КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПОРАЖЕНИЙ ТКАНЕЙ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/737 A61K35/12 A61K35/19 A61K38/18 A61K47/36 A61P1/00 A61P17/02 A61P19/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения поражений тканей.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому набору для предотвращения и/или лечения поражений тканей.

Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения поражений тканей.

Настоящее изобретение можно применять, в частности, в области медицины и ветеринарии.

В приведенном ниже описании ссылки в круглых скобках ( ) относятся к перечню ссылок, представленному в конце текста.

Уровень техники

Имплантация клеток, тканей или органов в терапевтических целях является серьезной проблемой в области медицины. Множество исследований на протяжении почти столетия продемонстрировали терапевтические преимущества таких имплантаций во многих областях применения, а многочисленные методики позволили контролировать и улучшать качество образцов, их хранение и их консервацию, или увеличение их объема перед имплантацией или повторным введением их пациенту-реципиенту. Аналогичным образом были осуществлены многочисленные улучшения в отношении показателей эффективности и свойств органов, тканей или клеток, которые применяют в способах, устройствах и продуктах с целью обеспечения пациенту-реципиенту терапевтического преимущества после повторного введения. В конечном итоге, лучшее понимание и контроль побочных реакций, в некоторых случаях связанных с указанным повторным введением, также позволили достигнуть большего успеха.

Однако после введения клеток показатели их интеграции и/или терапевтической эффективности с учетом количества вводимых клеток остаются очень низкими, что приводит к необходимости повторного лечения и, соответственно, очень высокой стоимости лечения. Кроме того, низкая выработка и высокая стоимость ограничивают виды патологических состояний и/или контингент пациентов, которых можно лечить с помощью указанных способов.

Поэтому в данной области техники существует насущная потребность в обеспечении дополнительного улучшения указанных способов и/или биологических инструментов для оптимизации их применения, а также для расширения терапевтической области применения.

Из уровня техники известны соединения, способные улучшать тканевую среду, например, полимеры, известные как HBGFPP для «протекторов и потенциаторов гепаран-связывающего фактора роста». Данные HBGFPP отбирали по их способности к защите факторов роста, которые имеют сродство к гепарину (например, FGF, TGFb и подобных), от разрушения протеазами, а также для повышения активности этих факторов без проявления какой-либо значительной антикоагулянтной активности в применяемых дозах. Данные HBGFPP продемонстрировали неожиданные свойства при восстановлении мышечной ткани, повреждениях нервной ткани и тканей пищеварительного тракта, а также активность в отношении воспалительной реакции, как показано, в частности, в заявке WO 1995/026739 или в патенте США US 7998922. Указанные полимеры также были определены с помощью химического анализа и представлены в качестве агентов регенерации ткани в доклинических моделях поражений тканей кожи, костей, роговицы и ишемической ткани. Также они продемонстрировали антифибротическое действие, единственную возможность для защиты от воздействия окислительного стресса в моделях ишемии, защитные эффекты против старения и нейродегенерации, и, в целом, они способствуют процессам регенерации. Одна конкретная форма HBGFPP, RGTA, в ходе применения продемонстрировала ускорение и улучшение восстановления поражений тканей, например, кожи, роговицы, кости или других мышц, и, по-видимому, уменьшение следов шрамов и фиброзов в целом (см. обзор Van Neck et al., Heparan Sulfate Proteoglycan Mimetics Promote Tissue Regeneration: An Overview chapter 4 in Tissue Regeneration - From Basic Biology to Clinical Application ISBN 978-953-51-0387-5, edited by Jamie Davies). Известно также, что RGTA способны защищать от вредного воздействия, вызванного облучением - (Mangoni М etal.; Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2009, 74, 1242-1250), окислительным стрессом в случае поражений, вызванных облучением (Yue X-L et al.; Cell Death and Differentiation 2009, 1-12), окислительным стрессом во время ишемии (Yue X-L etal.; Cell Death and Differentiation 2009, 1-12), а также в случае старения тканей (Larramendy-Gozalo С, D et al.; J Gen Virol. 2007, 88:1062-7).

В другой терапевтической области также наблюдались другие эффекты RGTA, в частности, при лечении боли и зуда, для которых специалисты в данной области не могли предвидеть связь с процессом восстановления или регенерации ткани, поскольку эффект был очень быстрым и, следовательно, независимым от процесса восстановления или регенерации, требующего намного больше времени.

RGTA были описаны и применялись для восстановления поврежденных тканей, в частности, посредством защиты факторов роста и клеточного взаимодействия, присутствующих на участке поражения, а также накопления клеток, которые присутствуют у пациента, получающего лечение. Например, в публикациях показано влияние RGTA на мобилизацию эндогенных стволовых клеток, таких как гемопоэтические клетки-предшественники, или стволовые клетки, полученные из крови (Albanes et al., Experimental Hematology 2009; 37:1072-1083), или на рост, клоногенность, миграцию и/или дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток in vitro или in vivo.

Применение RGTA, содержащих бензиламин, с клетками костного мозга было предложено в международной заявке WO 2003/101201 для лечения инфаркта миокарда для улучшения формирования васкуляризации коллатеральными кровеносными сосудами. Однако в указанном документе не приведены экспериментальные данные или какие-либо научные результаты. Таким образом, элементы, включенные в указанный документ, не позволяют воспроизводить описанные элементы или предвидеть какое-либо лечение. В частности, в документе Mullanghi et al. (Coronary; 22: 71) сообщается, что RGTA, введенные посредством инъекции одновременно с мезенхимальными клетками, взятыми в тот же день из костного мозга и введенными непосредственно в инфарктную область после перевязки нисходящей коронарной артерии у бабуинов, не обладают большей функциональной эффективностью, чем RGTA, которые вводили отдельно в эту мышцу, повторив, таким образом, наблюдения Yamauchi Н etal., FASEB J. 2000 (14): 2133-4, которые свидетельствуют о том, что RGTA в отдельности обладает способностью значительно улучшать восстановление миокарда после инфаркта. Таким образом, одновременная инъекция указанных клеток и RGTA не оказывает дополнительного положительного действия на восстановление миокарда после инфаркта по сравнению с применением только RGTA. Другими словами, никакого дополнительного положительного действия при инъекции клеток и RGTA не наблюдалось/не было продемонстрировано.

В литературе также упоминаются многочисленные исследования клеточной терапии, направленные на имплантацию клеток различного происхождения и различной природы различными способами, для реколонизации областей пораженных тканей или тканей с нарушенными функциями. Из всех указанных исследований следует, что чрезвычайно сложно обеспечить выживаемость клеток, имплантированных в требуемую область, и еще труднее обеспечить колонизацию области, и, более того, восстановления через некоторое время функций органа или ткани, повторно колонизированной таким образом. Эта проблема по-прежнему остается реальной проблемой, которая еще не была преодолена в удовлетворительной степени.

Поэтому существует насущная потребность в создании нового соединения и/или способа, способного улучшить лечение поражений тканей и/или эффективность клеточной терапии.

Применение RGTA, смешанного с биоматериалом-заменителем костной ткани, описано в предшествующем уровне техники (Billy et al., патент США 2006/0257449). В указанном документе также предусмотрено комбинирование данного (трикальциевого) биоматериала со стволовыми клетками, а не с RGTA, в попытке простимулировать имплантацию и колонизацию заменителя кости, однко в указанном документе не приведены пояснения или описание возможной реализации, стадии и т.д. Кроме того, данное описание не содержит экспериментальных данных или каких-либо научных доказательств. Таким образом, элементы, описанные в указанном документе, и его предписания не позволяют воспроизводить или разрабатывать любую комбинацию биоматериала-заменителя костной ткани и клеток, или любое применение любой комбинации.

Многочисленные патологические состояния, в частности вызванные старением, включают явления дегенерации тканей и/или клеток, например, болезнь Альцгеймера, дегенерацию макулы и/или состояния, вызванные биологическими явлениями, такими как уменьшение оксигенации тканей/клеток и т.д.

Для данных патологических состояний и, как упомянуто выше, в уровне техники существует серьезная потребность в разработке эффективных способов лечения и/или, в частности, в улучшении существующих способов лечения, в частности, в отношении клеточной терапии.

Также существуют многочисленные генетические патологические состояния, связанные, в частности, с плохой функцией тканей и/или клеток, для которых лечение практически отсутствует или не является достаточно эффективным. Для данных патологических состояний один вариант лечения представляет собой клеточную терапию. Однако эффективность данных способов лечения подвергается сомнению, в частности, вследствие низкой имплантации клеток после инъекции и/или очень высокой стоимости данных способов лечения.

Поэтому существует насущная потребность в создании новых композиции и вида лечения, которые позволят лечить поражение тканей независимо от их происхождения, и/или в повышении эффективности лечения известными композициями и/или клеточной терапии, в то же время снижая их стоимость.

Краткое описание изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в удовлетворении указанных потребностей путем получения фармацевтической композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения поражений тканей, где указанная композиция содержит:

- биосовместимый полимер следующей общей формулы (I)

в которой:

А представляет собой мономер,

X представляет собой группу R₁COOR₂ или -R₉(C=O)R₁₀;

Y представляет собой О- или N-сульфонатную группу, которая соответствует одной из следующих формул -R₃OSO₃R₄, -R₅NSO₃R₆, -R₇SO₃R₈

в которой:

R₁, R₃, R₅ и R₉ независимо представляют собой алифатическую углеводородную цепь, которая может быть разветвленной и/или ненасыщенной и которая необязательно содержит одно или более ароматических колец, R₂, R₄, R₆ и R₈ независимо представляют собой атом водорода или катион,

R₇ и R₁₀ независимо представляют собой связь или алифатическую углеводородную цепь, которая может быть разветвленной и/или ненасыщенной,

«а» представляет собой количество мономеров,

«х» представляет собой степень замещения мономеров А группами X,

«у» представляет собой степень замещения мономеров А группами Y, и

- эукариотическую клетку.

Авторы настоящего изобретения успешно продемонстрировали, что комбинация биосовместимых полимеров общей формулы (I), как определено выше, также обозначенных в настоящем изобретении как RGTA, и клеток неожиданно позволяет подготавливать или кондиционировать ткани и органы, например пациента-реципиента, и содействуют имплантации, увеличению объема и колонизации внешних клеток и/или органов и/или тканей-трансплантатов, например, у пациента-реципиента, в противоположность сведениям, известным в данной области техники.

В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно продемонстрировали, что применение биосовместимых полимеров общей формулы (I) в комбинации с клетками, органами, тромбоцитарными экстрактами предпочтительно и неожиданно позволяет заметно улучшить восстановление нарушенных функций тканей и/или органов, получавших такое лечение, с существенной пользой для пациента.

Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что комбинацию биосовместимых полимеров общей формулы (I) с клетками согласно настоящему изобретению можно применять/наносить для лечения множества патологических состояний/поражений и т.д. Действительно, настоящее изобретение можно применять независимо от типа поврежденных/имплантированных или привитых тканей или органов, независимо от применяемых клеток, например, вводимых посредством инъекции, например, отдельно или в комбинации, например, с тромбоцитарными лизатами, например, обогащенными факторами роста или, например, с инъекцией очищенных факторов роста, в частности, факторов роста, которые имеют сродство к RGTA или сульфатам гепарана.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно продемонстрировали, что эффект, получаемый при функциональном восстановлении ткани, получавшей лечение, превосходит эффект, получаемый либо только от RGTA, либо только от клеток, либо от тканей или органов или биоматериалов или тромбоцитарных лизатов или очищенных факторов роста, имплантированных или введенных отдельно.

