КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ БОРЬБЫ С ВИРУСОМ У КЛЕЩА VARROA И У ПЧЕЛ Российский патент 2020 года по МПК C07K14/435 A61K31/7105 C12N15/00 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Заявка, рассматриваемая в данный момент, содержит перечень последовательностей, который представлен в электронном виде и включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Перечень последовательностей, созданный 2 декабря 2014 года, назван P34159WO00_SL.TXT и имеет размер 12288 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящие варианты реализации изобретения в целом относятся к композициям и способам уменьшения восприимчивости пчел к инфекционному заболеванию с использованием технологии РНК-интерференции, и более конкретно к использованию технологии РНК-интерференции для снижения вирусной нагрузки и супрессии репликации вируса в Varroa клещевом векторе и у пчел.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Медоносные пчелы, Apis mellifera, необходимы для эффективного опыления сельскохозяйственных культур и, следовательно, имеют решающее значение для мирового сельского хозяйства. Также медоносные пчелы производят экономически важные продукты, включающие мед и пчелиный воск. Здоровье и жизненность пчелиных семей находятся под угрозой многочисленных паразитов и патогенных микроорганизмов, которые включают вирусы, бактерии, простейших и клещей, каждый с характерными способами передачи.

Как правило, передача вирусов может происходить двумя путями: горизонтальной и вертикальной передачами. При горизонтальной передаче вирусы передаются между индивидуумами одного и того же поколения, в то время как вертикальная передача происходит от взрослых к своему потомству. В социальных организмах передача может происходить через многожественные пути (для подробный обзор см. Chen Y P, et al (2006) Appl Environ Microbiol. 72(1):606-11). В последнее время в пчелиных семьях была зарегистрирована горизонтальная передача вирусов медоносных пчел, например, передача вируса деформации крыла (DWV) и кашмирского вируса пчел (KBV) через паразитного клеща Varroa destructor, а также есть некоторые доказательства присутствия вируса в пчелиных яйцах и молодых личинках, на этапах жизни, на которых Varroa клещи не паразитируют.

Varroa (Varroa destructor) клещи представляют собой паразита номер один для управляемых медоносных пчел (Apis mellifera) и наибольшую глобальную угрозу для коммерческого пчеловодства (Rosenkranz et al. 2010). Varroa клещи паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в сотах с кукольным расплодом. Клещи используют свои ротовые аппараты для прокалывания экзоскелета и питаются гемолимфой пчелы. Эти раневые участки в экзоскелете дают пристанище бактериальным инфекциям, таким как Melissococcus pluton, которая вызывает болезнь европейского гнильца. В дополнение к их паразитическим воздействиям, предполагается, что клещи Varroa действуют в качестве векторов для ряда пчелиных патогенов, включая вирус деформации крыла (DWV), кашмирский вирус пчел (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черных маточников (BQCV), и могут ослабить иммунные системы своих хозяев, делая их уязвимыми к инфекциям. Известно, что некоторые вирусы пчел реплицируются в клеще, тем самым значительно увеличивая вирусную нагрузку. Если не лечить заражения Varroa, то это, как правило, приводит к гибели на уровне колонии.

В настоящее время пчеловоды используют множество методов для контроля уровней Varroa, которые включают различные химические акарициды, большинство из которых утратили эффективность и являются токсичными и/ или остаются частично в воске и меде. Другие способы включают применение щавелевой или муравьиной кислоты, монотерпенов (тимола), и различные другие приемы обработки, с сильно изменчивыми последствиями, включающими токсичность для леченных колоний. Разведение пчел устойчивых к Varroa, например, путем выбора гигиенического поведения, приводящего в результате к удалению инфицированного расплода, обеспечило ограниченный практический успех.

Подтверждается, что современные методы лечения заражений Varroa являются неэффективными, поскольку клещ развивает устойчивость к существующим акарицидам. В дополнение, использование таких акарицидов может ввести вредные химические вещества в мед, предназначеный для утребления человеком.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящие варианты реализации изобретения относятся к композициям и способам борьбы с вирусной нагрузкой и/ или вирусной репликацией в клещах Varroa и в медоносных пчелах.

Данное изобретение относится к способу снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации в клеще Varroa destructor или в пчелиной семье; способ, включающий предоставление клещу Varroa destructor или пчелиной семьи композицией, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего снижается вирусная нагрузка или супрессируется вирусная репликация в клеще Varroa destructor или в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (Cloudy Wing Virus, CWV), вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса 1 клеща Varroa destructor (VDV-1), вируса Какуго (Kakugo Virus, KV) и вируса озера Синай (Laker Sinai Virus, LSV).

Данное изобретение также относится к композиции для предоставления клещу Varroa destructor, пчеле или пчелиной семье, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция снижает вирусную нагрузку или супрессирует вирусную репликацию у клеща Varroa destructor, у пчелы или в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция повышает устойчивость пчелы или пчелиной семьи к заболеванию, вызываемому вирусом пчел.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК), одноцепочечную РНК (оцРНК), двухцепочечную РНК (дцРНК), двухцепочечную ДНК (дцДНК) или двухцепочечный ДНК-РНК гибрид.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер подавляет регуляцию вирусного гена. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусный ген кодирует белок оболочки, РзРп, VP1, VP2 или хеликазу. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или к ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает смесь из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных полинуклеотидных триггеров, которые нацелены на различные вирусы, или нацелены на различные гены одного и того же вируса, или нацелены на различные фрагменты вирусного гена.

Данное изобретение также относится к способу снижения вирусной нагрузки в пчелиной семье; способ, включающий снижение вирусной нагрузки у паразита пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная нагрузка в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой клеща Varroa destructor.

Данное изобретение дополнительно относится к способу снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел; способ, включающий предоставление паразиту пчелы композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается восприимчивость пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание представяет собой синдром разрушения пчелиных семей (СРПС). В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой клеща Varroa destructor.

В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая эффективное количество полинуклеотидного триггера, предоставляется путем опрыскивания клеща Varroa, путем непосредственного кормления клеща Varroa, путем непосредственного кормления пчел в пчелиной семье, или любой из этих комбинаций.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается способ снижения вирусной нагрузки у клеща Varroa. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус пчел выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (Cloudy Wing Virus, CWV) вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса 1 клеща Varroa destructor (VDV-1) и вируса Какуго (Kakugo Virus, KV). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, предлагается полинуклеотидный триггер, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. Согласно некоторыми вариантами реализации изобретения, предлагается способ подавления регуляции экспрессии вирусного гена в клещах Varroa.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения предлагаются способы и композиции для предотвращения распространения болезней пчел, таких как синдром разрушения пчелиных семей, за счет применения технологии РНК-интерференции по отношению к клещу Varroa, направленные на инфекционные организмы и агенты пчел, такие как DWV, IAPV, вирус острого паралича пчел и кашмирский вирус пчел.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ повышения устойчивости пчелы к заболеванию, вызываемому вирусом пчел, включающий предоставление эффективного количества полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусному гену пчел, клещу Varroa, вследствие чего снижается вирусная нагрузка у клеща Varroa и повышается устойчивость пчелы к заболеванию, вызываемому вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ повышения устойчивости пчелиной семьи к заболеванию, вызываемому вирусом пчел, включающий предоставление эффективного количества полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусному гену пчел, клещу Varroa, вследствие чего снижается вирусная нагрузка у клеща Varroa и повышается устойчивость пчелиной семьи к заболеванию, вызываемому вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки у клеща Varroa destructor; способ, который включает предоставление или применение к клещу Varroa destructor композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у клеща Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность вирусного гена пчел представляет собой последовательность по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки в пчелиной семье; способ, включающий снижение вирусной нагрузки у паразита пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная нагрузка в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность гена вируса пчел представляет собой последовательность по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной репликации у клеща Varroa destructor; способ, который включает применение к клещу Varroa destructor композиции, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию гена вируса пчел у клеща Varroa destructor, вследствие чего снижается вирусная репликация у клеща Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидный триггер, который является по существу идентичным или по существу комплементарным вирусному гену или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной репликации в пчелиной семье; способ, включающий снижение вирусной репликации у паразита пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная экспрессия в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность гена вируса пчел представляет собой последовательность по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел; способ, включающий предоставление паразиту пчелы композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается восприимчивость пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представяет собой Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание представяет собой синдром разрушения пчелиных семей (СРПС). В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность гена вируса пчел представляет собой последовательность по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения пчела представяет собой медоносную пчелу.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения медоносная пчела представяет собой летную пчелу.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения медоносная пчела представяет собой ульевую пчелу.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к композиции, которая содержит эффективное количество одного или более полинуклеотидных триггеров, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (Cloudy Wing Virus, CWV) вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса 1 клеща Varroa destructor (VDV-1), вируса Какуго (Kakugo Virus, KV) и вируса озера Синай (Laker Sinai Virus, LSV). В некоторых вариантах реализации изобретения вирус представяет собой IAPV. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус представяет собой DWV. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусный ген кодирует белок оболочки, РзРп, VP1, VP2 или хеликазу. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или к ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает смесь из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных полинуклеотидных триггеров, которые нацелены на различные вирусы, или нацелены на различные гены одного и того же вируса, или нацелены на различные фрагменты вирусного гена. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция включает один или более полинуклеотидных триггеров, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности DWV; и один или более полинуклеотидных триггеров, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности IAPV. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к композиции, которая содержит эффективное количество одного или более полинуклеотидных триггеров, которые содержат нуклеиновую кислоту, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 11, 13, 14, 17 и 18. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к композиции, которая содержит эффективное количество одного или более полинуклеотидных триггеров, которые содержат нуклеиновую кислоту, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 12, 15, 16, 19 и 20. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК), одноцепочечную РНК (оцРНК), двухцепочечную РНК (дцРНК), двухцепочечную ДНК (дцДНК) или двухцепочечный ДНК-РНК гибрид. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция включает один или более полинуклеотидных триггеров и один или более вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения вспомогательное вещество включает одно или более вещество, выбранное из сахара, растворителя, белка, пчелиной пищи и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения сахар выбран из фруктозы, глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, галактозы, рибозы и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения пища для пчел выбрана из меда, пыльца, Wheast, соевой муки, дрожжей, дрожжевого продукта и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция представляет собой композицию, принимаемую пчелой вовнутрь, которая выбрана из группы, состоящей из жидкой композиции, принимаемой пчелой вовнутрь, и твердой композиции, принимаемой пчелой вовнутрь. В некоторых вариантах реализации изобретения жидкая композиция, принимаемая пчелой вовнутрь, представляет собой сахарный сироп. В некоторых вариантах реализации изобретения твердая композиция, принимаемая пчелой вовнутрь, представляет собой пирожное или сухую смесь.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 изображает филогенетическое дерево некоторых вирусов пчел.

Фигура 2а изображает график, показывающий процент выживаемости клеща Varroa после лечения смесью триггеров против вирусов пчел.

Фигура 2б изображает график, показывающий уровни DWV у Varroa через 72 ч после лечения в эксперименте непосредственного кормления Varroa, измеренные с помощью количественной ПЦР.

Фигура 3 изображает график, показывающий уровни DWV у пчел по сравнению с уровнями DWV у Varroa при различном числе (0-3 или 4-62) Varroa на 100 пчел.

Фигура 4 изображает график, показывающий репликацию DWV у пчел через 4 дня, 8 дней и 14 дней после кормления пчел смесью дцРНК триггеров (MIX), неспецифической дцРНК (SCR) или в отсутствие дцРНК (CON).

Фигура 5а изображает график, показывающий уровни DWV у Varroa через 3 дня после лечения в эксперименте непосредственного кормления Varroa, измеренные с помощью QuantiGene^®.

Фигура 5б изображает график, показывающий уровни IAPV у Varroa через 72 ч после лечения в эксперименте непосредственного кормления Varroa, измеренные с помощью QuantiGene^®.

Фигура 6а изображает график, показывающий экспрессию DWV у медоносных пчел через 4 дня после лечения пчел, измеренную с помощью QuantiGene^®.

Фигура 6б изображает график, показывающий репликацию DWV у медоносных пчел через 4 дня после лечения пчел, измеренную с помощью QuantiGene^®.

Фигура 7а изображает график, показывающий экспрессию IAPV у медоносных пчел через 4 дня после лечения пчел, измеренную с помощью QuantiGene^®.

Фигура 7б изображает график, показывающий репликацию IAPV у медоносных пчел через 4 дня после лечения пчел, измеренную с помощью QuantiGene^®.

Фигура 8 изображает график, показывающий экспрессию LSV у медоносных пчел через 4 дня после лечения пчел, измеренную с помощью QuantiGene^®.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Специалистам в данной области техники будут очевидны многочисленные способы, которые могут быть использованы в практике данного изобретения. В действительности данное изобретение никоим образом не ограничивается описанными способами и материалами. Все ссылки, цитируемые в данном документе, включены в своем полном объеме посредством ссылки. Для целей данного изобретения, ниже определены следующие термины.

