Способ получения биологически активного комплексного препарата на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта Российский патент 2020 года по МПК A61K31/714 A61P3/02 

Изобретение относится к фармакологии, в частности, к способам получения биологически активных препаратов и может быть использовано в ветеринарии в качестве лекарственного средства.

Поиск и разработка средств метаболической направленности на основе экологически безопасных и экономически доступных компонентов является приоритетной задачей современной биотехнологии и биохимии. Одним из важнейших эссенциальных (жизненно необходимых) для живого организма витаминов является цианокобаламин (Витамин В12). Фармакодинамика цианокобаламина сложная. Он участвует в азотистом, углеводном, минеральном обмене веществ, в образовании незаменимых аминокислот холина, метионина, креатина, нуклеиновых кислот. Под влиянием цианокобаламина повышается эритропоэз, улучшается функция нервной системы, улучшается развитие эмбрионов. Он незаменимый участник энергетического обмена. Выполняет каталитические функции при синтезе практически всех незаменимых аминокислот. Витамин В12 необходим для здорового производства эритроцитов, нормальных по размеру и зрелости. Незрелые, а также неподходящие по размеру красные кровяные тельца могут привести к более низкому уровню кислорода в крови, общим симптомам слабости и истощения. Дефицит витамина В12 приводит к проблемам с метаболизмом фолиевой кислоты. В результате, ДНК не может должным образом воспроизводиться и получает повреждения. Поврежденная ДНК может непосредственно способствовать образованию рака. В этой связи витамин В12 наряду с фолиевой кислотой исследуется как способ предотвращения и лечения определенных видов злокачественных поражений кожи и опоясывающего лишая. Низкий уровень витамина В12 увеличивает риск развития болезни Альцгеймера у пожилых мужчин и женщин. Данный витамин необходим для синтеза нейротрансмиттера, связанного с регуляцией настроения. В этой связи В12 помогает предотвратить депрессию. Витамин В12 помогает превращать белки, жиры и углеводы в «топливо» для нашего организма. Без него люди часто испытывают хроническую усталость. Витамин В12 также необходим для передачи сигналов нейротрансмиттера, который помогает мышцам сжиматься и поддерживает уровень энергии в течение дня.

Исключительно велика роль витамина В12 в организме животных, особенно лактирующих коров. Это связано с тем, что синтезируемая в рубце коров пропионовая кислота, основной предшественник для образования глюкозы, тесно связана с витамином В12. При дефиците витамина В12 ухудшается усвоение пропионовой кислоты организмом животного, что быстро приводит к энергетическому дефициту и, как следствие, снижению молочной продуктивности и качества молока. При недостаточности В12 у коров развиваются такие заболевания, как молочная лихорадка, кетоацидоз и ожирение печени.

В ветеринарной медицине показаниями к применению цианокобаламина являются: слабое развитие и отставание в росте молодых животных, хронические желудочно-кишечные заболевания, анемия, ослабление метаболической функции печени, нарушения кислотно-щелочного баланса, гипопротемия, суставные патологии, нарушения функции пищеварительной системы и поджелудочной железы, стимуляция энергетического обмена, невриты, извращения аппетита. Беременным препарат назначают для улучшения роста и развития плода.

В гуманной медицине витамин В12 является наиболее эффективным противоанемическим препаратом. В этой связи его с успехом применяют для лечения, злокачественного малокровия, при постгеморрагических и железодефицитных анемиях, апластических анемиях у детей, анемиях алиментарного характера, анемиях, вызванных токсическими и лекарственными веществами, и при других видах анемий.

Цианокобаламин представляет собой сложное соединение, основу которого составляет диэфирфосфорная кислота, кислотная группа которой нейтрализована зарядом кобальта (Мозгов И.Е. Фармакология. М.: Колос, 1974. С. 213-214.