Авторы настоящего изобретения также удивительным образом и неожиданно продемонстрировали, что режим дозирования, терапевтическая схема для введения композиции преимущественно позволяет оптимизировать терапевтические эффекты, а также обладает сильным синергическим эффектом, наблюдаемым при восстановлении функций и заживлении тканей или органов, получавших лечение.

Наблюдаемые результаты являются тем более неожиданными, поскольку клетки, применяемые согласно настоящему изобретению, могут иметь свойства и происхождение, которые отличаются от свойств клеток, присутствующих в тканях или органах, в которые они могут быть имплантированы. Неожиданно композиция согласно настоящему изобретению способствует колонизации имплантированных клеток в той степени, чтобы, например, ткань или орган, по наблюдениям, снова функционировали несмотря на то, что эти имплантированные клетки могут иметь различный фенотип и различное тканевое происхождение. Кроме того, нет необходимости экспериментально индуцировать появление плюрипотентных стволовых клеток или стволовых клеток, которые уже подвергались дифференциации клеток ткани или органа, подлежащего колонизации.

Авторы настоящего изобретения неожиданно продемонстрировали, что применение RGTA согласно настоящему изобретению позволяет получить новый и неожиданный технический/терапевтический эффект, а именно, в частности, кондиционирование участка поражения путем подготовки области имплантации, и получить более высокую имплантацию клеток/эффективность терапевтического лечения, чем та, которая получена при применении только RGTA и/или при применении отдельно клеток, в частности, в отношении эффективности клеточной терапии и/или имплантационной способности клеток или тканей или органов.

Таким образом, авторы настоящего изобретения удивительным образом и неожиданно продемонстрировали, что настоящее изобретение, например, при последовательном введении RGTA, то есть в соответствии с режимом дозировки, после определенного периода времени, например, от нескольких минут до нескольких дней, с последующим введением клеток любой природы и/или происхождения, которые были выбраны, преимущественно неожиданно способствует приживлению этих трансплантатов или функциональной имплантации этих клеток независимо от происхождения, их состояния развития и способа подготовки, при условии, что в соответствующих случаях механизмы отторжения, связанные с иммунной системой реципиента, находятся под контролем.

Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, в частности, в примерах, что настоящее изобретение можно применять, и поражения, которые можно лечить композицией согласно настоящему изобретению, могут представлять собой любой тип поражения тканей независимо от происхождения, а также любой тип ткани или органа. В частности, в свете приведенных ниже примеров, в которых эффективно лечат множество разнообразных поражений, специалисты в данной области могут с легкостью распространить их на другие пораженные ткани, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем изобретении термин «повреждения тканей» обозначает любое повреждение биологической ткани млекопитающего, известное специалистам в данной области. Оно может представлять собой, например, поражение соединительной ткани, мышечной ткани, нервной ткани, костной ткани, хрящевой ткани и/или эпителиальной ткани. Оно может представлять собой, например, любое поражение любых органов или органелл млекопитающих, известных специалистам в данной области. Оно может представлять собой, например, поражение тканей пищеварительного тракта, тканей желудочно-кишечного тракта, пищеварительной и экскреторной системы, полового тракта, репродуктивной системы, зрительной, обонятельной или слуховой системы, сенсорной системы, системы кровообращения и/или сердечно-сосудистой системы, респираторной системы, мышечной системы или опорно-двигательного аппарата. Оно может представлять собой, например, поражение желудочной ткани, буккальное поражение, поражение роговицы, поражение барабанной перепонки, кохлеарное поражение, поражение кожи, например рану, хроническую рану, например, диабетическую рану, язвенную рану, пролежни, ожог кожи, некротизирующую рану, венозное поражение, ишемическое поражение, например, ишемический некроз, поражение, вызванное инфарктом, например, инфаркт миокарда, поражение кости, например, перелом, перелом с дефектом кости, остеонекроз («неинвазивный перелом костей»), остеохондральное поражение, хрящевое поражение, повреждение сухожилия, хирургическое поражение, поражение, вызванное хирургической процедурой, поражение, вызванное медицинским лечением, например, лучевой терапией, поражение нервной ткани, например, поражение головного мозга, например, поражение, вызванное иссечением опухоли, поражение спинного мозга, поражение нервного волокна, например, поражение опорно-двигательного аппарата и/или сенсорной системы, поражение дыхательной системы, например, легочные поражения, поражение системы кровообращения, например, поражение артерий и/или сосудов, поражение пищеварительной, почечной, мочевыделительной системы.

В настоящем изобретении термин мономер обозначает, например, мономер, выбранный из группы, включающей сахара, сложные эфиры, спирты, аминокислоты или нуклеотиды.

В настоящем изобретении мономеры А, составляющие основные элементы полимеров формулы I, могут быть одинаковыми или разными.

В настоящем изобретении образование связи между мономерами может обеспечивать возможность образования полимерного каркаса, например, полимерного каркаса природы сложного полиэфира, многоатомного спирта или полисахарида, или нуклеиновой кислоты или белкового типа.

В настоящем изобретении среди сложных полиэфиров могут быть, например, биосинтетические или химически синтезированные сополимеры, например, алифатические сложные полиэфиры или сложные полиэфиры природного происхождения, например, полигидроксиалканоаты.

В настоящем изобретении полисахариды и их производные могут иметь бактериальное, животное, грибковое и/или растительное происхождение. Они могут представлять собой, например, одноцепочечные полисахариды, например, полиглюкозы, например, декстран, целлюлозу, бета-глюкан или другие мономеры, содержащие более сложные звенья, например, ксантаны, например, глюкозу, маннозу и глюкуроновую кислоту, или глюкуронаны и глюкоглюкуронан.

В настоящем изобретении полисахариды растительного происхождения могут быть одноцепочечными, например, целлюлоза (глюкоза), пектины (галактуроновая кислота), фуканы или крахмал, или могут быть более сложными, например, альгинаты (галуроновая и маннуроновая кислота).

В настоящем изобретении полисахариды грибкового происхождения могут представлять собой, например, стероглюкан.

В настоящем документе полисахариды животного происхождения могут представлять собой, например, хитины или хитозан (глюкозамин).

Количество мономеров А, определенное в формуле (I) как «а», может представлять собой такое, чтобы масса указанных полимеров формулы (I) была больше, чем приблизительно 2000 дальтон (что соответствует 10 мономерам глюкозы). Количество мономеров А, определенное в формуле (I) как «а», может представлять собой такое, чтобы масса указанных полимеров формулы (I) была меньше, чем приблизительно 2000000 дальтон (что соответствует 10000 мономерам глюкозы). Преимущественно масса указанных полимеров формулы (I) может составлять от 2 до 100 кДа.

В настоящем изобретении в группе -R₁COOR₂, представляющей собой X, R₁ может представлять собой от С₁ до С₆ алкил, например, метил, этил, бутил, пропил или нентил, предпочтительно метальную группу, и R₂ может представлять собой связь, от С₁ до С₆ алкил, например, метил, этил, бутил, пропил или пентил, или R₂₁R₂₂ группу, в которой R₂₁ представляет собой анион, и R₂₂ представляет собой катион, выбранный из группы щелочных металлов.

Предпочтительно группа X представляет собой группу формулы -R₁COOR₂, в которой R₁ представляет собой метальную группу -СН₂-, и R₂ представляет собой R₂₁R₂₂ группу, в которой R₂₁ представляет собой анион, и R₂₂ представляет собой катион, выбранный из группы щелочных металлов, предпочтительно группа X представляет собой группу формулы -СН₂-СОО^-.

В настоящем изобретении в группе -R₉(C=O)R₁₀, представляющей собой X, R₉ может представлять собой от С₁ до С₆ алкил, например, метил, этил, бутил, пропил или пентил, предпочтительно метальную группу, и R₁₀ может представлять собой связь, от C₁ до С₆ алкил, например, метил, этил, бутил, пропил или пентил или гексил.

В настоящем изобретении в группе, соответствующей одной из следующих формул: -R₃OSO₃R₄, -R₅NSO₃R₆ и -R₇SO₃R₈, и представляющей собой группу Y, R₃ может представлять собой связь, от C₁ до С₆ алкил, предпочтительно метил, этил, бутил, пропил или пентил, например, метальную группу, R₅ может представлять собой связь, от С₁ до С₆ алкил, например, метил, этил, бутил, пропил или пентил, предпочтительно метальную группу, R₇ может представлять собой связь, от С1 до С6 алкил, например, метал, этил, бутил, пропил или пентил, предпочтительно метальную группу, и R₄, R₆ и R₈ независимо могут представлять собой атом водорода или катион М⁺, например, М⁺ может представлять собой щелочной металл.

Предпочтительно группа Y представляет собой группу формулы R₇SO₃R₈, в которой R₇ представляет собой связь, и R₈ представляет собой щелочной металл, выбранный из группы, содержащей литий, натрий, калий, рубидий и цезий. Предпочтительно группа Y представляет собой -SO₃^-Na⁺ группу.

Степень замещения всех мономеров А группами Y, определенная в общей формуле (I) как «у», может составлять от 30% до 150%, и предпочтительно составляет примерно 100%.

В настоящем изобретении в определении степеней замещения выше термин «степень замещения «х», составляющая 100%», означает, что каждый мономер А полимера согласно настоящему изобретению статистически содержит группу X. Аналогичным образом, термин «степень замещения «у», составляющая 100%», означает, что каждый мономер полимера согласно настоящему изобретению статистически содержит группу Y. Степени замещения более 100% отражают тот факт, что каждый мономер статистически несет более одной группы рассматриваемого типа; наоборот, степени замещения менее 100% отражают тот факт, что каждый мономер статистически несет менее одной группы рассматриваемого типа.

Полимеры могут также содержать функциональные химические группы, обозначенные Z, отличные от X и Y.

В настоящем изобретении группы Z могут быть одинаковыми или различными и могут быть независимо выбраны из группы, содержащей аминокислоты, жирные кислоты, жирные спирты, церамиды или их производные или нацеливающие нуклеотидные последовательности.

Группы Z также могут представлять собой активные агенты, которые могут быть одинаковыми или разными. Они могут представлять собой, например, терапевтические агенты, диагностические агенты, противовоспалительный, противомикробный агент, антибиотик, фактор роста, фермент.

В настоящем изобретении группа Z может предпочтительно представлять собой насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту. Она может представлять собой, например, жирную кислоту, выбранную из группы, состоящей из уксусной кислоты, каприловой кислоты, каприновой кислоты, лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, бегеновой кислоты, лигноцериновой кислоты, церотиновой кислоты, миристолеиновой кислот, пальмитолеиновой кислоты, сапиеновой кислоты, олеиновой кислоты, элаидиновой кислоты, транс-вакценовой кислоты, линолевой кислоты, линолэлаидиновой кислоты, α-линоленовой кислоты, γ-линоленовой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, клупанодоновой кислоты или докозагексаеновой кислоты. Предпочтительно жирная кислота представляет собой уксусную кислоту.

В настоящем изобретении группа Z может предпочтительно представлять собой аминокислоту ряда L или D, выбранную из группы, включающей аланин, аспарагин, ароматическую цепь, например, тирозин, фенилаланин, триптофан, тироксин или гистидин.

Преимущественно группы Z могут придавать полимерам дополнительные биологические или физико-химические свойства. Например, группы Z могут увеличивать растворимость или липофильность указанного полимера, что дает возможность, например, лучшей диффузии или проникновения в ткань.

Полимеры, в которых присутствует Z, соответствуют формуле II ниже:

Aa Xx Yy Zz

в которой А, X, Y, a, х и у определены выше, и z представляет собой степень замещения группами Z.

