ВЕКТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СПЕЙСЕРНЫЕ/ФИЛЛЕР ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/00 C12N15/86 A61K39/23 

ИНФОРМАЦИЯ О РОДСТВЕННЫХ ЗАЯВКАХ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки серийный номер 61/799342, поданной 15 марта 2014 г., описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ВВЕДЕНИЕ

[0002] К настоящему времени в ряде клинических испытаний на ранних стадиях на разнообразных группах было показано, что рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) имеет великолепную терапевтическую перспективу. Разработка этого нового класса биологического продукта для клинических испытаний, близких к завершению, и последующего лицензирования будет включать дальнейшие улучшения векторных характеристик и способов контроля качества, включая лучшее понимание - как конструирование вектора и параметры процесса создания воздействуют на профиль примесей в векторах клинической степени очистки. Удаление примесей ДНК в AAV векторах осложняется тем фактом, что, даже при эффективной нуклеазной обработке для удаления доступных нуклеиновых кислот в процессе очистки вектора, фрагменты ДНК могут быть упакованы и таким образом быть устойчивы к обработке нуклеазой, проводимой таким образом, чтобы сохранить целостность векторной частицы.

[0003] Важной целью при конструировании систем производства rAAV является охарактеризовать и применить стратегии для минимизирования/контроля образования связанных с вектором примесей, включая дикий тип/псевдо дикий тип видов AAV (wtAAV), заключенные в капсид AAV остаточные примеси ДНК и пустые капсиды. Такие связанные с продуктом примеси очень похожи на сам вектор и не могут быть легко отделены от настоящих векторов в ходе процессов очистки. Сообщалось, что не векторные ДНК примеси находятся в очищенных векторных частицах в большом количестве в диапазоне от 1 до 8% от суммарной ДНК (Smith P.H. Wright J.F. Qu G. et al. 2003, Mo Therapy, 7:8348; Chadeuf G. Ciron C. Moullier P. Salvetti A., Mo. Therapy 2005, 12:744. Report from GHMP gene therapy expert group meeting. European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005, 183989/2004). Значительная часть заключенной в капсид остаточной ДНК происходит от ITR содержащей матрицы векторной плазмиды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторным плазмидам и вирусным частицам, которые содержат (включение в капсид, упаковка) векторные геномы. В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантная векторная плазмида содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность и филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность.

[0005] Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным AAV векторным плазмидам и AVV частицам, которые содержат (заключение в капсид, упаковка) AAV векторные геномы. В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантная AAV векторная плазмида содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность и филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность.

[0006] В ряде вариантов настоящего изобретения гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше 4,7 Кб. В частных аспектах гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше 4,7 Кб и расположена внутри двух аденоассоциированных вирусных (AAV) ITR последовательностей. В частных аспектах филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину такую, что, когда объединена с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, суммарная объединенная длина гетерологичной полинуклеотидной последовательности и филлер или спейсерной полинуклеотидной последовательности составляет между около 3,0-5,5 Кб или между около 4,0-5,0 Кб или между около 4,3-4,8 Кб.

[0007] Филлер или спейсерные полинуклеотидные последовательности могут находиться в векторе в любом необходимом положении так, чтобы это не мешало функции или активности вектора. В одном из аспектов филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность не расположена между 5’ и/или 3’ ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности. В другом аспекте филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность находится внутри 5’ и/или 3’ ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности. В дополнительном аспекте филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена примыкающей к 5’ и/или 3’ ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности. В дополнительном аспекте филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности, например, аналогично интрону внутри геномной нуклеиновой кислоты.

[0008] Таким образом, в ряде вариантов осуществления настоящего изобретения, филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена внутри ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV); филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV); или существует две филлер или спейсерные полинуклеотидные последовательности, первая филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена внутри двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV); а вторая филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV).

[0009] В ряде дополнительных аспектов филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность является последовательностью длиной между 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000 нуклеотидов.

[0010] В более частных аспектах филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину такую, что когда объединена с указанной гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, то суммарная объединенная длина гетерологичной полинуклеотидной последовательности и филлер или спейсерной полинуклеотидной последовательностью равна между около 3,0-5,5 Кб, между около 4,0-5,0 Кб или между около 4,3-4,8К б, когда расположена внутри двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV). В других более частных аспектах филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину больше чем 4,7 Кб, между около 5,0–10,0 Кб или между около 6,0-8,0 Кб, когда расположена за пределами двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV).

[0011] Настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантные векторные плазмиды, содержащие вторую (третью, четвертую и т.д.) филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность. В одном из вариантов осуществления изобретения первая филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена внутри двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV); а вторая филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV).

[0012] В одном из аспектов филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность является инертной или безвредной и не имеет функции или активности. В ряде частных аспектов филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность не является бактериальной полинуклеотидной последовательностью, филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность не является последовательностью, которая кодирует белок или пептид, филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность является последовательностью, отличной от любой из: гетерологичной полинуклеотидной последовательности, последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, элемента, контролирующего экспрессию, ориджина репликации, селективного маркера или полиаденин (поли-А) последовательности.

[0013] В ряде дополнительных частных аспектах, филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность является последовательностью интрона, которая связана или не связана с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью. В частных аспектах последовательность интрона расположена внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности. В других частных аспектах последовательность интрона связана с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, так как интрон находится в геномной ДНК, как, например, геномной ДНК, которая кодирует белок, белок, который также кодируется гетерологичной полинуклеотидной последовательностью.

[0014] В изобретении гетерологичная полинуклеотидная последовательность рекомбинантных векторных (например, AAV) плазмид или вирусных (например, AAV) частиц, которые содержат (заключение в капсида, упаковка) рекомбинантные векторные (например, AAV) геномы, может или транскрибируется и в последующем транслируется в белок, или может быть транскрибирована в транскрипт, который сам по себе обладает функцией или активностью. В одном из аспектов гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок. В частных аспектах белок является фактором свертываемости крови (например, Фактор XIII, Фактор IX, Фактор X, Фактор VIII, Фактор VIIa или белок С), CFTR (белок трансмембранный регулятор муковисцидоза), антителом, белком 65 кДа, специфичным для пигментного эпителия сетчатки (RPE65), эритропоэтином, LDL рецептором, липопротеинлипазой, орнитин транскарбамидазой, β-глобином, α-глобином, спектрином, α-антитрипсином, аденозиндезаминазой (ADA), транспортером метала (АТФ7А или АТФ7), сульфамидазой, ферментом, вовлеченным в лизосомную болезнь накопления (ARSA), гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазой, β-25 глюкоцереброзидазой, сфингомиелиназой, лизосомной гексозаминидазой, дегидрогеназой разветвленных кетокислот, гормоном, ростовым фактором (например, инсулин-подобные ростовые факторы 1 и 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор 3 и 4 головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β и т.д.), цитокином (например, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, фактор, стимулирующий колонии макрофагов-гранулоцитов, лимфотоксин и т.д.), продуктом суицидального гена (например, тимидинкиназа вируса простого герпеса, цитозиндезаминаза, токсин дифтерии, цитохром P450, дезоксицитидинкиназа, фактор некроза опухоли и т.д.), белком устойчивости к лекарствам (например, который обеспечивает резистентность к лекарству, используемому при терапии рака), белком, супрессирующим опухоль (например P53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), аденоматозный полипоз толстой кишки (APC)), пептидом с иммуномодуляторными свойствами, толерогенным или иммуногенным пептидом или белком Tregitopes, или hCDR1, инсулином, глюкокиназой, гуанилатциклазой 2D (LCA-GUCY2D), транспортным Rab белком 1 (хороидермия), LCA5 (LCA-леберсилин), орнитин кетокислотной аминотрансферазой (гиратная атрофия), ретиношизином 1 (X-связанный ретиношизис), USHIC (Синдром Ушера 1C), ГТФазой X-связанного пигментного ретинита (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментный ретинит) DFNB1(коннексин 26 глухота), ACHM 2,3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистозное заболевание почек), Tpp1, CLN2, генными дефицитами являющимися причиной лизосомных болезней накопления (например, сульфатаза, N-ацетилглюкозамин-1-фосфат трансфераза, катепсин А, GM2-AP, NPC1, VPC2, белки активаторы сфинголипидов и т.д.), одной или более цинк-пальцевой нуклеазой для редактирования генома или донорными последовательностями, используемыми для восстановления матрицы для редактирования генома.

[0015] В другом аспекте гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок, который, в свою очередь, ингибируют экспрессию или функцию нежелательного или аберрантного (нефункционального) находящегося (эндогенного) белка в индивиде. В дополнительном аспекте гетерологичная полинуклеотидная последовательность является полинуклеотидом, который, когда транскрибирован, транскрибирован в ингибиторную нуклеиновую кислоту (например, ингибиторную РНК). В более частных аспектах ингибиторная нуклеиновая кислота является одноцепочечной последовательностью или образует двух- или трехцепочечную последовательность. В дополнительных более частных аспектах ингибиторная нуклеиновая кислота является микро-РНК (мкРНК), миРНК, кРНК, транс-сплайсинговой РНК, антисмысловой РНК или РНК, образующей триплекс.

[0016] В третьих вариантах аспектов, гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует белок, который ингибирует инфекцию или предоставляет устойчивость или защиту от инфекции, например, ВИЧ инфекции. В частном аспекте таким белком является рецептор хемокина CCR5.

[0017] В дополнительных более частных аспектах ингибирующая нуклеиновая кислота ингибирует экспрессию: гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с денаторубропаллидолусиазной атрофией (например, атрофин 1 ATN-1), андрогенного рецептора в X хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, человеческого атаксина-1, -2, -3 и -7, Ca_v2.1 P/Q зависимого от напряжения кальциевого канала кодируемого (CACNA1A), TATA-связывающего белка, противоположной цепи Атаксина 8, также известного как ATXN8OS, бета изоформы 55 кДа регуляторной единицы В белковой серин/треонин фосфатазы 2А при спинально-церебеллярной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, 17), FMR1 (умственная отсталость 1 ломкой X хромосомы) при синдроме ломкой X хромосомы, FMR1 (умственная отсталость 1 ломкой X хромосомы) тремор/атаксия при ломкой X хромосоме, FMR1 (умственная отсталость 2 ломкой X хромосомы) или AF4/FMR2-членов семьи 2 при умственной отсталости ломкой XE хромосомы; миотонинпротеинкиназы (MT-PK) при миотонической дистрофии; фратаксина при наследственной атаксии Фридрейха; мутантного гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при амиотрофическом латеральном склерозе; гена, вовлеченного в патогенез болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеина B (APOB) и пропротеина конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9); гиперхолестеролемии; HIV Tat, транс-активатора транскрипционного гена вируса иммунодефицита человека при ВИЧ инфекции; HIV TAR, HIV TAR элемента гена трансактивирующего ответ вируса иммунного дефицита человека при ВИЧ инфекции; С-С хемокинового рецептора (CCR5) при ВИЧ инфекции; нуклеокапсидного белка вируса саркомы Рауса (RSV) при RSV инфекции, специфической микро РНК печени (miR-122) при вирусной инфекции гепатита С; p53 острого почечного нарушения или отсроченной функции почечного трансплантата или острой почечной недостаточности поврежденной почки, протеинкиназы N3 (PKN3) при развивающихся рецидивах или метастазирующих солидных раках; LMP2, LMP2 также известной как протеасомная субъединица бета-типа 9 (PSMB 9), метастазирующая меланома; LMP7 также известного как протеасомная субъединица бета-типа 8 (PSMB 8), метастазирующая меланома; MECL1 также известного как протеасомная субъединица бета-типа 10 (PSMB 10), метастазирующая меланома; сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в солидных опухолях, белка кинезинового веретена при солидных опухолях; супрессора апоптоза B-клеток CLL/лимфомы (BCL-2) при хронической миелоидной лейкемии; рибонуклеотидной редуктазы M2 (RRM2) при солидных опухолях; фурина при солидных опухолях; Polo-подобной киназы 1 (PLK1) при опухолях печени; диацилглицеролацилтрансферазы 1 (DGAT1) при инфекции гепатита С; бета катенина при семейном аденоматозном полипозе; бета 2 адренорецептора, глаукома; RTP801/Redd1 также известного как белок транскрипта 4, индуцируемого повреждением DAN при диабетическом отеке желтого пятна (DME) или возрастной макулярной дистрофии; рецептора 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной макулярной дистрофии или хороидальной неоваскуляризации, капсазы 2 при не артериитной ишемической оптической нейропатии; кератина 6А N17K мутантного белка при врожденной пахионихии; последовательностей генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппа; коронавирусных последовательностей генома/гена синдрома атипичной пневмонии (SARS) при SARS инфекции; последовательностей генома/гена синцитиального респираторного вируса при синцитиальной респираторной вирусной инфекции; последовательностей генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательностей генома/гена вируса гепатита В и С при инфекции гепатита В и С; последовательностей генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при HSV инфекции; последовательностей генома/гена вируса Коксаки В3 при инфекции вируса Коксаки В3; «молчания» патогенных аллелей гена (аллель специфичное «молчание») как, например, Торсин А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класс I и HLA-аллель специфичные при трансплантанте; мутантного гена родопсина (RHO) при аутосомно-доминантной наследственной пигментной дистрофии сетчатки (adRP); или ингибиторные нуклеиновые кислоты связываются с транскриптом любого из вышеизложенных генов или последовательностей.

[0018] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды или вирусные (например, AAV) частицы, которые содержат (заключение в капсид, упаковка) рекомбинантный векторный (AAV) геном, содержат дополнительные элементы, которые действуют в цис или транс положениях. В частных вариантах осуществления изобретения рекомбинантный вирусный (например, AAV) вектор и/или вирусная (например, AAV) частица, которая содержит (заключение в капсид, упаковка) рекомбинантный векторный (например, AAV) геном, также имеет: одну или более инвертированные концевые повторные (ITR) последовательности, которые фланкируют 5’ или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности; последовательность, управляющую экспрессией, которая управляет транскрипцией гетерологичной полинуклеотидной последовательности (например, промотор или энхансер, который участвует в транскрипции гетерологичной полинуклеотидной последовательности, как, например, конститутивный или индуцибильный управляющий элемент, или тканеспецифичный управляющий экспрессией элемент); полиадениновую последовательность, расположенную в 3’ конце гетерологичной полинуклеотидной последовательности; селективный маркер (например, белок, который предоставляет устойчивость к антибиотику, как, например, устойчивость к канамицину); и/или ориджин репликации.

[0019] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды или вирусные (например, AAV) частицы, которые содержат (заключение в капсид, упаковка) рекомбинантный векторный (AAV) геном, могут быть включены в клетки. В таком варианте осуществления изобретения клетки могут состоять из лизированных хелперных клеток для производства вирусных частиц или клеток мишеней, в которых требуется экспрессировать гетерологичную нуклеотидную последовательность.

[0020] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды или вирусные (например, AAV) частицы, которые содержат (заключение в капсид, упаковка) рекомбинантный векторный (AAV) геном, могут быть включены в фармацевтические композиции. Такие композиции подходят для введения индивиду рекомбинантных векторных (например, AAV) плазмид или вирусных (например, AAV) частиц, которые содержат (заключение в капсиды, упаковка) рекомбинантные векторные (например, AAV) геномы.

[0021] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды или вирусные (например, AAV) частицы, которые содержат (заключение в капсиды, упаковка) рекомбинантные векторные (например, AAV) геномы, могут быть применены в ряде способах и целях. В одном из вариантов осуществления изобретения способ направлен на доставку или передачу гетерогенной полинуклеотидной последовательности в индивид (например, млекопитающее) или клетку индивида (например, млекопитающего) и включает введение вирусной (например, AAV) частицы, множества вирусных (например, AAV) частиц или фармацевтической композиции вирусной (например, AAV) частицы, множества вирусных (например, AAV) частиц индивиду (например, млекопитающему) или в клетку индивида (например, млекопитающего), таким образом, доставляя или передавая гетерогенную полинуклеотидную последовательность в индивид (например, млекопитающее) или клетку индивида (например, млекопитающего). В другом варианте осуществления изобретения способ направлен на лечение дефицита у индивида (например, млекопитающего) или нуждающегося в экспрессии или функционировании белка, или нуждающегося в сниженной экспрессии или функции эндогенного белка (например, нежелательного, аберрантного, или с нарушенной функцией белка), что включает предоставление вирусной (например, AAV) частицы или множества вирусных (например, AAV) частиц или фармацевтической композиции вирусной (например, AAV) частицы или множества вирусных (например, AAV) частиц и введение индивиду (например, млекопитающему) вирусной (например, AAV) частицы, множества вирусных (например, AAV) частиц или фармацевтической композиции вирусной (например, AAV) частицы или множества вирусных (например, AAV) частиц, когда гетерологичная полинуклеотидная последовательность экспрессируется в млекопитающем, или в котором гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует ингибиторную последовательность или белок, который снижает в индивиде (например, млекопитающем) экспрессию или функцию эндогенного белка (например, нежелательного, аберрантного, или с нарушенной функцией белка).

[0022] Способы или применения для введения или доставки включают любой способ, совместимый с индивидом. В частном варианте осуществления изобретения вирусная (например, AAV) частица или множество вирусных (например, AAV) частиц вводят или доставляют внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, орально, путем интубации, через катетер, через кожу, внутричерпно, путем ингаляции, внутриполостно, или через слизистую.

[0023] Индивид включает млекопитающих, как, например, люди или не люди (например, приматы). В частных вариантах осуществления изобретения индивид выиграет от или нуждается в экспрессии гетерологичной полинуклеотидной последовательности.