Ныне применяемая в ветеринарии инъекционная форма препарата представляет собой водный раствор для инъекций, содержащий в 1 мл в 500 мкг цианокобаламина (витамина B₁₂), а также натрия хлорид и воду для инъекций - до 1 мл. Препарат вводят подкожно или внутримышечно 1-2 раза в день. При этом дозировка полезного вещества не должна превышать 5-10 мкг на килограмм массы тела. Это создает большие проблемы при индивидуальном применении препарата животным с небольшой массой тела, исключает или существенно ограничивает возможность его применения. Известен инъекционный препарат на основе витаминов группы В производного 3 оксипиридина (Витамин В6) и янтарной кислоты Эмицидин. В состав препарата входит 2,5% действующего вещества. Включение янтарной кислоты в состав препарата позволило улучшить его метаболическую активность. Тем не менее, данный препарат имеет ограничения по применению. Согласной действующей инструкции препарат применяют лишь домашним (непродуктивным) животным.

Возможность применения янтарной кислоты или ее солей-сукцинатов для улучшения метаболической активности цианокобаламина не изучалась. Между тем, уникальные свойства янтарной кислоты ныне с успехом используются для улучшения фармакологической активности и снижения токсического действия многих лекарственных средств (Коваленко А.Л., Белякова Н.В. Янтарная кислота: фармакологическая активность и лекарственные формы. Фармация 2000, №5-6. - С. 40-42). Сама кислота -абсолютно безвредное, не накапливающееся вещество.

Общим недостатком вышеуказанных препаратов цианокобаламина и эмицидина является относительно короткий период их биологического действия. В этой связи эти препараты вводят до 2-х раз в день. Такой учащенный курс введения препаратов не является рациональным, создает определенные трудности по применению, кроме того, в виду болезненной реакции на введение, вызывает повышенную стрессовую реакцию у животных.

Вышеуказанные недостатки инъекционной формы препарата цианокобаламин вполне могут быть устранены при включении в его состав пролонгатора. В качестве пролонгатора предлагается использовать поливиниловый спирт. Чистый поливиниловый спирт не имеет запаха и вкуса, не является токсичным. Отличаясь полной физиологической безвредностью, он используется в пищевой промышленности как желирующее средство (для получения желе), в фармации и медицине. Единственным его растворителем служит вода. Поливиниловый спирт не без успеха реализован в хорошо известном и популярном препарате йодинол.

Задачей изобретения является способ получения препарата на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта, обладающего пролонгированным действием.

Новым является то, что в водный раствор цианокобаламина с янтарной кислотой дополнительно вводится поливиниловый спирт в количестве не менее 1%. В ходе патентного поиска нами не выявлено сведений по использованию поливинилового спирта для повышения эффективности цианокобаламина. Кроме того, в способе предлагается использовать более простой состав действующих компонентов, а именно поливиниловый спирт - 1,0%; янтарная кислота 1%, цианокобаламин 1%; дистиллированная вода - остальное. При этом 1% концентрация поливинилового спирта, янтарной кислоты и цианокобаламина соответствует количественному содержанию каждого из вышеуказанных компонентов в количестве 10 мг в 1 мл, что позволяет легче стандартизировать конечный продукт, исключить трудности определения дозировки и вероятность передозировки при его применении.

Способ получения нового состава препарата, иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В стеклянную колбу внесли навеску из 10 г поливинилового спирта. В нее влили 700 мл воды для инъекций. Допускается использование дистиллированной воды. При нагревании и постоянном перемешивании осуществили полное растворение поливинилового спирта. В другую стеклянную колбу внесли навеску из 10 г янтарной кислоты и 10 г цианокобаламина. В нее влили 250 мл дистиллированной воды. При нагревании до 70-80°С провели растворение кислоты. При охлаждении до 30°С провели смешивание содержимого обеих колб и добавили воды до 1000 мл. При смешивании растворов образовалась единая розового цвета жидкость. При хранении расслоения или выпадения осадка не происходит.