В настоящем изобретении степень замещения группами Z, представляющая собой «z», может составлять от 0 до 50%, предпочтительно равна 30%.

Группы X, Y и Z могут быть независимо связаны с мономером А и/или независимо связаны друг с другом. Когда по меньшей мере одна из групп X, Y и Z независимо связана с группой X, Y и Z, отличной от первой, одна из указанных групп X, Y или Z связана с мономером А.

Таким образом, группы Z могут быть ковалентно связаны непосредственно с мономерами А или ковалентно связаны с группами X и/или Y.

В настоящем изобретении указанная композиция может содержать от 0,01 микрограммов до 100 мг по массе биосовместимого полимера по отношению к общей массе композиции. Например, композиция может содержать от 10 микрограммов до 10 миллиграммов по массе относительно общей массы композиции.

В настоящем изобретении композиция может быть приготовлена и/или адаптирована в соответствии с путем ее введения. Например, для внутривенного или внутримышечного введения композицию можно вводить для доставки дозы биосовместимого полимера от 0,1 до 5 мг на килограмм массы тела, или для перорального введения композицию можно вводить, например, от 2 до 5 одинаковых приемов в день в суточном количестве, например, от 1 до 500 мг, например, от 10 мкг до 5 мг биосовместимого полимера на кг, например, от 10 мкг до 5 мг на кг, например, для взрослого с массой тела 100 кг, от нескольких дней до нескольких недель. Например, для внутричерепного введения оно может включать однократное введение от 1 до 5 мл или введение посредством мини-помпы в течение нескольких дней; при этом композиция может содержать от 0,001 до 1 мг/мл биосовместимого полимера, или для сублингвального введения, например, ежедневно от 1 до 5 мл, композиция может содержать от 0,1 до 100 мг/мл биосовместимого полимера, или для местного введения в композицию можно вводить для доставки дозы от 0,1 до 5 мг биосовместимого полимера на килограмм массы тела указанного полимера.

Например, для перорального введения полимер может находиться в растворе, например, в воде или в любом растворителе, подходящем для перорального введения, известном специалистам в данной области. Композиция может также быть в форме таблетки, гелевой капсулы или в любой другой форме, совместимой с пероральным введением, известной специалистам в данной области. Она может представлять собой водный раствор, имеющий объем от 10 до 50 мл, содержащий, например, концентрацию 0,1 мг/мл полимера в растворе. Например, для системного введения полимер может быть, например, растворен в физиологическом растворе, например, физиологическом растворе для инъекций, или в любой другой форме, совместимой с инъекцией, например, в растворах с глюкозой и/или другими подходящими вспомогательными веществами, известными специалистам в данной области, например, содержащих полисахариды, например, гепарин. Например, указанный полимер может присутствовать в концентрации от 0,1 до 5 мг/кг, предпочтительно от 1 до 2,5 мг/кг, например, для внутривенного (IV) и/или внутримышечного (ВМ) введения.

Композиция согласно настоящему изобретению может также содержать факторы роста. Они могут представлять собой любые факторы роста, известные специалистам в данной области, которые способны содействовать или стимулировать рост клеток. Они могут представлять собой, например, факторы роста, выбранные из группы, содержащей фактор роста фибробластов (FGF), например, FGF1 или FGF2, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) или их смесь. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать от 10 нг/мл до 100 мкг/мл факторов роста.

Композиция согласно настоящему изобретению может также содержать неочищенный или обогащенный факторами роста тромбоцитарный экстракт или лизат. Он может представлять собой, например, любой тромбоцитарный экстракт или лизат, который известен специалистам в данной области и/или коммерчески доступен.

В настоящем изобретении термин «эукариотическая клетка» обозначает любую эукариотическую клетку, известную специалистам в данной области. Она может представлять собой, например, эукариотическую клетку млекопитающих, например, эукариотическую клетку животного или человека. Она может представлять собой, например, любую эукариотическую клетку независимо от ее стадии дифференциации, например, клетку, выбранную из группы, включающей эукариотические клетки взрослых особей и стволовые клетки взрослых особей. Они могут представлять собой, например, эукариотические клетки из пуповинной крови, клетки костного мозга, клетки жировой ткани, мезенхимальные клетки. Они также могут представлять собой группу клеток из трансплантата и/или из органа.

Эукариотическая клетка может представлять собой, например, клетку, которая является гетерологичной, гомологичной или аутологичной по отношению к человеку. Предпочтительно клетки представляют собой аутологичные клетки.

Она также может представлять собой плюрипотентную или тотипотентную стволовую клетку или клетки, предназначенные для путей дифференцировки, например, мезенхимальные стволовые клетки. Она также может представлять собой плюрипотентную или тотипотентную стволовую клетку, за исключением эмбриональных стволовых клеток.

Преимущественно, когда клетки являются аутологичными, композиция согласно настоящему изобретению может быть предпочтительной для регуляторных целей, целей безопасности, осуществимости, эффективности.

Преимущественно, когда клетки являются аутологичными, их предпочтительно выделяют у индивидуума и применяют в композиции согласно настоящему изобретению и/или применяют в лечении в течение 24 часов после удаления и выделения без других добавок. Преимущественно указанное однократное введение позволяет преодолевать и соответствовать нормативным требованиям/ограничениям.

В настоящем изобретении количество клеток, включенных в композицию, может составлять от 1 до 5 × 10⁷ клеток.

Преимущественно авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что лечение не зависит от типа клетки, ее происхождения и способов, применяемых для выбора, амплификации, кондиционирования и модификации клеток. В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно продемонстрировали, что настоящее изобретение, таким образом, относится ко всем клеткам независимо от их происхождения и селективных манипуляций, что приводит к переходу клеток на пути дифференциации или дедифференциации, поскольку введение RGTA преимущественно обеспечивает такую возможность, в частности, в комбинации с введением клеток, чтобы создать/сформировать микроокружение, подходящее для клетки, предпочтительно обеспечивая синергическое взаимодействие между RGTA и клетками, что позволяет увеличить имплантацию клеток.

Согласно настоящему изобретению, когда композиция содержит трансплантат или трансплантируемый орган или имплантируемый материал, введение полимера и трансплантата или органа или имплантируемого материала может быть одновременным. Например, подлежащий трансплантации орган или имплантируемый материал может быть пропитан, например, путем погружения его в раствор, содержащий биополимер, или путем перфузии, или путем распыления или любым другим подходящим способом, известным специалистам в данной области. В случае имплантируемого материала полимер может быть введен еще в начале изготовления имплантируемого материала, что преимущественно дает возможность предварительной инкубации или пропитывания.

Согласно настоящему изобретению время пропитывания может составлять от нескольких минут до нескольких часов, например, от 1 минуты до 18 часов, от 5 минут до 16 часов, в течение ночи.

Преимущественно, когда трансплантат или орган пропитывают в течение времени более 5 минут, например, 16 часов, пропитывание также позволяет повысить эффективность приживления трансплантата. Это объясняется тем, что авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что наличие полимера в растворе для консервации трансплантата и/или органа преимущественно имеет защитный и антиапоптотический эффект.

Преимущественно, трансплантат, орган или материал, пропитанный полимером, могут получать, до или после реимплантации или трансплантации, введения факторов роста или тромбоцитарного экстракта, чтобы способствовать колонизации клетками, вводимыми во время имплантации или впоследствии.

В настоящем изобретении термин «фармацевтическая композиция» обозначает любую форму фармацевтической композиции, известную специалистам в данной области. В настоящем изобретении фармацевтическая композиция может представлять собой, например, раствор для инъекций, например, для местной или системной инъекции, например, в физиологическом растворе, в инъекционном растворе глюкозы в присутствии вспомогательных веществ, например, декстранов, например, в концентрациях, известных специалистам в данной области, например, от одного микрограмма до нескольких миллиграммов на мл.

Фармацевтическая композиция может представлять собой, например, лекарственное средство, предназначенное для перорального введения, выбранное из группы, включающей жидкий состав, пероральную шипучую форму дозирования, пероральный порошок, многокомпонентную систему и рассасывающуюся галеновую форму.

Например, когда фармацевтическая композиция предназначена для перорального введения, она может находиться в форме жидкого состава, выбранного из группы, содержащей раствор, сироп, суспензию и эмульсию. Когда фармацевтическая композиция находится в форме пероральной шипучей дозированной формы, она может находиться в форме, выбранной из группы, включающей таблетки, гранулы и порошки. Когда фармацевтическая композиция находится в форме перорального порошка или многокомпонентной системы, она может находиться в форме, выбранной из группы, включающей зерна, гранулы, минитаблетки и микрогранулы. Когда фармацевтическая композиция находится в форме рассасывающейся дозированной формы, она может находиться в форме, выбранной из группы, включающей рассасывающиеся таблетки, лиофилизированные пластины, тонкие пленки, жевательную таблетку, таблетку, капсулу или медицинскую жевательную резинку.

Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию для перорального введения, например, буккального и/или сублингвального введения, например, выбранную из группы, включающей буккальные или сублингвальные таблетки, пастилки, капли и распыляемый раствор.

Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию для местного, трансдермального введения, например, выбранную из группы, включающей мази, кремы, гели, лосьоны, пластыри и пены.

Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию для назального введения, например, выбранную из группы, включающей назальные капли, назальный спрей и назальный порошок.

Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию для парентерального введения, например, подкожного, внутримышечного, внутривенного или интратекального введения.

Композиция согласно настоящему изобретению может также содержать по меньшей мере один другой активный ингредиент, особенно один другой терапевтически активный ингредиент, например, для одновременного, отдельного или последовательного применения во времени в зависимости от применяемого галенового состава. Указанный другой ингредиент может представлять собой, например, активный ингредиент, применяемый, например, при лечении оппортунистических заболеваний, которые могут развиваться у пациента, который имеет поражение ткани.

В настоящем изобретении введение биосовместимого полимера и клетки может быть одновременным, последовательным или параллельными.

Согласно настоящему изобретению, по меньшей мере одно из введений может быть осуществлено перорально или путем инъекции. Указанные два введения можно осуществлять одинаковым или различным образом. Например, введение биосовместимого полимера и клеток может быть осуществлено путем инъекции, введение биосовместимого полимера может быть осуществлено перорально, и клетки можно вводить путем местной инъекции. Введение также может зависеть от места поражения.

Согласно настоящему изобретению применение эукариотических клеток, в частности их введение, можно проводить через период от 5 минут до 1 недели после первого введения указанного биосовместимого полимера.

В случае трансплантации тканей или органов или применения имплантируемых материалов, предварительно пропитанных полимером, введение клеток можно проводить до имплантации или сразу после нее, например, в течение часа.

Согласно настоящему изобретению композицию можно, например, вводить ежедневно, дважды в день или еженедельно. Введение можно осуществлять, например, один раз в день, два раза в день или более.

Согласно настоящему изобретению композицию можно, например, вводить в течение периода от 1 дня до 3 месяцев, например, в течение 2 месяцев. Например, композицию можно вводить в течение 3 месяцев с частотой введения каждые 15 дней.

Согласно настоящему изобретению биополимер можно вводить, например, в течение периода от 1 дня до 3 месяцев, например, в течение 2 месяцев, например, с частотой один раз в день, и эукариотическую клетку можно вводить в течение идентичного или другого периода, например, периода от 1 дня до 3 месяцев, с недельной частотой.

