Применение наночастиц Fe-FeO со структурой ядро-оболочка для повышения чувствительности бактерий к антибиотикам Российский патент 2021 года по МПК A61K31/43 A61K31/7036 A61K33/26 A61P17/02 A61P31/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к медицине, а именно к потенцированию действия антибиотиков и может быть использовано для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, инфицированных множественно-устойчивыми бактериями.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известен магнитный нанокомпозит, раскрытый в [RU 2565677, опубл. 20.10.2015]. Магнитный нанокомпозит имеет структуру «ядро-оболочка-матрица», где ядром являются наночастицы железа с подавляющим преобладанием железа в нульвалентном состоянии Fe⁰ (74,5%), и его оксидов 25,5%, оболочкой, покрывающей наночастицы, является феррит, а матрицей - пироуглерод в состоянии в sp2-гибридизации. Общее содержание железа Fe⁰ в полученном магнитном нанокомпозите материале составляет 31,01-38,25%, намагниченность насыщения составляет 3-59 Гс•см3/г.

К недостаткам можно отнести наличие гидрофобного углеродного слоя на поверхности частиц, ухудшающего мембранотропные свойства наночастиц.

В статье авторов You Qiang, Jiji Antony, Amit Sharma, Joseph Nutting, Daniel Sikes and Daniel Meyer [Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications // Journal of Nanoparticle Research (2006) 8: 489–496] описаны наночастицы размером до 100 нм со структурой «ядро-оболочка», где ядро – это железо, а оболочка – оксид железа толщиной примерно 2,5 нм независимо от размера частиц. Описанные наночастицы предлагается использовать в биомедицинских приложениях как контраст, для разделения клеток или доставки лекарств.

К недостатком таких частиц можно отнести низкую величину дзета-потенциала наночастиц, обусловленную тонкой оксидной оболочкой на поверхности железного ядра, которая не обеспечивает мембранотропные свойства наночастиц.

Известно применение пористых наноструктур Fe₂O₃ для преодоления устойчивости бактерий к антибиотикам [RU 2720238 C1, опубл.: 28.04.2020] раскрытие которого основано на неожиданном наблюдении, что пористые наноструктуры Fe₂O₃ (гематит), имеющие удельную поверхность не менее 50 м²/г; положительный дзета-потенциал, у которых отношение объема мезопор к объему микропор больше или равно 2 обладают свойством повышать чувствительность резистентных штаммов бактерий к антибиотикам.

К недостаткам данного применения (или частиц) можно отнести то, что такие структуры оказывают потенцирующее действие при высокой концентрации наноструктур – не менее 1 мг/мл и антибиотика – 50 мкг/мл.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие основано на неожиданном наблюдении, что наночастицы Fe-Fe₃O₄ со структурой ядро-оболочка, имеющие положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С от +3,6 мВ до +10,4 мВ; средний размер частиц менее 100 нм; величину удельной поверхности от 6,7 м²/г до 9,3 м²/г, содержание оксида железа от 3 до 92 масс.%, обладают свойством повышать чувствительность бактерий к антибиотикам.

Задачей настоящего изобретения является применение вышеописанных наночастиц Fe-Fe₃O₄ для снижения действующей концентрации антибиотиков за счёт повышения чувствительности бактерий, в том числе резистентных штаммов, к лекарственным препаратам.

Технический результат - уменьшение дозы антибиотика, возможность применения низкотоксичных антибиотиков, повышение эффективности лечения.

Поставленная задача достигается тем, что наночастицы Fe-Fe₃O₄ (железо-оксид железа) со структурой ядро-оболочка, где ядро это Fe, а оболочка – Fe₃O₄, имеющие положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С от +3,6 мВ до +10,4 мВ, величину удельной поверхности от 6,7 м²/г до 9,3 м²/г, содержание оксида железа от 3 до 92 масс.% применяют в качестве средства повышения чувствительности бактерий, в том числе резистентных штаммов, к антибиотикам.