[0024] В соответствии с настоящим изобретением предоставляются способы производства по изобретению рекомбинантных векторных (например, AAV) плазмид или вирусных (например, AAV) частиц, которые содержат (заключение в капсид, упаковка) рекомбинантные векторные (например, AAV) геномы. В одном из вариантов осуществления изобретения способ производства рекомбинантных вирусных или AAV частиц включает введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной (например. AVV) плазмиды для производства продуктивной вирусной (например, AVV) инфекции; и культивирование хелперных клеток в условиях для производства рекомбинантных вирусных (например, AVV) частиц. В другом варианте осуществления изобретения способ производства рекомбинантных вирусных или AVV частиц с уменьшенным количеством рекомбинантных вирусных (например, AAV) частиц, в котором рекомбинантный вирусный вектор содержит загрязняющую нуклеиновую кислоту, включает введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной (например, AAV) плазмиды; и культивирование хелперных клеток в условиях для производства рекомбинантных вирусных (например, AAV) частиц, в котором произведенные рекомбинантные вирусные (например, AAV) частицы имеют пониженные количества вирусных (например, AAV) частиц с рекомбинантными векторными геномами, которые содержат загрязняющую нуклеиновую кислоту, по сравнению с количеством вирусных (например, AAV) частиц, которые содержат загрязняющую нуклеиновую кислоту, произведенных при условиях, при которых филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность из рекомбинантного вирусного вектора отсутствует. В частных аспектах загрязняющая нуклеиновая кислота является бактериальной нуклеиновой кислотой; или последовательностями, отличными от гетерогенной полинуклеотидной последовательностью; или ITR, промотором, энхансером, ориджином репликации, полиадениновой последовательностью; или селективным маркером.

[0025] Хелперные клетки включают клетки млекопитающих. Хелперные клетки также включают клетки насекомых, как, например, клетки F9. В частных вариантах осуществления изобретения, клетка-хелпер предоставляет хелперные (например, AVV) функции по упаковке гетерологичной полинуклеотидной последовательности в вирусную частицу. В частных аспектах клетка-хелпер предоставляет AAV Rep и/или Cap белки (например, Rep 78 и/или Rep68 белки); клетка-хелпер постоянно или транзиентно трансфицируется полинуклеотидом(ами), кодирующим Rep и/или Cap белковую последовательность(ти); клетка-хелпер постоянно или транзиентно трансфицируется полинуклеотидной последовательностью(тями), кодирующей Rep 78 и/или Rep68 белок.

[0026] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AVV) плазмиды могут основываться на любом штамме или серотипе, включая гибриды или химеры различных серотипов. По изобретению рекомбинантные вирусные (например, AAV) частицы могут также основываться на любом штамме или серотипе, включая гибриды или химеры различных серотипов. Типичные AAV серотипы включают, без ограничений, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 и Rh10 серотипы. Кроме того, По изобретению рекомбинантные векторные (например, AVV) плазмиды могут включать элементы из любого серотипа, смеси серотипов или гибридов или химер различных серотипов. В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантные AVV векторные плазмиды включают Cap, Rep и/или ITR последовательность, происходящую из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 и Rh10 серотипов, или гибрида или химеры любого из вышеупомянутых AAV серотипов. Кроме того, по изобретению рекомбинантные вирусные (например, AVV) частицы, содержащие векторные геномы, могут включать один или более капсидных белков из любого серотипа, смеси серотипов, или гибридов или химер различных серотипов, как, например, VP1, VP2 или VP3 капсидный белок AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74, Rh10 серотипов.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0027] Фигура 1 демонстрирует уровни примесей плазмидной ДНК в очищенных препаратах AAV вектора в зависимости от размера трансгенной кассеты.

[0028] Фигура 2 демонстрирует картирование 5’ конца векторного генома с использованием ПЦР и набора праймеров, покрывающих трансгенную кассету и апстрим последовательности основы плазмиды в векторном продукте до и после обработки ДНКазой 1. Одиночный праймер, расположенный в трансгенной кассете (круг), был использован в комбинации с праймерами, покрывающими последовательность в трансгенной кассете и фланкирующими участки цепи основы плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотику (KanR и AmpR). ПЦР реакции были проанализированы электрофорезом в 1% агарозном геле.

[0029] Фигуры 2A-2D демонстрируют ПЦР Вектор с короткой и длинной трансгенной кассетами до и после обработки ДНКазой. A) демонстрирует ПЦР Вектор с короткой трансгенной кассетой (2,7 кб) до обработки ДНКазой; B) демонстрирует ПЦР Вектор с короткой трансгенной кассетой (2,7 кб) после обработки ДНКазой и очистки ДНК; C) демонстрирует ПЦР Вектор с длинной трансгенной кассетой (4,3 кб) до обработки ДНКазой; D) демонстрирует ПЦР Вектор с длинной трансгенной кассетой (4,3 кб) после обработки ДНКазой и очистки ДНК.

[0030] Фигуры 3A-3В демонстрируют контрольные ПЦР плазмид с использованием того же набора праймеров до и после обработки ДНКазой 1, которые были осуществлены на продукте плазмидной ДНК, несущей трансгенную кассету. А) демонстрирует плазмиду с трансгенной кассетой (2,7 кб); В) демонстрирует плазмиду с трансгенной кассетой (4,3 кб); и С) демонстрирует образцы ДНК плазмид после обработки ДНКазой

[0031] Фигура 4 является диаграммой, демонстрирующей заключение в капсид векторов плазмидной ДНК с короткой трансгенной кассетой.

[0032] Фигура 5 демонстрирует, что большего размера плазмидная основа в транс положении (7,1 Кб), превышающая AAV лимит сборки, значительно уменьшает упаковку не векторной ДНК.

[0033] Фигура 6 демонстрирует остаточную плазмидную ДНК в очищенных AAV векторах, собранных при помощи векторных плазмид, содержащих не слишком большие (круги) по отношению к слишком большим (треугольники) основы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0034] Исследования, раскрытые в настоящем изобретении, показывают, что уровни остаточных примесей плазмидной ДНК были повышены в рекомбинантных аденоассоциированных вирусных (rAAV) векторных плазмидах с экспрессионными кассетами вектора более короткими, чем природный rAAV упаковочный лимит (приблизительно 4,7 Кб), и чем короче последовательности, чем природный упаковочный лимит rAAV, тем выше уровень примесей. В частности для примера rAAV А (размера 2,7 Кб) содержала 164 пг/10⁹ вг (n=9) остаточной плазмидной ДНК; rAAV В (размера 3,7 Кб) содержала 42,7 пг/10⁹ вг (n 32); и rAAV С (размера 4,3 Кб) содержала 14,0 пг/10⁹ вг (n 29). Таким образом, исследования демонстрируют, что увеличение длины экспрессионной кассеты в процессе конструирования вектора так, что длина является равной или близкой к (природному) упаковочному лимиту вирусного AAV капсида, будет уменьшать или предотвращать заключение в капсид примесной нуклеиновой кислоты, что, в свою очередь, уменьшает количество вирусных (AAV) частиц с включенными в капсид примесями нуклеиновых кислот.

[0035] В силу вышесказанного, настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные векторные плазмиды (например, AAV) с последовательностью, имеющей размер, приближающийся к природной упаковочной вместимости вируса (AAV), и способы использования таких рекомбинантных векторных (например, AAV) плазмид, например, для производства рекомбинантных вирусных частиц, имеющих сниженные или ликвидированные примеси ДНК. Например, оптимизация размера векторной геномной последовательности будет уменьшать потенциальные риски, связанные с опосредованной векторной передачей нежелательных последовательностей нуклеиновых кислот, таких как бактериальные гены, вызывающие устойчивость к антибиотикам.

[0036] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, в которых упакованная (заключенная в капсид) часть (указанная как «вектор» или «векторный геном») имеет размер, приближающийся к природной упаковочной емкости вируса (например, AAV), могут быть использованы для переноса/доставки гетерогенных полинуклеотидных последовательностей, таких как кодирующие последовательности (гены) белков, которые предоставляют требуемую или терапевтическую пользу, а также ингибиторной (например, антисмысловой) нуклеиновой кислоты, которая уменьшает или ингибирует экспрессию нежелательного или дефектного (например, патологичного) гена, таким образом, леча разнообразные заболевания. Например, рекомбинантная векторная плазмида (например, AAV) в которой упакованная (заключенная в капсид) часть (векторный геном) имеет размер, приближающийся к природной упаковочной емкости вируса (AAV), может быть использована для передачи/доставки терапевтических генов для лечения генетической болезни дефицита, такой как гемофилия А, В; других дефицитов белков метаболических или плазмы; и для других терапевтических целей.

[0037] В порядке, предусмотренном настоящим документом, рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды могут быть использованы для доставки полинуклеотидных последовательностей (например, гетерологичных полинуклеотидных последовательностей) в клетки ex vivo, in vitro и in vivo. Такие полинуклеотидные последовательности могут кодировать белки таким образом, что клетки, в которые были доставлены полинуклеотиды, экспрессируют кодированные белки. Например, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может содержать гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую необходимый (например, терапевтический) белок или пептид. Кроме того, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может содержать гетерологичную полинуклеотидную последовательность, которая после транскрипции содержит ингибиторную последовательность (например, РНК), например последовательность, которая направлена на ген (или транскрипт гена) для ингибирования экспрессии. Таким образом, доставка или введение вектора индивиду (например, млекопитающему) предоставляет индивиду не только полинуклеотиды, кодирующие белки или пептиды, но также ингибиторные нуклеиновые кислоты, которые нацелены на гены для ингибирования у индивида экспрессии или функции.

[0038] Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предоставляются рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, в которых упакованная (включенная в капсид) часть (векторный геном) имеет размер, приближающийся к природной упаковочной емкости вируса (например,AAV), включая гетерогенные полинуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды и белки, а также гетерогенные полинуклеотидные последовательности, которые напрямую или когда протранскрибированы содержат ингибиторные нуклеиновые кислоты, которые нацелены на гены для ингибирования экспрессии или функции. Кроме того, такие векторные геномы могут быть заключены (упакованы) внутри вируса, например аденоассоциированного вируса (например, AAV). Таким образом, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида, в которой векторный геном имеет размер, приближающийся к природной упаковочной емкости вируса, может быть упакована в вирус (также указанный в настоящем документе как «частица» или «вирион») для последующего инфицирования (трансформации) клетки ex vivo, in vitro или in vivo.

[0039] Такие частицы или вирионы будут обычно содержать белки, которые заключают в капсид или упаковывают векторный геном. Примеры частиц включают белки оболочки вируса и в случае AAV белки капсида.

[0040] Рекомбинантную «векторную плазмиду» или «AAV векторную плазмиду» получают из дикого типа вирусного генома (например, AAV) с использованием молекулярных методов для удаления из вируса (например, AAV) генома дикого типа и замены не родной нуклеиновой кислотой, такой как гетерологичная полинуклеотидная последовательность (например, экспрессионной кассетой терапевтического гена). Обычно для AAV одну или обе последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) генома дикого типа AAV оставляют в AAV векторной плазмиде.

Вирусный вектор, например, AAV отличается от вирусного (AAV) генома, так как весь или часть вирусного генома был замещен гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность обычно является не родной нуклеиновой кислотой по отношению к вирусной (например, AAV) геномной нуклеиновой кислоте.

[0041] Включение гетерологичного полинуклеотида определяет, таким образом, вирусный вектор (например, AAV) как «рекомбинантный» вектор, который в случае AAV может быть указан как «rAAV» вектор. Когда рекомбинантный геномный вектор заключен в капсид или упакован в AAV частицу, частица может быть указана как «rAAV».

[0042] В частных вариантах осуществления изобретения рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида является парвовирусным вектором. Парвовирусы – это маленькие вирусы с одноцепочечным ДНК геномом. «Аденоассоциированные вирусы» принадлежат семейству парвовирусов.

[0043] Парвовирусы, включая AAV, являются вирусами, полезными в качестве векторов для генной терапии, так как они могут проникать в клетки и вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал. Эти вирусы полезны в качестве векторов для генной терапии, так как они могут проникать в клетки и вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал таким образом, что нуклеиновая кислота/генетический материал стабильно сохраняется в клетках. Кроме того, эти вирусы могут вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал в определенные места. Например, такое, как определенное место в 19 хромосоме. Поскольку AAV не связаны с патогенными заболеваниями у людей, AAV вектора способны доставлять гетерологичные полинуклеотидные последовательности (например, терапевтические белки и соединения) людям-пациентам без вызывания значительного AAV патогенеза или болезни.

[0044] Такие векторные плазмиды (например, AAV) и частицы (например, AAV), содержащие такие векторные геномы, включают любой штамм вируса или серотип, и подгруппы и их варианты. Как используется в настоящем документе, термин «серотип» является отличием, используемым для ссылки на вирус (например, AAV), имеющий капсид, который серологически отличается от других вирусных (например, AAV) серотипов. «Серотип» обычно определяют на основе отсутствия перекрестной активности между антителами к одному вирусу по сравнению с другим вирусом. Такие различия в перекрестной активности обычно обусловлены различиями в капсидных белковых последовательностях/антигенных детерминантах (например, из-за различий в последовательностях VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV). По традиционному определению, серотип означает, что интересующий вирус был тестирован на сывороточную специфичность по нейтрализующей активности для всех существующих и охарактеризованных серотипов, и не было найдено антител, которые нейтрализуют интересующий вирус. Обнаруживаются чаще всего встречающиеся в природе их вирусные изоляты и/или производятся мутантные капсиды. Таким образом, в случаях, когда новый вирус (например, AAV) не имеет серологического отличия, этот новый вирус (например, AAV) будет подгруппой или вариантом соответствующего серотипа. Во многих случаях серологическое тестирование на нейтрализующую активность должно быть еще осуществлено на мутантных вирусах с модификациями капсидной последовательности для определения, не являются ли они другим серотипом в соответствии с традиционным определением серотипа. Соответственно, для удобства и во избежание повторения, термин «серотип» широко относится как к серологически различным вирусам (например, AAV), так и вирусам (например, AAV), которые не являются серологически отличными, которые могут быть внутри подгруппы или вариантом данного серотипа.

[0045] Путем не лимитирующего примера, AAV включают различные природные и неприродные встречающиеся серотипы. Такие не лимитирующие серотипы включают, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 и AAV-2i8. Кроме того, для удобства серотипы включают AAV с модификациями капсидной последовательности, которые не были полностью охарактеризованы как являющиеся отдельными серотипами и могут в действительности в настоящее время составлять подгруппу или вариант известного серотипа.

[0046] Соответственно, по изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды или частицы, которые включают упакованные или заключенные в капсид векторные геномы, а также способы и их использования, включают любой вирусный штамм или серотип. В качестве не лимитирующего примера, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может быть основана на любом AAV геноме, таком как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 или AAV-2i8. Частица (вирус), которая упаковывает (также указано как заключает в капсид) рекомбинантный векторный (например, AAV) геном, может быть основана на любом AAV серотипе, таком как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 или AAV-2i8. Такие векторы или частицы могут быть основаны на том же штамме или серотипе (или подгруппе или варианте) или отличаться друг от друга. В качестве не лимитирующего примера, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может быть основана на геноме серотипа AAV2, который может быть идентичен одному или более капсидным белкам, которые пакуют вектор, в таком случае, по крайней мере один из трех капсидных белков должен быть также AAV2. Кроме того, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может быть основана на геноме серотипа AAV2, может быть отлична по серотипу от одного или более капсидных белков, которые пакуют вектор, в случае чего не менее одного из трех капсидных белков могли бы быть не AAV2 капсидом, как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 или AAV-2i8.

[0047] Кроме того, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида и частицы, которые могут включать упакованную (заключенную в капсид) часть (векторный геном), содержат гибриды и химеры. Таким образом, в качестве не лимитирующего примера, гибридный векторный геном может быть таковым с вирусным геномным серотипом, таким как AAV2 серотип и не AAV2 серотип, как например, AAV2 фланкируемый (5’ или 3’) ITR и не AAV2 фланкируемый (5’ или 3’) ITR. Конкретнее, в качестве не лимитирующего примера, векторный геном, который является гибридом AAV серотипа, мог бы быть AAV2 фланкирующими (5’ или 3’) ITR и AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 и AAV-2i8 фланкирующими (5’ или 3’) ITR. В качестве другого не лимитирующего примера, вирус может быть гибридным AAV серотипом, таким как AAV2 капсид или не AAV2 капсид, например, AAV2Vp1, VP2 или VP3 и не AAV2Vp1, VP2 или VP3. Конкретнее гибрид или химерный вирус, являющийся AAV серотипом, мог бы быть AAV2Vp1, VP2 или VP3 и AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, –rh74, -rh10 или AAV-2i8 Vp1, VP2 или VP3.

[0048] Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды (например, AAV содержит одну или более AAV ITR) и частицы (например, которые содержат AAV капсидные белки) в порядке, предусмотренном настоящим документом, включают те, которые имеют полинуклеотиды, полипептиды или их части, которые имеют менее чем 100% идентичности последовательности по отношению к контрольной последовательности. В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность, которая имеет меньше чем 100% идентичности последовательности по отношению к контрольной последовательности, является не менее чем на 80% или более (например, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 96%,97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентичной контрольной последовательности, например на 80% и более (например, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 96%,97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентичной любой из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh74 5’ или 3’ ITR или AAV-2i8 Vp1, VP2 и/или VP3 капсидной последовательности. Такие 5’ и 3’ ITR и капсидные последовательности для AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh74 и AAV-2i8 известны в этой области техники.

[0049] Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, rh10, rh74 или AAV-2i8 и связанные с ними гибридные и химерные последовательности, могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных техник, которые известны специалистам в данной области техники, для включения одной или более гетерологичных полинуклеотидных последовательностей (трансгенов), фланкированных одной или более функциональными AAV ITR последовательностями.

[0050] Такие векторные плазмиды могут иметь делетированных полностью или частично один или более генов дикого типа AAV, например rep и/или cap ген, но сохранять не менее одной функциональной концевой ITR последовательности, что необходимо для сохранения, репликации и укладки AAV векторной частицы. Таким образом, AAV векторный геном содержит последовательности, необходимые в цис положении для репликации и укладки (например, функциональные ITR последовательности).