Согласно настоящему изобретению, в случае, когда введение полимеров и введение клеток происходит последовательно, режим дозирования для каждого введения может представлять собой введение полимеров с последующим введением клеток. Например, клетки можно вводить через от 1 минуты до 24 часов после введения полимеров, от 30 минут до 12 часов после введения полимеров, от 45 минут до 6 часов после введения полимеров или через 1 час после введения полимеров.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать тромбоцитарный экстракт. Он может представлять собой, например, любой тромбоцитный экстракт, известный специалистам в данной области, который подходит для введения млекопитающему. Он может представлять собой, например, коммерчески доступный тромбоцитный экстракт или тромбоцитный экстракт, полученный в соответствии со способом, описанным в документе D R Knighton, et al., Ann Surg. Sep 1986; 204(3): 322-330 "Classification and treatment of chronic nonhealing wounds. Successful treatment with autologous platelet-derived wound healing factors (PDWHF)" или в документах Everts, P.A.M etal., Autologous platelet gel growth factor release and leukocyte kinetics using three devices. Transf. Med., 2006, 16(5), 363-368 or "Is Use of Autologous Platelet-Rich Plasma Gels in Gynecologic, Cardiac, and General, Reconstructive Surgery Beneficial?" Pharmaceutical Biotechnology, 2012, Vol.13 No. 13). Он может представлять собой тромбоцитарный экстракт, соответствующий тромбоцитарным лизатам, обогащенным активностью факторов роста, которые могут быть введены, например, местно, которые могут быть введены посредством инъекции или которые могут быть осаждены в различных носителях, например, в гелях или кремах, спреях и/или в пораженных тканях. Согласно настоящему изобретению тромбоцитарный экстракт может представлять собой экстракт, который является аутологичным или гетерологичным по отношению к человеку, подлежащему лечению. Предпочтительно тромбоцитарный экстракт является аутологичным экстрактом. Он может представлять собой, например, тромбоцитарный экстракт и/или лизат, который был сконцентрирован, например, с помощью способов и/или наборов, которые известны специалистам в данной области и/или коммерчески доступны.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать от 0,1 мл до 100 мл тромбоцитарного экстракта и/или лизата.

Преимущественно тромбоцитный экстракт содержит факторы роста, которые способствуют образованию «среды», способствующей имплантации клеток. Эти факторы могут быть добавлены к тромбоцитарному экстракту или применены отдельно без экстрактов. Согласно настоящему изобретению можно добавлять FGF1 или FGF2 или VEGF или TGFbetal или BMP-фактор или другие факторы роста, предпочтительно по меньшей мере один фактор выбран из группы, включающей фактор FGF1 или FGF2 или VEGF или TGFbetal или BMP. Согласно настоящему изобретению факторы, добавленные в тромбоцитарный экстракт, можно добавлять в концентрациях от 10 нг до 100 мкг/мл экстракта.

Согласно настоящему изобретению перед введением композиции пораженную ткань можно «реактивировать», например, путем повторного открытия поражения с помощью скребков или механического удаления с помощью скальпеля. Реактивацию можно проводить, например, на старых ранах, например, сросшихся переломах костей, старых рубцах или хронических ранах.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтическая или дерматологическая композиция для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения поражений тканей, причем указанная композиция содержит биополимер формулы AaXxYy или AaXxYyZz и по меньшей мере один тромбоцитарный экстракт.

Согласно настоящему изобретению тромбоцитный экстракт является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению биополимер формулы AaXxYy или AaXxYyZz является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению фармацевтическая или дерматологическая композиция представляет собой такую, как определена выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения биосовместимого полимера может быть такой, как определена выше.

Согласно настоящему изобретению способ и/или способ введения биосовместимого полимера могут представлять собой такие, как определено выше.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтическая или дерматологическая композиция для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и/или лечения поражений тканей, причем указанная композиция содержит биополимер формулы AaXxYy или AaXxYyZz и по меньшей мере один фактор роста.

Согласно настоящему изобретению фактор роста является таким, как определено выше. Согласно настоящему изобретению биополимер формулы AaXxYy или AaXxYyZz является таким, как определено выше.

Фармацевтическая или дерматологическая композиция представляет собой такую, как определена выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения биосовместимого полимера может быть такой, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению способ и/или способ введения биосовместимого полимера могут представлять собой такие, как определено выше.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, перенесшего поражение тканей, включающему порядке следующие стадии в любой последовательности:

i. введение по меньшей мере одного биосовместимого полимера, и

ii. введение по меньшей мере одной эукариотической клетки, при этом указанные введения являются параллельными, последовательными или попеременным.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Эукариотическая клетка представляет собой такую, как определена выше.

Согласно настоящему изобретению пациент может представлять собой любое млекопитающее. Он может, например, представлять собой животное или человека.

Согласно настоящему изобретению вводимая эукариотическая клетка может представлять собой клетку, которая является гетерологичной или гомологичной по отношению к указанному пациенту.

Согласно настоящему изобретению способ и/или способ введения биосовместимого полимера могут представлять собой такие, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению способ и/или путь введения клетки могут представлять собой такие, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения биосовместимого полимера может быть такой, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения эукариотической клетки может быть такой, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению, в случае, когда введение биосовместимых полимеров и введение клеток происходит последовательно, режим дозирования для каждого введения может представлять собой введение биосовместимых полимеров с последующим введением клеток. Например, клетки можно вводить через от 1 минуты до 48 часов после введения полимеров, от 30 минут до 12 часов после введения биосовместимых полимеров, от 45 минут до 6 часов после введения полимеров или через 1 час после введения полимеров.

Преимущественно эукариотическая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку взрослых особей.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, перенесшего поражение тканей, включающему следующие стадии в любой последовательности:

i. введение по меньшей мере одного биосовместимого полимера, и

ii. введение по меньшей мере одного тромбоцитарного экстракта и/или лизата, при этом указанные введения являются параллельными, последовательными или попеременными.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Указанный тромбоцитарный экстракт и/или лизат является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению пациент может представлять собой любое млекопитающее. Он может, например, представлять собой животное или человека.

Согласно настоящему изобретению способ и/или способ введения биосовместимого полимера могут представлять собой такие, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения биосовместимого полимера может быть такой, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению, в случае, когда введение биосовместимых полимеров и введение тромбоцитарного экстракта и/или лизата происходит последовательно, режим дозирования для каждого введения может представлять собой введение биосовместимых полимеров с последующим введением тромбоцитарного экстракта и/или лизата. Например, тромбоцитарный экстракт и/или лизат можно вводить немедленно, то есть, одновременно, или через несколько минут, предпочтительно от 10 минут до нескольких часов, например, от 1 минуты до 120 минут, предпочтительно от 10 до 60 минут, после введения, например, местного введения или инъекции биосовместимого полимера, через несколько часов, предпочтительно от 4 ч до 24 ч, например, после перорального введения биосовместимого полимера.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, перенесшего поражение тканей, включающему следующие стадии в любой последовательности:

i. введение по меньшей мере одного биосовместимого полимера, и

ii. введение по меньшей мере одного фактора роста, при этом указанные введения являются параллельными, последовательными или попеременными.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Фактор роста является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению пациент может представлять собой любое млекопитающее. Он может, например, представлять собой животное или человека.

Согласно настоящему изобретению способ и/или способ введения биосовместимого полимера могут представлять собой такие, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению частота введения биосовместимого полимера может быть такой, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению, в случае, когда введение биосовместимых полимеров и введение по меньшей мере одного указанного фактора роста происходит последовательно, режим дозирования для каждого введения может представлять собой введение биосовместимых полимеров с последующим введением по меньшей мере одного указанного фактора роста. Например, по меньшей мере один указанный фактор роста можно вводить немедленно, то есть, одновременно, или, например, через от 1 минуты до нескольких часов, например, от 1 минуты до 120 минут, предпочтительно от 10 до 60 минут, после введения, например, местного введения или инъекции биосовместимого полимера, через несколько часов, предпочтительно от 4 ч до 24 ч после перорального введения биосовместимого полимера.

Другими словами, несмотря на то, что в настоящем описании приведены ссылки на композицию, следует понимать, что каждое из соединений композиции можно вводить одновременно с другими соединениями (например, в одной композиции или в двух композициях, при этом каждая из этих композиций содержит один или более из вышеуказанных компонентов, способ введения каждого из соединений или композиции(й) может быть одинаковым или различным) или независимо друг от друга, например, последовательно, например, независимо от введения биосовместимого полимера и независимо от введения эукариотической клетки, причем указанные введения осуществляют одному и тому же пациенту одновременно или последовательно или чередующимся образом в порядке, указанном выше, или в другом порядке. Указанные различные способы введения можно осуществлять независимо друг от друга или связанным образом (композиция или совместное введение) посредством идентичного или различного способа введения (инъекция, проглатывание, местное применение и т.д.) один или несколько раз в неделю, в течение одной или более последовательных или не последовательных недель.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтический набор для предотвращения и/или лечения поражений тканей, включающий:

I. биосовместимый полимер, и

II. по меньшей мере одну эукариотическую клетку.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Эукариотическая клетка представляет собой такую, как определена выше.

Предметом настоящего изобретения является также фармацевтический набор для предотвращения и/или лечения поражений тканей, включающий:

i. биосовместимый полимер, и

ii. по меньшей мере один тромбоцитарный экстракт и/или лизат.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Указанный экстракт и/или лизат является таким, как определено выше.

Предметом настоящего изобретения является также применение фармацевтической композиции, содержащей:

i. биосовместимый полимер, и

ii. по меньшей мере один фактор роста

для получения лекарственного средства для лечения поражений тканей.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Фактор роста является таким, как определено выше.

В указанном варианте реализации термин «лекарственное средство» обозначает фармацевтическую композицию, как определено выше.

Предпочтительно авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что последовательное введение RGTA после введения клеток через определенный период времени от нескольких минут до нескольких дней, независимо от их природы и происхождения, предпочтительно и неожиданно дает возможность стимулировать функциональную имплантацию указанных клеток или степень приживления трансплантата. Кроме того, авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что вышеупомянутые преимущества также наблюдались независимо от происхождения, стадии развития и/или способа получения применяемых клеток.

Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно обеспечивает общее и простое решение сложной технической задачи, высоко востребованное в данной области техники. В частности, в приведенных ниже примерах, но не ограничиваясь ими, показано, что для специалистов в данной области техники не составит труда распространить принципы настоящего изобретения на любой тип тканевого поражения независимо от его происхождения, а также на любой тип ткани или органа.

В частности, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что настоящее изобретение может в общем случае применяться в отношении любых поражений тканей, в частности, в силу определенных общих характеристик поражений тканей, включая разрушение клеток и внеклеточного матрикса на участке поражения.

Предметом настоящего изобретения также является способ получения трансплантата ex vivo, включающий пропитывание трансплантата и/или органа, подлежащего трансплантации раствором, содержащим биосовместимый полимер.

Предметом настоящего изобретения также является применение биополимера формулы AaXxYy или AaXxYyZz, как определено выше, для подготовки ex vivo трансплантата и/или органа.

Биосовместимый полимер является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению пропитывание можно проводить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области. Он может включать, например, погружение органа и/или погружение в раствор, содержащий биополимер, или перфузию, или распыление.

Предметом настоящего изобретения также является применение биополимера формулы AaXxYy или AaXxYyZz, как определено выше, для подготовки имплантируемого биоматериала in vitro и/или ex vivo.

Например, для имплантируемых биоматериалов биосовместимый полимер может быть добавлен, например, путем пропитывания после получения биоматериала, например, для ткани или органа. Его можно, например, также добавлять во время получения биоматериала с самого начала, например, биополимер формулы AaXxYy или AaXxYyZz, как определено ниже, может быть добавлен в последовательные слои, например, аналогично 3D-печати.