Используемый в данном документе термин "около" относится к ± 10%.

Используемая в данном документе форма единственного числа включает ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать в себя множество соединений, в том числе их смеси.

Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения приведены так, что читаются слева направо в направлении от 5'- к 3'-концу. Следует понимать, что любая последовательность с идентификационным номером (SEQ ID NO.), описанная в заявке, рассматриваемой в данный момент, может относиться как к последовательности ДНК, так и к последовательности РНК, в зависимости от контекста, в котором упоминается данный SEQ ID NO., даже если этот SEQ ID NO. выражен только в формате последовательности ДНК или только в формате последовательности РНК. Дополнительно, изобретение касательно последовательности нуклеиновой кислоты раскрывает ее обратную комплементарную последовательность, поскольку одна обязательно определяет другую, как это известно среднему специалисту в данной области техники. В случае, когда термин приводится в единственном числе, авторы даного изобретения также рассматривают аспекты изобретения, описываемые множественным числом этого термина.

Пчелы восприимчивы к огромному количеству вирусных инфекций. На данный момент идентифицировано 24 вируса пчел. Большинство из них представляют собой РНК вирусы с положительной цепью, которые содержат РНК-зависимую РНК-полимеразу (РзРп). Были идентифицированы два филогенетических семейства вирусов пчел с двумя основными структурными форматами. См. фигуру 1. Полевые образцы пчел в США, сортированные по наличию 9 различных вирусов пчел с использованием QuantiGene^® анализа, показали высокую распространенность вируса деформации крыла (DWV), вируса 1 клеща Varroadestructor (VDV-1), вируса израильского острого паралича (IAPV), вируса острого паралича пчел (ABPV) и кашмирского вируса пчел (KBV). Вирус озера Синай (Laker Sinai Virus, LSV), включая вирус озера Синай тип 1 (LSV-1) и вирус озера Синай тип 2 (LSV-2), представляет собой другой вирус, обнаруженный в пчелином улье. Показано, что лечение вирусных инфекций, путем подавления регуляции конкретного продукта вирусного гена, будет успешным при ликвидировании инфекций, индуцированных вирусами, у пчелы (см., публикацию патента США 2009/0118214). В настоящий момент авторы данного изобретения раскрывают способы и композиции для лечения вирусной инфекции у клещей Varroa и у пчел. Дополнительно авторы данного изобретения раскрывают лечение вирусной инфекции у пчел за счет снижения вирусной нагрузки у паразитных клещей Varroa.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной нагрузки у клещей Varroa destructor и у пчел. Varroa клещи паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в сотах с кукольным расплодом. Клещи используют свои ротовые аппараты для прокалывания экзоскелета и питаются гемолимфой пчелы. Полинуклеотидные агенты, примененные к пчелам для лечения Varroa клещевых заражений, присутствовали в гемолимфе пчелы, вследствие чего становились доступными и для клеща (см., публикацию патента США 2012/0258646).

В некоторых вариантах реализации данного изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной репликации у клещей Varroa destructor и у пчел. В некоторых вариантах реализации данного изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения или предотвращения передачи вирусов пчел от пчелы или пчелиной личинки к клещу Varroa destructor, который питается на пчеле или личинке пчелы. В некоторых вариантах реализации данного изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения или предотвращения передачи вирусов пчел от клеща Varroa destructor к пчеле или к личинке пчелы, на которых паразитирует клещ.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной нагрузки у пчелы. В некоторых вариантах реализации изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной нагрузки в пчелиной семье.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной репликации у пчелы. В некоторых вариантах реализации изобретения технология РНК-интерференции используется для снижения вирусной репликации в пчелиной семье.

"РНК-интерференция" относится к процессу сиквенс-специфического посттранскрипционного сайленсинга гена у животных, опосредованного малыми РНК. Соответствующий процесс у растений обычно называется "посттранскрипционный сайленсинг гена" или "РНК сайленсинг", а также называется "подавление транскрипции" в грибах. Пока не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что процесс посттранскрипционного сайленсинга гена, будучи эволюционно-консервативным механизмом клеточной защиты, используется для предотвращения экспрессии чужеродных генов и в нем обычно участвуют разнообразные растениями и таксономические группы. Такая защита от экспрессии чужеродного гена могла развиться в ответ на продуцирование двухцепочечных РНК (дцРНК), полученных в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозоных элементов в геном хозяина, через клеточный ответ, который специфически разрушает гомологичную одноцепочечную РНК или вирусную геномную РНК. В аспектах, согласно данному изобретению, композиция нуклеиновой кислоты приводит в результате к РНК-интерференции в целевом организме. В некоторых аспектах композиция нуклеиновой кислоты приводит в результате к РНК-интерференции у Varroa destructor, когда он находится на организме хозяина - пчелы или личинки пчелы.

Фраза "клещ Varroa destructor" относится к внешнему паразитическому клещу, который поражает медоносных пчел Apis cerana и Apis mellifera. Клещ может быть на взрослой стадии, питаясь на пчеле, или на личиночной стадии, внутри сот с расплодом медоносной пчелы.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения вирус пчел выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (Cloudy Wing Virus, CWV) вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса 1 клеща Varroa destructor (VDV-1), вируса Какуго (Kakugo Virus, KV) и вируса озера Синай (Laker Sinai Virus, LSV).

В некоторых вариантах реализации данного изобретения вирус пчел представляет собой РНК вирус с положительной цепью. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус пчел представляет собой РНК вирус с отрицательной цепью. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус пчел представляет собой DWV. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус пчел представляет собой IAPV. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус пчел представляет собой LSV.

Как используеся в данном документе, измерение "вирусной нагрузки", "вирусных уровней" и "вирусной экспрессии" относится к обнаружению смысловой цепи последовательности вируса пчелы, и эти термины являются взаимозаменяемыми в данном изобретении. В данной области техники известн ряд способов обнаружения, включая, но не ограничиваясь этими, количественную ПЦР (количественную ПЦР) и QuantiGene^® анализ. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная нагрузка или вирусная экспрессия определяется как средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) и нормируется по СИФ генов домашнего хозяйства, чтобы показать наличие вируса у пчелы, в пчелиной семье или у клещей Varroa. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная нагрузка измеряется по степени тяжести активной вирусной инфекции.

Как используется в данном документе, измерение "вирусной репликации" относится к обнаружению отрицательной цепи последовательности вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация определяется как средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) и нормируется по СИФ генов домашнего хозяйства, чтобы показать наличие вируса у пчелы, в пчелиной семье или у клещей Varroa. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация измеряется по степени тяжести активной вирусной инфекции.

Используемый в данном документе термин "титр вируса" относится к концентрации вирусов в пробе. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная нагрузка измеряется с помощью титра вируса. Ряд способов известны в данной области техники для расчета титра вируса, и они охватываются данной заявкой.

Используемый в данном документе термин "хозяин" или "организм-хозяин" относится к организму, который дает пристанище паразиту и обеспечивает питание паразита. "Паразит" представляет собой организм, который имеет не симбиотического взаимоотношения с организмом-хозяином и получает преимущества за счет организма-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения организм-хозяин представляет собой пчелу. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой клеща Varroa.

Используемый в данном документе термин "пчела" относится как к взрослой особи пчелы, так и к ее куколке в сотах. Согласно одному аспекту пчела представляет собой такую в улье. Взрослая пчела определена как любое из ряда летающих, покрытых волосками, как правило, жалящих насекомых надсемейства Apoidea, порядка Hymenoptera, включая как живущих обособленно, так и социальные виды, и характеризущихся грызуще-сосущими ротовыми аппаратами для сбора нектара и пыльцы. Примеры родов пчел включают, но не ограничиваются этими, Apis, Bombus, Trigona, Osmia и тому подобное. В одном аспекте пчелы включают, но не ограничиваются этими, шмелей (Bombus terrestris), медоносных пчел (Apis mellifera) (включая летных пчел и ульевых пчел) и Apis cerana. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для лечения насекомых: либо хозяина, либо паразита.

Согласно одному аспекту пчела представляет собой часть колонии. Термин "семья" относится к популяции пчел, содержащей десятки, как правило, несколько десятков тысяч пчел, которые взаимодействуют при строительстве гнезда, сборе пищи и выкармливании расплода. Семья обычно имеет одну матку, остальная часть пчел является либо "рабочими пчелами" (самки), либо "трутнями" (самцы). Социальная структура семьи поддерживается маткой и рабочими пчелами и зависит от эффективной системы коммуникации. Разделение труда в пределах касты рабочих пчел в первую очередь зависит от возраста пчелы, но меняется в зависимости от потребностей семьи. Репродукция и сила семьи зависит от матки, количества продовольственных запасов и размера рабочей силы. Также медоносных пчел можно подразделить на категории "ульевых пчел", обычно это начальный промежуток времени жизни рабочих пчел, в течение которого "ульевая пчела" выполняет работы внутри улья, и "летных пчел", во время более познего промежутка времени жизни пчел, в течение которого "летная пчела" находит и собирает пыльцу и нектар за пределами улья и приносит нектар или пыльцу в улей для потребления и хранения. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для лечения семей насекомых.

Используемый в данном документе термин "паразит" относится как взрослым, так и к незрелым формам организмов, которые непосредственно получают преимущества за счет другого организма, хозяина, например, путем питания кровью или жидкостями хозяина, живущим внутриклеточно в клетке организма-хозяина или живущих на теле организма-хозяина. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для лечения паразитов. В одном аспекте паразит представляет собой Varroa destructor.

Используемая в данном документе фраза "РНК сайленсинг" относится к группе регуляторных механизмов (например, РНК-интерференции (РНКи), транскрипционному сайленсингу генов (TGS), посттранскрипционному сайленсингу генов (PTGS), подавлению транскрипции, косупрессии и трансляционной репрессии), опосредованных молекулами РНК, которые приводят к ингибированию или "сайленсингу" экспрессии соответствующего вирусного гена. РНК сайленсинг наблюдается во многих типах организмов, в том числе у растений, животных и грибов. В аспектах, согласно данному изобретению, композиции нуклеиновых кислот обеспечивают РНК сайленсинг. В некоторых аспектах композиции нуклеиновых кислот обеспечивают сайленсинг вирусных генов у пчелиного паразита.

Данное изобретение относится к способу снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации в клеще Varroa destructor или в пчелиной семье; способ, включающий предоставление клещу Varroa destructor или пчелиной семьи композицией, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего снижается вирусная нагрузка или супрессируется вирусная репликация в клеще Varroa destructor или в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения вирус выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (Cloudy Wing Virus, CWV), вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса 1 клеща Varroa destructor (VDV-1), вируса Какуго (Kakugo Virus, KV) и вируса озера Синай (Laker Sinai Virus, LSV).

Данное изобретение также относится к композиции для предоставления клещу Varroa destructor, пчеле или пчелиной семье, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция снижает вирусную нагрузку или супрессирует вирусную репликацию у клеща Varroa destructor, у пчелы или в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция повышает устойчивость пчелы или пчелиной семьи к заболеванию, вызываемому вирусом пчел.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК), одноцепочечную РНК (оцРНК), двухцепочечную РНК (дцРНК), двухцепочечную ДНК (дцДНК) или двухцепочечный ДНК-РНК гибрид.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер подавляет регуляцию вирусного гена. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусный ген кодирует белок оболочки, РзРп, VP1, VP2 или хеликазу. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности, или которая имеет 100% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или к ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает смесь из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных полинуклеотидных триггеров, которые нацелены на различные вирусы, или нацелены на различные гены одного и того же вируса, или нацелены на различные фрагменты вирусного гена.

Данное изобретение также относится к способу снижения вирусной нагрузки в пчелиной семье; способ, включающий снижение вирусной нагрузки у паразита пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная нагрузка в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой клеща Varroa destructor.

Данное изобретение дополнительно относится к способу снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел; способ, включающий предоставление паразиту пчелы композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается восприимчивость пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание представяет собой синдром разрушения пчелиных семей (СРПС). В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой клеща Varroa destructor.

В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая эффективное количество полинуклеотидного триггера, предоставляется путем опрыскивания клеща Varroa, путем непосредственного кормления клеща Varroa, путем непосредственного кормления пчел в пчелиной семье, или любой из этих комбинаций.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации у клеща Varroa destructor; способ, который включает предоставление клещу Varroa destructor композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация или снижается вирусная нагрузка у клеща Varroa destructor.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации у пчелы или в пчелиной семье; способ, который включает предоставление пчеле или пчелиной семье композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация или снижается вирусная нагрузка у пчелы или в пчелиной семье.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации у пчелы или в пчелиной семье; способ, который включает снижение вирусной нагрузки или супрессию вирусной репликации у паразита пчелы или пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная нагрузка в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой Varroa destructor.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации у клеща Varroa destructor; способ, который включает применение к клещу Varroa destructor композиции, которая содержит эффективное количество по меньшей мере одного полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию вирусного гена у клеща Varroa destructor, вследствие чего снижается вирусная нагрузка или супрессируется вирусная репликация у клеща Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидный триггер, который является по существу идентичным или по существу комплементарным вирусному гену или его фрагменту.