Пример 2. В стеклянную колбу внесли навеску из 10 г поливинилового спирта. В нее влили 700 мл воды для инъекций. Допускается использование дистиллированной воды. После взбалтывания раствор оставили на 12 часов при комнатной температуре с последующим нагреванием до полного растворения спирта. Такая выдержка позволяет без постоянного перемешивания добиться лучшего растворения поливинилового спирта при нагревании раствора. В другую стеклянную колбу внесли навеску из 10 г янтарной кислоты и 10 г цианокобаламина. В нее влили 250 мл дистиллированной воды. При нагревании до 70-80°С провели растворение кислоты. При охлаждении до 25°С провели смешивание содержимого обеих колб и добавили воды до 1000 мл. При смешивании растворов образовалась единая розового цвета жидкость. При хранении расслоения или выпадения осадка не происходит.

Таким образом, способ получения метаболического препарата на основе цианкобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта заключается в растворении данных компонентов в воде для инъекций или дистиллированной воде, расфасовку по флаконам и стерилизацию автоклавированием. В 1 мл препарата содержится цианокобаламина - 10 мг (100 мкг).

Стерилизация растворов цианокобаламина во флаконах емкостью 100 мл автоклавированием в режиме 1,0-1,1 атм. в течение 20 мин. не изменяет физических свойств конечного продукта.

При определении безвредности препарата установлено, что белые мыши массой 18-20 г без каких-либо осложнений перенесли 5-кратный курс ежедневного внутрибрюшинного введения препарата в объеме 0,25 мл.

При внутримышечном введении препарата в дозе 3,0 мл клинически здоровым бычкам массой тела 75-80 кг каких-либо побочных реакций выявлено не было. Это давало основание для проведения клинических испытаний препарата непосредственно на животных с признаками В12 недостаточности. Место проведения клинических опытов - молочный комплекс учхоза «Знаменский» Курской ГСХА.

Примеры применения. Пример 1. Клинический опыт провели на трех группах телят месячного возраста с признаками отставания в росте и развитии. В каждой группе было по 3 теленка с массой тела в пределах 32-34 кг. Эта категория животных наиболее проблемная при В12 недостаточности. Инструкция по применению фармакологического препарата цианокобаламин по сути не позволяет определить точную дозировку. В связи с чем цианокобаламин не регламентирован к применению на телятах раннего возраста.

В клинических опытах в качестве контрольного сравнения использовали 1% раствор цианокобаламина в комплексе с 1% янтарной кислотой (без поливинилового спирта) и 1% водный раствор цианокобаламина на поливиниловом спирте. Препараты вводились внутримышечно в объеме 2 мл. Это достаточно стандартная минимальная дозировка для большинства инъекционных препаратов, применяемых в ветеринарии. Продолжительность клинического наблюдения 14 дней. Спустя 2 недели провели повторный курс введения в объеме 2,5 мл. Эффективность применения контролировалась клинически и на основании влияния испытуемых препаратов на биохимический и гематологичесий статус подопытных животных.

В ходе клинических наблюдений какого-либо побочного действия на введение препаратов выявлено не было.

Клинически выраженные изменения у подопытных телят всех групп начали проявляться спустя сутки. Вначале снижением лизания волосяного покрова. Это косвенно подтверждало редуцирование симптомов В12 недостаточности. На третьи-четвертые сутки у телят первой и второй групп заметно вырос аппетит. С каждым днем он усиливался. Это позитивно отражалось на общем состоянии телят этих групп.

На 14-е сутки у телят первой и второй подопытных групп выраженно улучшилось состояние волосяного покрова. В целом клиническое состояние телят первой и второй подопытных групп было намного лучше, чем у их сверстников из третьей группы.

Результаты биохимических исследований сыворотки крови на 14-е и 28-е сутки были сопоставлены с исходными и для наглядности представлены в таблице 1.