В настоящем изобретении термин «имплантируемые биоматериалы» обозначает любые имплантируемые биоматериалы, известные специалистам в данной области и/или коммерчески доступные. Имплантируемый биоматериал может представлять собой, например, совместимый имплантируемый материал, например, любой природы, который является биодеградируемым, сшитым или несшитым, предпочтительно колонизируемым. Имплантируемые биоматериалы могут представлять собой имплантируемые биоматериалы на основе поперечно сшитых белков, например, коллагенов, фибрина, полисахаридов, например, декстрана, хитина, гиалуроновой кислоты, альгината, целлюлозы и их производных, и биодеградируемых и биосовместимых сополимеров на основе гликолевой кислоты, молочной кислоты или яблочной кислоты, или на основе полимеров, которые могут, например, осуществлять переходы жидкость-гель посредством терморегулируемой полимеризации или с помощью ферментов или облучения или других способов. Он может представлять собой, например, полимер на основе поликапролактона, полиуретана, политетрафторэтиленового силикона или на основе неорганических солей, например, фосфатов кальция или гидроксиапатитов. Имплантируемые биоматериалы могут представлять собой, например, материалы на основе или выполненные из керамики, из металла, например, алюминия, стали, титана и/или их сплавов. Предпочтительно, когда материал представляет собой материал на основе или выполненный из керамики и/или металла, чтобы пропитывание позволяло покрывать внешнюю поверхность материала; пропитывание можно преимущественно осуществлять распылением.

Согласно настоящему изобретению раствор для пропитывания может содержать от 0,1 мкг/мл до 1 мг/мл биосовместимого полимера, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению время пропитывания может составлять от 5 минут до 24 часов. Преимущественно время пропитывания может зависеть от структуры имплантируемого трансплантата и/или органа и/или материала.

Преимущественно пропитывание позволяет также повысить эффективность приживления трансплантата. Действительно, авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что наличие полимера в растворе для консервации трансплантата и/или органа преимущественно имеет защитный и антиапоптотический эффект.

Пропитывание может быть предпочтительно завершено после пропитывания биосовместимым полимером пропитыванием факторами роста и/или тромбоцитарными экстрактами, как указано выше. Согласно настоящему изобретению, время пропитывания фактором роста и/или тромбоцитарным экстрактом может составлять от 5 минут до 24 часов.

Пропитывание может быть предпочтительно завершено пропитыванием ex vivo и/или in vitro и/или осаждением клеток на имплантируемый биоматериал, пропитанный биосовместимым полимером.

Согласно настоящему изобретению клетки представляют собой такие, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению раствор для пропитывания и/или осаждения клеток может содержать от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, предпочтительно от 10000 до 1000000 клеток.

Согласно настоящему изобретению время ex vivo и/или in vitro пропитывания и/или осаждения клеток может составлять от 5 минут до 24 часов.

В настоящем изобретении пропитывание и/или осаждение клеток на имплантируемый биоматериал, пропитанный биосовместимым полимером, может быть осуществлена любым подходящим способом, известным специалистам в данной области.

Кроме того, согласно настоящему изобретению пропитывание имплантируемых биоматериалов может быть предпочтительно завершено после пропитывания биосовместимым полимером и/или ex vivo и/или in vitro пропитывания или осаждения клеток, пропитыванием по меньшей мере одним фактором роста.

Согласно настоящему изобретению пропитывание имплантируемого биоматериала, пропитанного по меньшей мере одним фактором роста, можно проводить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области.

Согласно настоящему изобретению фактор роста является таким, как определено выше.

Согласно настоящему изобретению раствор для пропитывания по меньшей мере одного фактора роста может содержать от 10 нг/мл до 100 мкг/мл фактора роста.

Согласно настоящему изобретению тромбоцитарный экстракт или тромбоцитный лизат является таким, как определено выше. Он может представлять собой, например, концентрированный тромбоцитарный экстракт, например, от 5 до 100 мл крови, например, с применением наборов для концентрации тромбоцитов, которые известны специалистам в данной области и имеются в продаже, например, наборы от Curasan (зарегистрированный товарный знак), Plateltex (зарегистрированный товарный знак), GPS (зарегистрированный товарный знак) II и RegenLab (зарегистрированный товарный знак).

Согласно настоящему изобретению раствор для пропитывания может содержать от 0,1 до 6 мл тромбоцитарного экстракта.

Другие преимущества специалисты в данной области техники могут также обнаружить при чтении приведенных ниже примеров, иллюстрируемых прилагаемыми фигурами, и приведенных в качестве иллюстрации.

Примеры

Пример 1: Получение RGTA и способ введения:

Синтез RGTA подробно описан в предшествующем уровне техники, например, в патенте “PROCEDE DE SULFONATION DE COMPOSES COMPRENANT DES GROUPEMENTS HYDROXYLES (OH) LIBRES OU DES AMINES PRIMAIRES OU SECONDAIRES” [“PROCESS FOR SULFONATION OF COMPOUNDS COMPRISING FREE HYDROXYL (OH) GROUPS OR PRIMARY OR SECONDARY AMINES”], а также в литературных источниках: Yasunori I. et al., Biomaterials 2011, 32:769e776) и Petit E. et al. Biomacromolecules. 2004 Mar-Apr; 5(2):445-52.

В примерах ниже применяли несколько известных и описанных RGTA, из которых OTR4120 (описанный в Khammari-Chebbi et al., J Fr Ophtalmol. 2008 May;31(5):465-71) и OTR4131 (описанный в Frescaline G. etal., Tissue Eng Part A. 2013 Jul;19(13-14):1641-53. doi: 10.1089/ten.TEA.2012.0377), являются коммерчески доступными. Кроме того, соединение OTR4131 представляет собой соединение, содержащее радикал Z, который представляет собой жирную кислоту, а именно уксусную кислоту, описанное в Virginie Coudry, et al. Long-Term Follow-up of Superficial Digital Flexor Tendonitis Treated by a Single Intralesional Injection of a ReGeneraTing Agent in 51 Horses Journal of Equine Veterinary Science 34 (2014) 1357-1360, и соединение, в котором Z представляет собой аминокислоту, такую как фенилаланин, описанное в патенте США №7 998 922 и патенте США №8 790 631, также применяли в примерах ниже.

В приведенных ниже примерах введение осуществляли, как описано выше. Другими словами, когда RGTA не смешивали в одном растворе с клетками, указанный RGTA вводили в соответствии со способами введения, известными для данного соединения.

Преимущественно, когда RGTA вводят в форме независимой композиции, один из полученных эффектов может представлять собой подготовку ткани или органа, подлежащего лечению, чтобы способствовать имплантации, колонизации и увеличению в объеме выбранных клеток, которые обеспечивают более эффективное и синергетическое восстановление и регенерацию тканей благодаря комбинации RGTA и клеток.

Частота введения может быть однократной или повторяться каждую неделю или пятнадцать дней или даже ежемесячно, редко в течение всего периода, составляющего несколько месяцев, в зависимости от успеха колонизации и требуемого количества инъекций/введения клеток, а также времени, необходимого для подготовки ниши перед имплантацией.

Концентрации и дозы RGTA, которые вводили, зависели от местных или системных форм введения, от частоты, от тканей, органов или областей, подлежащих лечению, и от объемов или площади поверхности поражения.

В приведенных ниже примерах, в случае когда введение осуществляли перорально, RGTA мог находиться в растворе в воде или в виде любой другой формы для перорального введения, но также в форме таблетки, гелевой капсулы или любой другой формы, совместимой с пероральным введением. Кроме того, предпочтительно перорально вводимые RGTA демонстрировали заметную резистентность к разрушению кислотой и пищеварительными соками. Преимущественно, поскольку продукт не имеет вкуса и полностью растворим в воде, предпочтительное введение представляет форму водного раствора в объеме от 10 до 25 мл и при концентрации 0,1 мг/мл, таким образом, что количество составляет от 1 до 2,5 мг на прием, от двух до пяти раз в день. В большинстве примеров эти приемы осуществляли утром перед едой и вечером перед сном для пациентов с массой от 50 до 100 кг, дозы и частоту, возможно, также изменяли; таким образом, в целом, ежедневный прием составлял от 1 до 500 мг/сут. Период данного введения может составлять от нескольких месяцев без наблюдения побочных эффектов. В частности, прием человеком по 25 мг/день в течение более одного года не вызывает никаких нарушений или каких-либо заметных побочных эффектов.

В случае лечения пищеварительного тракта клетками для восстановления и регенерации поражений количество RGTA может быть предпочтительно уменьшено. Это связано с тем, что молекулы RGTA могут преимущественно повторно собираться непосредственно на поврежденной ткани и, например, воссоздавать нишу, преимущественно обеспечивая улучшенную имплантацию клеток и, при необходимости, способствуя их пролиферации. Дозы, применяемые во время лечения пищеварительного тракта, могут составлять, например, от 1 до 50 мл при 100 мкг/мл в день. Они могут, например, представлять собой дозы, которые идентичны или аналогичны описанным в документе Meddahi et al., J Biomed Mater Res 60: 497-501 2002, например, для лечения язв желудка или пищеварительной системы, дозы, идентичные или аналогичные описанным в документе Alexakis etal., Gut 2004;53:85-90 для лечения болезни Крона, или дозы, идентичные или аналогично описанным в документе Alexakis etal., FASEB J. 2001, 15,1546-1554 для тканей, пораженных после облучения.

В приведенных ниже примерах, в случае, когда введение осуществляют путем системной инъекции, RGTA предпочтительно находились в растворе в физиологическом растворе, пригодном для инъекций, или в любой другой форме, совместимой с инъекцией, в частности, в растворах с глюкозой или другими вспомогательными веществами, которые обычно представляют собой полисахариды, такие как гепарин, или смешаны с терапевтическими продуктами, имеющими другие свойства, при условии оценки риска взаимодействия с другими активными ингредиентами. RGTA применяли в концентрациях от 0,1 до 5 мг/кг, предпочтительно от 1 до 2,5 мг/мл, внутривенно (ВВ) или внутримышечно (ВМ). Для данного пути введения посредством инъекции, инъекция может представлять собой однократную, ежедневную или еженедельную инъекцию.

В приведенных ниже примерах, когда это было возможно, местное введение в или вблизи пораженной ткани или участка было предпочтительным. В частности, этот способ введения является предпочтительным для слизистых тканей, например, буккальной, вагинальной, уретральной, желудочно-кишечной слизистой оболочки, с эндоскопическим сосудистым или сердечным доступом и/или в областях, где доступ затруднен, но может быть достигнут непосредственно, например, для костного мозга, области около сетчатки, внутрижелудочковой области, дыхательных путей или других, во время операции, которая открывает прямой доступ, или непосредственно через другие ткани или органы с помощью катетеров, игл или подходящих эндоскопов.

RGTA также можно вводить в виде спрея на поверхность ткани в случае имплантации выделенных клеток или клеток в листах или других клеток, пропитанных имплантированными материалами, которые являются опорой для существующей или будущей колонии клеток.

Что касается дыхательных путей, введение также может быть предусмотрено при вдыхании.

Что касается слизистых оболочек и/или стенок пищеварительного тракта или мышц матки или связок, если возможно, ректальный или вагинальный способ введения является предпочтительным.

Для лечения глазных тканей предпочтительная форма введения представляла собой, например, форму для промывания глаз, например, для лечения роговицы, путем транскорнеальной инъекции, например, при обработке десцеметовой оболочки, при лечении тканей, покрывающих основание глазного яблока, например, для лечения дефектов зрения, или, например, для лечения поражения клеток, связанных со слухом, например, для имплантации кохлеарных цилиарных клеток.