В одном аспекте данное изобретение предложено для снижения вирусной нагрузки или супрессии вирусной репликации в пчелиной семье; способ, который включает снижение вирусной нагрузки или супрессию вирусной репликации у паразита пчелиной семьи путем предоставления паразиту композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается вирусная экспрессии в пчелиной семье. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представляет собой Varroa destructor.

В одном аспекте в данном изобретении предложен способ снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел; способ, включающий предоставление паразиту пчелы композиции, которая содержит эффективное количество полинуклеотидного триггера, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентичная или по существу комплементарная вирусной последовательности, вследствие чего супрессируется вирусная репликация у паразита и снижается восприимчивость пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения паразит представяет собой Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание представяет собой синдром разрушения пчелиных семей (СРПС).

Используемый в данном документе термин "триггер" или "полинуклеотидный триггер" относится к биологически активной полинуклеотидной молекуле, которая по существу гомологичная или комплементарная полинуклеотидной последовательности целевого гена или РНК, которая экспрессирована с этого целевого гена или его фрагмента, и функционирует для супрессии экспрессии целевого гена или обеспечения нокдаун фенотипа. Полинуклеотидные триггеры способны к ингибированию или "сайленсингу" экспрессии целевого гена. Полинуклеотидные триггеры, как правило, описывают по отношению к их "целевой последовательности". Полинуклеотидные триггеры могут быть одноцепочечной ДНК (оцДНК), одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК) или двухцепочечными ДНК/РНК гибридами. Полинуклеотидные триггеры могут содержать встречающиеся в природе нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды, нуклеотидные аналоги или любую из их комбинаций. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер может быть включен в состав более крупного полинуклеотида, например, в молекулу первичной микроРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер может быть процессирован в малые интерферирующие РНК (миРНК). В одном аспекте полинуклеотидный триггер способен ингибировать экспрессию вирусного гена. В другом аспекте полинуклеотидный триггер может быть использован в способах ингибирования экспрессии вирусного гена и вследствие чего может снижать вирусную нагрузку у организма-хозяина. В некоторых аспектах вирусный ген представляет собой ген DWV, VDV-1, IAPV, ABPV, KBV или LSV, а организм-хозяин представляет собой Varroa destructor.

Используемый в данном документе термин "целевая последовательность" или "целевой ген" относится к нуклеотидной последовательности, которая встречается в гене или в продукте гена, против которой направлен полинуклеотидный триггер. В данном контексте термин "ген" означает обнаруживаемый участок геномной последовательности, соответствующей единице наследования, который включает регуляторные участки, такие, как промоторы, энхансеры, 5'-нетранслируемые участки, интронные участки, 3'-нетранслируемые участки, транскрибируемые участки и другие функциональные участки последовательности, которые могут существовать в виде природных генов или трансгенов в геноме растения. В зависимости от обстоятельств, термин целевая последовательность или целевой ген может относиться к полноразмерной нуклеотидной последовательности гена или продукта гена, направленной на супрессию, либо к нуклеотидной последовательности части гена или части продукта гена, направленной на супрессию.

Используемый в данном документе термин "полученный из" относится к указанной последовательности нуклеотидов, которая может быть получена из конкретного указанного источника или вида, хотя и не обязательно непосредственно из этого указанного источника или вида.

Используемые в данном документе термины "последовательность", "нуклеотидная последовательность" или "полинуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК, молекулы РНК или их части.

Термин "полинуклеотид" относится к любому полимеру мононуклеотидов, которые связаны межнуклеотидными связями. Полинуклеотиды могут состоять из встречающиеся в природе рибонуклеотидов, встречающиеся в природе дезоксирибонуклеотидов, аналогов встречающиеся в природе нуклеотидов (например, энантиомерных форм встречающиеся в природе нуклеотидов) или любой их комбинации. Там, где полинуклеотид представляет собой одноцепочечный, его длина может быть описана в терминах числа нуклеотидов. Там, где полинуклеотид представляет собой двухцепочечный, его длина может быть описана в терминах числа пар оснований.

Используемый в данном документе термин "нетранскрибируемый полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, который не включает полную транскрипционную единицу полимеразы II.

Термин "экспрессия гена" относится к процессу преобразования генетической информации, закодированной в геномной ДНК, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК или малую ядерную РНК) через транскрипцию гена, посредством ферментного действия РНК-полимеразы, и в белок через трансляцию с мРНК. Экспрессия гена может регулироваться на многих этапах процесса.

В вариантах реализации изобретения, описанных в данном документе, вирусные последовательности выбраны в качестве мишеней для полинуклеотидных триггеров. В некоторых вариантах реализации изобретения выбраны целевые последовательности, включающие низкое содержание G/C нуклеотидов, поскольку такие оказались более эффективными при опосредовании сайленсинга генов по сравнению с теми, в которых содержание G/C нуклеотидов выше чем 55%. В некоторых вариантах реализации изобретения по длине целевого гена выбираются несколько целевых участков.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная вирусному гену или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеиновую кислоту, которая по существу комплементарная или по существу идентичная последовательности по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеиновую кислоту, которая по существу комплементарная или по существу идентичная последовательности по меньшей мере из 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 смежных нуклеотидов гена вируса пчел. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусный ген кодирует белок оболочки, РзРп, вирусный белок 1 (VP1), VP2 или хеликазу. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная DWV гену или IAPV гену, или их фрагментам. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная LSV гену или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная гену вируса острого паралича пчел или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная гену кашмирского вируса пчел или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная гену вируса черных маточников или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная гену вируса хронического паралича пчел или его фрагменту. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарная или по существу идентичная гену вируса туманного крыла или его фрагменту.

Могут быть разработаны множественные последовательности патогена пчел с целью включения последовательностей, подходящих для получения полинуклеотидных триггеров, эффективных против более чем одного вируса пчел. Такие множественные дцРНК патогена пчел могут быть длинного или короткого размера и могут включать в себя последовательности, соответствующие гомологичным последовательностям в пределах одного класса пчелиных вирусов. Дополнительно могут быть разработаны множественные последовательности с целью включения двух или более последовательностей дцРНК одного и того же патогена пчел.

Под термином "по существу идентичный" или "по существу комплементарный" подразумевается, что биологически активный полинуклеотидный триггер (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида или его части, или часть одноцепочечного полинуклеотида) гибридизуется при физиологических условиях с эндогенным геном, с РНК, транскрибируемой с этого гена, или с их фрагментами, для осуществления регуляции или супрессии эндогенного гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения биологически активный полинуклеотидный триггер имеет 100-процентную идентичность последовательности или по меньшей мере около 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более смежных нуклеотидов в целевом гене или в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения биологически активный полинуклеотидный триггер имеет 100-процентную комплементарность последовательности или по меньшей мере около 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более смежных нуклеотидов в целевом гене или в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения биологически активный полинуклеотидный триггер имеет 100-процентную идентичность или комплементарность последовательности к одному аллелю или к одному члену семейства данного целевого гена (кодирующей или некодирующей последовательности гена). В некоторых вариантах реализации изобретения биологически активный полинуклеотидный триггер имеет по меньшей мере около 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность или комплементарность последовательности к множественным аллелям или к членам семейства данного целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения биологически активный полинуклеотидный триггер имеет 100-процентную идентичность или комплементарность последовательности к множественным аллелям или к членам семейства данного целевого гена.

Как используется в данном документе, говорят, что молекулы последовательности нуклеиновой кислоты проявляют "полную комплементарность", когда каждый нуклеотид одной последовательности, читаемой от 5'-конца к 3'-концу, комплементарный каждому нуклеотиду другой последовательности, читаемой от 3'-конца к 5'-концу. Нуклеотидная последовательность, которая полностью комплементарна эталонной нуклеотидной последовательности, будет проявлять последовательность, идентичную обратной комплементарной последовательности эталонной нуклеотидной последовательности.

Следует иметь в виду, что полинуклеотидный триггер, например, дцРНК по данному изобретению, не обязательно должен быть ограничен теми молекулами, которые содержат только природные нуклеотиды, но дополнительно охватывает химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотидные компоненты. Полинуклеотидные триггерные агенты по данному изобретению также могут включать модификации или замены оснований. Используемый в данном документе термин "немодифицированные" или "природные" основания включают пуриновые основания: аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания: тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные основания включают, но не ограничиваются этими, другие синтетические и природные основания, такие как 5-метилцитозин (5-Ме-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил (halouracil) и цитозин, 5-(пропинил)урацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденинов и гуанинов, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилов и цитозинов, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные основания включают те, которые описаны в патенте США № 3687808, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, I., ed. John Wiley & Sons, 1990, те, которые раскрыты в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 613, и те, которые раскрыты в Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-2, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Такие основания являются особенно полезными для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений данного изобретения. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины, и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин (aminopropyladenine), 5-(пропинил)урацил и 5-(пропинил)цитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замены увеличивали стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2 °C. (Sanghvi YS et al. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными заменами оснований, еще более конкретно, когда сочетаются с 2'-O-метоксиэтил модификациями сахара.

После синтеза, полинуклеотидный триггер по данному изобретению, необязательно, может быть очищен. Например, полинуклеотиды могут быть очищены из смеси путем экстракции растворителем или смолой, осаждением, электрофорезом, хроматографией, или их комбинацией. В альтернативном варианте полинуклеотидные триггеры могут быть использованы без какой-либо, или с минимальной, очисткой во избежание потерь в результате обработки образцов. Полинуклеотидные триггеры могут быть высушены для хранения или растворены в водном растворе. Раствор может содержать буферы или соли, чтобы способствовать отжигу и/ или стабилизировать цепи дуплекса.

Используемые в данном описании термины "гомология" и "идентичность", когда используется в отношении нуклеиновых кислот, описывают степень сходства между двумя или более нуклеотидными последовательностями. Процент "идентичности последовательности" между двумя последовательностями определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, таким образом, что часть последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставок или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывается путем определения числа позиций, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих позиций, делением числа совпадающих позиций на общее число позиций в окне сравнения, и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Последовательность, которая идентичная в каждой позиции при сравнении с эталонной последовательностью, называется идентичная эталонной последовательности, и наоборот. Выравнивание двух или более последовательностей можно выполнить с использованием любой подходящей компьютерной программы. Например, широко используемая и принятая компьютерная программа для выполнения выравниваний последовательностей представляет собой CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994).

Используемый в данном документе термин "контрольный организм" означает организм, который не содержит полинуклеотидный триггер или другую нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает борьбу с вирусной инфекцией или вирусной репликацией. Контрольные организмы, как правило, того же вида и той же стадии развития, выращенные при тех же условиях роста, как и леченный организм. Аналогичным образом "контрольная семья" означает семью организмов, которые не содержат полинуклеотидный триггер или другую нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает борьбу с вирусной инфекцией или вирусной репликацией. Контрольные семьи организмов, как правило, того же вида и той же стадии развития, выращенные при тех же условиях роста, как и леченные семьи организмов.

Используемый в данном документе термин "лечение" включает подавление, по существу ингибирование, замедление или реверсию прогрессирования состояния, по существу улучшение клинических или эстетических симптомов состояния или по существу предотвращение появления клинических или эстетических симптомов состояния. В одном аспекте, согласно данному изобретению, композиция может быть использована для лечения организма или семьи организмов от вирусной инфекции. В одном аспекте композиция дцРНК может быть использована для лечения организма-хозяина или паразита от вирусной инфекции. В одном аспекте организм-хозяин представляет собой пчелу, а паразит представляет собой клеща Varroa destructor. В одном аспекте данное изобретение предлагает способ лечения синдрома разрушения пчелиных семей (СРПС).

Используемые в данном документе термины "улучшение", "улучшенный", "увеличение" и "увеличенный" относятся к по меньшей мере около 2%, по меньшей мере около 3%, по меньшей мере около 4%, по меньшей мере около 5%, по крайней мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90% или более увеличения организма или популяции семьи, увеличенной продуктивности организма или колонии (например, увеличенное производство меда), увеличению скорости роста организма или семьи, или увеличенной репродуктивной скорости по сравнению с контрольным организмом или семьей. Данное изобретение относится к способам улучшения здоровья организма или семьи путем предоставления противовирусной композиции.

Используемый в данном документе термин "вирусная нагрузка", также известный как "вирусная нагрузка", "титр вируса", "вирусный уровень" или "вирусная экспрессия", в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой меру тяжести вирусной инфекции, и может быть подсчитана путем оценки количества вируса в зараженном организме, включенной жидкости организма, или пораженной семье. Она также может быть подсчитана путем оценки количества смысловых цепей последовательности вируса пчелы в зараженном организме, включенной жидкости организма, или пораженной семье.