При этом содержание оксида железа (Fe₃O₄) предпочтительно составляет не менее 39 масс.% при толщине оболочки оксида железа, предпочтительно составляющей не менее 3 нм.

При этом толщина оболочки оксида железа, составляет не менее 3 нм.

Предпочтительно, что величина дзета-потенциала наночастиц в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С составляет от 8 мВ до 13 мВ.

Предпочтительно, что средний размер частиц составляет не менее 100 нм; предпочтительно 60-80 нм.

Причем упомянутые структуры используют в качестве средства повышения чувствительности как грамположительной, так и грамотрицательной бактерии к антибиотикам.

Кроме того, бактерия представляет собой грамотрицательную и выбрана из родов Pseudomonas aeruginosa, которая устойчива к ампициллину.

Кроме того, бактерия представляет собой грамположительную и выбрана из рода Staphylococcus aureus и представляет собой клинический штамм или клинический изолят метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA), который устойчив к ампициллину.

При этом антибиотик выбран из β-лактамов, например, ампициллин, и из аминогликозидов, например, амикацин.

Синергетический потенцирующий эффект (когда концентрация живых клеток после инкубированияя меньше 50 % относительно контроля) по отношению к MRSA достигается при использовании концентрации наночастиц от 0,025 до 0,075 мг/мл, и ампициллина с концентрацией не менее 16 мкг/мл или амикацина с концентрацией не менее 8 мкг/мл. По отношению к P. aeruginosa синергетический потенцирующий эффект достигается при использовании концентрации наночастиц от 0,05 до 0,125 мг/мл и ампициллина с концентрацией не менее 64 мкг/мл или амикацина с концентрацией не менее 8 мкг/мл.

Потенцирующим действием обладают наночастицы Fe-Fe₃O₄, содержащие не менее 39 масс.% Fe₃O₄. Это связано с величиной дзета-потенциала наночастиц, которая для данных наночастиц в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С составляет 9,6±1,8 мВ. Положительный дзета-потенциал наночастиц способствует более интенсивной адгезии к отрицательно заряженным бактериальным мембранам, что, в свою очередь, приводит к деполяризации мембран и более интенсивному проникновению антибиотика к мишеням действия, более интенсивному проникновению наночастиц вместе с антибиотиками внутрь бактерий, а также нарушению защитных функций бактерий, например инактивации ферментов, отвечающих за выработку бета-лактамазы.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность изобретения поясняется также нижеприведенными примерами конкретного выполнения.

В таблице 1 представлены основные характеристики использованных синтезированных наночастиц для оценки их антимикробной активности.

Таблица 1 – Характеристики наночастиц Fe-Fe₃O₄

Образец Содержание оксида железа, масс. % Расчетное значение толщины оболочки, нм Дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С Величина удельной поверхности, м²/г Средний размер частиц, нм 1 3 0,5±0,2 3,6±1,1 9,3±1,0 66±1 2 19 3,9±0,7 5,6±1,3 8,5±1,1 68±2 3 39 7,9±2,0 9,6±1,8 6,7±0,9 81±5 4 92 20,2±2,2 10,4±2,3 7,3±0,8 78±3

Пример 1

Оценка антимикробной активности наночастиц в комбинации с ампициллином или амикацином по отношению к метициллин-резистентному золотистому стафилококку (MRSA), штамм AATCC 43300.