[0051] Термин «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используют в настоящем документе взаимозаменяемо для ссылки на все формы нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Полинуклеотиды включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, и сплайсированную или несплайсированную мРНК, рРНК, тРНК и ингибиторные ДНК или РНК (иРНК, например, маленькая или короткая шпилечная (к)РНК, микроРНК (мкРНК), маленькая или короткая интерферирующая (ми)РНК, транс-сплайсингующая РНК или антисмысловая РНК). Полинуклеотиды включают встречающиеся в природе, синтетические и намеренно измененные или модифицированные нуклеотиды, а также аналоги и производные. Полинуклеотиды могут быть единичными, двойными или тройными, линейными или циклическими и могут быть любой длины. В обсуждаемых полинуклеотидах последовательность или структура конкретного полинуклеотида может быть описана в настоящем документе в соответствии с соглашением предоставления последовательности в направлении от 5’ к 3’.

[0052] «Гетерологичный» полинуклеотид относится к полинуклеотиду, вставленному в векторную (например, AAV) плазмиду с целью опосредованной вектором (например, AAV) передачи/доставки полинуклеотида в клетку. Гетерологичные полинуклеотиды, как правило, отличаются от вирусных (например, AAV) нуклеиновых кислот, то есть являются «не родной» по отношению к вирусной (например, AAV) нуклеиновой кислоте. Будучи трансформированным/доставленным в клетку, гетерологичный полинуклеотид, содержащийся внутри вириона (например, AAV), может быть экспрессирован (например, транскрибирован и транслирован в случае необходимости). Альтернативно, затрансформированный/доставленный в клетку гетерологичный полинуклеотид, содержащийся внутри вириона, не нуждается в экспрессии. Хотя термин «гетерологичный» не всегда используется в настоящем документе по отношению к полинуклеотидам, ссылка на полинуклеотид даже в отсутствие определения «гетерологичный» предназначена включать гетерологичные полинуклеотиды несмотря на пропуск.

[0053] «Полипептиды», «белки» и «пептиды», кодируемые «полинуклеотидными последовательностями», включают полноразмерные природные последовательности, как встречающихся в природе белков, так и функциональные подпоследовательности, модифицированные формы или варианты последовательностей таких же по длине, как и подпоследовательности, модифицированные формы или варианты, сохраняющие некоторую степень функциональности природного полноразмерного белка. В способах и использованиях по настоящему изобретению такие полипептиды, белки и пептиды, кодированные полинуклеотидными последовательностями, могут, но не обязательно, быть идентичными эндогенному белку, который является дефектным или чья экспрессия является недостаточной или дефицитного у млекопитающего, которого лечат.

[0054] По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды могут быть использованы для введения/доставки полинуклеотидов постоянно или транзиентно в клетки и их потомство. Термин «трансгенный» используется в настоящем документе для удобной ссылки на гетерологичный полинуклеотид, который был введен в клетку или организм. Трансгены включают любой полинуклеотид, такой как ген, который кодирует полипептид или белок, полинуклеотид, который транскрибируется в ингибирующий полинуклеотид, или полинуклеотид, который не транскрибируется (например, не имеет элемента, управляющего экспрессией, такого как промотор, который управляет транскрипцией).

[0055] Например, в клетке, имеющей трансген, трансген был введен/передан путем векторной (например, AAV) «трансформации» или «трансфекции» клетки. Термины «трансформирует» или «трансфицирует» обозначают введение молекулы, такой как полинуклеотид, в клетку или организм хозяина. На клетку, в которую трансген был введен, ссылаются как на «трансформированную» клетку или «трансформант». Соответственно, «трансформированная» или «трансфицированная» клетка (например, в млекопитающем, такая как клетка ткани или клетка органа) означает генетическое изменение в клетке, следующее за введением экзогенной молекулы, например, полинуклеотида или белка (например, трансгена) в клетку. Таким образом «трансфицированной» или «трансформированной» клеткой является, например, клетка, в которую или потомство которой была введена экзогенная молекула. Клетка(и) может размножаться, и введенный белок экспрессироваться, или нуклеиновая кислота транскрибироваться. Для методов и применений в генной терапии трансформированная клетка может быть в индивиде.

[0056] Введенный полинуклеотид может, а может и не быть интегрирован в нуклеиновую кислоту реципиентной клетки или организма. Если введенный полинуклеотид становится интегрированным в нуклеиновую кислоту (геномную ДНК) реципиентной клетки или организма, он может постоянно сохраняться в клетке или организме и далее передаваться или наследоваться клетками потомства или организмами реципиентной клетки или организма. Наконец, введенная нуклеиновая кислота может существовать в реципиентной клетке или организме только транзиентно.

[0057] Клетки, которые могут быть затрансформированы, включают клетку любого типа ткани или органа, любой природы (например, мезодермы, эктодермы или эндодермы). Не лимитирующие примеры клеток включают клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки), поджелудочной железы (например, бета инсулоциты), легкого, центральной или периферической нервной системы, такой как головной мозг (например, нервные, глиальные или эпендимальные клетки) или спинного мозга, почки, глаза (например, клеточные компоненты сетчатки), селезенки, кожи, тимуса, яичек, легкого, диафрагмы, сердца (сердечные), мышцы или поясничной мышцы или кишечника (например, эндокринные), жировой ткани (белой, коричневой или бежевой), мышц (например, фибробласты), синовициты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки слюнной железы, нервные клетки внутреннего уха или гематопоэтические (например, крови или лимфы) клетки. Дополнительные примеры включают стволовые клетки, такие как плюрипотентные или мультипотентные клетки-предшественники, которые развиваются или дифференцируют в клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эпителиальные клетки), поджелудочной железы (например, бета инсулоциты), легкого, центральной или периферической нервной системы, такой как головной мозг (например, нервные, глиальные или эпендимальные клетки) или спинного мозга, почки, глаза (например, клеточные компоненты сетчатки), селезенки, кожи, тимуса, яичек, легкого, диафрагмы, сердца (сердечные), мышцы или поясничной мышцы или кишечника (например, эндокринные), жировой ткани (белой, коричневой или бежевой), мышцы (например, фибробласты), синовициты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки слюнной железы, нервные клетки внутреннего уха или гематопоэтические (например, крови или лимфы) клетки.

[0058] «Терапевтическая молекула» в одном из вариантов осуществления изобретения является пептидом или белком, который может ослаблять или уменьшать симптомы, которые происходят из-за отсутствия или дефекта белка в клетке или индивиде. Альтернативно, «терапевтический» пептид или белок, кодируемый трансгеном, является тем, который приносит пользу индивиду, например чтобы скорректировать генетический дефект, чтобы скорректировать ген (экспрессию или функционально), дефицит или противораковый эффект.

[0059] Конкретные не лимитирующие примеры гетерологичных полинуклеотидных кодирующих генных продуктов (например, терапевтических белков), которые являются полезными в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не лимитируются этим: гены, которые содержат или кодируют CFTR (белок трансмембранный регулятор муковисцидоза), фактор свертываемости (тромбообразования) крови (Фактор XIII, Фактор IX, Фактор X, Фактор VIII, Фактор VIIa, белок С и т.д.), включающие ростовые или функциональные факторы свертываемости крови, антитело, белок 65 кДа специфичный для пигментного эпителия сетчатки (RPE65), эритропоэтин, LDL рецептор, липопротеин липазу, орнитин транскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозин дезаминазу (ADA), транспортер метала (АТФ7А или АТФ7), сульфамидазу, фермент, вовлеченный в лизосомную болезнь накопления (ARSA), гипоксантин- гуанин-фосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомную гексозаминидазу, дегидрогеназу разветвленных кетокислот, гормон, ростовой фактор (например, инсулин-подобные ростовые факторы 1 и 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор 3 и 4, нейротрофический фактор головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β и т.д.), цитокин (например, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, фактор, стимулирующий колонии макрофагов-гранулоцитов, лимфотоксин и т.д.), продукт суицидального гена (например, тимидинкиназа вируса простого герпеса, цитозиндезаминаза, токсин дифтерии, цитохром P450, дезоксицитидинкиназа, фактор некроза опухоли и т.д.), белок устойчивости к лекарствам (например, который обеспечивает резистентность к лекарству, используемому при терапии рака), белок, супрессирующий опухоль (например, P53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), аденоматозный полипоз толстой кишки (APC)), пептид с иммуномодуляторными свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitopes [de Groot et al., Blood 2008 Oct 15;112(8):3303], или hCDR1 [Sharabi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Jun 6; 103(23):8810-5], инсулин, глюкокиназу, гуанилат циклазу 2D (LCA-GUCY2D), транспортный Rab белок 1 (хороидермия), LCA5 (LCA-леберсилин), орнитин кетокислотную аминотрансферазу (гиратная атрофия), ретиношизин 1 (X-связанный ретиношизис), USHIC (Синдром Ушера 1C), ГТФазу X-связанного пигментного ретинита (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментный ретинит), DFNB1 (коннексин 26, глухота), ACHM 2,3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистозное заболевание почек), TPP1, CLN2, лизосомные болезни накопления, вызванные генными дефицитами (например, сульфатазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазы, катепсина А, GM2-AP, NPC1, VPC2, белков активаторов сфинголипидов и т.д.), одну или более цинк-пальцевые нуклеазы для редактирования генома или донорные последовательности, используемые как восстановительные матрицы для редактирования генома.

[0060] Еще одни не лимитирующие примеры гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих генные продукты (например, терапевтические белки), которые полезны в соответствии с настоящим изобретением, включают те, которые могут быть использованы при лечении болезни или патологии, включая, но не лимитируясь ими, муковисцидоз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемию и другие патологии крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический латеральный склероз, эпилепсию, и другие неврологические патологии, рак, сахарный диабет, мышечную дистрофию (например, Дюшена, Беккера), болезнь Гоше, болезнь Гурлера, дефицит аденозин дезаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические патологии, дегенеративные болезни сетчатки (и другие заболевания глаза) и болезни целых органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца).

[0061] Все формы генных продуктов млекопитающих и не млекопитающих, кодируемые полинуклеотидами, включая не лимитирующие гены и белки, раскрытые в настоящем документе, точно включены, известны они или нет. Таким образом, изобретение включает гены и белки не млекопитающих, млекопитающих, отличных от людей, и людей, чьи гены и белки функционируют по сути в манере, подобной человеческим генам и белкам, описанным в настоящем документе. Не лимитирующим примером гена не млекопитающих является нуклеазный домен Fok, который имеет бактериальную природу. Не лимитирующие примеры FIX последовательностей не человеческих млекопитающих описаны у Yoshitake et al., 1985, выше; Kurachi et al., 1995, supra; Jallat et al., 1990 выше; Kurachi et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jaye et al., 1983, Nucl. Acids. Res 11:2325-2335; Anson et al., 1984 EMBO J. 3:1053-1060; Wu et al., 1990, Gene 86:275-278; Evans et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:10095 (1989), Blood 74:207-212; Pendurthi et al., 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; и Katayama et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994.

[0063] В порядке, предусмотренном настоящим документом, гетерологичные полинуклеотидные последовательности (трансгены) включают ингибиторные и антисмысловые последовательности нуклеиновых кислот. Ингибиторные, антисмысловые, миРНК, мкРНК, кРНК, иРНК и антисмысловые олигонуклеотиды могут модулировать экспрессию гена мишени. Такие молекулы включают те, которые способны ингибировать экспрессию гена-мишени, вовлеченного в посредничество процесса болезни, таким образом, снижая, ингибируя или ослабляя один или более симптомов заболевания.

[0063] Антисенс включает одно-, двух- и трехцепочечные полинуклеотиды и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), которые связывают транскрипты РНК или ДНК (например, геномную ДНК). Олигонуклеотиды, происходящие из сайта инициации транскрипции гена-мишени, например, между позициями -10 и +10 от начала сайта, являются другим конкретным примером. Триплекс, образующий антисенс, может связываться с двухцепочечной ДНК, ингибируя таким образом транскрипцию гена. «иРНК» - это использование последовательностей одно- и двухцепочечных РНК для ингибирования экспрессии гена (смотри, например, Kennerdell et al., Cell 95:1017 (1998); and Fire et al., Nature, 391:806 (1998)). Последовательности двухцепочечной РНК из кодируемого участка гена мишени могут, таким образом, быть использованы для ингибирования или предотвращения экспрессии/транскрипции гена в соответствии со способами и использованиями по настоящему изобретению. Антисенс и иРНК могут быть произведены на основе нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности гена-мишени (например, хантингтина или HTT), как, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей HTT млекопитающего или человека. Например, одно- или двухцепочечная нуклеиновая кислота (например, РНК) может быть направлена на HTT транскрипт (например, мРНК).

[0064] «миРНК» относится к терапевтической молекуле, вовлеченной в процесс РНК интерференции для последовательность специфичного посттранскрипционного сайленсинга или нокдауна гена. миРНК имеют гомологию с последовательностью родственной мРНК гена-мишени. Малые интерферирующие РНК (миРНК) могут быть синтезированы in vitro или образованы путем вырезания рибонуклеазой III из более длинной дцРНК и являются медиаторами последовательность специфичной деградации мРНК. миРНК или другие такие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть синтезированы химически с использованием подходящих защищенных рибонуклеозид фосфорамидитов и подходящего ДНК/РНК синтезатора. миРНК могут быть синтезированы как две раздельные комплементарные молекулы РНК или как одиночная РНК молекула с двумя комплементарными участками. Коммерческие поставщики синтетических РНК молекул или реагентов для синтеза включают Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), Proligo (Humburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, Colo, USA), Pierre Chemical (part of Perbio Science, Rockford, Ill., USA), Glen Research (Sterling, Va., USA) ChemGenes (Ashland, Mass., USA) and Cruachem (Glasgow, UK). Специфические миРНК конструкции для ингибирования мРНК гена-мишени могут быть в длину между 15-50 нуклеотидами, и более типично около 20-30 нуклеотидов в длину. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть легко включены в вирусные вектора, раскрытые в настоящем документе, с использованием подходящих способов, известных специалисту в данной области техники.

[0065] Частные не лимитирующие примеры генов (например, геномной ДНК) или транскрипта патогенного гена (например, РНК или мРНК), которые могут быть мишенью последовательностей ингибирующей нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не лимитируются этим: гены, ассоциированные с заболеваниями полинуклеотидных повторов, такими как ген хантингтина (HTT), ген, ассоциированный с дентаторубро-паллидолюисовой атрофией (например, атрофин 1, ATN1); андрогенный рецептор в Х-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, человеческий Атаксин -1, -2, -3 и -7 и Са_v2.1 P/Q зависимый от напряжения кальциевый канал, кодируемый (CACNA1A), TATA-связывающий белок, противоположную цепь атаксина 8, также известную как ATXN80S, серин/треонин белковую фосфатазу 2А 55 кДа регуляторная субъединица В бета изоформы при спиноцеребральной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (умственная отсталость 1 хрупкой X-хромосомы) при синдроме хрупкой Х-хромосомы, FMR1 (умственная отсталость 1 хрупкой X-хромосомы) при тремор/атаксии синдроме, ассоциированном с хрупкой X-хромосомой, FMR1 (умственная отсталость 2 хрупкой X-хромосомы) или член 2 семейства AF4/FMR2 при умственной отсталости хрупкой XE; миотонинпротеинкиназу (MT-PK) при миотонической дистрофии; Фратаксин при атаксии Фридрейха; мутант гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при амиотрофическом латеральном склерозе; ген, вовлеченный в патогенез болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеин В (APOB) и пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9) гиперхолестеролемия; ВИЧ Tat, ген транс-активатора транскрипции вируса иммунодефицита человека при ВИЧ инфекции; ВИЧ TAR, ВИЧ TAR элемент гена транс-активатора ответа вируса иммунного дефицита человека при ВИЧ инфекции; С-С хемокиновый рецептор (CCR5) при ВИЧ инфекции; нуклеокапсидный белок вируса саркомы Рауса (RSV) при RSV инфекции, специфическую микро РНК печени (miR-122) при вирусной инфекции гепатита С; p53, острое почечное нарушение или отсроченная функция почечного трансплантата или острая почечная недостаточность поврежденной почки; протеинкиназу N3 (PKN3) при развивающемся рецидиве или метастазирующих солидных раках; LMP2, LMP2 также известна как протеасомная субъединица бета-типа 9 (PSMB 9), метастазирующая меланома; LMP7 также известен как протеасомная субъединица бета-типа 8 (PSMB 8), метастазирующая меланома; MECL1 также известен как протеасомная субъединица бета-типа 10 (PSMB 10), метастазирующая меланома; сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) в солидных опухолях; белок кинезинового веретена при солидных опухолях, супрессор апоптоза B-клеток CLL/лимфомы (BCL-2) при хронической миелоидной лейкемии; рибонуклеотидную редуктазу M2 (RRM2) при солидных опухолях; фурин при солидных опухолях; Polo-подобную киназу 1 (PLK1) при опухолях печени; диацилглицеролацилтрансферазу 1 (DGAT1) при инфекции гепатита С, бета катенин при семейном аденомазном полипозе; бета 2 адренорецептор, глаукома; RTP801/Redd1 также известный как белок транскрипта 4 индуцируемого повреждением DAN при диабетическом отеке желтого пятна (DME) или возрастной макулярной дистрофии; рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной макулярной дистрофии или хороидальной неоваскуляризации, капсаза 2 при неартериитной ишемической оптической нейропатии; кератин 6А N17K мутантный белок при врожденной пахионихии; последовательности генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппа; последовательности генома/гена коронаровируса синдрома атипичной пневмонии (SARS) при SARS инфекции; последовательности генома/гена синцитиального респираторного вируса при синцитиальной респираторной инфекции; последовательность генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательности генома/гена вируса гепатита В и С при инфекции гепатита В и С; последовательности генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при HSV инфекции; последовательности генома/гена вируса Коксаки В3 при инфекции вируса Коксаки В3; «молчание» патогенных аллелей гена (аллель специфичное «молчание», как, например, Торсин А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класс I и HLA-аллель специфичные у трансплантанта; или мутантный ген родопсина (RHO) при аутосомно-доминантной наследственной пигментной дистрофии сетчатки (adRP).