В примерах местное введение или инъекция могут быть однократными, ежедневными или еженедельными, тогда доза связана с площадью поверхности или объемом поражения. В частности, в примерах концентрация RGTA предпочтительно составляла 100 мкг/мл, что является предпочтительной концентрацией, и применяемый объем выбирали таким образом, чтобы покрывать пораженную площадь поверхности или пропитывать объем поражения. Таким образом, инъекция в непосредственной близости пораженного участка в ткань или орган или в участок от 0,1 до 0,5 мл RGTA позволяла пропитать ткань в объеме, который составлял в 5-100 раз больше. При нанесении на поверхность или нанесении в форме спрея, когда RGTA проникал путем адсорбции, покрытие пораженной области было достаточным. Таким образом, от трех до четырех «спреев», каждый по 140 мл, на расстоянии 5 см от поражения, было достаточно, чтобы пропитывать площадь поверхности 10 см², в качестве альтернативы, несколько миллилитров крема или геля или мази можно распространять на поражение или в непосредственной близости и, таким образом, обеспечивать доступ к RGTA. Галеновые формы кремов, мазей, гелей, молочка, пен, эмульсий, порошковых паст и т.д. являются известными специалистам в данной области и предпочтительно выбраны исходя из их гидрофильных и увлажняющих свойств, совместимых с полисахаридами, например, гиалуроновой кислотой.

В примерах другой способ введения RGTA представлял собой способ пропитывания тканей, например, для случаев трансплантации ткани или органа, такого как почка, печень, сердце, легкое, кожа, роговица, барабанная перепонка, мышцы, нервы, сухожилия, связки, кости, сосуды или кишечник, толстая кишка, как в областях анастомозов, так и в имплантатах, мочевой пузырь и т.д., являющийся исчерпывающим без данного перечня. В этом варианте реализации, который можно применять в отношении всех тканей и трансплантатов, подлежащий трансплантации орган может быть пропитан, например, путем погружения его в раствор RGTA или перфузией или путем распыления или любым другим известным для специалистов в данной области способом. Преимущественно пропитывание тканей, как упомянуто выше, преимущественно позволяет воссоздать микроокружение ткани. Действительно, RGTA преимущественно специфически связывается с сайтами связывания гепарана, доступными после поражения, и индуцируется при отборе трансплантата или подготовке реципиента трансплантата. Преимущественно это связывание позволяет воссоздать нишу, которая способствует колонизации клетками. Предпочтительные концентрации RGTA составляли от 0,01 до 100 мкг (мг) на мл. Время пропитывания было коротким, так как достаточно нескольких минут. Преимущественно пропитывание в течение нескольких часов или дня (дней) может позволить упростить процедуру, поскольку RGTA может быть добавлен к консервирующим растворам и может показать себя как защитный и антиапоптотический агент, как описано в известном уровне техники (Barritault D., Caruelle J-P. BIP121532, "POLYMERES BIOCOMPATIBLES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT" ["BIOCOMPATIBLE POLYMERS, PROCESS FOR PREPARING SAME AND COMPOSITIONS CONTAINING SAME"]; and Yue X-L, Lehri S, Li P, V, Petit V, Huang Q-F, Albanese P, Barritault D, Caruelle J-P, Papy-Garcia D and Morin C. Insights on a new path of pre-mitochondrial apoptosis regulation by a glycosaminoglycan mimetic.; Yue X-L and al, Cell Death and Differentiation, 2009, 1-12). Затем ткани подвергали воздействию растворов или суспензий, обогащенных, если это необходимо, клетками необходимой специфичности, до или после имплантации. К данной методике можно добавить тромбоцитарные экстракты или лизаты, обогащенные фактором роста.

Аутологичные клетки добавляли к трансплантату до или после имплантации, что преимущественно позволяло облегчать колонизацию областей соединения хозяин-трансплантат и способствовать трансплантации трансплантата. Данный способ обеспечивает приживление трансплантата, предотвращает некроз и увеличивает функциональное восстановление.

В примерах тромбоцитарные экстракты вводили отдельно после введения RGTA или с RGTA. В этом случае смесь получали с соотношением RGTA/PRP экстракт таким образом, что тромбоцитарный лизат, полученный из 109 тромбоцитов, суспендированных в 1 мл физиологического раствора, помещали в присутствии тромбина или 100 мг RGTA. По окончании дегрануляции тромбоцитов раствор центрифугировали с низкой скоростью. Затем супернатант, содержащий тромбоцитарные факторы и RGTA, вводили на участок поражения.

В другом варианте реализации RGTA, отдельно или смешанные с тромбоцитарными экстрактами (PRP) или выделенными факторами, вводили с терапевтическими клетками.

В примерах введение RGTA проводили не позднее первого введения клеток или предпочтительно за несколько часов или дней до этого. Таким образом, в случае перорального приема RGTA отмечали, что один или более ежедневных приемов за неделю до клеточной терапии увеличивали конечный результат регенерации ткани, причем предпочтительной дозой является прием 25 мл RGTA OTR4120 при 100 мг/мл утром перед едой и вечером перед сном, в течение по меньшей мере одной недели. В случае ВВ или местной инъекции RGTA клеточную терапию могли проводить в течение часа после введения RGTA.

В примерах, описанных ниже, клетки являются аутологичными и их предпочтительно вводят в тот же день, в который они были отобраны.

Пример 2: Пример лечения поражения ткани посредством введения RGTA и мезенхимальных стволовых клеток (MSC) на модели мышей

В настоящем примере применяемые мыши представляли 70 десятинедельных самцов (C57/BL6) мышей от Charles River, разделенных на 7 групп по 10 мышей, и соответствующих модели мыши, признанной в уровне техники.

На спине мышей наносили кожную рану с применением пуансона диаметром 6 мм (применяемого в клинике для биопсии), после чего рану оставляли на открытом воздухе. Каждому животному наносили четыре раны.

Применяемый полимер представлял собой OTR4120, и его вводили посредством подкожной (SC) инъекции в пропорции 25 мкл (мкл) раствора в 100 мкл в двух (диаметрально противоположных) точках. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC), происходящие из костного мозга (большеберцовой кости), выделенные в соответствии с стандартными протоколами, такими как описанные в «А protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow", Soleimani M, Nadri S. Nat Protoc. 2009;4(1): 102-6, суспендировали в фосфатно-буферном растворе PBS в концентрации 1×10⁶ клеток на мл и вводили в пропорции 2 инъекции 50 мкл на рану в двух точках (симметричных, ортогональных к точкам RGTA) в разное время, и рану затем измеряли через 3, 5, 7 и 10 дней после повреждения.

В течение экспериментов каждой мыши наносили несколько ран, и проводили сравнение между:

- двумя инъекциями, которые были диаметрально противоположны по отношению к ране для RGTA,

- двумя инъекциями, которые были диаметрально противоположны по отношению к ране для MSC, и

- четырьмя инъекциями в 4 кардинальных точках, соединяющих RGTA и MSC.

Различные группы мышей определяли в соответствии с композицией, вводимой в соответствии с вышеупомянутыми способами, и они подробно описаны ниже:

- Группа 1 Контроль (плацебо): введение физиологического раствора в течение 15 минут после раны/поражения.

- Группа 2 Введение MSC: 1 миллион MSC на введение при 2 симметричных точках напротив мест инъекции RGTA, 24 часа после повреждения.

- Группа 3: введение RGTA после повреждения.

- Группа 4: введение RGTA в смеси с MSC (совместная инъекция).

- Группа 5: введение RGTA после повреждения с последующим введением MS С через 5 минут.

- Группа 6: введение RGTA после повреждения с последующим введением MSC через 6 часов.

- Группа 7: введение RGTA после повреждения с последующим введением MSC через 12 часов.

- Группа 8: введение RGTA после повреждения с последующим введением MSC через 24 часа.

В таблице ниже обощены результаты относительно кинетики закрытия раны, измеренного в %, для каждого животного согласно обработке. В момент времени 0 площадь поверхности поражения по определению составляет 100% для каждого животного, когда рана закрыта, значение равно 0%.

В таблице 1 показано, что введение MSC и RGTA позволяет улучшить восстановление тканей и, в частности, позволяет значительно ускорить заживление. В частности, введение клеток через 24 часа после RGTA обеспечивает намного лучшее закрытие раны, чем при применении только RGTA или только MSC.

Аналогичный эффект был получен с клетками, происходящими из адипоцитов мышей того же помета.

Примеры настоящего изобретения, наблюдаемые в клинической практике

Многие примеры, проведенные в клинической практике, упомянутые ниже, иллюстрируют действие настоящего изобретения. Продукт RGTA в его коммерческой форме, OTR4120 или CACIPLIQ®, является легко доступным. С другой стороны, объективация не является возможной, и только клинические наблюдения документируют действие настоящего изобретения.

Пример 3: Действие комбинированного лечения посредством RGTA и аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (MSC) при лечении хронических ран

В данных примерах пациенты, имеющие различные типы хронических ран различной этиологии, такие как диабетические язвы, венозные язвы, ишемические язвы, пролежни, ожоги и приживление трансплантата, испытывали неудачную терапию в течение нескольких месяцев. Несколько способов лечения были безуспешными, включая местное лечение с помощью CACIPLIQ® (RGTA OTR4120) в соответствии с рекомендациями производителей.

Данный клиницист также применял комбинированную технологию RGTA с тромбоцитарными экстрактами или для проведения клеточной терапии с применением аутологичных MSC, полученных путем отбора 5 мл костного мозга из грудины пациента, давшего согласие. Образец, который отфильтровывали и обогащали центрифугированием в соответствии с методами, описанными для MSC, суспендировали в 1,5 мл физиологического раствора, и раствор клеток вводили в край раны подкожно, а также в центр раны. Всего выполняли примерно двенадцать инъекций по 0,1 мл вокруг контура язвы (и согласно изображению, сравнивающему язву с четвертью часов, и инъекции вводили в каждом положении часов). Согласно этому клиницисту, применение только одного RGTA или только клеточной терапии не обеспечивало заживления ран.

Также проводили комбинированное введение RGTA и клеток согласно настоящему изобретению. CACIPLIQ® наносили местно в соответствии с протоколом, рекомендованным для продукта CACIPLIQ: 5 мл раствора, содержащего 100 мкл CACIPLIQ® (RGTA OTR4120), выливали на 15×15 см компресс, и пропитанный компресс наносили на хорошо очищенную рану, в течение 5 минут, а затем удаляли. Затем вводили MSC, как описано выше (пример 1), в течение часа после применения RGTA. Затем CACIPLIQ® вводили местно два раза в неделю. Для нескольких пациентов второй образец костного мозга отбирали через 3 недели, и пациенты снова получали лечение, как и ранее, посредством инъекции MSC. Результат был очень быстрым, так как закрытие всех язв наблюдалось менее чем за 6 недель.

Другую серию клинических испытаний также проводили для других пациентов путем инъекции CACIPLIQ® (RGTA), а затем инъекции клеток в течение часа после отбора проб клеток (время для подготовки клеток). Результат был еще более удивительным, так как все у всех пациентов произошло полное заживление менее чем за один месяц. Более того, он даже отметил, что у некоторых из этих пациентов наблюдали закрытие раны через 15 дней, несмотря на то, что эта рана сохранялась в течение нескольких месяцев без каких-либо признаков улучшения. Данный клиницист никогда не наблюдал такую скорость независимо от применяемого лечения, в частности, во время лечения только CACIPLIQ® или только MSC.