Для оценки потенцирующей способности наночастиц по отношению к ампициллину или амикацину определяли дозы наночастиц и антибиотиков, при которых выживает не более 50 % бактерий (IC50). В исследовании использовали суточную культуру MRSA. При определении IC50 наночастиц, 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации: 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 мкг/мл. Суспензию наночастиц и бактерий встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

При определении IC50 антибиотиков, 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего антибиотик в концентрации: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 мкг/мл. Суспензию бактерий с антибиотиком встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли количество выживших бактерий после инкубирования с наночастицами или антибиотиками. Концентрацию, при которой выжило 50 % бактерий, принимали за IC50. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Антибактериальная активность наночастиц Fe-Fe₃O₄ по отношению к MRSA

Действующее вещество IC50 мкг/мл Fe-Fe₃O₄ (3 масс. % Fe₃O₄) 200 Fe-Fe₃O₄ (19 масс. % Fe₃O₄) 200 Fe-Fe₃O₄ (39 масс. % Fe₃O₄) 200 Fe-Fe₃O₄ (92 масс. % Fe₃O₄) 200 Ампициллин 32 Амикацин 16

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что выживаемость бактерий MRSA составляет 50% при применении наночастиц Fe-Fe₃O₄ в концентрации 200 мкг/мл. Для ампициллина эта концентрация составляет 32 мкг/мл, а для амикацина – 16 мкг/мл.

Для оценки комбинированного воздействия использовали наночастицы в концентрации 75, 50, 25 мкг/мл (ниже IC50 более, чем в 2 раза), при которых наблюдается низкий ингибирующий эффект (эффект подавления роста бактерий) и субоптимальные концентрации антибиотиков – 16 мкг/мл для ампициллина и 8 мкг/мл для амикацина (в 2 раза ниже IC50).

Для этого использовали суточную культуру MRSA. 1 мл бактериальной культуры MRSA в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 2 мл бульона Мюллера-Хинтона, чтобы концентрация наночастиц составляла 75, 50 и 25 мкг/мл.

Далее, в пробирки добавляли 1 мл раствора антибиотика, так, чтобы концентрация ампициллина в пробирках составила 16 мкг/мл, а амикацина – 8 мкг/мл, и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли комбинацию наночастиц и антибиотика, при концентрации которых выживало не более 50 % бактерий. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Комбинированное антибактериальное действие наночастиц Fe-Fe₃O₄ с антибиотиками по отношению к MRSA.

Образец Концентрация, мкг/мл Количество выживших бактерий, % Ампициллин,
16 мкг/мл Амикацин,
8 мкг/мл Без антибиотика Fe-Fe₃O₄ (3 масс. % Fe₃O₄) 75 56±3 55±3 83±4* 50 72±3 69±2 91±4* 25 88±4 83±4 95±5* Fe-Fe₃O₄ (19 масс. % Fe₃O₄) 75 53±2 58±3 81±4* 50 64±2 67±3 85±5* 25 71±4 73±4 93±5* Fe-Fe₃O₄ (39 масс. % Fe₃O₄) 75 11±3 6±2 81±3* 50 27±3 21±4 86±4* 25 44±4 38±4 91±4* Fe-Fe₃O₄ (92 масс. % Fe₃O₄) 75 0 0 85±5* 50 11±3 6±2 88±5* 25 29±4 34±5 93±6* Без наночастиц 0 86±4* 81±3* 100*

* Результаты из эксперимента по определению IC50 наночастиц и IC50 антибиотиков

Комбинированное применение наночастиц, содержащих 3 и 19 масс. % Fe₃O₄ и ампициллина или амикацина не приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. Следовательно, при инкубировании бактерий MRSA в комбинации с антибиотиками и наночастицами с тонкой оксидной пленкой толщиной не более 3,9 нм в диапазоне концентраций наночастиц от 25 мкг/мл до 75 мкг/мл не наблюдается потенцирующее синергетическое действие.

Комбинированное применение наночастиц, содержащих 39 и 92 масс % Fe₃O₄ и ампициллина или амикацина приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. При инкубировании бактерий MRSA в комбинации с антибиотиками и наночастицами в диапазоне концентраций наночастиц от 25 мкг/мл до 75 мкг/мл наблюдается потенцирующее синергетическое действие.

Пример 2

Оценка антимикробной активности наночастиц в комбинации с ампициллином или амикацином по отношению к синегнойной палочке P.aeruginosa, штамм ATCC 9027.