[0066] Полинуклеотиды, полипептиды и их последовательности включают модифицированные и вариантные формы. Как используется в настоящем документе, термины «модифицированные» или «вариантные» и их грамматические вариации означают, что полинуклеотиды, полипептиды и их последовательности происходят из референсной последовательности. Модифицированные и вариантные последовательности могут вследствие этого иметь практически ту же, больше или меньше активность или функцию, что и референсная последовательность, но по крайней мере сохраняют частичную активность или функцию референсной последовательности.

[0067] Соответственно, настоящее изобретение также включает встречающиеся природные и не природные варианты. Такие варианты включают приобретение и потерю функции вариантов. Например, дикий тип ДНК последовательностей FIX человека, белковые варианты которых или мутанты сохраняют активность или являются терапевтически эффективными, или являются сравнимыми или даже более терапевтически активными в способах и использованиях по настоящему изобретению, чем неизменяемый FIX человека. В частном примере, коллаген IV служит для захвата FIX, означая, что, когда он введен в мышечную ткань млекопитающего, некоторое количество FIX становится недоступным для участия в свертывании крови, так как он задерживается в интерстициальных пространствах в мышечной ткани. Мутация в последовательности FIX, которая приводит к белку с уменьшенным связыванием коллагеном IV (например, потеря функции), является полезным мутантом в способах по изобретению, например, для лечения гемофилии. Пример такого мутанта гена FIX человека кодирует человеческий FIX белок с аминокислотой аланин вместо лизина в пятом от начала аминокислотном положении зрелого белка.

[0068] Не лимитирующие примеры модификаций включают одну или более нуклеотидных или аминокислотных замен (например, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 или более нуклеотидов или остатков), вставок (например, инсерции или 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100 или более нуклеотидов или остатков) и делеций (например, подпоследовательности или фрагменты) в референсной последовательности. В частном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная или вариантная последовательность сохраняет по крайней мере часть функции или активности немодифицированной последовательности. Такие модифицированные формы и варианты могут иметь меньше чем такую же или большую, но по крайней мере часть функции или активности референсной последовательности, например, как описано в настоящем документе.

[0069] Вариант может иметь одно или более не консервативные или консервативные отличия или модификации аминокислотной последовательности, или оба. «Консервативная замена» является заменой одной аминокислоты биологически, химически или структурно похожим остатком. Похожий биологически означает, что замена не разрушает биологическую активность. Похожий структурно означает, что аминокислоты имеют боковые цепи с похожей длиной, такие как аланин, глицин и серин или похожие размеры. Химическая схожесть означает, что остатки имеют тот же заряд или оба являются гидрофильными или гидрофобными. Конкретные примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой или замену одного полярного остатка на другой, как, например, замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин, серина на треонин и подобные. Частные примеры консервативных замен включают замену гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, замену полярного остатка на другой, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и подобные. Например, консервативные аминокислотные замены обычно включают замены внутри следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. «Консервативные замены» также включают использование замещенных аминокислот на месте незамещенных родственных аминокислот.

[0070] Соответственно, настоящее изобретение включает генные и белковые варианты (например, белков, описанных в настоящем изобретении, кодируемых полинуклеотидами), которые сохраняют одну или более биологической активности (например, функцию в свертываемости крови и т.д.). Такие варианты белков или полипептидов включают белки или полипептиды, которые были или могут быть модифицированы с использованием технологии рекомбинантной ДНК таким образом, что белок или полипептид содержат измененные или дополнительные свойства, например, вариант, дающий улучшенную стабильность белка в плазме или улучшенную активность белка. Варианты могут отличаться от референсной последовательности, как, например, встречающихся в природе полинуклеотидов, белков или пептидов.

[0071] На уровне нуклеотидной последовательности встречающиеся природные и не природные варианты гена будут, обычно, по крайней мере на около 50% идентичны, более типично на около 70% идентичны, еще более типично на около 80% идентичны (на 90% или более идентичны) референсному гену. На аминокислотном уровне последовательности, природный и не природный встречающийся вариант белка будет типично по крайней мере на около 70% идентичен, более типично на около 80% идентичен, еще более типично на около 90% или более идентичен референсному белку, хотя не идентичные участки замещения разрешены в неконсервативных участках (например, менее чем на 70% идентичности, как, например, менее чем на 60%, 50% или даже 40%). В других вариантах осуществления изобретения последовательности имеют идентичность с референсной последовательностью по крайней мере на 60%, 70%, 75% или более (например, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности). Процедуры введения нуклеотидных или аминокислотных замен в полинуклеотид, белок или полипептид известны специалисту в данной области (смотри, например, Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual (2007))

[0072] Термин «идентичность», «гомология» и их грамматические варианты означает, что две или более указанных сущностей являются одним и тем же, когда они являются «совмещенными» последовательностями. Таким образом, путем примера, когда две полипептидные последовательности являются идентичными, они имеют одинаковую аминокислотную последовательность, по крайней мере внутри указанного участка или части. Когда две полинуклеотидные последовательности являются идентичными, они имеют одинаковую полинуклеотидную последовательность, по крайней мере внутри указанного участка или части. Идентичность может быть сверх определенной области (участка или домена) последовательности. «Область» или «участок» идентичности относится к части двух или более указанных сущностей, которые являются одинаковыми. Таким образом, когда два белка или последовательности нуклеиновых кислот являются идентичными сверх одной или более областей или участков последовательности, они являются идентичными внутри этого участка. «Совмещенная» последовательность относится ко многим полинуклеотидным или белковым (аминокислотным) последовательностям, часто содержащим коррекции отсутствующих или дополнительных оснований или аминокислот (пропуски) по сравнению с референсной последовательностью.

[0073] Идентичность может протягиваться за полную длину или часть последовательности. В частных аспектах длина последовательности, совмещающей процент идентичности, составляет 2, 3, 4, 5 или более прилегающих полинуклеотидов или аминокислот, например 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д. прилегающих аминокислот. В дополнительных частных аспектах длина последовательности, совмещающей идентичность, составляет 20 или более прилегающих полинуклеотидов или аминокислот, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 и т.д. прилегающих аминокислот. В следующем частном аспекте длина последовательности, совмещающей идентичность, составляет 35 или более прилегающих полинуклеотидов или аминокислот, например, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 и т.д. прилегающих аминокислот. Еще в одном частном аспекте длина последовательности, совмещающей идентичность, составляет 50 или более прилегающих полинуклеотидов или аминокислот, например 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 76-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-110 и т.д. прилегающих полинуклеотидов или аминокислот.

[0074] Термины «гомологичный» или «гомология» означают, что две или более референсных сущностей совмещают, по крайней мере, частичную идентичность сверх данного участка или части. «Области, участки или домены» гомологии или идентичности означают, что часть двух или более референсных сущностей совмещают гомологию или являются теми же. Таким образом, когда две последовательности являются идентичными свыше одного или более участков последовательности, они совмещают идентичность в этих участках. «Существенная гомология» означает, что молекула является структурно или функционально консервативной так, что она имеет или предсказано, что имеет, по крайней мере частичную структуру или функцию одной или более структур или функций (например, биологическую функцию или активность) референсной молекулы или соответствующего/аналогичного участка или части референсной молекулы, с которой она совмещает гомологию.

[0075] Степень идентичности (гомологии) между двумя последовательностями может быть установлена с использованием компьютерной программы и математического алгоритма. Такие алгоритмы, которые рассчитывают процент идентичности (гомологии) последовательностей, обычно берут в расчет пропуски и несоответствия в процессе сравнения участков или областей. Например, BLAST (например, BLAST 2.0) поисковый алгоритм (смотри, например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215-403 (1990), общедоступен через NCBI) имеет следующие типичные поисковые параметры: несовпадение 2; открытый пропуск 5; расширение пропуска 2. Для сравнений полипептидной последовательности обычно используется BLASTP алгоритм в комбинации с матрицей замены, например, PAM 100, PAM 250, BLOSUM 62 или BLOSUM 50, FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) и SSEARCH программ сравнения последовательностей, также используемых для количественного расчета протяженности идентичности (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); и Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Также были разработаны программы для количественного определения структурной схожести белков, использующие топографическое отображение по Делоне (Bostick et al., Biochem. Biophys Res Commun. 304-320 (2003).

[0076] Полинуклеотиды включают присоединения и включения, например, гетерологичных доменов. Присоединение (например, гетерологичного домена) может быть ковалентным и нековалентным присоединением любого типа молекулы к соединению. Обычно добавления и включения (например, гетерологичного домена) предоставляют комплементарную или отличную функцию или активность.

[0077] Присоединения и включения включают химерные и гибридные последовательности, которые являются полинуклеотидной или белковой последовательностью, имеющей одну или более молекул, обычно не присутствующих в референсной природной (дикого типа) последовательности, пришитые ковалентно к последовательности. Термин «гибридные» или «химерные» и их грамматические варианты, когда используются при ссылке на молекулу, означает, что доли или часть молекулы содержат другую сущность, отличную (гетерологичную) от молекулы, так как они обычно не существуют вместе в природе. Другими словами, например, одна доля гибрида или химеры включает или состоит из доли, которая не существует вместе в природе и отличается структурно.

[0078] Термин «вектор» относится к плазмиде, вирусу (например, AAV вектор), космиде или другому носителю, которым можно манипулировать путем включения или введения полинуклеотида. Такие векторы могут быть использованы для генетических манипуляций (например, «клонирующие векторы»), для введения/трансфекции полинуклеотидов в клетки и для транскрипции или трансляции введенного в клетки полинуклеотида. Векторная плазмида обычно содержит, по крайней мере, ориджин репликации для размножения в клетке и по необходимости дополнительные элементы, такие как гетерологичная полинуклеотидная последовательность, элемент управления экспрессией (например, промотор, энхансер), селективный маркер (например, устойчивости к антибиотику), полиадениновую последовательность.

[0079] Как используется в настоящем документе, термин «рекомбинантный» как модификатор вирусного вектора, как например, AAV вектора, а также модификатор последовательностей, как, например, рекомбинантные полинуклеотиды или полипептиды, означает, что соединения были обработаны (например, сконструированы) в виде, который обычно не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора, такого как AAV вектор, будет пример, когда полинуклеотид, который не существует в норме в диком типе вирусного (например, AAV) генома, существует в вирусной (например, AAV) частице и/или вирусном (например, AAV) геноме. Например, конкретным примером рекомбинантного полинуклеотида будет пример, когда полинуклеотид (например, ген), кодирующий белок, клонирован в вектор, с или без 5’, 3’ и/или областями интрона, с которыми ген в норме соединен внутри вирусного (например, AAV) генома. Хотя термин «рекомбинантный» не всегда используется в настоящем документе при ссылке на вирусные векторы, такие как AAV векторы, а также последовательности, такие как полинуклеотидные и полипептидные, гибриды, химеры, их рекомбинантные формы (например, AAV), векторы и последовательности, включая полинуклеотиды и полипептиды, гибриды и химеры, однозначно включены, несмотря на любой такой пропуск.

[0080] Для рекомбинантной векторной плазмиды векторный геном относится к части векторной плазмиды, которая упакована или заключена в капсид вирусом (например, AAV), который содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность. Плазмидная часть рекомбинантной векторной плазмиды включает основу, используемую для трансфекции хелперной клетки и продукции клеткой вируса, который упаковывает/заключает в капсид векторный геном, но сама по себе не упаковывается и не заключается в капсид вирусом (например, AAV).

[0081] Вирусный вектор происходит из или основан на одном или более элементов нуклеиновых кислот, которые составляют вирусный геном. Конкретные вирусные геномы включают парвовирусные векторы, такие как аденоассоциированные вирусные (AVV) векторы.

[0082] Рекомбинантные векторные плазмиды в порядке, предусмотренном настоящим документом, включают дополнительную филлер/спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, которая изменяет размер или добавляет длину до близкого или нормального размера последовательности вирусного генома, которая упаковывается или заключается в капсид для образования инфекционных вирусных частиц. В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения филлер/спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты является не транслируемым (не кодирующим белок) сегментом нуклеиновой кислоты. В частных вариантах AAV вектора, гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше 4,7 Кб, а филлер/спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая, если объединена (например, включена в вектор) с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, имеет суммарную длину между около 3,0-5,5 Кб или между около 4,0-5,0 Кб, или между около 4,3-4,8 Кб. Например, длина вектора для укладки векторной AAV частицы может быть до около 5,2 Кб. Более конкретно, филлер или спейсерная нуклеотидная последовательность имеет длину последовательности между 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000 нуклеотидов в длину.

[0083] Как раскрыто в настоящем документе, филлер/спейсерная полинуклеотидная последовательность может быть в любом положении в рекомбинантной векторной плазмиде по отношению к другим последовательностям, таким как гетерологичная полинуклеотидная последовательность, элемент(ы) контроля, ITR(s), ориджин репликации, селективный маркер и т.д., совместимом с векторной функцией. В частном аспекте филлер/спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена между 5’и 3’ ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности, например, в контексте AAV векторной плазмиды филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность находится в части векторного генома рекомбинантной векторной плазмиды и является, таким образом, доступной для вирусной упаковки/заключения в капсид. В другом частном аспекте филлер/спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами 5’ и 3’ ITR , которая фланкирует соответственно 5’ или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности, например, в контексте AAV векторной плазмиды филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена в основной или плазмидной части рекомбинантной векторной плазмиды. Еще в одном частном аспекте филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности, например, в контексте AAV векторной плазмиды филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность, расположенная внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности, находится в части векторного генома рекомбинантной векторной плазмиды и таким образом доступна для вирусной упаковки/заключения в капсид.

[0084] Рекомбинантные векторные плазмиды, включающие рекомбинантные AAV векторные плазмиды по настоящему изобретению, могут содержать еще дополнительные элементы из нуклеиновых кислот. Эти элементы включают без ограничения одну или более копий AAV ITR последовательности, промоторный или энхансерный элемент, сигнал терминации транскрипции, 5’ или 3’ нетраслируемую область (например, полиаденилирующие последовательности), которые фланкируют полинуклеотидную последовательность, и весь или часть интрона I. Такие элементы также, если необходимо, содержат сигнал терминации транскрипции. Конкретным не лимитирующим примером сигнала терминации транскрипции является сигнал терминации транскрипции SV40.

[0085] Рекомбинантные векторные плазмиды по настоящему изобретению могут содержать один или более «элементов, регулирующих экспрессию». Элементы регулирования, включая элементы, управляющие экспрессией, в порядке, предусмотренном в настоящем изобретении, присутствующие внутри вектора, облегчают правильную транскрипцию гетерологичного полинуклеотида и их соответствующую трансляцию (например, сигнал сплайсинга для интронов, сохранение правильной считывающей рамки гена для разрешения внутрирамочной трансляции мРНК и стоп кодоны и т.д.). Обычно элементы, управляющие экспрессией, являются последовательностями (последовательностью) нуклеиновых кислот, такими как промоторы и энхансеры, которые влияют на экспрессию присоединенного функционально гетерологичного полинуклеотида. Такие элементы, как правило, действуют в цис положении, но могут также действовать и в транс положении.

[0086] На управление экспрессией можно влиять на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности транскрипта и т.д. Как правило, элемент, управляющий экспрессией, который управляет транскрипцией, располагается рядом с 5’ концом транскрибируемого полинуклеотида (т.е. «апстрим»). Элементы, управляющие экспрессией, могут находиться также на 3’ конце транскрибируемой последовательности (например, «даунстрим») или внутри транскрипта (например, в интроне). Экспрессионные контрольные элементы могут быть расположены на расстоянии, удаленном от транскрибируемой последовательности (например, от 100 до 500, от 500 до 1000, от 2000 до 5000, от 5000 до 10000 или более нуклеотидов от полинуклеотида), даже на значительных расстояниях. Тем не менее, из-за ограничений длины полинуклеотида вирусных векторов, таких как AAV векторы, такие элементы, управляющие экспрессией, обычно будут находиться в пределах от 1 до 1000 нуклеотидов от полинуклеотида.

[0087] Функционально, экспрессионный или оперативно связанный гетерологичный полинуклеотид является, по крайней мере, частично регулируемым элементом (например, промотором), так что этот элемент регулирует транскрипцию гетерологичного полинуклеотида и, по необходимости, трансляцию транскрипта. Характерным примером элемента, управляющего экспрессией, является промотор, который обычно расположен с 5’ конца от транскрибируемой последовательности. Другим примером элемента, управляющего экспрессией, является энхансер, который может быть расположен в 5’, 3’ концах транскрибируемой последовательности или внутри транскрибируемой последовательности.

[0088] Термин «промотор», как используется в настоящем документе, может относиться к последовательности ДНК, которая расположена примыкающе к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует рекомбинантный продукт. Промотор, как правило, функционально связан с примыкающей последовательностью, например, гетерологичным полинуклеотидом. Промотор, как правило, увеличивает количество, экспрессированное с гетерологичного полинуклеотида, по сравнению с количеством, экспрессируемым, когда промотор не существует.

[0089] Термин «энхансер», как используется в настоящем документе, относится к последовательности, которая расположена примыкающе к полинуклеотидной последовательности. Элементы энхансеры обычно расположены апстрим от элемента промотора, но тоже функционируют и могут быть расположены даунстрим или внутри последовательности ДНК (например, гетерологичного полинуклеотида). Следовательно, элемент энхансер может быть расположен на 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 пар оснований или более пар оснований апстрим или даунстрим от гетерологичного полинуклеотида. Элементы энхансеры, как правило, увеличивают экспрессию гетерологичного полинуклеотида выше увеличенной экспрессии, которую может дать элемент промотор.

[0090] Элементы, управляющие экспрессией (например, промоторы), включают те, которые активны в специфической ткани или типе клеток, указаны в настоящем документе как «тканеспецифичные элементы/промоторы, управляющие экспрессией». Тканеспецифичные элементы/промоторы, управляющие экспрессией, как правило, активны в специфической клетке или ткани (например, активны в печени, головном мозге, центральной нервной системе, спинном мозге, глазе, сетчатке, кости, мышце, легком, поджелудочной железе, сердце, почке, клетке почки и т.д.). Элементы, управляющие экспрессией, обычно активны в этих клетках, тканях или органах, так как они узнаются белками активаторами транскрипции или другими регуляторами транскрипции, которые уникальны для специфического типа клетки, ткани или органа.