По результатам биохимических исследований установлено, что у телят первой опытной группы (тестировался цианокобаламин в комплексе с янтарной кислотой на поливиниловом спирте), как и у их сверстников из второй группы (тестировался цианокобаламин в комплексе с янтарной кислотой) показатели содержания общего белка, глюкозы и общего кальция на 14-е сутки приобрели устойчивую тенденцию к росту. Применение цианокобаламина в комплексе с поливиниловым спиртом на телятах третьей группы не оказало столь выраженного метаболического действия. У животных этой группы показатели белка и глюкозы были ниже, чем у телят первой и второй подопытных групп.

На 28-е сутки (спустя 14 дней после повторного введения препаратов) у телят первой опытной группы показатели содержания белка, глюкозы и общего кальция находились в пределах средних физиологических значений. Это указывало на качественное улучшение белкового, энергетического и минерального обмена. Значительно улучшилось кальций-фосфорное соотношение за счет увеличения в крови кальция. Напротив, у их сверстников из третьей группы показатели не достигли нижней границы физиологических значений.

Несмотря на весьма трудоемкие методы лабораторного определения цианокобаламина в плазме крови, тем не менее, удалось установить, что в сравнении с исходными данными, его количество в организме телят всех подопытных групп в среднем выросло в 8-10 раз. Следует отметить позитивное влияние цианокобаламина на энергетический обмен. Если у телят в первой и второй подопытных групп увеличение глюкозы во многом обусловлено энергетической активностью янтарной кислоты, то у телят третьей группы цианокобаламином. На 28-е сутки показатель содержания глюкозы в крови телят третьей группы достиг нижней границы физиологической нормы.

Качественное улучшение биохимических показателей позитивно отразилось на гематологическом профиле телят всех подопытных групп. Наблюдалась хорошо выраженная тенденция роста количества эритроцитов и их насыщенность гемоглобином. Результаты гематологических исследований сыворотки крови на 14-е и 28-е сутки были сопоставлены с фоновыми и для наглядности представлены в таблице 2.

Таким образом, применение цианокобаламина в комплексе с янтарной кислотой на телятах с синдромом клинически выраженной гипотрофии обеспечило относительно быстрое улучшение метаболических процессов, в частности восстановить белковый, энергетический и минеральный обмен.

При этом комплексный препарат на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта оказывает несколько замедленное, но более продолжительное действие по сравнению с препаратом без поливинилового спирта. В перспективе это позволяет увеличить концентрацию цианокобаламина без риска побочного действия.

Пример 2. Клинический опыт был проведен на коровах с клинически выраженными признаками В-12 недостаточности. В подопытные группы включали коров с признаками извращенного аппетита, нарушениями волосяного покрова, аллопециями (бесшерстными участками). В каждой группе было по 5 коров. Испытуемые образцы препаратов применяли внутримышечно. Основной задачей данного опыта являлась оценка эффективности поливинилового спирта пролонгировать фармакологическую активность цианокобаламина и янтарной кислоты в отдаленный период после применения испытуемых препаратов.

При первом введении объем испытуемых препаратов составил 10 мл. В течение 7 дней какого-либо побочного действия препаратов выявлено не было. Первые признаки позитивного влияния препаратов на клиническое состояние коров первой и второй подопытных групп начали проявляться на 2-3-и сутки. Во-первых, улучшился аппетит. У них стала активнее жвачка. Во-вторых, у коров стала выраженно редуцироваться симптом лизания. Схожие признаки у 2 из 5 коров третьей группы начали проявляться на 3-4-е сутки.