Для оценки потенцирующей способности наночастиц по отношению к ампициллину или амикацину определяли дозы наночастиц и антибиотиков, при которой выживает не более 50 % бактерий (IC50). В исследовании использовали суточную культуру P.aeruginosa.

При определении IC50 наночастиц, 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации: 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 мкг/мл. Суспензию наночастиц и бактерий встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

При определении IC50 антибиотиков, 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 3 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего антибиотик в концентрации: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 мкг/мл. Суспензию бактерий с антибиотиком встряхивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли количество выживших бактерий после инкубирования с наночастицами или антибиотиками. Концентрацию, при которой выжило 50 % бактерий, принимали за IC50. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.

Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Антимикробная активность наночастиц Fe-Fe₃O₄ по отношению к P.aeruginosa

Действующее вещество IC50 мкг/мл Fe-Fe₃O₄ (3 масс. % Fe₃O₄) 500 Fe-Fe₃O₄ (19 масс. % Fe₃O₄) 500 Fe-Fe₃O₄ (39 масс. % Fe₃O₄) 500 Fe-Fe₃O₄ (92 масс. % Fe₃O₄) 500 Ампициллин 128 Амикацин 16

Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что выживаемость бактерий P.aeruginosa составляет 50% при применении наночастиц Fe-Fe₃O₄ в концентрации 500 мкг/мл. Для ампициллина эта концентрация составляет 128 мкг/мл, а для амикацина – 16 мкг/мл.

При комбинированном воздействии с антибиотиками использовали наночастицы в концентрации 125, 75, 50 мкг/мл (ниже IC50 более, чем в 2 раза), при которых наблюдается низкий ингибирующий эффект (эффект подавления роста бактерий) и субоптимальные концентрации антибиотиков – 64 мкг/мл для ампициллина и 8 мкг/мл для амикацина (в 2 раза ниже IC50).

Для этого использовали суточную культуру P.aeruginosa. 1 мл бактериальной культуры P.aeruginosa в концентрации 5×10⁵ КОЕ/мл помещали в 2 мл бульона Мюллера-Хинтона, содержащего наночастицы в концентрации 125, 75 или 50 мкг/мл.

Далее, в пробирки добавляли 1 мл раствора антибиотика, так чтобы концентрация ампициллина в пробирках составила 64 мкг/мл, а амикацина – 8 мкг/мл и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С.

После инкубирования, методом серийных разведений высевали содержимое пробирок на чашки Петри с питательным агаром, инкубировали в течение 24 часов при 37 °С, осуществляли подсчет колоний и определяли комбинацию наночастиц и антибиотика, при концентрации которых выживало не более 50 % бактерий. Для подтверждения достоверности результатов исследования проводили с шестикратным повторением.

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Комбинированное антимикробное действие наночастиц Fe-Fe₃O₄ с антибиотиками по отношению к P.aeruginosa

Образец Концентрация, мкг/мл Количество выживших бактерий, % Ампициллин,
64 мкг/мл Амикацин,
8 мкг/мл Без антибиотика Fe-Fe₃O₄ (3 масс. % Fe₃O₄) 125 62±2 56±3 80±4* 75 74±3 64±2 85±4* 50 79±3 73±3 93±4* Fe-Fe₃O₄ (19 масс. % Fe₃O₄) 125 57±3 53±2 82±3* 75 65±3 63±3 87±4* 50 73±3 69±4 94±4* Fe-Fe₃O₄ (39 масс. % Fe₃O₄) 125 21±2 17±2 80±3* 75 29±3 23±2 84±4* 50 40±3 35±3 92±4* Fe-Fe₃O₄ (92 масс. % Fe₃O₄) 125 13±3 9±2 83±4* 75 23±3 17±2 91±5* 50 33±4 31±5 94±5* Без наночастиц 0 93±5* 97±3* 100*

* Результаты из эксперимента по определению IC50 наночастиц и IC50 антибиотиков

Комбинированное применение наночастиц, содержащих 3 и 19 масс. % Fe₃O₄ и ампициллина или амикацина не приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением. Следовательно, при инкубировании бактерий P.aeruginosa в комбинации с антибиотиками и наночастицами с тонкой оксидной пленкой толщиной не более 3,9 нм в диапазоне концентраций наночастиц от 50 мкг/мл до 125 мкг/мл не наблюдается потенцирующее синергетическое действие.