[0091] К примеру, если требуется экспрессия в мышце скелета, может быть использован промотор, активный в мышце.

Это включает промоторы генов, кодирующих скелетный α-актин, легкую цепь 2А миозина, дистрофин, мышечную креатинкиназу, а также синтетические мышечные промоторы с активностью выше, чем у встречающихся в природе промоторов. Смотри Li et al., Nat. Biotech. 17:241-245 (1999). Примерами промоторов, которые являются тканеспецифичными, среди других для печени являются альбумин, Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); промотор кора вируса гепатита В, Sanding et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996); альфа-фетопротеин (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], кости (остеокальцин, Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997); сиалопротеин костей, Chen, et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), лимфоциты (CD2, Hansal, et al., J. Immunol., 161-1063-8 (1998)); тяжелая цепь иммуноглобулина; цепь рецептора Т-клеток), нейрональные (промотор нейронспецифиченской енолазы (NSE), Andersen, et al., Cell Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); ген легкой цепи нейрофиламента, Piccioli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5615-5 (1991); нейронспецифический vgf ген, Piccioli, et al., Neuron , 15: 373-84 (1995).

[0092] Элементы, управляющие экспрессией, также включают повсеместные или беспорядочные промоторы/энхансеры, которые способны управлять экспрессией полинуклеотида во многих различных типах клеток. Такие элементы включают, но не лимитируются, быстрые ранние промотор/энхансер последовательности цитомегаловируса (CMV); промотор/энхансер последовательности вируса саркомы Рауса (RSV) и другие вирусные промоторы/энхансеры, активные в ряде типов клеток млекопитающих, или синтетические элементы, которые не существуют в природе (смотри, например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)), SV40 промотор, промотор дигидрофолат редуктазы, промотор цитоплазматического β-актина и промотор фосфоглицеролкиназы (PGK).

[0093] Элементы, управляющие экспрессией, могут также проводить экспрессию таким образом, что она является регулируемой, что является сигнальными или стимулирующими увеличениями или уменьшениями экспрессии функционально связанного гетерологичного полинуклеотида. Регуляторный элемент, который увеличивает экспрессию гетерологичного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимул, также указан как «индуцируемый элемент» (то есть индуцируемый с помощью сигнала). Конкретные примеры включают, но не лимитируются, гормональный (например, стероидный) индуцируемый промотор. Регулируемый элемент, который уменьшает экспрессию или функционально связывает гетерологичный полинуклеотид в ответ на сигнал или стимул, указан как «репрессивный элемент» (то есть сигнал, снижающий экспрессию так, что, когда сигнал убирают или он отсутствует, экспрессия увеличивается). Как правило, количество увеличения или снижения, предоставленное таким элементом, пропорционально количеству присутствующего сигнала или стимула; чем больше количество сигнала или стимула, тем больше увеличение или уменьшение экспрессии. Конкретные, не лимитирующие примеры, включают цинк индуцируемый промотор металлотионина (MT) овцы; индуцируемый стероидным гормоном промотор вируса рака молочной железы мыши (MMTV); T7 полимеразная промоторная система (WO 98/10088); тетрациклин репрессивная система (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)); тетрациклин индуцируемая система (Gossen et al., Science. 268:1766-1769 (1995), смотри также Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-618 (1998)); RU486 индуцируемая система (Wang, et al., Nat Biotech. 15:239-243 (1997) и Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441(1997); и рапамицин индуцируемая система (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)). Другие типы регулируемых контролирующих элементов, которые могут быть полезны в этом контексте, являются те, которые регулируются конкретными физиологическими состояниями, например, температурой, острой фазой.

[0094] Элементы, управляющие экспрессией, также включают собственные элементы для гетерологичного полинуклеотида. Собственный управляющий элемент (например, промотор) может быть использован, когда желательно, чтобы экспрессия гетерологичного полинуклеотида имитировала собственную экспрессию. Собственный элемент может быть использован, когда экспрессия гетерологичного полинуклеотида должна регулироваться временно или в развитии или тканеспецифичным образом, или в ответ на конкретный транскрипционный стимул. Другие собственные элементы управления экспрессией, такие как интроны, участки полиаденилирования или консенсусные последовательности Козака, могут также быть использованы.

[0095] Как раскрыто в настоящем документе, AAV векторы, как правило, допускают вставки ДНК, имеющие определенный диапазон размера, который обычно составляет от около 4 кб до около 5,2 кб или немного больше. Таким образом, для более коротких последовательностей используют включение спейсера или филлера во вставочный фрагмент с целью достижения приемлемой длины для укладки в вирусную частицу AAV вектора. Как также раскрыто в настоящем документе, интрон может также функционировать как филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность с целью достижения длины для укладки в вирусную частицу AAV вектора. Интроны и фрагменты интронов (например, часть интрона I FIX), которые действуют как филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность, могут также улучшать экспрессию. Например, включение элемента интрона может улучшать экспрессию по сравнению с экспрессией в отсутствие элемента интрона (Kurachi et al., 1995, выше).

[0096] Использование интронов не лимитируется включением последовательности интрона I FIX, но также включает другие интроны, эти интроны могут быть ассоциированы с тем же геном (например, когда гетерологичный полинуклеотид кодирует FIX, интрон происходит из интрона, присутствующего в геномной последовательности FIX) или абсолютно другим геном или другой ДНК последовательностью. Соответственно, другие нетранслируемые (не кодирующие белок) области нуклеиновой кислоты, такие как интроны, обнаруженные в геномных последовательностях родственных (связанных) генов (гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует весь или область этого же белка, кодируемого геномной последовательностью) и не родственных (несвязанные) генов (гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует белок, который отличается от белка, кодируемого геномной последовательностью), могут также действовать в соответствии с настоящим изобретением как филлер или спейсерные полинуклеотидные последовательности.

[0097] «Часть интрона I» в данном контексте означает область интрона I, имеющую длину нуклеотида от около 0,1 кб до около 1,7 кб, такая область улучшает экспрессию FIX на матрице векторной плазмиды или вируса, как правило, в около 1,5 раз или более по сравнению с экспрессией FIX при отсутствии области интрона I. Более специфичная область является областью интрона I в 1,3 кб.

[0098] Термин «олигонуклеотид» в данном контексте относится к последовательностям, праймерам и зондам, определенным как молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из двух или более рибо- или дезоксирибонуклеотидов, как правило, более чем из трех. Точный размер олигонуклеотида будет зависеть от ряда факторов и от конкретного применения и использования олигонуклеотида, но, как правило, олигонуклеотид имеет длину около 5-50 нуклеотидов.

[0099] Термин «праймер» в данном контексте относится к ДНК олигонуклеотиду, либо одноцепочечному либо двухцепочечному, либо происходящему из биологической системы, генерированный гидролизом ферментом рестрикции, или произведенный синтетически, который, когда помещен в подходящее окружение, способен функционально действовать как ингибитор синтеза нуклеиновой кислоты, зависящего от матрицы. Когда представлены с подходящей матрицей нуклеиновой кислоты подходящие прекурсоры нуклеиновых кислот нуклеозидтрифосфаты, фермент полимераза, подходящие кофакторы и условия, такие как подходящая температура и pH, праймер может быть удлинен с его 3’ конца путем добавления нуклеотидов действием полимеразы или такой же активности, чтобы выдать продукт удлинения праймера. Праймер может варьировать в длину в зависимости от конкретных условий и требований применения. Например, при диагностических применениях олигонуклеотидный праймер имеет в длину, как правило, 15-30 или более нуклеотидов. Праймер должен быть достаточно комплементарен заданной матрице для инициации синтеза продукта заданной длины, другими словами связываться с заданной цепью матрицы образом, достаточным для предоставления 3’ гидроксил части праймера для подходящего совмещения для использования в инициации синтеза полимеразой или похожим ферментом. Не требуется, чтобы последовательность праймера представляла точную комплементарность заданной матрице. Например, последовательность некомплементарного нуклеотида может присоединяться к 5’ концу другого комплементарного праймера. Альтернативно, некомплементарные основания могут быть вкраплены внутри последовательности олигонуклеотидного праймера, при условии, что последовательность праймера имеет достаточную комплементарность с последовательностью цепи заданной матрицы для функционального обеспечения комплекса матрица-праймер для синтеза удлиненного продукта.

[0100] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была описана в U.S. Patent №№ 4683194, 4800195 и 4965188.

[0101] Фраза «специфически гибридизуют» относится к объединению двух одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот с достаточно комплементарной последовательностью для допущения гибридизации при заранее заданных условиях, обычно используемых в данной области (иногда называются «практически комплементарные»). В частности, данный термин относится к гибридизации двух последовательностей нуклеотидов с практически комплементарными последовательностями, для значительного исключения гибридизации с другими одноцепочечными некомплементарными последовательностями нуклеиновых кислот.

[0102] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, могут быть сделаны с использованием ряда стандартных клонирований, метода рекомбинантной ДНК, посредством клеточной экспрессии или in vitro трансляции и методов химического синтеза. Чистота полинуклеотидов может быть определена путем сиквенса, гель-электрофореза и им подобным. Например, нуклеиновые кислоты могут быть выделены с использованием гибридизации или методов, основанных на компьютерном скрининге базы данных. Такие методы включают, но не лимитируются этим: (1) гибридизацию геномных библиотек ДНК или кДНК с помощью зондов для выявления гомологичных нуклеотидных последовательностей; (2) скрининг при помощи антител для определения полипептидов, имеющих общие структурные черты, например, с использованием экспрессионной библиотеки; (3) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на геномной ДНК или кДНК с использованием праймеров, способных отжигать на интересующей последовательности нуклеиновой кислоты; (4) компьютерный поиск родственных последовательностей по базам данных последовательностей; и (5) дифференциальный скрининг выделенной библиотеки нуклеиновых кислот.

[0103] «Ген селективного маркера» относится к гену, который, когда экспрессирован, обеспечивает трансформированной клетке селективный фенотип, такой как устойчивость к антибиотику (например, канамицину). «Репортерный» ген является тем геном, который предоставляет детектируемый сигнал. Не лимитирующим примером репортерного гена является ген люциферазы.

[0104] В соответствии с данным контекстом, термин «функциональная связь» или «связаны функционально» относится к физическому или функциональному соединению компонентов, так сконструированному, чтобы дать возможность им действовать в их предназначенной манере. В примере управляющего экспрессией элемента в функциональном соединении с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, взаимодействие является таковым, что элемент управления управляет экспрессией гетерологического полинуклеотида. Более конкретно, например, две последовательности ДНК, связанные функционально, означает, что две ДНК расположены (в цис или транс положении) в такой взаимосвязи, что по крайней мере одна из последовательностей ДНК способна оказывать физиологическое воздействие на другую последовательность.

[0105] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, могут быть также химически синтезированы способами, известными специалисту в данной области, например, автоматизированным синтетическим аппаратом (смотри, например, Applied Biosystems, Foster City, CA). Пептиды могут быть синтезированы полностью или частично, с использованием химических методов (смотри, например, Caruthers (1980). Nucleic. Acids. Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); и Banga , A.K. Therapeutic Peptides and Proteins. Formulation Processing and Delivery Systems (1995) Thechnomic Publishing Co., Lancaster, PA). Пептидный синтез может быть осуществлен с использованием ряда твердофазных методов (смотри, например, Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289-3 (1997)), и автоматизированный синтез может быть проведен с использованием, например, Пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями по проведению.

[0106] Термин «выделенный», если используется в качестве преобразователя компонента, означает, что соединения сделаны руками человека или отделены, полностью или хотя бы частично, от их окружения встречающегося в природе, in vivo. Обычно выделенные компоненты существенно свободны от одного или более веществ, с которыми они в норме связаны в природе, например, с одним или более белков, нуклеиновой кислотой, липидом, углеводородом, клеточной мембраной. Термин «выделенный» также не исключает альтернативные физические формы компонента, такие как гибриды/химеры, мультимеры/олигомеры, модификации (например, фосфорилирование, гликозилирование, липидизация) или производные формы, или формы, экспрессированные в клетках хозяина, произведенные руками человека.

[0107] Способы и использования по настоящему изобретению предоставляют пути доставки (трансдукции) гетерологичных полинуклеотидов (трансгенов) в широкий диапазон клеток хозяина, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы, использования и фармацевтические препараты по настоящему изобретению являются также полезными в способах введения белка, пептида или нуклеиновой кислоты в качестве способа лечения индивида, нуждающегося в этом. Следовательно, белок, пептид или нуклеиновая кислота могут таким образом быть произведены in vivo в индивиде. Индивид может получить пользу от или нуждаться в белке, пептиде или нуклеиновой кислоте, потому что индивид имеет дефицит белка, пептида или нуклеиновой кислоты, или потому, что производство белка, пептида или нуклеиновой кислоты в индивиде может оказать некоторое терапевтическое действие, как способ лечения или другое. Альтернативно, может быть желательно заингибировать или уменьшить экспрессию или производство целевого гена, вовлеченного в процесс болезни, например, для лечения нейродегенеративной болезни, рака или атеросклероза, например, для достижения терапевтического результата.

[0108] Обычно, по изобретению рекомбинантные векторные (например, AVV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы и использования могут быть применены для доставки любых гетерологичных полинуклеотидов (трансгенов) с биологическим действием для лечения или улучшения одного или более симптомов, ассоциированных с любой патологией, связанной с недостаточной или нежелательной экспрессией гена. По изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы рекомбинантные вирусные частицы, способы и использования могут быть использованы для предоставления терапии при разнообразных болезненных состояниях.

[0109] Существует большое количество наследственных заболеваний, в которых дефектные гены известны и были клонированы. Обычно вышеупомянутые болезненные состояния делятся на два класса: состояния дефицита, обычно ферментов, которые обычно наследуются по рецессивному типу, и несбалансированные состояния, по крайней мере, иногда вовлекающие регуляторные или структурные белки, которые наследуются по доминантному типу. Для заболеваний состояния дефицита передача гена могла бы быть использована для внесения нормального гена в затронутые ткани для заместительной терапии, а также для создания животной модели болезни, использующей антисмысловые мутации. Для несбалансированных болезненных состояний передача гена может быть использована для создания болезненного состояния в модельной системе, которая могла бы быть затем использована в усилиях противодействовать болезненному состоянию. Таким образом, по изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы и применения позволяют лечить генетические болезни. В данном контексте, болезненное состояние лечиться путем частичного или полного устранения дефицита или дисбаланса, который вызывает заболевание или делает его более тяжелым. Использование сайт-специфичной интеграции последовательностей нуклеиновых кислот для вызывания мутаций или коррекции дефектов также возможно.

[0110] Иллюстративные болезненные состоянии включают, но не лимитируются этим: муковисцидоз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемию и другие патологии свертываемости крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический латеральный склероз, эпилепсию и другие неврологические патологии, рак, сахарный диабет, мышечную дистрофию (например, Дюшена, Беккера), болезнь Гоше, болезнь Гурлера, дефицит аденозин дезаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические патологии, Болезнь Помпе, застойную сердечную недостаточность, дегенеративные болезни сетчатки (хороидеремия, амавроз Лебера и другие заболевания глаза) и болезни целых органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца) и им подобные.

[0111] В соответствии с настоящим изобретением способы и использования лечения предоставляются так, что включают по изобретению рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы и по изобретению вирусные частицы, содержащие векторный геном. Способы и применения по настоящему изобретению широко применимы к болезням, поддающимся лечению введением гена, кодирующего белок, или увеличением или стимулированием экспрессии или функции гена, например, добавлением или заменой гена. Способы и применения по настоящему изобретению также широко применимы к болезням, поддающимся лечению путем уменьшения или снижения экспрессии или функции гена, например, нокаута гена или снижение экспрессии гена (нокдаун гена).

[0112] Не лимитирующие конкретные примеры болезней, поддающихся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают те, которые изложены в настоящем документе а также болезнь легких (например муковисцидоз), патологию свертываемости или геморрагическую крови (например, гемофилия А или гемофилия В с или без ингибиторов), талассемию, патологию крови (например, анемия), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический латеральный склероз (ALS), эпилепсию, лизосомную болезнь накопления, нарушения накопления меди или железа (например, болезнь Вильсона или Менкеса), дефицит лизосомальной кислой липазы, неврологические или нейродегенеративные патологии, рак, диабеты типа I или 2, болезнь Гоше, болезнь Гурлера, дефицит аденозиндезаминазы, метаболические дефекты (например, болезни накопления гликогена), дегенеративные болезни сетчатки (такие как дефицит или дефект RPE65, хороидеремия и другие заболевания глаза) и болезни целых органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца).

[0113] Кроме того, по изобретению рекомбинантные векторные (например, AVV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, способы и применения могут применяться для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих моноклональные антитела или их части, для предоставления полезных биологических эффектов для лечения или улучшения симптомов, связанных с раками, инфекционными заболеваниями и аутоиммунными заболеваниями, как, например, ревматоидный артрит.

[0114] В одном из вариантов осуществления изобретения способ или применение по настоящему изобретению включает: (а) предоставление вирусной частицы, содержащей по изобретению векторный геном, вектор, содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность, и филлер/спейсерную полинуклеотидную последовательность, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность функционально связана с элементом, управляющим экспрессией, обеспечивающим транскрипцию указанной полинуклеотидной последовательности так, что объединенная длина имеет суммарную длину около 3,0-5,5 Кб или около 4,0-5,0 Кб, или около 4,3-4,8 Кб; и (б) введение дозы вирусной частицы млекопитающему так, чтобы указанный гетерологичный полинуклеотид экспрессировался в млекопитающем. В частных аспектах экспрессия гетерологичного полинуклеотида кодирует белок или ингибиторную нуклеиновую кислоту, что обеспечивает терапевтическую пользу млекопитающему (например, человеку).