Используемый в данном документе термин "снижение" уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что уровень снижается по отношению к организму или семье, у которых нет полинуклеотидного триггера, например, молекулы дцРНК, способного снижать агент. Также используемый в данном документе термин "снижение", в отношении вирусной нагрузки, означает, что вирусная нагрузка снижается по отношению к организму или семье, у которых нет нуклеиновой кислоты или другой молекулы дцРНК, способной снижать вирусную нагрузку. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для снижения уровня вирусного белка или экспрессии вирусного гена и снижения вирусной нагрузки. Данное изобретение также относится к способам и композициям для снижения уровня вирусной репликации у клеща Varroa или у пчелы.

Используемый в данном документе термин "по меньшей мере частичное снижение" уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что уровень снижается по меньшей мере на 25% по отношению к организму или семье, у которых нет полинуклеотидного триггера, например, молекулы дцРНК, способного снижать агент. Также, как используется в данном документе, "по меньшей мере частичное снижение" в отношении вирусной нагрузки, означает, что уровень снижается по меньшей мере на 25% по отношению к организму или семье, у которых нет нуклеиновой кислоты или другой молекулы дцРНК, способной снижать вирусную нагрузку. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для по меньшей мере частичного снижения уровня вирусного белка или экспрессии вирусного гена и по меньшей мере частичного снижения уровня вирусной нагрузки.

Используемый в данном документе термин "существенное снижение" уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что уровень снижается по отношению к организму или семье, у которых нет полинуклеотидного триггера, например, молекулы дцРНК, способного снижать агент, причем снижение уровня агента составляет по меньшей мере 75%. Также, как используется в данном документе, "существенное снижение" в отношении вирусной нагрузки, означает, что вирусная нагрузка снижается по меньшей мере на 75% по отношению к организму или семье, у которых нет нуклеиновой кислоты или другой молекулы дцРНК, способной снижать вирусную нагрузку. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для существенного снижения уровня вирусного белка или экспрессии вирусного гена и существенного снижения уровня вирусной нагрузки.

Как используется в данном документе, "эффективная элиминация" агента, такого как белок или мРНК, по отношению к организму или семье, у которых нет полинуклеотидного триггера, например, молекулы дцРНК, способного снижать агент, причем снижение уровня агента больше, чем на 95%. Полинуклеотидный триггер, предпочтительно молекула дцРНК, предпочтительно способный обеспечивать по крайней мере частичное снижение, более предпочтительно - существенное снижение, или наиболее предпочтительно - эффективную элиминацию другого агента, такого как вирусный белок или экспрессия вирусного гена, или вируса, причем агент оставляет уровень экспрессии гена хозяина, по существу незатронутым, значительно незатронутым или частично незатронутым. Также используемый в данном документе термин "эффективная элиминация", в отношении вирусной нагрузки, означает, что вирусная нагрузка уменьшается по меньшей мере на 95% по отношению к организму или семье, у которых нет нуклеиновой кислоты или другой молекулы дцРНК, способной снизить количество вирусного белка, экспрессию вирусного гена или вирусную нагрузку. Данное изобретение относится к и включает способы и композиции для эффективной элиминации вирусного белка или экспрессии вирусного гена и эффективной элиминации вирусной инфекции.

Используемые в данном документе термины "супрессия", "репрессия" и "подавление регуляции", когда относятся к экспрессии или активности молекулы нуклеиновой кислоты в организме, используются равнозначно в данном документе и означают, что уровень экспрессии или активности молекулы нуклеиновой кислоты в клетке организма или семье после применения способа по данному изобретению ниже, чем ее экспрессия или активность в клетке организма или семье перед применением метода, или по сравнению с контрольным организмом или семьей, у которых нет молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для супрессии, репрессии и подавления уровня вирусного белка или экспрессии вирусного гена, и супрессии, репрессии и подавления уровня вирусной инфекции в организме или семье. Данное изобретение также относится к способам и композициям для супрессии, репрессии и подавления уровня вирусной репликации в организме или семье. В некоторых вариантах реализации изобретения организм представляет собой клеща Varroa. В некоторых вариантах реализации изобретения организм представляет собой пчелу. В некоторых вариантах реализации изобретения колония представляет собой пчелиную семью.

Термины "супрессированный", "репрессированный" и "с подавленной регуляцией", используемые в данном документе, представляют собой синонимы и означают в данном документе пониженную, предпочтительно существенно пониженную, экспрессию или активность целевой молекулы нуклеиновой кислоты. Также, как используется в данном документе, "супрессированный", "репрессированный" и "с подавленной регуляцией" по отношению к вирусной инфекции или вирусной нагрузке означает, что уровень инфекции или вирусной нагрузки пониженный, предпочтительно существенно пониженный, по отношению к организму или семье, у которых нет нуклеиновой кислоты или другой дцРНК молекулы, способной снижать экспрессию вирусного гена. Данное изобретение относится к и включает в себя способы и композиции для супрессии, репрессии и подавления регулирования экспрессии или активности вирусного белка или вирусного гена, и супрессии, репрессии и подавления регулирования инфекционности вирусов.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК), одноцепочечную РНК (оцРНК), двухцепочечную РНК (дцРНК), двухцепочечную ДНК (дцДНК) или двухцепочечный ДНК/ РНК гибрид. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер представляет собой дцРНК.

В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности, или которая имеет 100% идентичности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или их фрагментов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидный триггер включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарности последовательности, или которая имеет 100% комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или их фрагментов. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция полинуклеотидного триггера включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет существенную идентичность или существенную комплементарность последовательности, состоящей по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 смежных нуклеотидов из последовательности, выбранной из SEQ ID NO. 1-21.

В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции дцРНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. от 1 до 21, или их фрагментов. В некоторых аспектах композиция дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая имеет 100% идентичности или комплементарности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1-21, или их фрагментов. В другом аспекте данное изобретение относится к ДНК, которая кодирует по меньшей мере один предшественник дцРНК, содержащий нуклеотидную последовательность, которая имеет 100% идентичности или комплементарности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. от 1 до 21, или их фрагментов, или которая имеет по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из SEQ ID NO. от 1 до 21, или их фрагментов. Еще в другом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантной ДНК, которая кодирует по меньшей мере один предшественник дцРНК, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO. от 1 до 21, или их фрагментов, и предоставляются гетерологический промотор и терминатор транскрипции. В другом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантной ДНК, которая кодирует по меньшей мере один предшественник дцРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или комплементарности последовательности к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. от 1 до 21, или их фрагментов, и дополнительно содержит гетерологический промотор и терминатор транскрипции.

В некоторых вариантах реализации в данном изобретении предложена композиция, которая содержит по меньшей мере один полинуклеотидный триггер. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит смесь по меньшей мере из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных полинуклеотидных триггеров. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит смесь из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных полинуклеотидных триггеров. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидные триггеры могут нацеливаться на различные вирусы. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидные триггеры могут нацеливаться на различные гены одного и того же вируса. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидные триггеры могут нацеливаться на различные фрагменты вирусной последовательности или вирусного гена.

Следует иметь в виду, что полинуклеотидные триггеры, например, дцРНК, могут быть доставлены вредителю или паразиту по большому разнообразию путей. Согласно одному аспекту полинуклеотидные триггеры доставляются непосредственно паразиту (например, путем опрыскивания клеща, заражающего улей). Полинуклеотидные триггеры или конструкции, кодирующие их, могут входить в тела клещей путем диффузии. В другом аспекте полинуклеотидные триггеры доставляются опосредованным путем через организм-хозяин (например, путем предоставления пчелиной пищи, содержащей полинуклеотидный триггер, пчеле). В одном аспекте паразит представляет собой Varroa destructor. В одном аспекте организм-хозяин представляет собой пчелу.

Следует иметь в виду, что поскольку многие паразиты используют свои ротовые аппараты для прокалывания экзоскелета членистоногого хозяина и питаются гемолимфой членистоногих, данное изобретение рассматривает доставку полинуклеотидных триггеров, например, дцРНК по данному изобретению, членистоногому хозяину, вследствие чего они становятся присутствующими в гемолимфе членистоногого хозяина, таким образом, становятся доступными для паразита. Таким образом, согласно другому аспекту нуклеотидные агенты доставляются опосредованным путем паразиту (например, клещу через пчелу-хозяина). В некоторых аспектах сельскохозяйственный вредитель или паразит представляет собой Varroa destructor и членистоногий хозяин представляет собой пчелу.

Согласно одному аспекту полинуклеотидные триггеры, например, дцРНК, доставляются инвазированным хозяевам путем распыления. Полинуклеотидные триггеры, например дцРНК, или конструкции, кодирующие их, могут входить в тела хозяев путем диффузии. В некоторых аспектах сельскохозяйственный вредитель или паразит представляет собой Varroa destructor и членистоногий хозяин представляет собой пчелу.

Согласно другому аспекту полинуклеотидные триггеры, например, дцРНК, доставляются хозяину через его пищу. Авторы данного изобретения считают, что после приема внутрь полинуклеотидных триггеров по данному изобретению, полинуклеотидные триггеры могут присутствовать, например, в членистоногом хозяине, в гемолимфе хозяина, вследствие чего он становится доступным для паразита, например, для клеща Varroa.

В одном аспекте полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы in vitro и добавлены к пище. Например, двухцепочечную РНК можно синтезировать путем добавления двух противостоящих промоторов (например, Т7 промоторов) на концах сегментов гена, причем промотор помещают непосредственно на 5'-конце гена и промотор помещают непосредственно на 3'-конце сегмента гена в противоположной ориентации. Затем дцРНК могут быть транскрибированы in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7.

Не ограничивающие примеры последовательностей для синтеза дцРНК, согласно аспектами данного изобретения, предложены в SEQ ID NO. 1-21. Полноразмерные или фрагменты этих последовательностей могут быть использованы в качестве матрицы.

Данная заявка предлагает и раскрывает композиции, включающие полинуклеотидный триггер и вспомогательное вещество. В одном аспекте вспомогательное вещество может быть сочетанием одного или более неактивных компонентов. В некоторых аспектах вспомогательное вещество содержит сахар. Примеры сахаров включают гексозы, дисахариды, трисахариды и высшие сахара. Вспомогательные сахара включают, например, фруктозу, глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, галактозу, рибозу. В других аспектах вспомогательное вещество содержит сахар и растворитель. В других аспектах вспомогательное вещество содержит белок. В одном аспекте белок представляет собой соевый белок. В других аспектах вспомогательное вещество представляет собой пыльцу. В аспектах в соответствии с данным изобретением вспомогательное вещество представляет собой пищу пчелы.

В некоторых вариантах реализации изобретения вспомогательное вещество включает одно или более вещество, выбранное из сахара, растворителя, белка, пчелиной пищи и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения сахар выбран из фруктозы, глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, галактозы, рибозы и любой их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения пища для пчел выбрана из меда, пыльца, Wheast, соевой муки, дрожжей, дрожжевого продукта и любой их комбинации.

Подкармливание пчел является распространенной практикой среди пчеловодов для обеспечения как пищевых, так и других, например, дополнительных потребностей. Пчелы, как правило, питаются медом и пыльцой, но известно также, что они принимают внутрь ненатуральные корма. Пчел могут кормить различными пищевыми продуктами, включая, но не ограничиваясь этими, Wheast (молочные дрожжи, выращенные на твороге), соевую муку, дрожжи (например, пивные дрожжи, дрожжи торула) и дрожжевые продукты, продукты подавали по отдельности или в комбинации, и соевую муку подавали в виде сухой смеси или влажного пирожного внутри улья, или в виде сухой смеси на открытых кормушках за пределами улья. Также полезным является сахар или сахарный сироп. Добавление от 10 до 12 процентов пыльцы к добавке, подаваемой пчелам, улучшает вкусовую привлекательность. Добавление 25 процентов пыльцы улучшает качество и количество необходимых питательных веществ, которые требуются пчелам для жизнедеятельности. Тростниковый или свекловичный сахар, изомеризованный кукурузный сироп и сахарный сироп тип-50 (type-50 sugar syrup)представляют собой удовлетворительные заменители меда в естественном рационе медоносных пчел. Последние два могут подаваться пчелам только в виде жидкости. Жидкий корм может подаваться пчелам внутрь улья с помощью, например, любого из следующих методов: емкость с отверстиями в крышке, соты в гнездовой секции улья, разделительная рамочная кормушка, кормушка системы Бордмана и тому подобное Сухой сахар может скармливаться путем размещения фунта или двух на перевернутой внутренней крышке. Запас воды должен быть доступен для пчел при любых условиях. В одном аспекте предусмотрен поддон или ванночки с плавучими опорами, такими как древесные стружки, корок или пластиковая губка. Подробное описание додавочных кормов для пчел можно найти, например, в публикации USDA у Standifer, et al. 1977, озаглавленной ʺSupplemental Feeding of Honey Bee Coloniesʺ (USDA, Agriculture Information Bulletin No. 413).