Комбинированное применение наночастиц, содержащих 39 и 92 масс % Fe₃O₄ и ампициллина или амикацина приводит к существенному подавлению роста бактерий по сравнению с их раздельным применением.

При инкубировании бактерий P.aeruginosa в комбинации с антибиотиками и наночастицами в диапазоне концентраций наночастиц от 50 мкг/мл до 125 мкг/мл наблюдается потенцирующее синергетическое действие.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к применению наночастиц Fe-Fe₃O₄ (железо-оксид железа) со структурой ядро-оболочка, где ядро – это Fe, а оболочка – Fe₃O₄, в качестве средства повышения чувствительности бактерий резистентных штаммов, таких как Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, к антибиотикам, таким как ампициллин и амикацин, при лечении ран, причем наночастицы выбраны из 1) имеющих положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С 9,6±1,8 мВ, величину удельной поверхности 6,7±0,9 м²/г, содержание оксида железа (Fe₃O₄) 39 масс.% и средний размер частиц 81±5 нм или 2) имеющих положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С 10,4±2,3 мВ, величину удельной поверхности 7,3±0,8 м²/г, содержание оксида железа (Fe₃O₄) 92 масс.% и средний размер частиц 78±3 нм. Технический результат заключается в уменьшении дозы антибиотика, возможности применения низкотоксичных антибиотиков, повышении эффективности лечения. 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

1. Применение наночастиц Fe-Fe₃O₄ (железо-оксид железа) со структурой ядро-оболочка, где ядро - это Fe, а оболочка - Fe₃O₄, в качестве средства повышения чувствительности бактерий резистентных штаммов к антибиотикам при лечении ран, причем наночастицы выбраны из

1) имеющих положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С 9,6±1,8 мВ, величину удельной поверхности 6,7±0,9 м²/г, содержание оксида железа (Fe₃O₄) 39 масс.% и средний размер частиц 81±5 нм или

2) имеющих положительный дзета-потенциал в деионизованной воде при рН 7,4 и температуре 37 °С 10,4±2,3 мВ, величину удельной поверхности 7,3±0,8 м²/г, содержание оксида железа (Fe₃O₄) 92 масс.% и средний размер частиц 78±3 нм.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что наночастицы используют в качестве средства повышения чувствительности как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий к антибиотикам.

3. Применение по п. 2, отличающееся тем, что грамотрицательные бактерии представляют собой бактерии Pseudomonas aeruginosa, которые устойчивы к ампициллину.

4. Применение по п. 2, отличающееся тем, что грамположительные бактерии представляют собой бактерии Staphylococcus aureus, выбранные из клинического штамма или клинического изолята метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA), который устойчив к ампициллину.

5. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что антибиотик выбран из β-лактамов, например, ампициллина, или из аминогликозидов, например, амикацина.

6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что для достижения синергетического потенцирующего эффекта по отношению к Staphylococcus aureus (MRSA) используют концентрацию наночастиц от 0,025 до 0,075 мг/мл и ампициллин с концентрацией 16 мкг/мл или амикацин с концентрацией 8 мкг/мл.

7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что для достижения синергетического потенцирующего эффекта по отношению к Pseudomonas aeruginosa используют концентрацию наночастиц от 0,05 до 0,125 мг/мл и ампициллин с концентрацией 64 мкг/мл или амикацин с концентрацией 8 мкг/мл.