[0115] В другом варианте осуществления изобретения способ или использование по настоящему изобретению включает доставку или трансфекцию гетерологичной полинуклеотидной последовательности в млекопитающее или клетку млекопитающего путем введения вирусной (например, AAV) частицы или множества вирусных (например, AAV) частиц, содержащих по изобретению векторный геном, вектор, содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность, и филлер/спейсерную полинуклеотидную последовательность, в результате чего объединенная длина имеет общую длину между около 3,0-5,5 Кб, или между около 4,0-5,0 Кб, или между около 4,3-4,8 Кб, млекопитающему или в клетку млекопитающего, таким образом, доставляя или трансфицируя гетерологичную полинуклеотидную последовательность млекопитающему или в клетку млекопитающего.

[0116] Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения способ или использование по настоящему изобретению для лечения дефицита у млекопитающего, нуждающегося в экспрессии или функционировании белка, включает предоставление вирусной (например, AAV) частицы или множества вирусных (например, AAV) частиц, содержащих по изобретению векторный геном, вектор, содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность, и филлер/спейсерную полинуклеотидную последовательность, в результате чего объединенная длина имеет общую длину между около 3,0-5,5 Кб, или между около 4,0-5,0 Кб, или между около 4,3-4,8 Кб; и введение вирусной частицы или множества вирусных частиц млекопитающему, когда последовательность гетерологичного полинуклеотида кодирует белок, экспрессируемый в млекопитающем, или когда последовательность гетерологичного полинуклеотида кодирует ингибиторную последовательность или белок, который уменьшает экспрессию эндогенного белка у млекопитающего.

[0117] Способы и использования по настоящему изобретению включают способы лечения, которые приводят к любому терапевтическому или полезному действию. В ряде способов и применений по изобретению, также включенными являются ингибирование, уменьшение или снижение одного или более неблагоприятных (например, физических) симптомов, патологий, заболеваний, болезней или осложнений, вызванных или ассоциированных с болезнью, как, например, сниженное времени свертываемости крови, сниженная доза введения дополнительного белкового фактора свертываемости крови.

[0118] Терапевтическое или полезное действие лечения является, таким образом, любым объективным или индивидивным измеряемым или определяемым улучшением или пользой, предоставленной конкретному индивиду. Терапевтическое или полезное действие может, но не нуждается, быть полным удалением всех или любого конкретного неблагоприятного симптома, патологии, заболевания или осложнения болезни. Таким образом, удовлетворяющий клинический конечный показатель достигается, когда существует поступательное улучшение или частичное снижение неблагоприятного симптома, патологии, заболевания или осложнения, вызванных или ассоциированных с болезнью или ингибированием, снижением, уменьшением, супрессией, предотвращением, ограничением или контролем ухудшения или прогресса одного или более неблагоприятных симптомов, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или ассоциированных с болезнью, короткой или длинной продолжительности (часы, дни, недели, месяцы и т.д.).

[0119] Векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы, содержащие векторные геномы, способы и использования по настоящему изобретению могут быть введены индивиду, нуждающемуся в них в достаточном или эффективном количестве. «Эффективное количество» или «достаточное количество» относится к количеству, которое предоставляет в одной или многократных дозах одно или в комбинации с одной или более других композиций (терапевтических средств, таких как лекарство), в лечениях, протоколах, средствах терапевтических регламентов, детектируемый ответ за любую продолжительность времени (длинный или короткий срок), ожидаемый или желательный результат, или пользу для индивида при любом измеряемом или детектируемом уровне или в течение любой продолжительности времени (например, в течение минут, часов, дней, месяцев, лет или вылеченных).

[0120] Доза векторного генома или вирусной (например, AAV) частицы для достижения терапевтического эффекта, например, доза векторного генома/на килограмм массы тела (векторный геном/килограмм, вг/кг), будет варьировать в зависимости от ряда факторов, включающих, но не лимитирующихся этим: путь введения, уровень экспрессии гетерологичного полинуклеотида, требуемый для достижения терапевтического эффекта, леченную специфическую болезнь хозяина, любой иммунный ответ хозяина на вирусный вектор, иммунный ответ хозяина на гетерологичный полинуклеотид или продукт экспрессии (белок) и стабильность экспрессированного белка. Специалист в данной области может легко определить диапазон дозы вириона для лечения пациента, имеющего конкретную болезнь или патологию, основанный на вышеуказанных факторах, а также других факторах. Обычно, для достижения терапевтического эффекта, дозы будут находиться в интервале от, по крайней мере, 1×10⁸ или более, например, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³ или 1×10¹⁴ или более векторных геномов на килограмм (вг/кг) массы индивида.

[0121] Используя гемофилию в качестве примера, говоря в общем, можно полагать, что с целью достижения терапевтического эффекта концентрация фактора свертываемости крови, которая составляет меньше чем 1% от концентрации фактора, обнаруживаемого у нормального индивидуума, нуждается в изменении тяжелого фенотипа болезни на умеренный. Тяжелый фенотип характеризуется соединением повреждения и угрожающих жизни кровотечений. Считается что для перевода фенотипа болезни средней тяжести в легкую необходима концентрация фактора свертываемости крови выше, чем 5% от нормальной. По отношению к лечению таких индивидов с гемофилией, для достижения требуемого терапевтического эффекта типичная доза составляет, по крайней мере, 1×10¹⁰ векторных геномов (в/г) на килограмм (вг/кг) массы индивида, или между около от 1×10¹⁰ до 1×10¹¹ вг/кг веса индивида, или между около от 1×10¹¹ до 1×10¹² вг/кг веса индивида, или между около от 1×10¹² до 1×10¹³ вг/кг веса индивида.

[0122] Дозы в «эффективном количестве» или «достаточном количестве» для лечения (например, для улучшения или для предоставления терапевтической пользы или улучшения) типично являются эффективными для обеспечения ответа на один, многие или все неблагоприятные симптомы, последствия или осложнения болезни, одному или более неблагоприятным симптомам, нарушениям, болезням, патологиям или осложнениям, например, вызванным или ассоциированным с болезнью, до измеряемой величины, однако, снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение или контролирование прогрессии или ухудшения болезни является удовлетворительным результатом.

[0123] Эффективное количество или достаточное количество может, но не обязано, быть предоставленным однократным введением, может требовать многократные введения и может, но не обязано, быть введено одно или в комбинации с другой композицией (например, препаратом), лечением, протоколом или терапевтическим регламентом. Например, количество может быть пропорционально увеличено, как требуется необходимостью индивида, типом, статусом и тяжестью болезни, которую лечат, или побочными эффектами (если есть) лечения. Кроме того, эффективное количество или достаточное количество не обязано быть эффективным или достаточным, если дается в однократной или многократной дозах без второй композиции (например, лекарства или препарата), лечения, протокола или терапевтического регламента, так как дополнительные дозы, количества или продолжительность выше и за пределами таких доз, или дополнительные композиции (например, лекарства или препараты), лечения, протоколы или терапевтические регламенты могут быть включены для того, чтобы считаться эффективными или достаточными у принимающего индивида. Количества, считающиеся эффективными, также включают количества, которые приводят к снижению использования другого лечения, терапевтического регламента или протокола, как, например, введение рекомбинантного белка фактора свертываемости крови для лечения нарушений свертываемости (например, гемофилии А или В).

[0124] Эффективное количество или достаточное количество не обязано быть эффективным у каждого леченого индивида, ни у большинства леченых индивидов в данной группе популяции. Эффективное количество или достаточное количество означает эффективность или достаточность у конкретного индивида, не группы или основной популяции. Как типично для таких способов, некоторые индивиды будут проявлять более высокий отклик или менее или не будут проявлять отклик на данное лечение или использование. Таким образом, подходящее количество будет зависеть от условий лечения, требуемого терапевтического эффекта, а также индивидуальности индивида (например, биодоступности у индивида, пола, возраста и т.д.).

[0125] Термин «улучшать» означает детектируемое или измеряемое улучшение в болезни индивида или ее симптомов, или лежащий в основе клеточный ответ. Детектируемое или измеряемое улучшение включает индивидивное или объективное уменьшение, снижение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль в проявлении, частоте, тяжести, прогрессировании или продолжительности болезни или осложнения, вызванного или связанного с болезнью или усилением симптома или лежащей в основе причины или последствием болезни или возвращением болезни.

[0126] Таким образом, успешный результат лечения может приводить к «терапевтическому эффекту» или «пользе» в уменьшении, снижении, ингибировании, подавлении, ограничении, контроле или предотвращении появления, частоты, тяжести, прогрессии или продолжительности болезни или одного или более неблагоприятных симптомов или лежащих в основе причин или последствий болезни у индивида. Способы и применения лечения, воздействующие на одну или более лежащих в основе причин болезни или неблагоприятных симптомов, считаются, таким образом, эффективными. Уменьшение или снижение ухудшений, как, например, стабилизация болезни или ее неблагоприятных симптомов, является также успешным результатом лечения.

[0127] Терапевтический эффект или улучшение вследствие этого не обязаны быть полностью удаленной болезнью или любого одного, большей части или всех неблагоприятных симптомов, осложнений, последствий, или лежащих в основе причин, связанных с болезнью. Таким образом, удовлетворительный результат достигается, когда существует возрастающее улучшение в болезни индивида или частичное снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение, контроль или предотвращение в появлении, частоте, тяжести, прогрессии, или продолжительности или ингибировании или возврата болезни (например, стабилизации одного или более симптомов или осложнений) в течение короткой или длительной продолжительности времени (часы, дни, недели, месяцы и т.д.). Эффективность способа или использования, как например, лечения, которое предоставляет потенциальный лечебный эффект или улучшение болезни, может быть установлена рядом методов.

[0128] По изобретению способы и использования могут быть объединены с любым веществом, препаратом, лекарством, лечением или другим терапевтическим регламентом или протоколом, имеющими требуемую терапевтическую, полезную, суммарную, синергистическую, или комплементарную активность или эффект. Примеры комбинаций композиций и лечений включают вторые активные вещества, такие как биологические вещества (белки), препараты или лекарства. Такие биологические вещества (белки), препараты или лекарства, лечения и терапии могут вводиться или осуществляться до, в основном одновременно с или следуя за любым другим способом или использованием изобретения, например, терапевтическим способом лечения индивида от болезни свертываемости крови.

[0129] Вещество, препарат, лекарство, лечение или другой терапевтический регламент или протокол могут быть применены в виде комбинированной композиции или применяться раздельно, как, например, доставка или введение векторного генома или вирусной (например, AAV) частицы по изобретению конкурентно, или партиями, или последовательно (до или после). Таким образом, изобретение предоставляет комбинации, в которых способ или применение по изобретению находится в комбинации с любым веществом, средством, лекарством, терапевтическим регламентом, протоколом лечения, процессом, препаратом или композицией, в порядке, предусмотренным настоящим документом или известном специалисту в данной области. Вещество, средство, лекарство, терапевтический регламент, протокол лечения, процесс, препарат или композиция могут применяться или осуществляться до, в основном одновременно с или после применения векторного генома или вирусной (например, AAV) частицы по настоящему изобретению индивиду. Конкретные не лимитирующие примеры комбинации вариантов, таким образом, включают вышеуказанное или другое вещество, средство, лекарство, терапевтический регламент, протокол лечения, процесс, препарат или композицию.

[0130] Способы и использования по изобретению также включают, среди других вещей, способы и использования, которые приводят к уменьшению необходимости или использования другого соединения, средства, лекарства, терапевтического регламента, протокола лечения, процесса или препарата. Например, при болезни свертываемости крови, способ или использование по изобретению имеет терапевтическую пользу для индивида, если у заданного индивида менее частая или уменьшенная доза или прекращение применения рекомбинантного белка фактора свертываемости для дополнения при дефиците или дефектном (ненормальном или мутантном) эндогенном факторе свертываемости. Таким образом, в соответствии с изобретением, предоставляются способы и использования сокращения нужды или использования другого лечения или терапии.

[0131] Изобретение полезно для животных, включая ветеринарные медицинские применения. Подходящие индивиды, следовательно, включают млекопитающих, как, например, человек, а также не человеческих млекопитающих. Термин «индивид» относится к животному, обычно млекопитающему, как, например, человек, не человеческие приматы (обезьяны, гиббоны, гориллы, шимпанзе, орангутанги, макаки), домашние животные (собаки и коты), сельскохозяйственные животные (птицы например куры и утки, лошади, коровы, козы, овцы, свиньи) и экспериментальные животные (мышь, крыса, кролик, морская свинка). Человеческие индивиды включают плод, новорожденного, ребенка, подростка и взрослого индивида. Индивиды включают модели болезней животных, например, мышиную и другие животные модели болезней свертываемости крови и другие модели животных заболеваний свертываемости крови, и другие, известные специалисту в данной области.

[0132] В порядке, предусмотренном настоящим документом, по изобретению векторы и вирусные частицы, содержащие такие векторы, могут быть использованы для предоставления белка индивиду, который имеет недостаточное количество белка или дефицит функционального генного продукта (белка), или предоставления ингибиторной нуклеиновой кислоты или белка индивиду, который производит неправильный, частично функциональный или не функциональный генный продукт (белок), что может привести к болезни. Индивиды, подходящие для лечения в соответствии с настоящим изобретением, включают тех, кто имеет или находится в риске производства неправильного или дефектного (мутантного) генного продукта (белка), что приводит к болезни, такой, что уменьшение количества, экспрессии или функции неправильного или дефективного (мутантного) генного продукта (белка) может привести к лечению заболевания или уменьшению одного или более симптомов или улучшению болезни. Целевые индивиды, таким образом, включают индивиды, которые имеют такие дефекты, независимо от типа болезни, сроков или степени начала, прогрессии, тяжести, частоты, или типа, или продолжительности симптомов.

[0133] «Профилактика» и ее грамматические вариации означает способ, в котором прием, применение или in vivo доставка индивиду происходит до болезни. Прием, применение или in vivo доставка индивиду может осуществляться до развития неблагоприятного синдрома, состояния, осложнения и т.д., вызванных или связанных с болезнью. Например, скрининг (например, генетический) может быть использован для выявления таких индивидов, как кандидаты для способов и применений по изобретению, но болезнь может не проявляться у индивида. Такие индивиды, вследствие этого, включают тех, кто скринирован положительно на недостаточное количество или дефицит в функциональном генном продукте (белке), или у кого продуцируется аномальный, частично функциональный или нефункциональный генный продукт (белок), что может привести к болезни; и индивиды, которые скринированы положительно на аномальный или дефектный (мутантный) генный продукт (белок), который ведет к болезни, даже хотя у таких индивидов не проявляются симптомы болезни.

[0134] Способы и применения по настоящему изобретению включают доставку и применение систематично, регионально или локально, или любым путем, например, путем инъекции, инфузии, орально (например, прием внутрь или ингаляция) или наружно (например, трансдермально). Такая доставка и применение включают внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную, подкожную, внутриполостную, внутричерепную, трансдермальную (наружную), парентеральную, например, трансмукозальную или ректальную. Примеры путей применения и доставки включают внутривенную (вв), внутрибрюшинную (вб), внутриартериальную, внутримышечную, парентеральную, подкожную, внутрилегочную, наружную, дермальную, внутрикожную, трансдермальную, парентеральную, например, трансмукозальную, внутричерепную, внутриспинальную, оральную (с питанием), мукозальную, дыхательную, внутриназальную, интубацию, внутрилегочную, внутрилегочную инстилляцию, щечную, подъязычную, внутрисосудистую, интратекальную, внутриполостную, ионтофоретическую, внутриокулярную, офтальмическую, глазную, внутрижелезестую, внутриорганную, внутрилимфатическую.

[0135] Дозы могут варьировать и зависеть от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, типа, начала, прогрессии, тяжести, частоты, продолжительности, или возможности болезни, на которую направлено лечение, желаемого клинического эффекта, предыдущих или текущих лечений, общего здоровья, возраста, пола, расы или иммунологической компетентности индивида и других факторов, которые будут приняты во внимание специалистом в данной области. Количество доз, число, частота или продолжительность могут быть пропорционально увеличены или уменьшены, как указано любыми нежелательными побочными эффектами, осложнениями или другими факторами риска лечения или терапии и состоянием индивида. Специалист в данной области примет во внимание эти факторы, которые могут влиять на дозировку и хронометраж, требуемые для предоставления достаточного количества для предоставления терапевтической или профилактической пользы.

[0136] Способы и использования по настоящему изобретению, как раскрыто в настоящем документе, могут быть употреблены в порядке, предусмотренном настоящим документом, в течение 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 или 24-72 часов после того, как было идентифицировано, что индивид имеет заболевание, на которое направлено лечение, имеет один или более симптомов заболевания, или был скринирован и определяется как положительный, даже если индивид не имеет один или более симптомов болезни. Без сомнения, способы и применения по настоящему изобретению могут быть использованы на практике в порядке, предусмотренном настоящим изобретением, 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 или более дней, месяцы или годы, после того как индивид был выявлен как имеющий заболевание, предназначенное для лечения, имеет один или более симптомов болезни, или был скринирован и выявлен как положительный.

[0137] Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы (например, AAV) и другие композиции, средства, лекарства, биологические вещества (белки) могут быть включены в фармацевтические композиции, например, фармацевтически приемлемые носители или наполнители. Такие фармацевтические композиции являются полезными, среди прочего, для введения и доставки индивиду in vivo или ex vivo.

[0138] Как используется в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый» и «физиологически приемлемый означает биологически приемлемый препарат, газовый, жидкость или твердое вещество, или их смесь, который является подходящим для одного или более путей введения, доставки in vivo или приема. «Фармацевтически приемлемая» и «физиологически приемлемая» композиция является веществом, которое не является биологически или по другому нежелательным, например, вещество может быть введено индивиду без вызывания существенных нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такая фармацевтическая композиция может быть использована, например, при введении индивиду вирусного вектора или вирусной частицы или трансформированной клетки.