В некоторых вариантах реализации изобретения подкармливание пчел включает предоставление композиции, принимаемой пчелой вовнутрь, выбранной из группы, состоящей из жидкой композиции, принимаемой пчелой вовнутрь, и твердой композиции, принимаемой пчелой вовнутрь, пчеле-хозяину.

В аспектах, согласно данному изобретению, полинуклеотидный триггер, например, дцРНК, комбинируется со вспомогательным веществом. В одном аспекте полинуклеотидный триггер, например, дцРНК, может предлагаться как соотношение полинуклеотидного триггера к вспомогательному веществу. В одном аспекте соотношение представляет собой одну часть полинуклеотидного триггера на 4 части вспомогательного вещества. В одном аспекте соотношение полинуклеотидного триггера к вспомогательному веществу представляет собой 1:1, 1:2, 1:5 или 1:10. В других аспектах соотношение полинуклеотидного триггера к вспомогательному веществу представляет собой 1:20, 1:25, 1:30, 1:40 или более. В одном аспекте соотношение полинуклеотидного триггера к вспомогательному веществу представляет собой 1:50. В аспектах, согласно данному изобретению, соотношение может быть определено как соотношение объема к объему (об./об.), как соотношение массы к массе (мас./мас.) или как соотношение массы к объему (мас./об.). В некоторых аспектах соотношение выражают как соотношение объема к объему (об./об.), как соотношение массы к массе (мас./мас.) или как соотношение массы к объему (мас./об.).

В аспектах, согласно данному изобретению, композиция может включать массу полинуклеотидного триггера, например, дцРНК, в сочетании со вспомогательным веществом. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет процент от общей массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет около 0,1% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет около 0,2% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет около 0,3% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет около 0,4% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 0,5% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 0,6% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 0,7% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 0,8% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 1,0% от массы композиции. В одном аспекте полинуклеотидный триггер составляет до 1,5% от массы композиции. Еще в других аспектах полинуклеотидный триггер составляет до 2,0% от массы или 2,5% от массы композиции.

Данное изобретение относится к и включает в себя композиции, которые имеют от 0,1% до 5% по массе полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция включает от 0,1 до 4%, от 0,1 до 3%, от 0,1 до 2%, от 0,1 до 1%, от 0,1 до 2%, от 0,1 до 3%, или от 0,1 до 4% по массе полинуклеотидного триггера. В одном аспекте композиция включает от 0,2% до 5% по массе полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция включает от 0,2 до 4%, от 0,2 до 3%, от 0,2 до 2%, от 0,2 до 1%, от 0,2 до 2%, от 0,2 до 3%, или от 0,2 до 4% по массе полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция включает до 1%, до 2%, до 3%, до 4% или до 5% полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция включает до 7,5%, до 10% или до 15% полинуклеотидного триггера.

Данное изобретение относится к и включает в себя композиции, имеющие от 0,01 до 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит от 0,01 до 0,1 мг/мл, от 0,01 до 1,0 мг/мл, от 0,01 до 2,0 мг/мл, от 0,01 до 2,5 мг/мл, от 0,01 до 5 мг/мл, от 0,01 до 10 мг/мл, от 0,01 до 15 мг/мл или от 0,01 до 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция содержит от 0,1 до 1,0 мг/мл, от 0,1 до 2,0 мг/мл, от 0,1 до 2,5 мг/мл, от 0,1 до 5 мг/мл, от 0,1 до 10 мг/мл, от 0,1 до 15 мг/мл или от 0,1 до 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит по меньшей мере 0,01 мг/мл полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит по меньшей мере 0,1 мг/мл полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит по меньшей мере 1,0 мг/мл полинуклеотидного триггера. Еще в других аспектах композиция содержит по меньшей мере 10 мг/мл полинуклеотидного триггера. Еще в других аспектах композиция содержит по меньшей мере 15 мг/мл полинуклеотидного триггера. Еще в других аспектах композиция содержит по меньшей мере 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В одном аспекте композиция содержит от 0,01 до 0,5 мг/мл полинуклеотидного триггера. В одном аспекте композиция содержит от 0,5 до 10 мг/мл полинуклеотидного триггера. В других аспектах композиция содержит от 0,5 до 1,0 мг/мл, от 0,5 до 2,0 мг/мл, от 0,5 до 2,5 мг/мл, от 0,5 до 5 мг/мл, от 0,5 до 10 мг/мл, от 0,5 до 15 мг/мл или от 0,5 до 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В одном аспекте композиция содержит от 1,0 до 10 мг/мл полинуклеотидного триггера. В других аспектах, в других аспектах композиция содержит от 0,01 до 0,02 мг/мл, от 0,02 до 0,03 мг/мл, от 0,03 до 0,04 мг/мл, от 0,04 до 0,05 мг/мл, от 0,05 до 0,06 мг/мл, от 0,06 до 0,07 мг/мл, от 0,07 до 0,08 мг/мл, от 0,08 до 0,09 мг/мл, от 0,09 до 0,1 мг/мл, от 0,1 до 0,2 мг/мл, от 0,2 до 0,3 мг/мл, от 0,3 до 0,4 мг/мл, от 0,4 до 0,5 мг/мл, от 0,5 до 0,6 мг/мл, от 0,6 до 0,7 мг/мл, от 0,7 до 0,8 мг/мл, от 0,8 до 0,9 мг/мл, от 0,9 до 1,0 мг/мл, от 1,0 до 2,0 мг/мл, от 1,0 до 2,5 мг/мл, от 2,0 до 3,0 мг/мл, от 3,0 до 4,0 мг/мл, от 4,0 до 5,0 мг/мл, от 5,0 до 6,0 мг/мл, от 6,0 до 7,0 мг/мл, от 7,0 до 8,0 мг/мл, от 8,0 до 9,0 мг/мл, от 9,0 до 10,0 мг/мл, от 10,0 до 12,0 мг/мл, от 12,0 до 13,0 мг/мл, от 13,0 до 14,0 мг/мл, от 14,0 до 15,0 мг/мл, от 15,0 до 16,0 мг/мл, от 16,0 до 17,0 мг/мл, от 17,0 до 18,0 мг/мл, от 18,0 до 19,0 мг/мл, от 19,0 до 20,0 мг/мл, от 1,0 до 5 мг/мл, от 1,0 до 10 мг/мл, от 1,0 до 15 мг/мл или от 1,0 до 20 мг/мл полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит около 0,1 мкг/мл, около 0,2 мкг/мл, около 0,5 мкг/мл, около 1,0 мкг/мл, около 2,0 мкг/мл, около 5,0 мкг/мл, около 10 мкг/мл, около 0,02 мг/мл, около 0,05 мг/мл, около 0,1 мг/мл, около 0,125 мг/мл, около 0,2 мг/мл, около 0,25 мг/мл, около 0,3 мг/мл, около 0,4 мг/мл, около 0,5 мг/мл, около 0,6 мг/мл, около 0,7 мг/мл, около 0,8 мг/мл, около 0,9 мг/мл, около 1,0 мг/мл, около 1,5 мг/мл, около 2,0 мг/мл, около 2,5 мг/мл, около 3,0 мг/мл, около 3,5 мг/мл, около 4,0 мг/мл, около 4,5 мг/мл, около 5,0 мг/мл, около 5,5 мг/мл, около 6,0 мг/мл, около 6,5 мг/мл, около 7,0 мг/мл, около 7,5 мг/мл, около 8,0 мг/мл, около 8,5 мг/мл, около 9,0 мг/мл, около 9,5 мг/мл, 10 мг/мл, около 11 мг/мл, около 12 мг/мл, около 13 мг/мл, около 14 мг/мл, около 15 мг/мл, около 16 мг/мл, около 17 мг/мл, около 18 мг/мл, около 19 мг/мл или около 20 мг/мл полинуклеотидного триггера.

В некоторых аспектах композиция содержит от около 1 мг до около 2000 мг полинуклеотидного триггера. В некоторых аспектах композиция содержит от около 1 мг до около 100 мг, от около 1 мг до около 200 мг, от около 1 мг до около 300 мг, от около 1 мг до около 400 мг, от около 1 мг до около 500 мг, от около 1 мг до около 600 мг, от около 1 мг до около 700 мг, от около 1 мг до около 800 мг, от около 1 мг до около 900 мг, около от 1 мг до около 1000 мг, около от 1 мг до около 1200 мг, от около 1 мг до около 1500 мг, около от 1 мг до около 1800 мг, около от 10 мг до около 100 мг, около от 10 мг до около 200 мг, около от 10 мг до около 300 мг, от около 10 мг до около 400 мг, около от 10 мг до около 500 мг, около от 10 мг до около 600 мг, от около 10 мг до около 700 мг, от около 10 мг до около 800 мг, от около 10 мг до около 900 мг, около от 10 мг до около 1000 мг, около от 10 мг до около 1200 мг, около от 10 мг до около 1500 мг, около от 10 мг до около 1800 мг, или от около 10 мг до около 2000 мг полинуклеотидного триггера на пчелиную семью. В других аспектах композиция содержит около 1 мг, около 5 мг, около 10 мг, около 15 мг, около 20 мг, около 25 мг, около 30 мг, около 35 мг, около 40 мг, около 45 мг, около 50 мг, около 60 мг, около 70 мг, около 80 мг, около 90 мг, около 100 мг, около 125 мг, около 150 мг, около 175 мг, около 200 мг, около 250 мг, около 300 мг, около 350 мг, около 400 мг, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 850 мг, около 900 мг, около 950 мг, около 1000 мг, около 1100 мг, около 1200 мг, около 1300 мг, около 1400 мг, около 1500 мг, около 1600 мг, около 1700 мг, около 1800 мг, около 1900 мг или 2000 мг полинуклеотидного триггера на пчелиную семью.

Данное изобретение относится к и включает в себя способы снижения вирусной нагрузки на организм. В некоторых вариантах реализации изобретения организм представляет собой паразита. В одном аспекте вирусная нагрузка относится к числу вирусов у отдельного хозяина. В одном аспекте вирусная нагрузка относится к среднему числу вирусов на 100 организмов-хозяев. В одном аспекте вирусная нагрузка относится к числу вирусов на колонию паразитных хозяев. В другом аспекте вирусная нагрузка определяется путем измерения вирусной экспрессии у хозяина, такого как пчела или клещ Varroa. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.

В одном аспекте способы снижения вирусной инфекции включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, организму хозяина, на котором питается паразит. В другом аспекте способы снижения вирусной инфекции включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, непосредственно паразитическому организму. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. Эффективное количество композиции по данному изобретению приводит в результате к снижению вирусной инфекции у хозяина и/ или паразита в течение промежутка времени. В одном аспекте снижение вирусной инфекции может быть измерено в течение одного дня или в течение двух дней с момента предоставления эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК. В одном аспекте вирусная инфекция может быть измерена через два дня. В одном аспекте вирусная инфекция может быть измерена через 3 дня. В других аспектах вирусная инфекция может быть измерена через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, через неделю, через две недели, через три недели или через месяц. В другом аспекте вирусная инфекция может быть измерена более чем один раз, например, каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной инфекции можно измерить и сравнить с нелеченным контрольным организмом хозяина, паразита, или семьей. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.

В одном аспекте способы снижения вирусной репликации включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, организму хозяина, на котором питается паразит. В другом аспекте способы снижения вирусной репликации включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, непосредственно паразитическому организму. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. Эффективное количество композиции по данному изобретению приводит в результате к снижению экспрессии вирусного гена у хозяина и/ или паразита в течение промежутка времени. В одном аспекте снижение экспрессии вирусного гена может быть измерено в течение одного дня или в течение двух дней с момента предоставления эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК. В одном аспекте вирусная репликация может быть измерена через два дня. В одном аспекте вирусная репликация может быть измерена через 3 дня. В других аспектах вирусная репликация может быть измерена через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней или через неделю, через две недели, через три недели или через месяц. В другом аспекте вирусная репликация может быть измерена более чем один раз, например, каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной репликации можно измерить и сравнить с нелеченным контрольным организмом хозяина, паразита, или семьей. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.

В одном аспекте способы снижения вирусной нагрузки включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, организму хозяина, на котором питается паразит. В другом аспекте способы снижения вирусной нагрузки включают предоставление эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК, непосредственно паразитическому организму. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. Эффективное количество композиции по данному изобретению приводит в результате к снижению вирусной нагрузки у хозяина и/ или паразита в течение промежутка времени. В одном аспекте, снижение вирусной нагрузки измеряется в течение одного дня или в течение двух дней с момента предоставления эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК. В одном аспекте вирусная нагрузка может быть измерена через два дня. В одном аспекте вирусная нагрузка может быть измерена через 3 дня. В других аспектах вирусная нагрузка может быть измерена через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, через неделю, через две недели, через три недели или через месяц. В другом аспекте вирусная нагрузка может быть измерена более чем один раз, например, каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной нагрузки можно измерить и сравнить с нелеченным контрольным организмом хозяина, паразита, или семьей. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.