Поэтому этот пример наглядно демонстрирует, что композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно и неожиданно дает возможность эффективно лечить поражения тканей, в частности, хронические раны, и преимущественно обеспечивает значительное ускорение заживления.

Кроме того, этот пример наглядно демонстрирует, что композиция согласно настоящему изобретению обеспечивает новое решение проблемы, для которой в предшествующем уровне техники не существует никакого решения.

Кроме того, сопоставимый, если не лучший эффект, наблюдали у пациентов с совместным введением RGTA, PRP и клеток. В одном предпочтительном варианте реализации после введения RGTA следовала инъекция PRP, а затем клеток, причем указанное введение по нормативным причинам проводили в течение того же периода времени. RGTA вводили отдельно (1 мл при 100 мг/мл OTR4120), совместно или последовательно с PRP (полученным из тромбоцитарного лизата из образца крови пациента, например, 50 мл), совместно или последовательно с мезенхимальными аутологичными клетками, например, но без ограничения, из различных тканевых источников.

В другом варианте реализации образец мезенхимальных стволовых клеток отбирали из жировых тканей пациента, подлежащего лечению, посредством липосакции. Способ выделения MSC был идентичен способу, описанному в примере 1 выше.

В другом примере лечения с применением композиции согласно настоящему изобретению представлен пациент с глубокой раной, покрывающей нижнюю часть ноги, включая большой палец, и включающей видимую область некроза по меньшей мере на половине нижней части пальца. В комнате для консультаций присутствовал сильный запах разложения. Первое лечение с применением клеточной терапии с применением инъекций 0,1 мл в нескольких точках вокруг раны в целом для 1 мл мезенхимальных клеток, происходящих непосредственно из костного мозга из грудины пациента, была выполнена безуспешно, и, кроме того, состояние раны ухудшилось. Второе лечение с применением CACIPLIQ только местно (зарегистрированный товарный знак) также не обеспечивало улучшения раны, и только позволило предотвратить более серьезное разрушение и «поддержать» состояние статус-кво в отношении прогрессирования и обострения раны, что позволило избежать немедленной ампутации. После этих неудач вводили инъекцию 0,5 мл в 5 точках от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл RGTA (CACIPLIQ) на стыке между здоровой областью и областью некроза пальца ноги, через час путем 5 инъекций, каждая по 0,1 мл, клеток, полученных непосредственно из другого образца, вводили 0,5 мл клеток из пункции грудины. После введения композиции согласно настоящему изобретению наблюдали регрессию раны, позволяющую избежать какой-либо ампутации и вплоть до полного восстановления раны. В частности, некротическую область полностью устраняли, а затем она заменялась прорастанием ткани, происходящим из все еще здоровых тканей, прилегающих к ране, до полного покрытия раны. В этом примере только последовательность инъекций (RGTA, а затем и мезенхимальные аутологичные клетки) была достаточной для лечения этого пациента и позволила закрыть рану пациента.

Пример 4: Действие комбинированного лечения посредством RGTA и клеточной терапии при заживлении костной ткани

В этом примере лечение не срастающегося перелома проводили с применением композиции согласно изобретению.

Аналогичным образом, в известном уровне техники описана так называемая неэффективная и сдерживающая комбинация введения RGTA с клеточной терапией, проводимая в известном уровне техники, но не позволяющая получить какое-либо улучшение переломов через несколько месяцев. Результаты для открытых ран позволили добиться заметного ускорения процесса заживления.

Описаны пациенты с не срастающимся переломом большой берцовой кости, для которых не добились успешного улучшения при применении только RGTA, либо после введения клеток из костного мозга в соответствии с протоколами, известными из уровня техники, описанными выше, или описанными Hernigou Р, Homma Y, Flouzat-Lachaniette СН, Poignard A, Chevallier N, Rouard H. Cancer risk is not increased in patients treated for orthopaedic diseases with autologous bone marrow cell concentrate. J Bone Joint Surg Am. 2013;95:2215-21.

Пациентов, не ответивших ни на лечение только RGTA, ни на лечение аутологичными клетками, взятыми непосредственно из костного мозга, лечили композицией согласно настоящему изобретению. Удивительно и неожиданно, в частности, в свете предшествующего уровня техники, что применение композиции согласно настоящему изобретению, в частности, комбинации RGTA с клетками из костного мозга, позволило инициировать процесс заживления у этих пациентов и получить то, что не было успешно достигнуто никаким лечением отдельно, таким образом демонстрируя преимущество настоящего изобретения. В частности, трех пациентов, испытывающих неудачное терапевтическое лечение, лечили композицией согласно настоящему изобретению и смогли обеспечить благотворное действие такого двойного лечения. В этих случаях клетки из костного мозга вводили через 1 ч после введения 1 мл RGTA путем местной инъекции в область не сросшегося перелома и 1 мл мезенхимальных клеток, взятых путем прокола грудины пациента, и повторно вводили в область не сросшегося перелома кости без какой-либо другой стадии лечения.

Также получали комбинацию, дополнительно содержащую тромбоцитарные экстракты, и получали отличные результаты, когда применяли ее между введением RGTA и клеток. В частности, очень положительные результаты получали при введении RGTA, после чего через час вводили PRP, а затем клетки.

В другом примере также изучали влияние композиции согласно настоящему изобретению на сохранение костей и влияние на ишемический некроз головки бедренной кости. Лечение проводили с применением RGTA и клеток или RGTA, PRP и клеток. Пациенты представляли случаи ишемии головки бедренной кости на ранней стадии до глубокого некроза, вызвавшего значительную боль. Лечение с применением RGTA и клеток согласно настоящему изобретению позволило предотвратить разрушение головки бедренной кости и необходимость выполнять хирургические процедуры для имплантации протеза. Лечение состояло из местной инъекции 1 мл RGTA OTR4131 при 10 мкг/мл в периостальной ишемической области, близкой к поражению, а затем через 30 минут местной инъекции 5 мл аутологичных клеток из костного мозга, взятых из подвздошной ямки в тот же день.

В другом случае проводили лечение с помощью PRP; указанный PRP получали из образца 10 мл периферической крови в соответствии с обычными способами и вводили местно за несколько минут до клеток образца. Результаты, полученные с помощью этих двух вариантов лечения, показали сохранение головки бедренной кости. Следует отметить, что у нескольких из этих пациентов, у которых уже появился некроз ткани, произошло полное исчезновение некроза, что указывает на процесс регенерации и замены некротических тканей. Комбинация RGTA и аутологичных клеток преимущественно позволяет обеспечить эту регенерацию с синергическим и неожиданным эффектом, улучшенным посредством инъекции PRP. В данном примере изучали влияние композиции согласно настоящему изобретению на лечение разрушения костей в случае постинфекционного остеонекроза.

Разрушение костной ткани является частым результатом и осложнением лечения хронических ран после остеомиелита инфекционного бактериального происхождения, которое в течение длительного периода времени лечили антибиотиками. Применяли композицию/способ согласно настоящему изобретению, и это позволило сохранить и реформировать костную ткань. Синергическое действие RGTA, дополненное клеточной терапией, позволило регенерировать поврежденную костную ткань, чего никогда не наблюдали при применении только RGTA или только клеточной терапии. Таким образом, несколько пациентов, получавших лечение посредством нескольких местных инъекций 0,1 мл CACIPLIQ (OTR4120 при 100 мкг/мл) в часть здоровой ткани вокруг некротической области с последующей инъекцией того же объема мезенхимальных клеток, взятых из грудины пациента без какой-либо подготовки, таким образом, были способны к восстановлению костной ткани до наступления полного разрушения, что было бы невозможно без данной терапии. Следует отметить, что это лечение проводили при сохранении терапии антибиотиками, и что, однако, не наблюдалось существенного возобновления роста костей, лечение позволяло сохранить или даже восстановить, но не позволило возобновить рост полностью разрушенной кости ех nihilo.

Пример 4: Лечение поражений суставов и сухожилий с помощью примера композиции согласно настоящему изобретению

В предшествующем уровне техники описаны эффекты инъекции только RGTA, в частности OTR4131, при лечении поражений сухожилий и суставов у спортивных и скаковых лошадей (Coudry V et al. Journal of Equine Veterinary Science, 2014, 34 pages 1357-1360, David Carnicer, research report “Preliminary report: ultrasonographic evolution of tendon lesions treated with RGTA in horses” école nationale vétérinaire de [national veterinary school of] Maison Alfort); то же самое верно для применения клеточной терапии, в частности мезенхимных клеток, взятых у лошадей у подвздошной ямки или, чаще, грудной клетки (Pechayre M. and Betizeau C. S0704, AVAC Conference, 2-4 December 2011. Lyon annual conference).

PRP также применяли по тем же показаниям (http://fr.slideshare.net/dvmfun/platelet-rich-plasma-prp-therapy).

Сравнительное исследование проводили с применением лошадей, которых лечили посредством комбинирования либо RGTA и клеток согласно настоящему изобретению, либо RGTA и PRP, либо RGTA, PRP и клеточной терапии, по сравнению с лечением только клетками.

В данном примере у лошадей были представлены либо повреждения сухожилий (на уровне сухожилия SDF), либо совместные повреждения (osteochondrosis dessicans, киста субхондральной кости, поражения мениска). Во всех случаях комбинированное лечение посредством RGTA и мезенхимальных клеток позволило значительно быстрее восстанавливать скаковых лошадей (возвращение примерно через 5-6 месяцев, то есть ускорение от одного до двух месяцев по сравнению с временем восстановления после лечения только RGTA или только клеточной терапии). Данное восстановление оценивали с точки зрения восстановления после прихрамывания; более быстрого возвращения к тренировкам и к предыдущим результатам почти для всех лошадей, получавших лечение. Для этих лошадей RGTA вводили сначала в течение недели после повреждения сухожилий под контролем эхографии. Инъекцию клеток проводили, по мере необходимости, в тот же день, но после инъекции RGTA (чаще всего приблизительно от 30 минут до одного часа, соответствующего времени, требуемому для приготовления клеток). После инъекции RGTA иногда через несколько минут проводили инъекции PRP, а затем инъекции аутологичных клеток.

Количество RGTA, клеток и PRP составляло соответственно 1 мл OTR4131, 1,5 мл лизата PRP (из 10 мл взятой крови) и 1 мл аутологичных клеток, введение PRP и клеток проводили через один час после первой инъекции RGTA.

Наилучшие результаты были получены в случае совместных повреждений, когда клетки вводили в смеси с биоматериалом, таким как коллаген или гиалуроновая кислота или комбинация этих двух веществ. В этих случаях данные продукты имеют качество, пригодное для инъекций, в растворе (применяют в пластической хирургии для морщин или суставов у людей), и их непосредственно добавляют к раствору клеток перед инъекцией. Затем раствор клеток разбавляли приблизительно в два раза: 1 мл клеток и 1 мл раствора биоматериалов, предпочтительно от 0,1 до 3 мг/мл.

В другом варианте реализации введение осуществляли в форме болюса, содержащего либо RGTA и клетки, или RGTA, PRP и клетки. Полученные результаты показали эффективное и значительно улучшенное лечение по сравнению с лечением, включающим введение только одного из вышеуказанных элементов. Более того, еще более неожиданные результаты были получены путем разделения введения RGTA и клеток на период от 30 до 60 минут до нескольких часов (предпочтительно, то же самое).

В настоящее время лечение поражений суставов и болезненности у пациентов проводили с применением клеточной терапии, и в частности путем местной инъекции аутологичных мезенхимальных клеток, происходящих из костного мозга или из жировой ткани.

