют для лечения у субъекта инфицированной раны, позволяющего преодолеть устойчивость к антибиотикам, как за счёт обработки раны субъекта эффективным количеством антибиотика, так и введения субъекту антибиотика, например, внутримышечно в комбинации или раздельно с эффективным количеством упомянутого Fe₂O₃.

12. Продукт, содержащий пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), имеющие удельную поверхность не менее 120 м₂/г, дзета-потенциал, измеренный в воде при 25°С не менее +30 мВ, и отношение объема мезопор к объему микропор, большее или равное 2, и, по меньшей мере, один антибиотик в виде комбинированного препарата для одновременного или последовательного применения для преодоления устойчивости к антибиотику у грамположительной и грамотрицательной бактерии.