[0139] Такие композиции включают растворители (водные или неводные), растворы (водные или неводные), эмульсии (например, масло в воде или вода в масле), суспензии, сиропы, эликсиры, дисперсионные и суспензионные среды, покрытия, изотонические и абсорбционные вещества, улучшающие или задерживающие абсорбцию, совместимые с фармацевтическим применением или in vivo приемом или доставкой. Водные и неводные растворители, растворы и суспензии могут включать суспензирующие вещества и загустители. Такие фармацевтически приемлемые носители включают таблетки, (покрытые или непокрытые), капсулы (твердые или мягкие), микробусины, порошок, гранулы и кристаллы. Активные дополнительные вещества (например, консерванты, антибактериальные, антивирусные и антигрибковые вещества) могут быть также включены в композиции.

[0140] Фармацевтические композиции могут быть составлены так, чтобы быть совместимыми с конкретным путем введения или доставки, в порядке, предусмотренном в настоящем документе или известном специалисту в данной области. Таким образом, фармацевтические композиции включают носители, разбавители или наполнители, подходящие для введения различными путями.

[0141] Композиции, подходящие для парентерального введения, составляют водные и неводные растворы, суспензии и эмульсии активного вещества, композиции которых обычно являются стерильными и могут быть изотоническими с кровью предполагаемого реципиента. Не лимитирующие иллюстративные примеры включают воду, физиологический раствор, декстрозу, фруктозу, этанол, масла животного, растительного или синтетического происхождения.

[0142] Для трансмукозального или трансдермального введения (например, наружного применения) в фармацевтическую композицию могут быть включены вещества, способствующие проницаемости. Вещества, способствующие проницаемости, известны в данной области и включают, например для трансмукозального введения, детергенты, соли желчной кислоты и производные фусидовой кислоты. Для трансдермального введения активный ингредиент может быть составлен в аэрозолях, спреях, мазях, кремах, гелях или жидких кремах, как, в общем, известно в данной области. Для контакта с кожей фармацевтические композиции обычно включают мази, жидкие кремы, лосьоны, пасты, гели, спреи, аэрозоли, жидкие масла. Носители, которые могут быть использованы, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоль, алкоголь, трансдермальные усилители и их комбинации.

[0143] Сорастворители и адъюванты могут быть добавлены в композицию. Не лимитирующие примеры сорастворителей содержат гидроксильные группы или другие полярные группы, например, алкоголи, как например, изопропиловый спирт; гликоли, как например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, гликолевый эфир; глицерол; полиоксиэтиленовые спирты и эфиры полиоксиэтиленовой жирной кислоты. Адъюванты включают, например, поверхностноактивные вещества, как, например, соевый лецитин и олеиновая кислота; эфиры сорбитана, как, например, триолеат сорбитана; и поливинилпирролидон.

[0144] Фармацевтические композиции и системы доставки, подходящие для векторных геномов, векторных частиц (например, AAV), и способы и использования по настоящему изобретению известны в данной области (смотри, например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remnington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merсk Index (1996) 12^th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc. Lancaster,Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11^th ed., Lippincot Wilams & Wilkins, Baltimore, MD; и Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R.L. Juliano, cd., Oxford, N.Y., pp 253-315).

[0145] «Форма с однократной дозировкой» в данном контексте относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократной дозировки для индивида, предназначенного для лечения; каждая единица содержит предопределенное количество в некоторых случаях в соединении с фармацевтическим носителем (эксципиентом, разбавителем, носителем или наполнителем), которая, когда вводится в одной или более доз, рассчитана произвести желаемый эффект (например, профилактический или терапевтический эффект). Формы с однократной дозировкой могут быть, например, в ампулах и пузырьках, которые могут включать жидкие композиции, или композицию в состоянии сушки замораживанием или лиофилизации; стерильный жидкий носитель, например, может быть добавлен до введения или доставки in vivo. Индивидуальные формы однократной дозировки могут быть включены в набор с многократными дозами или контейнеры. Рекомбинантные векторные (например, AAV) плазмиды, векторные геномы, рекомбинантные вирусные частицы (например, AAV) и их фармацевтические композиции могут быть упакованы в форме однократной или многократной дозировки для удобного применения и единообразия дозировки.

[0146] Настоящее изобретение предоставляет наборы с упаковочным материалом и одним или более компонентами в нем. Набор обычно включает бирку или упаковочный вкладыш, включающий описание компонентов или инструкцию для применения компонентов в нем in vitro, in vivo или ex vivo. Набор может содержать группу таких компонентов, например, векторного (например, AAV) генома или вирусной частицы (например, AAV) и, если требуется, второе активное вещество, как, например, другое вещество, средство, лекарство или композиция.

[0147] Набор относится к физической структуре, вмещающей один или более компонентов набора. Упаковочный материал может сохранять компоненты стерильно и может быть сделан из материала, обычно используемого для таких целей (например, бумаги, гофрированной фибры, стекла, пластика, фольги, ампул, пузырьков, пробирок и т.д.).

[0148] Бирки или упаковочные вкладыши могут включать идентифицирующую информацию об одном или более компонентах в нем, дозовых количествах, клинической фармакологии активного ингредиента(ов), включая механизм действия, фармакокинетиках и фармакодинамиках. Бирки или упаковочные вкладыши могут включать информацию, идентифицирующую производителя, номер лота, местонахождение производителя и дату, конечные сроки действия. Бирки или упаковочные вкладыши могут включать информацию о болезни, для которой компонент набора может быть использован. Бирки или упаковочные вкладыши могут включать инструкции для клиницистов или индивида по применению одного или более компонентов набора в способе, применении или протоколе лечения или терапевтическом регламенте. Инструкции могут включать дозировочные количества, частоту или продолжительность и инструкции для осуществления на практике любого из способов, применений, протоколов лечения или профилактики или терапевтических регламентов, описанных в настоящем документе.

[0149] Бирки или упаковочные вкладыши могут включать информацию о любой пользе, которую компонент может предоставить, как, например, в качестве профилактической или терапевтической пользы. Бирки или упаковочные вкладыши могут включать информацию о потенциальных неблагоприятных побочных эффектах, осложнениях или реакциях, как, например, предупреждение индивида или клинициста относительно ситуаций, где было бы не уместно использовать конкретную композицию. Неблагоприятные побочные эффекты или осложнения могут также возникнуть, когда индивид имеет, будет или принимает в настоящее время один или более других медикаментов, которые могут быть несовместимы с композицией, или индивид имеет, будет или подвергается в настоящее время другому протоколу лечения или терапевтическому регламенту, что может быть несовместимо с композицией, и, таким образом, инструкции могут включать информацию, касающуюся таких несовместимостей.

[0150] Бирки или упаковочные вкладыши включают «печатную информацию», например бумагу или картон, или отдельную или прикрепленную к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), или присоединенную к ампуле, пробирке или пузырьку, содержащим компонент набора. Бирки или упаковочные вкладыши могут кроме того включать читаемый компьютером носитель, как, например, бирку с напечатанным штрих-кодом, диск, оптический диск, как, например, CD или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитную ленту, или носитель электрического хранения памяти, как, например, RAM или ROM или их гибриды, такие как магнитные/оптические носители хранения информации, FLASH носители или карты типа памяти.

[0151] Если не определено другое, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что и обычно понимается специалистом в данной области, к которому настоящее изобретение относится. Хотя способы и материалы, похожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, могут использоваться при тренировке или проверке настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе.

[0152] Все применения, публикации, патенты и другие ссылки, GenBank цитирования и ATCC цитирования, процитированные в настоящем документе, включены путем ссылки в их полном объеме. В случае конфликта, описание изобретения, включающее определения, будет контролировать.

[0153] Все элементы, раскрытые в настоящем документе, могут быть объединены в любой комбинации. Любой элемент, раскрытый в описании изобретения, может быть заменен альтернативным элементом, служащим для того же, эквивалентным или похожим целям. Таким образом, если однозначно не указано противоположное, раскрытые элементы (например, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида, векторный геном или рекомбинантная вирусная частица (например, AAV)) являются примером вида эквивалента или похожих элементов.

[0154] В данном контексте формы единственного числа “a”, “and” и “the” включают множественные формы определяемого объекта, если в контексте ясно не указано обратное. Таким образом, например, ссылка на «”a” полинуклеотид» включает множество таких полинуклеотидов, ссылка на «”a” вектор» включает множество таких векторов и ссылка на «”a” вирус» или «частица» включает множество таких вирионов/частиц.

[0155] В данном контексте все цифровые величины или цифровые интервалы включают целые числа внутри таких интервалов и доли значений или целых чисел внутри интервалов, если контекст ясно не указывает обратное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка по крайней мере 80% идентичности включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% и etc., а также 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и так далее.

[0156] Ссылка на количество с более (больше) или менее чем включает любое количество соответственно больше чем или меньше чем упомянутое количество. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на менее чем 1000 включает 999, 998, 997 и т.д., до конца вплоть до количества один (1); и меньше чем 100 включает 99, 98, 97 и т.д., до конца вплоть до количества один (1).

[0157] В данном контексте все численные значения или диапазоны включают доли целых значений и целые числа внутри таких диапазонов и доли целых чисел внутри таких диапазонов, если контекст ясно не указывает обратное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на численный диапазон, такой как диапазон процентов, как, например, 1-10 включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д. Ссылка на диапазон от 1-50, следовательно, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., вплоть до и включая 50, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и так далее.

[0158] Ссылка на серии диапазонов включает диапазоны, которые комбинируют значения границ различных диапазонов внутри серий. Таким образом, для иллюстрации, ссылки на серии диапазонов в 11-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 15-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000, 8000-9000 включают диапазоны в 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.д.

[0159] Настоящее изобретение в целом раскрыто в настоящем документе с использованием утвердительного языка для описания многочисленных вариантов и аспектов настоящего изобретения. Изобретение также намеренно включает варианты осуществления изобретения, в которых исключено конкретное содержание изложения полностью или частично, как, например, вещества и материалы, этапы и условия способов, протоколы или процедуры. Например, в определенных вариантах или аспектах осуществления изобретения, материалы и/или этапы способов исключены. Таким образом, даже хотя настоящее изобретение в целом не выражено в настоящем документе в терминах, что настоящее изобретение не включает аспекты, которые не исключены однозначно в настоящем изобретении, являются, тем не менее, раскрытыми в настоящем документе.

[0160] Был описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, специалист в данной области может делать разнообразные изменения и модификации настоящего изобретения без отступления от существа и объема изобретения, для его адаптации к различным применениям и условиям. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не лимитируют объем формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

[0161] Этот пример включает описание ряда материалов и способов.

[0162] Стандартный ПЦР был проведен на плазмидной ДНК, содержащей геномную последовательность AAV вектора в качестве положительного контроля для ПЦР амплификации (Фигура 3, Панели А и В) и на геномной ДНК вектора, экстрагированной из препарата очищенного вектора (Фигура 2B Панели А и С для векторов с размерами геномов 2,7 Кб и 4,2 Кб, соответственно) и на геномной ДНК вектора, экстрагированной после обработки вектора ДНКазой I (Фигура 2, Панели B и D , размеры векторных геномов 2,7 Кб и 4,2 Кб, соответственно). Праймер, расположенный внутри кассеты трансгенной последовательности (красный круг на фигуре), был использован в каждой ПЦР реакции в паре-комбинации с набором праймеров, перекрывающих последовательность в трансгенной кассете и находящийся на конце участок основы плазмиды, содержащий ген устойчивости к антибиотику (KanR или AmpR). Реакции ПЦР были проанализированы с использованием электрофореза в 1% агароза/EtBr геле.

[0163] Данные для Фигуры 3, контроли для ПЦР амплификации, ДНК плазмиды: ПЦР фрагменты были получены для всех пар праймеров (9 пар праймеров, Панель A и В), когда в качестве матрицы была использована ДНК плазмиды, предполагая, что все пары праймеров, используемые в исследовании, образуют ПЦР продукты. Все ПЦР продукты были ожидаемого размера, как было предсказано, основываясь на плазмидной последовательности и расположении праймеров. Как и ожидалось, не наблюдалось ПЦР амплификации, когда образец плазмиды был обработан до ПЦР ДНКазой I (Панель С).

[0164] Данные для Фигуры 2: Только набор пар праймеров образовывал ПЦР продукты в экспериментах, когда ПЦР был проведен на ДНК, экстрагированной из очищенного вектора (6 пар праймеров для вектора с коротким 2,7 Кб геномом (Панели А и В) и 4 пары праймеров для вектора с длинным 4,2 Кб геномом (Панели C и D)). Максимальный размер продукта ПЦР (объединенный с последовательностью векторного генома за пределами ПЦР ампликона) указывал на то, что максимальный размер амплифицированной ДНК соответствует упаковочной емкости AAV вируса (4,5 Кб).

[0165] Обработка препарата вектора ДНКазой I до экстракции ДНК из вектора (Фигура 2 Панели В и D) не изменяла паттерн ПЦР амплификации (Фигура 2, Панели А и С, в сравнении с панелями В и D, соответственно): число пар праймеров, образующих ПЦР продукт и размеры ПЦР продукта не изменились, из чего можно предположить, что последовательности, амплифицированные при ПЦР (векторный геном или фланкирующие последовательности), защищены от ДНКазы, заключены в капсид.

[0166] Размер заключенной в капсид ДНК (например, размер устойчивой к ДНКазе ДНК основы плазмиды, объединенной с векторным геномом) был сравним с векторами короткого и длинного генома и приблизительно соответствовал упаковочной емкости AAV вектора (4,5 Кб). Упаковка ДНК в вектор с коротким геномом включала последовательности плазмиды, фланкирующие геном, указывая на то, что векторы с короткими геномами упаковывают последовательности плазмиды вплоть до полной упаковочной емкости AAV вируса.

Пример 2

[0167] Этот пример включает описание производства и очистки рекомбинантных AAV векторов с использованием GMP-адекватного процесса производства.

[0168] Уровни остаточной плазмидной ДНК были оценены в сериях AAV2 векторов, содержащих одноцепочечные трансгенные экспрессионные кассеты, которые располагались в ряд по размеру следующим образом: rAAV A: 2,7 Кб (57% размера дикого типа); rAAV B: 3,7 Кб (83% от дикого типа); и rAAV C: 4,3 Кб (91% от дикого типа). Множественные партии каждой из конструкций были произведены и очищены с использованием тех же процессов. Векторы были произведены свободной трансфекцией клеток HEK293 хелперным вирусом и были очищены комбинацией катионообменной хроматографии (foros SOHS) и ультрацентрифугированием в цезии хлориде isOQVCnic.

[0169] Концентрация остаточной плазмидной ДНК была измерена в KanR копиях на мл препарата вектора и затем выражена в % от векторных геномов (вг) или пг на 10⁹ вг, основываясь на допущении, что каждая копия KanR (AmpR) представляет полную копию плазмиды (наихудший случай сценария). Векторные титры и концентрация остаточной ДНК плазмиды были измерены количественной ПЦР в реальном времени (aPCR) c TaqMan технологией, в соответствии с протоколом проведения, с использованием праймеров и зондов, специфичных к KanR или AmpR гену, расположенному в основной части трансгенной плазмиды в непосредственной близости к 5’ ITR трансгенной кассеты.

[0170] В исследованиях с ДНКазой 1×10⁶ векторного генома или копий плазмиды были расщеплены 5 Ед ДНКазы I. Амплификация была проведена стандартной ПЦР с использованием 500 векторного генома или копий плазмиды для ПЦР реакции. Примеси плазмидной ДНК в AAV векторах с короткой трансгенной кассетой были устойчивы к ДНКазе, указывая на заключение в капсид фрагментов плазмидной ДНК, расположенных в непосредственной близости к ITR плазмидного вектора.

[0171] Консервативный способ был использован для количественного определения остаточной плазмидной ДНК, основанный на измерении в векторных образцах числа копий для ампликонов-мишеней кПЦР; а именно число копий было увеличено Мм плазмиды. Уровень примесей, как функции размера трансгенной кассеты, просуммирован на Фигуре 1. Оценка показала, что rAAV A (размером 2,7 Кб) содержала 164 пг/10⁹ вг (n=9) остаточной плазмидной ДНК; rAAV B (размером 3,7 Кб) содержала 42,7 пг/10⁹ вг (n 32); и rAAV С (размером 4,3 Кб) содержала 14,0 пг/10⁹ вг (n 29).

[0172] Также упаковка ДНК «основы» векторной плазмиды происходит в значительной степени через «обратную упаковке» от ITRs, которая значительно уменьшается при использовании основы с превышенным размером (>4,7 Кб) (Фигура 5).

Пример 3

[0173] Этот пример включает описание исследований, показывающих примеси ДНК с вектором, приготовленным без основы с превышенным размером по сравнению с векторами с использованием основы с превышенным размером.

[0174] Серии из 12 партий рекомбинантных AAV векторов были приготовлены с использованием тех же способов, основанных на производстве вектора путем транзиентной трансфекции клеток 293 почки эмбриона человека в соответствии со следующим способом производства и очистки вектора:

Производство вектора в HEK293 клеточной культуре:

1. Первый пассаж клеточной культуры HEK293 клеток Master Cell Bank в T75 колбах

↓

2. Пассаж клеток в ~2 Т225 колбы.

↓

3. Пассаж клеток в ~2 роллер-флакона

↓

4. Пассаж клеток в~ 10 роллер-флаконов

↓

5. Пассаж клеток в ~102 роллер-флакона

↓

6. Трансфекция клеток плазмидной ДНК, включая векторную плазмиду с или без сверхразмерной векторной основой

↓

7. Замена свободной среды на сыворотку

Очистка вектора (даунстрим):

8. Сбор клеток, содержащих вектор, и клеточной культуры

↓

9. Концентрация и диафильтрование собранного продукта путем тангенциальной поточной фильтрации (TFF) (100 Кд)

↓

10. Микрофлюидизация концентрированного продукта

↓

11. Фильтрация микрофлюидизированного промежуточного продукта (0,65 мк/0,2 мк серийного размера пор)

↓

12. Очистка путем ионообменной хроматографии

↓

13. Очистка центрифугированием в градиенте хлорида цезия isopycnic

↓

14. Замена буфера путем TFF (100 кД)

↓

15. Составление и 0,2мк фильтрация для изготовления очищенного основного объема вектора

↓

16. Окончательная 0,2 мк фильтрация, заполнение флаконов и окончание для приготовления разлитого по флаконам вектора.