В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной нагрузки или снижение вирусной инфекции через промежуток времени означает снижение титра вируса. В одном аспекте титр вируса снижается на около 10%, 20%, 30% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 40% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 50% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 60% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 70% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 80% или более между измерениями. В другом аспекте титр вируса снижается на около 90% или более между измерениями. В некоторых вариантах реализации изобретения титр вируса в организме хозяина или паразита, которых обеспечивали эффективным количеством полинуклеотидного триггера, снижается по меньшей мере на около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с титром вируса в организме хозяина или паразита, которых не обеспечивали полинуклеотидным триггером. В некоторых вариантах реализации изобретения титр вируса измеряется в пределах 1 дня, в пределах 2 дней, через 2 дня, через 3 дня, через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, или через неделю, через 2 недели, через 3 недели, или через месяц после предоставления полинуклеотидного триггера. В некоторых вариантах реализации изобретения титр вируса измеряется более чем один раз. В некоторых вариантах реализации изобретения титр вируса измеряется каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В одном аспекте организм-хозяин представляет собой пчелу. В одном аспекте паразит представляет собой Varroa destructor.

В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной нагрузки или снижение вирусной инфекции через промежуток времени означает снижение вирусной экспрессии. В одном аспекте вирусная экспрессия снижается на около 10%, 20%, 30% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 40% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 50% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 60% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 70% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 80% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная экспрессия снижается на около 90% или более между измерениями. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная экспрессия в организме хозяина или паразита, которых обеспечивали эффективным количеством полинуклеотидного триггера, снижается по меньшей мере на около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с вирусной экспрессией в организме хозяина или паразита, которых не обеспечивали полинуклеотидным триггером. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная экспрессия измеряется в пределах 1 дня, в пределах 2 дней, через 2 дня, через 3 дня, через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, или через неделю, через 2 недели, через 3 недели, или через месяц после предоставления полинуклеотидного триггера. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная экспрессия измеряется более чем один раз. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная экспрессия измеряется каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В одном аспекте организм-хозяин представляет собой пчелу. В одном аспекте паразит представляет собой Varroa destructor.

В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной нагрузки или снижение вирусной инфекции через промежуток времени означает снижение вирусной репликации. В одном аспекте вирусная репликация снижается на около 10%, 20%, 30% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 40% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 50% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 60% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 70% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 80% или более между измерениями. В другом аспекте вирусная репликация снижается на около 90% или более между измерениями. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация в организме хозяина или паразита, которых обеспечивали эффективным количеством полинуклеотидного триггера, снижается по меньшей мере на около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с вирусной репликацией в организме хозяина или паразита, которых не обеспечивали полинуклеотидным триггером. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация измеряется в пределах 1 дня, в пределах 2 дней, через 2 дня, через 3 дня, через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, или через неделю, через 2 недели, через 3 недели, или через месяц после предоставления полинуклеотидного триггера. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация измеряется более чем один раз. В некоторых вариантах реализации изобретения вирусная репликация измеряется каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В одном аспекте организм-хозяин представляет собой пчелу. В одном аспекте паразит представляет собой Varroa destructor.

В аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной нагрузки через промежуток времени приводит в результате к снижению смертности у пчел. В одном аспекте смертность пчел снижается на около 10%, 20%, 30% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 40% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 50% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 60% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 70% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 80% или более между измерениями. В другом аспекте смертность пчел снижается на около 90% или более между измерениями. В некоторых вариантах реализации изобретения смертность пчел в пчелиной семье, которую обеспечивали эффективным количеством полинуклеотидного триггера, снижается по меньшей мере на около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению со смертностью пчел в пчелиной семье, которую не обеспечивали полинуклеотидным триггером. В некоторых вариантах реализации изобретения смертность пчел измеряется в пределах 1 дня, в пределах 2 дней, через 2 дня, через 3 дня, через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, или через неделю, через 2 недели, через 3 недели, или через месяц после предоставления полинуклеотидного триггера. В некоторых вариантах реализации изобретения смертность пчел измеряется более чем один раз. В некоторых вариантах реализации изобретения смертность пчел измеряется каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц.

В аспектах, согласно данному изобретению, эффективное количество полинуклеотидного триггера, например дцРНК, может предоставляться периодически или непрерывно. В одном аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться один, два или три раза в день. В другом аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться один раз в день. В другом аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться один или более раз через день. В одном аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться через каждые два дня, каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, каждые шесть дней или один раз в неделю. В одном аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может непрерывно предоставляться нуждающемуся организму, например, через непрерывное предоставление источника пищи. В одном аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться непрерывно в виде композиции, принимаемой пчелой вовнутрь. В одном аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться организму- хозяину. В другом аспекте эффективное количество композиции триггера, например, дцРНК, может предоставляться непосредственно паразитическому организму. В аспектах, согласно данному изобретению, паразит представляет собой Varroa destructor, а хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.

Данное изобретение относится к способам снижения вирусной нагрузки в семье медоносной пчелы, включающим предоставление пчелиной семье эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК. Эффективное количество композиции полинуклеотидного триггера по данному изобретению приводит в результате к снижению экспрессии вирусных генов и вирусной репликации в течение промежутка времени. В одном аспекте снижение вирусной репликации или вирусной экспрессии измеряется в течение одного дня или в течение двух дней с момента предоставления эффективного количества композиции триггера, например, дцРНК. В одном аспекте снижение вирусной репликации или вирусной экспрессии может быть измерено через два дня. В одном аспекте снижение вирусной репликации или вирусной экспрессии может быть измерено через 3 дня. В других аспектах снижение вирусной репликации или вирусной экспрессии может быть измерено через 4 дня, через 5 дней, через 6 дней, через 7 дней, через неделю, через две недели, через три недели или через месяц. В другом аспекте снижение вирусной репликации или вирусной экспрессии может быть измерено более чем один раз, например, каждый день, через каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждые 7 дней, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц, два раза в месяц или три раза в месяц. В некоторых аспектах, согласно данному изобретению, снижение вирусной репликации или вирусной экспресии можно измерить и сравнить с нелеченным контрольным организмом хозяина, паразита, или семьей.

В одном аспекте данное изобретение относится к способам и композициям для снижения восприимчивости пчел к вирусной инфекции. В других аспектах данное изобретение относится к способам и композициям для предотвращения вирусной инфекции в семьях пчел. В другом аспекте данное изобретение относится к способам снижения вирусной инфекции у медоносных пчел, которая передается клещом Varroa destructor.

Следующие примеры представлены с иллюстративными целями и не должны рассматриваться как ограничения.

ПРИМЕР 1

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на Varroa, клещей помещали на чашки Петри с рационом, дополненным смесью дцРНК триггеров. Неспецифическая дцРНК, не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами Varroa, была использована в качестве неспецифического контроля (SCRAM; SEQ ID NO. 24). Клещей Varroa собирали, выделяли из них РНК и анализировали экспрессию DWV или IAPV с использованием количественной ПЦР с обратной транскрипцией (количественной ПЦР).

Экспериментальная процедура:

Сначала был подготовлен искусственный рацион как указано в таблице 1.

Таблица 1

Компоненты искусственного рациона

Реагент контроль неспецифический контроль смесь дцРНК Стандартная среда LB 1X 1X 1X 1X Антибиотик Фунгицидный раствор (100х), Стабилизатор (SIGMA A5955) Разведение 1:100 до 1X нистатин [5 мг/мл] Разведение 1:100 канамицин [50 мг/мл] Разведение 1:20 1XPB до 1 мл Рандомизированная контрольная дцРНК (SCRAM) [9 мг/мл] 200 мкг/мл смесь дцРНК 200 мкг/мл

В одном эксперименте смесь дцРНК триггеров содержала составные части из SEQ ID NO. 1-10 из нижеследующих дцРНК последовательностей.

Таблица 2

дцРНК триггерные последовательности, использованные в анализах непосредственного кормления Varroa

SEQ ID NO. Источник последовательности Кодирующая последовательность Белок 1 геном IAPV GAUACAUUGAAAGAUGAGCGUCGACCCAUUGAAAAAGUUAAUCAAUUGAAAACACGAGUAUUCUCAAAUGGACCAAUGGAUUUCUCUAUAGCUUUUCGAAUGUAUUAUUUGGGCUUUAUAGCUCAUUUGAUGGAAAAUCGAAUUACUAAUGAGGUGUCCAUUGGAACGAAUGUGUAUUCUCAAGACUGGAGUAAAACUGUUCGUAAGUUGACUAAAUUUGGAAAUAAAGUUAUUGCAGGUGAUUUUUCAACUUUUGAUGGAUCACUGAAUGUAUGUAUUAUGGAAAAAUUUGC РзРп (не инвертированный повтор) 2 геном IAPV GAAACUCCAAAUAGGAUCGAUACCCCCAUGGCUCAGGAUACUUCAUCGGCUAGGAACAUGGAUGAUAC VP2 3 геном IAPV GACGGACCUUCACAUAUAACAUACCCCGUAAUCAAUCCUGUGCAUGAAGUAGAAGUUCCAUUCUAUUCUCAGUAUAGGAAAAUACCUAUCGCUUCAACAUCGGAUAAAGGUUAUGAUUCCUCUCUAAUGUAUUUUUCAAAUACAGCAACAACUCAAAUUGUUGCCAGAGCAGGAAACGAUGACUUUACCUUUGGUUGGAUGAUAGGUC VP1 (CP) 4 геном IAPV GCCCCCUAGAUGUGCACUGGGAGACAGACAAAUCUCCCUAUGUAUGGCUAUAGUCUAAAUUUUUCACAAAAUUUCAGUUUAGACCGAAAACCGACAC VP1 (CP) 5 геном DWV GAAGAAAUAUAUAGCUACGUGGUGUAGUAAGCGUCGUGAACAUACUGCUGACUUUGAUCUU Хеликаза для VPg 6 геном DWV GCUCCCAAUGCUGAAGCGGAGGAGGCAAGUGCUUGGGUAUCCAUUAUUUAUAAUGGUGUGUGUAAUAUGCUUAAUGUGGCUGCUCAAAAACCGAAACAAUUUAAAGAUUGGGUAAAAUUAGCUACUGUAGAUUUUAGUAAUAAUUGUAGAGGUAGUAAUCAGGUAUUUGUAUUUUUCAAGAAUACAUUUGAAGUGUUGAAGAAAAUGUGGGGUUAUGUAUUUUGUCAGAGUAAUCCUGCAGCGCGUUUGUUGAAAGCUGUGAAUGACGAGCCUGAGAUUUUGAAAGC Хеликаза 7 геном DWV GAAAGCUGUGAAUGACGAGCCUGAGAUUUUGAAAGCAUGGGUGAAGGAAUGUC Хеликаза 8 геном DWV GGTACAGTTTACCATACCGTTTCGACAGTATTACTTAGACTTTATGGCATCCTATCGAGCTGCACGACTTAATGCTGAGCATGGTATTGGTATTGATGTTAACAGCTTAGAGTGGACAAATTTGGCAAC РзРп 9 геном DWV GAAUGGAUAACUCCUGUGUAUAUGGCUAACCGUCGUAAGGCGAAUGAAUCGUUUAAGAUGCGUGUAGAUGAAAUGCAAAUGUUACGUAUGGAUGAACCAUUGGAAGGUGAUAAUAUUCUCAAUAAGUAUGUUGAAGUUAAUCAGCGCUUAGUGGAGGAAAUGAAGGCAUUUAAGGAGCGUACACUAUGGUCAGAUUUACAUCGC Хеликаза 10 геном IAPV GAAACACAAAAUCACAACGCUUUAAUGAAAGGAUGUGGUGAGUUUAUUGUAAACUUGCGAACUCUUCUCAGAACCUUUAGAACAAUAACAGAUAAUUGGAUAUUACAAGC VP1 (не CP)

После охлаждения чашек Петри, 15 клещей Varroa помещены на каждую чашку Петри. Затем чашки Петри герметизировали абсорбционной бумагой, парафильмом, и инкубировали 72 ч в термостате при 29°C. После 72 ч на агаризированой среде LB, содержащий лекарственное вещество, подсчитывали соотношение мертвых к живым клещей. Как показано на фигуре 2а, не наблюдалось, чтобы смесь триггеров против вирусов пчел оказывала влияние на смертность клеща Varroa.