На 7-е сутки испытуемые препараты в объеме 15 мл были повторно введены всем подопытным коровам. Увеличение дозировки препаратов на 5 мл также не вызвало какого-либо побочного действия. При этом еще более выражено улучшалось клиническое состояние, аппетит. Молочная продуктивность коров первой и второй групп на 10-е сутки выросла на 1-2 литра. На 14-е сутки заметно улучшилось состояние волосяного покрова, и обозначился рост волос на участках с аллопециями. В этот период клиническое состояние коров третьей группы было выражено хуже. У них слабее был аппетит, жвачка. Молочная продуктивность только начала приобретать тенденцию к росту. Отсутствовали признаки роста волос на участках с аллопециями. Волосяной покров был тусклым.

Контрольные биохимические исследования сыворотки крови были проведены на 14-е и 21-е сутки. Результаты исследований отражены в таблице 3.

По результатам биохимических исследований подтверждено позитивное влияние препаратов цианокобаламина на кислотно-щелочной баланс. Фактически достигнутая нормализация кислотно-щелочного состояния по сути является индикатором всех обменных процессов в организме животных. На 28-е сутки показатели содержания белка, резервной щелочности у коров первой и второй подопытных групп находились на нижней границе физиологической нормы, а глюкозы и кальция в пределах средних физиологических значений. Наиболее позитивно выраженное влияние цианокобаламина в комплексе с янтарной кислотой проявилось в отношении снижения концентрации в плазме крови мочевой кислоты. Сверхвысокие исходные ее количественные показатели могли свидетельствовать о серьезной почечной недостаточности и низкой способности почек фильтровать плазму крови. При длительной гиперурикемии происходит отложение солей в суставах и развиваются суставные патологии: артриты, артрозы. Именно эти патологии наиболее распространены не только у коров, но и телят в современном молочном животноводстве.

По результатам биохимических исследований установлено, что комплекс на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта обеспечил более выраженную коррекцию кислотно-щелочного баланса в отдаленный период после применения препарата.

Результаты биохимических и гематологических исследований свидетельствовали о том, что препарат на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта обеспечил более продолжительную коррекцию патобиохимических процессов, по сравнению с препаратами на основе цианокобаламина и янтарной кислоты или цианокобаламина и поливинилового спирта. Это подтвердило правомерность включения поливинилового спирта в состав комплексного препарата в качестве стабилизатора и пролонгатора. При этом снижение концентрации цианокобаламина в комплексном препарате до 1% делает возможным его применение на ослабленных, с низкой массой тела животных. Это открывает перспективу более широкого применения препарата при В12 недостаточности у молодняка сельскохозяйственных и домашних животных.

Примечание: верхняя строка - показатели у телят первой опытной группы; средняя строка у телят второй группы; нижняя строка - у третьей группы.

Изобретение относится к способу получения биологически активных препаратов и может быть использовано в ветеринарии в качестве лекарственного средства. Технический результат: разработан способ получения биологически активного комплексного препарата на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта, который включает растворение в воде для инъекций или дистиллированной воде 10,0 г янтарной кислоты и 10,0 г цианокобаламина (В12) при нагревании до 70-80°С. Отдельно растворяют в воде 10 г поливинилового спирта при нагревании до полного растворения. После охлаждения растворов до 25-30°С их смешивают, доводят объем раствора добавлением воды до 1000 мл, фасуют по флаконам по 100 мл и стерилизуют автоклавированием в режиме 1,0-1,1 атм в течение 20 мин. 3 табл., 4 пр.

Способ получения биологически активного комплексного препарата на основе цианокобаламина, янтарной кислоты и поливинилового спирта, включающий растворение в воде витамина группы В с янтарной кислотой, отличающийся тем, что 10,0 г янтарной кислоты и 10,0 г цианокобаламина (В12) растворяют в воде для инъекций или дистиллированной воде при нагревании до 70-80°С и отдельно растворяют 10 г поливинилового спирта при нагревании до полного растворения с последующим смешиванием растворов после их охлаждения до 25-30°С и доведением объема раствора добавлением воды до 1000 мл, расфасовкой по флаконам по 100 мл и стерилизацией автоклавированием в режиме 1,0-1,1 атм в течение 20 мин.