[0175] Образцы из 9 очищенных партий вектора, приготовленных с использованием векторной плазмиды-продукта с основой с превышенным размером, и трех, произведенных с использованием плазмиды-продукта с основой со свойством не превышенного размера были подвергнуты измерению остатков плазмидной ДНК хозяина, что было определено путем измерений кПЦР уровней остаточных генов устойчивости к ампициллину и канамицину, содержащихся в участках плазмиды-продукта, которые не подразумеваются быть частью очищенного векторного продукта (и являются, таким образом, примесями). Способ, использованный для измерения примесей, описан далее:

Остаточная плазмидная ДНК путем кПЦР в реальном времени.

[0176] TaqMan^® процедура кПЦР в реальном времени описывает использование мишень-специфичных праймеров и зондов кПЦР, для определения специфичных последовательностей в плазмидах-продуктах (Amp^R или Kan^R), использованных для производства вектора. В случаях, в которых одна мишень была общей для всех плазмид, использованных для производства векторов, суммарную остаточную плазмиду определяли в единичном кПЦР анализе. В случае, когда оба Amp^R или Kan^R присутствовали в одной или более плазмидах-продуктах для данной партии, суммарная остаточная плазмида была рассчитана как сумма остаточной Amp^R и остаточной Kan^R ДНК, каждой определенной в отдельном анализе. Для каждой партии, описанной в этом примере:

1. Приготовлены три независимых разведения опытных образцов и референсного вектора в кПЦР буфере для разведения.

2. Рассчитывают число копий на лунку, основанное на угловых коэффициентах стандартной кривой (Ct vs. LOG (число копий каждого стандарта). Неизвестное = 10^{(Сt-отрезок)/уклон}. Корреляционный коэффициент (Pearson R²) стандартов отражает среднее Ct значение для каждого стандарта vs LOG (число копий каждого стандарта).

3. Рассчитана концентрация ампликона в каждом из трех разведений опытных образцов, в каждом из трех разведений референсного вектора и средняя концентрация, соответственно:

Amp^R или Kan^R [копии/мл] = Среднее [копии/лунка или 5 мкл]×200×фактор разведения

4. Перевод концентрации числа копий в массу (например, пг/мл) может быть осуществлен с использованием допущения о среднем размере копий остаточной плазмидной ДНК.

[0177] Результирующий уровень примесей остаточной плазмидной ДНК в 12 измерениях, показанный на Фигуре 6, указывал, что средний уровень в 301 пг примесей плазмидной ДНК на 10⁹ векторного генома был в 5 раз больше в векторах, произведенных с использованием векторной плазмиды без (отсутствует) основы с превышенным размером по сравнению со средним, измеренным в векторах, произведенных с использованием основы с превышенном размером, который был 60 пг примесей ДНК на 10⁹ вг. Таким образом, основа векторной плазмиды с превышенным размером может быть использована для снижения примесей в препаратах вирусного вектора.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана рекомбинантная векторная плазмида для переноса и доставки гетерогенной полинуклеотидной последовательности в клетку млекопитающего, содержащая: векторный геном аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность и последовательность контроля экспрессии, которая запускает тренскрипцию гереологичной полинуклеотидной последовательности; и основную последовательность, содержащую первую инертную полинуклеотидную последовательность филлера или спейсерную полинуклеотидную последовательность, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность в длину составляет менее 4,7 Кб и расположена между двух последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), где указанная первая инертная полинуклеотидная последовательность филлера или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами ITR AAV и имеет длину 4,5-10 Кб или 6-8 Кб и где длина указанной основной последовательности составляет по меньшей мере 7,0 Кб. Указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, который предоставляют терапевтическую пользу, или кодирует ингибиторную нуклеиновую кислоту, которая уменьшает или ингибирует экспрессию нежелательного или дефектного гена. Изобретение снижает примеси остаточной плазмидной ДНК. 9 н. и 33 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Рекомбинантная векторная плазмида для доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности в клетку млекопитающего, содержащая:

векторный геном аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность и последовательность контроля экспрессии, которая запускает транскрипцию гетерологичной полинуклеотидной последовательности; и

основную последовательность, содержащую полинуклеотидную последовательность первого инертного филлера или спейсера, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность составляет в длину менее 4,7 Кб и расположена между двух последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), где указанная полинуклеотидная последовательность первого инертного филлера или спейсера расположена за пределами ITR AAV и имеет длину 4,5-10 Кб или 6-8 Кб и где длина указанной основной последовательности составляет по меньшей мере 7,0 Кб; и

где указанный гетерологичный полинуклеотид кодирует белок, который предоставляет терапевтическую пользу, или кодирует ингибиторную нуклеиновую кислоту, которая уменьшает или ингибирует экспрессию нежелательного или дефектного гена.

2. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, дополнительно содержащая полинуклеотидную последовательность второго инертного филлера или спейсера, расположенную между двух последовательностей ITR аденоассоциированного вируса (AAV), где длина указанной полинуклеотидной последовательности второго инертного филлера или спейсера составляет меньше 4,7 Кб.

3. Рекомбинантная векторная плазмида по п.2, где указанная полинуклеотидная последовательность второго инертного филлера или спейсера является интроном, относящимся или не относящимся к гетерологичной полинуклеотидной последовательности.

4. Рекомбинантная векторная плазмида по п.2, где указанная полинуклеотидная последовательность первого или второго инертного филлера или спейсера содержит полинуклеотидную последовательность, которая не является бактериальной полинуклеотидной последовательностью.

5. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где указанная полинуклеотидная последовательность первого или второго интертного филлера или спейсера содержит последовательность, которая отличается от любой из следующих: гетерологичной полинуклеотидной последовательности, последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, элемента контроля экспрессии, точки начала репликации, маркера селекции или полиадениновой последовательности.

6. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где указанная полинуклеотидная последовательность первого инертного филлера или спейсера содержит последовательность длиной 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000 нуклеотидов.

7. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок.

8. Рекомбинантная векторная плазмида по п.7, где указанный терапевтический белок является фактором свертываемости крови.

9. Рекомбинантная векторная плазмида по п.7, где указанный терапевтический белок представляет собой CFTR (белок трансмембранного регулятора муковисцидоза), Фактор XIII, Фактор IX, Фактор X, Фактор VIII, Фактор VIIa или белок C, антитело, специфичный белок пигментного эпителия сетчатки массой 65 кД (RPE65), эритропоэтин, рецептор LDL, липопротеинлипазу, орнитинтраскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндеаминазу (ADA), переносчик ионов металлов (ATP7A или ATP7), сульфамидазу, фермент, участвующий в лизосомальной болезни накопления (ARSA), гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомальную гексозаминидазу, дегидрогеназу с разветвленной цепью кетокислоты, гормон, фактор роста (например, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор -3 и -4, нейротрофический фактор мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β и тому подобное), цитокин (например, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и тому подобное), продукт суициального гена, (например, тимидинкиназа вируса простого герпеса, цитозиндеаминаза, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназа, фактор некроза опухоли и тому подобное), белок лекарственной устойчивости (например, белок, который делает лекарство, используемое при терапии рака, устойчивым), белок-супрессор опухолей (например, р53, Rb, Wt-1, NF1, болезнь фон Гиппеля-Линдау (VHL), аденоматозный полипоз кишки (APC)), пептид с иммуномодулирующими свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitope или hCDR1, инсулин, глюкокиназу, гуанилатциклазу 2D (LCA-GUCY2D), Rab сопровождающий белок 1 (хороидеремия), LCA 5 (LCA-леберцилин), орнитин-кетокислота аминотрансферазу (аторофия гирате), ретиношизин 1 (Х-сцепленный ретиношизис), USH1C (синдром Ашера 1C), ГФА-азу Х-сцепленного пигментного ретинита (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментный ретинит), DFNB1 (коннексин-26-связанная глухота), ACHM 2, 3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 ил PKD-2 (поликистоз почек), TPP1, CLN2, дефицит генов, вызывающий лизосомальные болезни накопления (например, сульфатазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансфераза, катепсин А, GM2-AP, NPC1, VPC2, белки-активаторы сфинголипидов и тому подобное), одну или несколько нуклеаз цинкового пальца для редактирования генома или донорные последовательности, используемые в качестве шаблонов восстановления для редактирования генома.

10. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотид, который, если транскрибирован, транскрибирован в РНК.

11. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность представляет собой полинуклеотид, который, если транскрибирован, транскрибирован в ингибиторную нуклеиновую кислоту (например, ингибиторную РНК).

12. Рекомбинантная векторная плазмида по п.11, где указанная ингибиторная нуклеиновая кислота содержит одноцепочечную последовательность или образует двух- или трехцепочечную последовательность.

13. Рекомбинантная векторная плазмида по п.11, в котором указанная ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой микро-РНК (мкРНК), миРНК, шРНК, транс-сплайсинговую РНК, антисмысловую РНК или РНК, образующую триплекс.

14. Рекомбинантная векторная плазмида по п.11, где указанная ингибиторная нуклеиновая кислота ингибирует экспрессию: гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с дентаторубро-паллидолюисовой атрофией (например, атрофин 1, ATN1); андрогенного рецептора на Х-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, атаксина-1, -2, -3 и -7 человека, Cav2.1 P/Q потенциалзависимого кальциевого канала, кодируемого (CACNA1A), TATA-связывающий белок, противоположную цепь атаксина 8, также известен как ATXN8OS, серин/треонин-протеинфосфатазу 2A 55 кДа, регулирующую субъединицу B бета-изоформы при спиноцеребеллярной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, 17), FMR1 (fragile X mental retardation 1) при синдроме хрупкой X-хромосомы, FMR1 (fragile X mental retardation 1) при треморе/атаксии, связанной с синдромом хрупкой Х-хромосомы, FMR1 (fragile X mental retardation 2) или представитель семейства 2 AF4/FMR2 при умственной отсталости, связанной с синдромом XE; миотонин-протеинкиназу (МТ-PK) при миотонической дистрофии; фратаксин при атаксии Фридрейха; мутант гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при боковом амиотрофическом склерозе; ген, участвующий в патогенезе болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеин B (APOB) и пропротеин-конвертаза субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), гиперхолестеринемия; ВИЧ Tat, ген трансактиватора транскрипции вируса иммунодефицита при ВИЧ-инфекции; ВИЧ TAR, ВИЧ TAR, ген элемента трансактиваторного ответа вируса иммунодефицита человека при ВИЧ-инфекции; рецептор хемокина C-C (CCR5) при ВИЧ-инфекции; нуклеокапсидный белок вируса саркомы Рауса (RSV) при инфекции RSV, специфичную для печени микроРНК (miR-122) при вирусном гепатите С; р53, острая травма почки или отсроченная функция трансплантата при пересадке почки или острая почечная недостаточность при травме почки; протеинкиназу N3 (PKN3) при последних стадиях солидных опухолей с рецидивами или метастазами; LMP2, LMP2, также известен как протеасомная субъединица бета-типа 9 (PSMB 9), метастатическая меланома; LMP7, также известен как протеасомная субъединица бета-типа 8 (PSMB 8), метастатическая меланома; MECL1, также известен как протеасомная субъединица бета-типа 10 (PSMB 10), метастатическая меланома; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в солидных опухолях; белок веретена кинезин в солидных опухолях, супрессор апоптоза В-клеток CLL/лимфома (BCL-2) при хроническом миелоидном лейкозе; рибонуклеотидредуктазу М2 (RRM2) в солидных опухолях; фурин при солидных опухолях; поло-подобную киназу 1 (PLK1) в опухолях печени, диацилглицерин-ацилтрансферазу 1 (DGAT1) при гепатите С, бета-катенин при семейном аденоматозном полипозе; бета2 адренергический рецептор, глаукома; RTP801/Redd1, также известен как белок транскрипта 4, индуцированный повреждением ДНК, при диабетической макулярном отеке (DME) или возрастной макулярной дегенерации; рецептор I фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1) при возрастной макулярной дегенерации или хориоидальной нейваскуляризации, каспазу 2 при неартериитной ишемической невропатии зрительного нерва; мутантный белок кератина 6А N17K при врожденной пахионии; последовательности генома/гена вируса гриппа А при гриппе; последовательности генома/гена коронавирусного тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) при инфекции SARS; последовательности генома/гена респираторно-синцитиального вируса при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции; последовательность генома/гена вируса лихорадки Эбола при заражении вирусом Эбола; последовательности генома/гена вируса гепатита В и С при гепатите В и С; последовательности генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при инфекции HSV, последовательности генома/гена вируса Коксаки В3 при инфекции вирусом Коксаки В3; "молчание" патогенного аллеля гена (аллель-специфичный сайленсинг), такого как торсин А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класс I и HLA-аллель, специфичные для трансплантата; мутантный ген родопсина (RHO) при аутосомно-доминантно наследуемом пигментном ретините (adRP); или где указанная ингибирующая нуклеиновая кислота связывается с транскриптом любого из вышеуказанных генов или последовательностей.

15. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где последовательность контроля экспрессии включает промотор или энхансер, который обеспечивает транскрипцию гетерологичной полинуклеотидной последовательности.

16. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где элемент контроля экспрессии включает конститутивный или регулируемый элемент управления.

17. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, где элемент контроля экспрессией включает тканеспецифичный элемент контроля экспрессии или промотор.

18. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, дополнительно содержащая полиадениновую последовательность, расположенную на 3’-конце гетерологичной полинуклеотидной последовательности.

19. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, дополнительно содержащая маркер селекции и/или точку начала репликации.

20. Рекомбинантная векторная плазмида по п.19, где указанный маркер селекции включает ген, кодирующий белок, который обеспечивает устойчивость к антибиотику.

21. Клетка млекопитающего, содержащая рекомбинантную векторную плазмиду по любому из пп.2-20, которая продуцирует частицы AAV, содержащие векторный геном AAV рекомбинантной векторной плазмиды.

22. Частица AAV, содержащая векторный геном AAV по любому из пп.2-20 для доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности в организм млекопитающего или клетку млекопитающего.

23. Частица AAV по п.22, где вирусная частица или частица AAV выделена или очищена.

24. Фармацевтическая композиция, содержащая частицы AAV по п.22 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное средство.

25. Способ доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности в организм млекопитающего или клетку млекопитающего, включающий введение частицы AAV по п.22 или фармацевтической композиции по п.24 в организм указанного млекопитающего или в клетку указанного млекопитающего, таким образом доставляя или перенося гетерологичную полинуклеотидную последовательность в организм млекопитающего или клетку млекопитающего.

26. Способ лечения дефицита экспрессии или функции белка у млекопитающего, включающий введение частицы AAV по п.22 или фармацевтической композиции по п.24 в организм млекопитающего, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует белок, экспрессирующийся у млекопитающего.

27. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в снижении экспрессии или функции эндогенного белка, включающий введение частицы AAV по п.22 или фармацевтической композиции по п.24 в организм млекопитающего, где указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует ингибиторную последовательность или белок, который снижает экспрессию или функцию эндогенного белка у млекопитающего.

28. Способ по пп.25-27, где частицу AAV доставляют внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, перорально, при интубации, через катетер, чрескожно, внутричерепным путем, ингаляцией, в полость или через слизистую.

29. Способ по пп.25-27, где млекопитающее является человеком.

30. Способ получения рекомбинантных AAV частиц, включающий:

а. введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-20 для получения продуктивной AAV инфекции; и

b. культивирование указанных клеток-хелперов в условиях для получения частиц AAV, имеющих векторный геном AAV.

31. Способ получения рекомбинантных AAV частиц со сниженным количеством рекомбинантных частиц AAV частиц, в которых векторные гены AAV содержат загрязняющую бактериальную нуклеиновую кислоту, включающий:

а. введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-20; и

b. культивирование указанных клеток-хелперов в условиях для получения рекомбинантных частиц AAV, имеющих векторный геном AAV, в которых полученные рекомбинантные частицы AAV имеют пониженное количество частиц AAV с рекомбинантными векторными геномами, которые содержат загрязняющую бактериальную нуклеиновую кислоту, по сравнению с количеством частиц AAV, которые содержат загрязняющую бактериальную нуклеиновую кислоту, полученных в условиях, при которых полинуклеотидная последовательность филлера или спейсера из рекомбинантной векторной плазмиды отсутствует.

32. Способ по п.31, в котором указанная загрязняющая нуклеиновая кислота состоит из нуклеиновой кислоты, происходящей из основы или плазмидной части рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-20.

33. Способ по любому из пп.29-32, в котором клетка представляет собой клетки млекопитающих.

34. Способ по любому из пп.29-32, в котором клетка обеспечивает хелперные функции, такие как упаковку указанного вектора в вирусную частицу.

35. Способ по любому из пп.26-32, в котором клетка обеспечивает AAV хелперные функции.

36. Способ по любому из пп.26-32, в котором клетка предоставляет Rep и/или Cap белки AAV.

37. Способ по любому из пп.26-32, в котором клетка постоянно или временно трансфицирована полинуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), кодирующей белки Rep и/или Cap.

38. Способ по любому из пп.29-32, в котором клетка предоставляет белки Rep78 или Rep68.

39. Способ по любому из пп.29-32, в котором клетка постоянно или временно трансфицирована полинуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), кодирующей(ими) белки Rep78 или Rep68.

40. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.1-20, клетка по п.21, AAV частица по любому из пп.22-24 или способ по любому из пп.25-32, где указанный векторный геном AAV содержит ITR AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74 и Rh10, или гибрид, или химерный вариант любого из указанных выше ITR.

41. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.1-20, клетка по п.21, AAV частица по любому из пп.22 или 23 или способ по любому из пп.25-32, где указанная частица AAV содержит VP1, VP2 или VP3 капсидный белок серотипа AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74, Rh10, или гибрида, или химерного варианта любого из указанных серотипов AAV.

42. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.1 или 2, где указанные последовательности ITR получены из серотипов AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74, Rh10, или гибрида, или химерного варианта любого из указанных серотипов AAV.