Были собраны как живые, так и мертвые Varroa для выделения РНК, и уровни вирусов пчел и репликация были проанализированы с помощью количественной ПЦР или QuantiGene^® Plex 2.0 (платформа для анализа РНК от Affymetrix). На фигуре 2б показано снижение уровней DWV у Varroa через 72 ч после лечения триггерной смесью против вирусов пчел по сравнению уровнями в контроле, как было проанализировано с помощью количественной ПЦР.

ПРИМЕР 2

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на вирусную нагрузку (IAPV или DWV) у медоносных пчел и у клещей Varroa в условиях мини-ульев, пчел помещают на диету с добавлением одного или более триггеров дцРНК (например, SEQ ID NO. 1-10 и 21), нацеленные на вирусные гены пчел. Неспецифическая дцРНК, не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами Varroa, была использована в качестве неспецифического контроля (SCRAM, например, SEQ ID NO. 22, 23 или 24). Пустой контроль не содержит дцРНК.

Определили пчелиные ульи с высокой вирусной нагрузкой и Varroa нагрузкой. Затем собирают мини-ульи из 400-600 пчел (2 чашки) из ульев, в которых определили большое количество клеща Varroa и высокую вирусную нагрузку, вощинных рамок, и матки в маточнике с несколькими сопровождающими пчелами. Маточник запечали конфетой. При заполнении ульев, отобрали образцы пчел и Varroa для нулевого момента времени (1 чашка пчел из каждого улья). Образцы замораживают (-70 °С), клещей Varroa собирают из замороженных чашек и образцы пчел и клещей Varroa готовят к количественной ПЦР или QuantiGene^® анализу. Вирусные нагрузки у медоносных пчел и клещей Varroa определяли в начальный момент времени.

В мини-ульи подают 66% сахарный раствор и белковые пирожные и помещают в сеточный дом под темным покрытием на 24 часа для улучшения проживания матки. Исходя из расположения матки черное покрытие убирают и пчел кормят сахарным раствором содержащим смесь дцРНК, воздействующие на вирусы пчел (концентрация от 1 мкг/ пчелу до 10 мкг/ пчелу).

Собирают образцы пчел: 10 пчел из каждого улья через каждые 4-5 дней. Собранных пчел анализируют с помощью QG (QuantiGene^® Plex 2.0 платформа для анализа РНК от Affymetrix) для определения вирусной нагрузки. Вирусная нагрузка уменьшается у пчел, которых кормят дцРНК, воздействующими на вирусы пчел, по сравнению с пчелами, получающими питание, дополненное неспецифическими дцРНК.

Varroa собирают с каждого улья через каждые 4-5 дней путем встряхивания с сахаром: одна чашка пчел из каждого мини-улья и две ложки сахарной пудры помещают в контейнер с пробитым герметиком. Чашку встряхивают и переврачивают вверх дном - клещи Varroa выпадают через отверстия в уплотнителе, а пчелы остаются в чашке. Пчел возвращают в мини-улей и анализируют Varroa Varroa с помощью QG (QuantiGene^® Plex 2.0 платформа для анализа РНК от Affymetrix) для определения вирусной нагрузки. Вирусная нагрузка уменьшается у Varroa, собранных с пчел которых кормят дцРНК, воздействующими на вирусы пчел, по сравнению с Varroa, собранными с пчел, получавших питание, дополненное неспецифическими дцРНК.

Quantigene^®, количественный анализ выявления нуклеиновой кислоты, не основывающийся на амплификации, проводят на общем лизате из замороженных медоносных пчел или клещей Varroa для измерения вирусной экспрессии и репликации вируса. Олигонуклеотидные зонды, используемые для анализа QuantiGene^® Plex 2.0, разработаны и поставляются Affymetrix с использованием смысловой цепи последовательностей вирусов пчел в качестве матрицы или отрицательной цепи для репликации вируса. Зонды конститутивных генов получены из последовательностей актина Apis mellifera, рибосомного белка субъединиц 5 (RPS5) и рибосомного белка 49 (RP49). Анализ QuantiGene^® проводят согласно инструкциями изготовителя (Affymetrix, Inc., Руководство по эксплуатации, 2010) с добавлением этапа тепловой денатурации перед гибридизацией образца олигонуклеотидными зондами. Образцы объемом 20 мкл смешивают с 5 мкл прилагаемого зонда, помещенного в лунку микропланшки для ПЦР с последующим нагреванием в течение 5 минут при 95°С с использованием амплификатора. Термообработанные образцы поддерживают при 46°С до использования. По 25 мкл образцов наносили на гибридизационную пластину Affymetrix для гибридизации в течение ночи. Перед извлечением плашки из амплификатора в каждую лунку с образцом добавляют 75 мкл гибридизационного буфера, содержащего остальные компоненты. Затем плашку для ПЦР извлекают из амплификатора и содержимое каждой лунки (~ 100 мкл) переносят в соответствующую лунку гибридизационной плашки (Affymetrix) для гибридизации в течение ночи. После амплификации сигнала для каждого обазца записывают среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) с помощью устройства Luminex 200 (Luminex Corporation).

ПРИМЕР 3

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на DWV или IAPV у медоносных пчел и у клещей Varroa, медоносным пчелам определяли рацион, дополненный смесью дцРНК триггеров, выбранных из SEQ ID NO. 5-9, нацеленные на DWV, и SEQ ID NO. 1-4 и 10, нацеленные на IAPV. Неспецифическая дцРНК, не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами Varroa, была использована в качестве неспецифического контроля (SCRAM; SEQ ID NO. 22 или 23).

Определили пчелиные ульи с высокой вирусной нагрузкой и Varroa нагрузкой. На фигуре 3 показан пример количественной оценки Varroa нагрузки и уровень DWV. Затем были собраны мини-ульи из 400-600 пчел (2 чашки) из ульев, в которых определили большое количество клеща Varroa и высокую вирусную нагрузку, вощинных рамок, и матки в маточнике с несколькими сопровождающими пчелами. Маточник запечатывали конфетой.

В мини-ульи подавали 66% сахарный раствор и белковые пирожные и помещали в сеточный дом под темным покрытием на 24 часа для улучшения проживания матки. Через 2 дня после акклиматизации, пчел кормили: только сахарным раствором (CON), сахарным раствором, содержащим неспецифическую контрольную дцРНК (SCR), или сахарным раствором, содержащим смесь дцРНК, нацеленных на множественные вирусы пчел (SEQ ID NO. 1-10; MIX) при концентрации от 1 мкг/ пчелу до 10 мкг/ пчелу.

Собирали по 10 пчел из каждого улья через каждые 4-5 дней после инфицирования ульев. Собранных пчел анализировали с помощью QuantiGene^®, как описано в примере 2, для определения вирусной репликации как средней интенсивности флуоресценции (СИФ).

На фигуре 4 показано, что репликация DWV была снижена у всех пчел, которые питались смесью дцРНК, нацеленных на вирус, (MIX) по сравнению с пчелами, которые питались только сахарным раствором (CON) или ранионом, дополненным неспецифической дцРНК (SCR). Размножение DWV вируса измеряли с использованием анализа QuantiGene^® через 4, 8 и 14 дней после лечения пчел. Результаты показывают, что с 8-го дня репликация DWV увеличилась в двух контролях (CON и SCR), но не увеличилась у пчел, которых лечили смесью дцРНК, нацеленных на вирус, (MIX), указывая на то, что смесь дцРНК, нацеленных на вирус, была эффективной для супрессии вирусной репликации.

ПРИМЕР 4

Это другой пример эксперимента непосредственного кормления Varroa, описанного в примере 1. Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на Varroa, клещей помещали на чашки Петри с рационом, дополненным смесью дцРНК триггеров. Неспецифическая дцРНК, не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами Varroa, была использована в качестве неспецифического контроля (SEQ ID NO. 22 или 23). Пустой контроль не содержал дцРНК. Клещей Varroa собирали, выделяли из них РНК и анализировали экспрессию DWV или IAPV с использованием анализа QuantiGene^® Plex 2.0 (платформа для анализа РНК от Affymetrix).

Экспериментальная процедура:

Сначала был подготовлен искусственный рацион как указано в таблице 3.

Таблица 3

Компоненты искусственного рациона

Реагент контроль неспецифический контроль смесь дцРНК Стандартная среда LB 1X 1X 1X 1X Антибиотик Фунгицидный раствор (100х), Стабилизатор (SIGMA A5955) Разведение 1:100 до 1X нистатин [5 мг/мл] Разведение 1:100 канамицин [50 мг/мл] Разведение 1:20 1XPB до 1 мл Неспецифическая дцРНК
[10 мг/мл] 1000 мкг/мл смесь дцРНК 1000 мкг/мл

Смесь дцРНК триггеров содержала составные части из SEQ ID NO. 2-6 и 8-10 (125 мкг/мл каждого).

После охлаждения чашек Петри, 15 клещей Varroa помещены на каждую чашку Петри. Затем чашки Петри герметизировали абсорбционной бумагой, парафильмом, и инкубировали 72 ч в термостате при 29°C. Живых Varroa собирали для выделения РНК, и анализировали уровни вирусов пчел и репликацию с помощью QuantiGene^® Plex 2.0 (платформа для анализа РНК от Affymetrix).

На фигуре 5а показано снижение уровней DWV у Varroa через 72 ч после лечения триггерной смесью против вирусов пчел по сравнению уровнями как в пустом контроле, так и с неспецифической дцРНК. Аналогичным образом на фигуре 5б показано снижение уровней IAPV у Varroa через 72 ч после лечения триггерной смесью против вирусов пчел по сравнению уровнями как в пустом контроле, так и с неспецифической дцРНК.

ПРИМЕР 5

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на вирусную нагрузку и репликацию DWV у медоносных пчел в условиях пчелиного ящика (лабораторные условия), медоносных пчел доставляли из коммерческих ульев в поле и помещали в пчелиные ящики, кормили 66% сахарным сиропом, дополненным либо единичными дцРНК триггерами, выбранными из SEQ ID NO. 5, 6, 8 и 9, нацеленными на DMV (T1= SEQ ID NO. 5, T2= SEQ ID NO. 6, T3= SEQ ID NO. 8 и T4= SEQ ID NO. 9), либо смесью этих дцРНК триггеров. Неспецифическая дцРНК (SEQ ID NO. 22 или 23), не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами медоносной пчелы, была использована в качестве неспецифического контроля. Пустой контроль не содержал дцРНК.

Определили пчелиные ульи с высокой вирусной нагрузкой. Затем были собраны пчелиные ящики с 5 пчелами с идентифицированной высокой вирусной нагрузкой. При заполнении ящиков, отобрали образцы пчел для нулевого момента времени. Образцы замораживали (-70°С). Вирусные нагрузки у медоносных пчел определяли в начальный момент времени.

В пчелиные ящики подавали 66% сахарный раствор. Через 2 дня после акклиматизации, пчел кормили сахарным раствором, содержащим единичную или смесь дцРНК, нацеленных на DMV (в концентрации 1 мкг/ пчелу до 10 мкг/ пчелу), содержащим неспецифическую дцРНК для контроля, или не содержащим дцРНК. Еще через 3 дня, пчел снова кормили теми же сахарными растворами.

24 пчелы из каждой группы лечения были собраны через 4 и 10 дней после второго курса лечения. Собранных пчел анализировали с помощью QuantiGene^® Plex 2.0 для определения вирусной нагрузки и вирусной репликации.

На фигуре 6а показано, что и смесь дцРНК триггеров и единичные триггеры были эффективными для супрессии DWV нагрузки у пчел по сравнению с двумя контролями, а также, что T1 и T4 оказывают большее воздействие. На фигуре 6б показано аналогичное воздействие на репликацию DWV у пчел, а также, что T1 и T4 оказывают большее воздействие.

ПРИМЕР 6

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на вирусную нагрузку и репликацию IAPV у медоносных пчел в условиях пчелиного ящика (лабораторные условия), медоносных пчел доставляли из коммерческих ульев в поле и помещали в пчелиные ящики, кормили 66% сахарным сиропом, дополненным либо единичными дцРНК триггерами, выбранными из SEQ ID NO. 2-4 и 10, нацеленными на IAPV (T5= SEQ ID NO. 2, T6= SEQ ID NO. 3, T7= SEQ ID NO. 4 и T8= SEQ ID NO. 10), либо смесью этих дцРНК триггеров. Неспецифическая дцРНК (SEQ ID NO. 22 или 23), не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами медоносной пчелы, была использована в качестве неспецифического контроля. Пустой контроль не содержал дцРНК.

Определили пчелиные ульи с высокой вирусной нагрузкой. Затем были собраны пчелиные ящики с 5 пчелами с идентифицированной высокой вирусной нагрузкой. При заполнении ящиков, отобрали образцы пчел для нулевого момента времени. Образцы замораживали (-70°С). Вирусные нагрузки у медоносных пчел определяли в начальный момент времени.