Однако это лечение не позволяло получить эффективное лечение и было неудачным. Таким образом, лечение с применением композиции согласно настоящему изобретению посредством, в частности, введения (инъекции) RGTA в синовиальную жидкость с последующей инъекцией аутологичных мезенхимальных клеток или адипоцитов проводили у нескольких пациентов, испытывающих неудачное лечение клеточной терапией отдельно. Для этого количество RGTA и клеток составляло соответственно 1 мл при 100 мкг/мл, от 1 до 5 мл аутологичных клеток, обогащенных мезенхимальными клетками адипоцитов посредством центрифугирования, и их вводили посредством инъекции в тот же день, обычно от 30 минут до одного часа после инъекции RGTA. Расчет времени введения путем инъекции клеток производили в пределах часа после инъекции RGTA или инъекции двух растворов, одного из RGTA, немедленно сопровождаемого инъекцией клеток, или одновременного введения RGTA и клеток посредством одного раствора.

Добавление гиалуроновой кислоты после инъекции RGTA, но до или совместно с инъекцией клеток, а также комбинация с другими биоматериалами, такими как коллагенты типа 2, дало еще лучшие результаты у некоторых пациентов.

После такого лечения, и удивительно, повреждения и связанная с ними болезненность были устранены, что преимущественно позволяло пациентам постепенно ходить снова, не требуя имплантации коленного протеза и при отсутствии боли.

В частности, примерно у двенадцати пациентов, страдающих остеохондральными поражениями, очень ограниченных в их движениях и страдающих от боли, которых ранее безуспешно лечили с помощью только клеток или RGTA; после вышеупомянутого лечения восемь из них смогли восстановить двигательную способность в результате двукратного лечения посредством RGTA с последующим введением аутологичных клеток, что наглядно демонстрирует удивительные и неожиданные преимущества композиции согласно настоящему изобретению.

Пример 5: Лечение поражений тканей пищеварительной системы с помощью композиции согласно настоящему изобретению

В известном уровне техники описаны свойства RGTA на слизистой оболочке пищеварительного тракта, на буккальной слизистой оболочке (Morvan et al., Am J Pathol. 2004 Feb; 164(2):739-46), гингивальной слизистой оболочке (Escartin et al., FASEB J. 2003 Apr; 17(6):644-51) и на язвах желудка или кишечника (Meddahi et al., J Biomed Mater Res. 2002, 60(3):497-501); а также его способность уменьшать фиброзы, действуя на синтез коллагена, на нормальные или облученные выделенные клетки (Alexakis С.et al., FASEB J. 2001 Jul; 15(9): 1546-54), а также на биопсии тканей пациентов, страдающих от болезни Крона (Alexakis С. et al., Gut. 2004 Jan; 53(1):85-90). Однако влияния RGTA на повреждения тканей пищеварительной системы не наблюдалось или не выявлялось, в частности в отношении возможного восстановления повреждений.

В этом примере лечение с применением композиции согласно настоящему изобретению, а именно RGTA и клеток, применяли к пациенту, страдающему болезнью Крона и страдающему от перианальной фистулы в течение нескольких лет. В этом примере 0,5 мл RGTA, применяемого в концентрации 100 мкг/мл, вводили посредством инъекции вблизи фистулы (0,1 мл/на инъекцию и в 3 местах), после чего в течение 30 минут после инъекции вводили фракцию, обогащенную клетками, происходящими из образца липосакции по 10 мл) (0,1 мл на инъекцию клеток в двух или трех местах).

Введение композиции согласно настоящему изобретению позволило закрыть перианальную фистулу, тогда как ни RGTA отдельно, ни введение этих же клеток не позволило обеспечить такое закрытие и восстановление.

У второго пациента, подвергшегося хирургическому удалению эпидермоидной карциномы, расположенной очень близко к сфинктеру, с последующей химиолучевой терапией, у которого была утрачена функция сфинктера, наблюдалось положительное влияние местной инъекции RGTA OTR4120 (0,1 мл при 100 мкг/мл) на нескольких участках, через 30 минут после которой делали местную инъекцию аутологичных клеток адипоцитов (100 мкл/инъекция из исходного объема липосакции 10 мл). После такого введения наблюдали быструю колонизацию клеток очага поражения, что позволило обеспечить пациенту функциональное восстановление сфинктера, казавшееся невозможным.

Пример 6: Лечение поражений тканей, включающее введение композиции согласно настоящему изобретению:

В этих примерах не приведено объективизации аддитивного эффекта, сочетающего RGTA и клеточную терапию, поскольку каждый случай был изолирован и уникален, что не позволяло объективизировать эффект(ы). Единственный критерий, наблюдаемый и изучаемый, заключается в наличии или отсутствии улучшения у пациента после лечения.

В этом примере изучали влияние композиции согласно настоящему изобретению при регенерации легких. Пациенты, страдающие поражениями слизистой оболочки легких, вызванными воздействием токсичных паров от пожаров, вдыхали RGTA OTR4120, помещенный в испаритель, а аутологичные клетки адипоцитов вводили в тот же день, через час после ингаляции. Испаритель содержал раствор OTR4120 при 100 мкг/мл, а ингаляцию проводили в течение 10 минут, что обеспечивало приблизительно 5 мл для вдыхания. Через следующие полчаса вводили аутологичные клетки, взятые в тот же день посредством липосакции (без концентрирования) (5 мл, ВВ). Это введение удивительным образом и неожиданно обеспечило быстрое и функциональное восстановление пациента, а именно, улучшение дыхания, тогда как пациент, получавший лечение, подвергался неудачному лечению в течение нескольких месяцев.

В этом примере наблюдали действие композиции согласно настоящему изобретению на ткани, поврежденные после имплантации стента. Для этого пероральное введение RGTA проводили в день имплантации стента, и через 24 часа проводили ВВ введение аутологичных клеток адипоцитов (полученных из 50 мл липосакции). Пероральное введение RGTA OTR4120 осуществляли в количестве 50 мл раствора при 100 мкг/мл, и его поддерживали в течение 1 месяца. Инъекцию клеток повторяли через 10 дней и 20 дней.

Наблюдали, но не документировали реколонизацию участка поражения после имплантации стента, неожиданно обнаруживая подтверждение реэндотелиализации области имплантации стента, которую никогда не наблюдали при применении только RGTA или только клеток.

В этом примере приведено действие композиции согласно настоящему изобретению на поврежденные ткани, в данном случае мышцы, получившие облучение случайным образом и утратившие свою функцию. Для этого проводили пероральное введение RGTA, а именно, 25 мл при 100 мг/мл, в течение двух дней с последующим введением в облученную область мышцы клеток, а именно, 5 инъекций 1 мл раствора клеток, полученных из 50 мл образца костного мозга, взятого из подвздошной ямки в тот же день, а затем обогащенных центрифугированием, и суспендированных в 5 мл физиологического раствора. После введения проводили оценку функциональной активности. Удивительным образом и неожиданно, лечение обеспечило функциональное двигательное восстановление, которое казалось невозможным.

В этом примере изучали влияние композиции согласно настоящему изобретению на реэпителизацию роговицы. Для этого образец клеток, взятых из буккальной слизистой оболочки пациента, местно высевали в тот же день на роговицу, предварительно обработанную двумя каплями RGTA на роговицу. Такое лечение позволило обеспечить восстановление поврежденной ткани, и, в частности, эффект был значительно увеличен введением только CACICOL.

Наконец, также проводили оценку действия примера композиции согласно настоящему изобретению на поражение спинного мозга. Представлен 20-летний пациент с нарушением двигательной функции после недавнего поражения спинного мозга, что привело к параличу нижних конечностей. Лечение в течение курса из трех дней с применением примера композиции согласно настоящему изобретению, для которой количество RGTA и клеток составляло соответственно 25 мл/день раствора RGTA перорально при 100 мг/мл OTR4120 и местной инъекции клеток (в области, периферической к поражению спинного мозга) 1 мл, в 4 точках, полученных из 50 мл пункции костного мозга из подвздошной ямки. Эту инъекцию повторяли через 10 и 20 дней, в то время как ежедневное пероральное введение RGTA поддерживали в течение двух месяцев.

Неожиданно и очень положительно, у пациента началось восстановление небольшой части нейромоторной функции после первых трех дней лечения, и постепенно - заметное улучшение восстановления двигательной функции.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложено применение комбинации, содержащей биосовместимый полимер и эукариотическую клетку, выбранную из аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани, для предотвращения и/или лечения поражений тканей, выбранных из поражений тканей кожи, поражений костной ткани, поражений мышечной ткани, поражений опорно-двигательного аппарата, поражений тканей пищеварительной системы, поражений легочных тканей. Указанный биосовместимый полимер имеет общую формулу (I) AaXxYy или общую формулу (II) AaXxYyZz, где А – мономер, представляющий собой глюкозу; X – группа R₁COOR₂; Y – группа -R₇SO₃R₈; Z – ацетатная группа; R₁ – C₁-C₆ алифатическая углеводородная цепь, которая может быть разветвленной и/или ненасыщенной; R₂ и R₈ – атом водорода или катион щелочного металла; R₇ – связь; а – количество мономеров, такое, чтобы масса указанных биосовместимых полимеров составляла более 2000 Да; х – степень замещения мономеров А группами Х и равна 20-150%; y – степень замещения мономеров А группами Y и равна 30-150%; z – степень замещения мономеров А группами Z и равна 0-50%. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения поражений тканей и ускорение их заживления. 2 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл.

1. Применение комбинации для предотвращения и/или лечения поражений тканей, выбранных из поражений тканей кожи, поражений костной ткани, поражений мышечной ткани, поражений опорно-двигательного аппарата, поражений тканей пищеварительной системы, поражений легочных тканей, где указанная комбинация содержит:

- биосовместимый полимер общей формулы (I) или общей формулы (II)

AaXxYy (I)

AaXxYyZz (II)

в которой:

А представляет собой мономер, представляющий собой глюкозу,

X представляет собой группу R₁COOR₂,

Y представляет собой -R₇SO₃R₈ группу;

Z представляет собой ацетатную группу;

где R₁ представляет собой C₁-C₆ алифатическую углеводородную цепь, которая может быть разветвленной и/или ненасыщенной;

R₂ и R₈ представляют собой атом водорода или катион щелочного металла;

R₇ представляет собой связь;

а представляет собой количество мономеров, такое, чтобы масса указанных биосовместимых полимеров формулы (I) и формулы (II) была более 2000 дальтон;

х представляет собой степень замещения мономеров А группами Х и составляет от 20 до 150%;

y представляет собой степень замещения мономеров А группами Y и составляет от 30 до 150%;

z представляет собой степень замещения мономеров А группами Z и составляет от 0 до 50%;

- эукариотическую клетку, выбранную из аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный биосовместимый полимер вводят:

- внутривенно или внутримышечно в дозе от 0,1 до 5 мг/кг массы тела, или

- посредством местной инъекции в дозировке от 1 до 100 микрограммов на миллилитр, или

- перорально, от 2 до 5 равноценных приемов в день, в общем суточном количестве от 10 мкг до 5 мг/кг массы тела, или

- сублингвально натощак в виде концентрированного водного раствора от 1 до 100 мг/мл, или

- посредством введения раствора в форме назального аэрозоля или спрея,

и где указанную эукариотическую клетку вводят посредством инъекции в течение периода от 5 мин до 24 ч после первого приема указанного биосовместимого полимера.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанная комбинация содержит тромбоцитарный экстракт и/или тромбоцитарный лизат.