В пчелиные ящики подавали 66% сахарный раствор. Через 2 дня после акклиматизации, пчел кормили сахарным раствором, содержащим единичную или смесь дцРНК, нацеленных на DMV (в концентрации 1 мкг/ пчелу до 10 мкг/ пчелу), содержащим неспецифическую дцРНК для контроля, или не содержащим дцРНК. Еще через 3 дня, пчел снова кормили теми же сахарными растворами.

24 пчелы из каждой группы лечения были собраны через 4 и 10 дней после второго курса лечения. Собранных пчел анализировали с помощью QuantiGene^® Plex 2.0 для определения вирусной нагрузки и вирусной репликации.

На фигуре 7а показано, что T5 и T6 были эффективными для супрессии IAPV нагрузки по сравнению с контролями. На фигуре 7б показано, что за исключением смеси и Т8, вирусная репликация супрессировалась у всех пчел, которых кормили дцРНК, нацеленными на IAPV последовательности, по сравнению с пчелами, которых кормили рационом, дополненным неспецифической дцРНК.

ПРИМЕР 7

Для проверки воздействия дцРНК, нацеленной на вирусы пчел, на вирусную нагрузку и репликацию LSV у медоносных пчел в условиях пчелиного ящика (лабораторные условия), медоносных пчел доставляли из коммерческих ульев в поле и помещали в пчелиные ящики, кормили 66% сахарным сиропом, дополненным смесью из пяти дцРНК триггеров, выбранных из SEQ ID NO. 11-20. Были протестированы две смеси дцРНК триггеров. Смесь А состояла из SEQ ID NO. 11, 13, 14, 17 и 18, а смесь Б состояла из SEQ ID NO. 12, 15, 16, 19 и 20, которые имеют следующие последовательности дцРНК:

Таблица 4

дцРНК триггерные последовательности, нацеленные на LSV

SEQ ID NO. Источник последовательности Кодирующая последовательность Белок 11 геном LSV1 GCUUACAAUAACUUCGUUCACAGACACCGCGUUGCUGCCUAUGCUGCUGGCGUGCGUAUCCACCGUUACCGCACGCCGUGGUAUUGCGCCGCGUCACGGUCUGUUCCGGUCGUCCAUCCUCUUAACUGGUUGAUGACCCAGUACGAUCUUACUACUGGCCAUGUUCGUGAAUUACUGGAUCGACUGGAGGUUGUCAAUGUUACCCUUCGUGAUGGCCUCCGCACUGUUGCUGACACUGCGUUUACAGCUUAUAUGUACUAUCAGAUAAUGUGGUGUC РзРп+капсид 12 геном LSV2 GAGCAGUAUCUCCUCAAUUUAAAAUAUGUCCCCUCUACUUACCGCUAUCUCAAGCGCGAUCUCGACAUUGACGGUGUCCAUACCGCGUUGUUGGGUGAGUUUAGGUCUGUUCUUUACGCGUAAUUAAUAGAAAUUAUCACGAUGAAUCCACCAACUACGACUACGACUACGACGCGCACCAUCCGCGCCCCAAAAGUUCAACUGACGCCCAAUUCUGCUACUCGGCGUCGGCGUAAUCGUCGGCGCCGUCGAC РзРп+капсид 13 геном LSV1 GCCUGACUAUUAUGAGAUUGAUUACUCCCGAUUCGACUUGUCUAUUAGUGCUGAAGUUAUUUCACAGUACGAGCAUGCCUGGGUCUCUCUUGUUUAUCCUCCUCUCAAUUACCCUGGCUUCUGGCAGACUCUCGUUUCGACACUCAUUACCUCGGGCUUUAGUGAGUACGGUAUUACUUACUCUUUGCCUGGGUCACGUUGUAGCGGUGACCCACAUACGUCCGUUGGUAAUGGUUUGCUGAACGGGUUCUUAAC РзРп 14 геном LSV1 GCCUCGUGCGGACCUCAUUUCUUCAUGUCAGUGUGUGAGCAUGAUGAGUCAAUACCUACGGUGUUCCAUGCACACUCGGUGGGAGGUCAAGAUAUCACCCACGACAUUGAUUCAGGUUUGGGAGCAAUUAUAUCAAAACGCUUUAGUGCUUCGCAGCUACGCCUCCUUAGCUGGUCUAUCGACGGAAUACUCAACACUUUAUCUCGCGCCGCCACCUCAUCGUUUGUCGAAUCGUCGCUGUUGUCCUUGUUACGAUUUAUGC РзРп 15 геном LSV2 GAUUAUACCGGACUUGGGCUUCAUGCUCAAGAUCGAUCACUAUGAGCAUGUCGACGAUUGUUCGUUUUGCGGUAUGUACUUGCUGGAUGAUCGUGGAUCGCUCCGCAUGUACUCUGACCCGGUGCGCACACUGUCUAUGAUACAUGUGUGCUGCGCCGAUGGUCUACCCAACAAUUUGAUCGUGGCCAAGGCUCUGAGCCUUCUCAAUCUGAAUCCAUGUACCCCCAUCGUCACAGCCUUUUGUCGUCACAUAUUGC РзРп 16 геном LSV2 GAGCAUAAUGCCGCUGGUUUACCCUUCUUAAUUAAGGGAUGUGACAUGGCGGCUCGUGCCGCCAAGAUGCGUGACCUCCUGGGUUGGCCUCACUAUUACGAGAUCGACUACUCUCGUUUUGAUUUGUCGAUAAGUGCUGAGGUCAUAUCUCAGUUUGAGCAUGCUUGGAUCUCGUUGGUCUACGCCCCCGACAUGCACCCGCUGUUCUGGCAGACGCUGGUCGCCACGUUGGUCACUUCAGGGUUUAGUGAGUAUGGC РзРп 17 геном LSV1 GAGCAGUAUCUGCUCUCAUUAUUGUUUGUUCCGUCGCGUUAUGCCUUACUUAAACGAGACAUUGAGCUCGACGGCCUACAGACCACCCUUCUUGGCGACUUCAGGUCUGUUCUUUACGCGUGAACAUUAUAAAUUUACUAUCAUGAAUCAACAACAAAUGAACCCCGCGCAGCGAUCGUUGCGCCCCCGCGCUCAAUCUACUCCCUCUCGGUCCGCUCGACGACGACGCAAUCGUAGGCGCCGUAACC РзРп 18 геном LSV1 GCCUGGCUUCGGCAGUAUUUGAACCCUAUGGGCCCUUCUACAUCCAGUGUGAGUGGCUUUCCUGAUGGGUCUGCUGUUACCACAUGCAUUGCCGAUUACACCAACACAUUCAAUAUCUCUUUCCCUCCUCGUGAGGCGAUUUAUUGUACCGGUUCUAAUUCUGAUGAGAAACCUGUUAUGCUGGACGCCGCCACCUAUGCUAAGAUCGACGCGUGGACUAAGUCGGAUAUCACCUUGUGCAUACUCGCCUUGCCC РзРп 19 геном LSV2 GUCCUAUGUUUACUUGCCGAACGUUGACAAGCACCUUUCUGCUGCCCGGGGAUACCGCUUACUGUCCCGCGGCAUCACUGGUAUCUUUAGUGCUCCUGCUCUUGAGACUCAGGGAUUCGUCACAGCUUGCCAGUAUUUGGCUGAGGGGUCUAUACAAUCUCAGUCCAUUAAGUCUGACGCUGUUCGAUCCGUCACUGUUAACAGUGAUGGUACUGUUAAGAACGUUGAGUCUAGCUCACAAACAGUUUCGUCUAUGC Капсид 20 геном LSV2 GAGGGCAUCUCACCUAAAUUUUCUCUCAAACUUAAGACUCGAACUGUAUUGCAAUAUAUUCCCACCUCCGGCUCUGUCUUGGCUAACUUCACCAGACACGAGCCUACUUACGAUCAGAUAGCGCUCGAUGCUGCUGAUCGUCUGCGUAACCUGAUGCCUCACGCUUACCCUGCCGCAUACAACGAUUGGGGAUGGCUUGGUGAUCUGCUCGAUUCUGCCAUCUCCAUGUUGCCGGGUGUAGGUACUGUGUAUAAC Капсид

Неспецифическая дцРНК (SEQ ID NO. 22 или 23), не имеющая идентичности последовательности свыше 19 пар оснований с генами медоносной пчелы, была использована в качестве контроля. Пустой контроль не содержал дцРНК.

Определили пчелиные ульи с высокой вирусной нагрузкой. Затем были собраны пчелиные ящики с 5 пчелами с идентифицированной высокой вирусной нагрузкой. При заполнении ящиков, отобрали образцы пчел для нулевого момента времени. Образцы замораживали (-70°С). Вирусные нагрузки у медоносных пчел определяли в начальный момент времени.

В пчелиные ящики подавали 66% сахарный раствор. Через 2 дня после акклиматизации, пчел кормили сахарным раствором, содержащим единичную или смесь дцРНК, нацеленных на DMV (в концентрации 1 мкг/ пчелу до 10 мкг/ пчелу), содержащим неспецифическую дцРНК для контроля, или не содержащим дцРНК. Еще через 3 дня, пчел снова кормили теми же сахарными растворами.

24 пчелы из каждой группы лечения были собраны через 4 и 10 дней после второго курса лечения. Собранных пчел анализировали с помощью QuantiGene^® Plex 2.0 для определения вирусной нагрузки.

На фигуре 8 показано, что как смесь А, так и смесь Б были эффективными для супрессии LSV нагрузки по сравнению с контролями, но смесь Б показывает больший эффект. LSV нагрузка была снижена в пчелиных ульях, в которых кормили рационом, дополненным дцРНК, нацеленной на LSV последовательности, по сравнению с ульями, в которых кормили рационом, дополненным неспецифической дцРНК.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ снижения вирусной нагрузки у клеща Varroa destructor, способ супрессии вирусной репликации у клеща Varroa destructor и способ снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел. Указанные способы включают в себя предоставление клещу Varroa destructor композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одной двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную или комплементарную последовательности из по меньшей мере 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел. В одном из вариантов реализации указанная композиция содержит смесь дцРНК, состоящую из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных дцРНК. Изобретение расширяет арсенал средств для снижения вирусной нагрузки у клеща Varroa destructor. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Способ снижения вирусной нагрузки у клеща Varroa destructor, включающий предоставление клещу Varroa destructor композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одной двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную или комплементарную последовательности из по меньшей мере 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, и причем дцРНК понижающе регулирует экспрессию гена вируса пчел у клеща Varroa destructor, вследствие чего снижается вирусная нагрузка репликация у клеща Varroa destructor.

2. Способ супрессии вирусной репликации у клеща Varroa destructor, включающий предоставление клещу Varroa destructor композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одной двухцепочечной РНК (дцРНК), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную или комплементарную последовательности из по меньшей мере 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, и причем дцРНК понижающе регулирует экспрессию гена вируса пчел у клеща Varroa destructor, вследствие чего подавляется вирусная репликация у клеща Varroa destructor.

3. Способ по п.1 или 2, в котором указанная композиция содержит смесь дцРНК, состоящую из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных дцРНК.

4. Способ по п.3, в котором указанные различные дцРНК нацелены на различные вирусы, или нацелены на различные гены одного и того же вируса, или нацелены на различные фрагменты вирусного гена.

5. Способ по п.4, в котором вышеупомянутый вирус выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (CWV), вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса клеща Varroa destructor (VDV-1) и вируса Какуго (KV).

6. Способ по п.1 или 2, в котором указанная по меньшей мере одна дцРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-21.

7. Способ снижения восприимчивости пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел, включающий предоставление клещу Varroa destructor композиции, содержащей эффективное количество дцРНК, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична или комплементарна последовательности из по меньшей мере 21 смежного нуклеотида гена вируса пчел, вследствие чего подавляется вирусная репликация у клеща Varroa destructor и снижается восприимчивость пчелы к заболеванию, которое вызывается вирусом пчел.

8. Способ по п.7, в котором вышеупомянутая пчела представляет собой медоносную пчелу.

9. Способ по п.8, в котором вышеупомянутая медоносная пчела представляет собой фуражира или ульевую пчелу.

10. Способ по п.7, в котором дцРНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10 и 21.

11. Способ по п.7, в котором вирус пчел выбран из группы, состоящей из вируса острого паралича пчел (ABPV), вируса деформации крыла (DWV), кашмирского вируса пчел (KBV), вируса черных маточников (BQCV), вируса мешотчатого расплода (SBV), вируса хронического паралича пчел (CPV), вируса туманного крыла (CWV), вируса израильского острого паралича (IAPV), радужного вируса беспозвоночных 6-го типа (IIV-6), вируса клеща Varroa destructor (VDV-1) и вируса Какуго (KV).

12. Способ по пп. 1-11, в котором указанное предоставление осуществляют путем опрыскивания вышеупомянутого клеща Varroa destructor указанной композицией, содержащей указанную дцРНК, или путем непосредственного кормления вышеупомянутого клеща Varroa destructor указанной композицией, содержащей указанную дцРНК.