КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ БОРЬБЫ С LEPTINOTARSA Российский патент 2019 года по МПК C12N15/82 C12N15/113 C07K14/435 A01N57/16 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/856137, поданной 19 июля 2013 года, предварительной заявке на патент США № 61/899000, поданной 1 ноября 2013 года, и предварительной заявке на патент США № 61/980800, поданной 17 апреля 2014 года, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Перечни последовательностей, содержащиеся в файлах "40-21_60191_A.txt" (2291 килобайт, создан 19 июля 2013 года, подан с предварительной заявкой на патент США № 61/856137 19 июля 2013 года), "40-21_60191_0001US_ST25.txt" (2322 килобайта, создан 30 октября 2013 года, подан с предварительной заявкой на патент США № 61/899000 1 ноября 2013 года) и "40-21_60191_0002_US_ST25.txt" (2338 килобайт, создан 17 апреля 2014 года, подан с предварительной заявкой на патент США № 61/980800 17 апреля 2014 года), включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащийся в файле "40-21_60191_0003_ST25_new.txt" (2532856 байт, создан 17 июля 2014 года), подается в данном документе и включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Описаны способы борьбы с заражениями беспозвоночными вредителями, в частности у растений, а также композиции, полинуклеотиды и рекомбинантные ДНК конструкции полезные в таких способах. Конкретнее, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам и способам их применения для модификации экспрессии генов в насекомом-вредителе, в частности, путем РНК-интерференции. Целевые виды вредителей включают виды рода Leptinotarsa, в особенности те, которые заражают культурные растения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Коммерческие культуры часто подвержены атакам беспозвоночных вредителей, таких как насекомые. Композиции для борьбы с заражениями насекомыми в растениях были представлены, как правило, в форме химических инсектицидов. Тем не менее, существует некоторые недостатки при использовании химических инсектицидов. Например, химические инсектициды, как правило, не являются избирательными и применение химических инсектицидов, предназначенных для борьбы с насекомыми-вредителями культурных растений, может также оказывать воздействие на не целевых насекомых и других беспозвоночных. Химические инсектициды часто сохраняются в окружающей среде и могут характеризоваться медленным распадом и, таким образом, могут потенциально накапливаться в пищевой цепи. Кроме того, использование стойких химических инсектицидов может привести к развитию резистентности у целевых видов насекомых. Таким образом давно существует необходимость в более экологически безопасных способах для борьбы или уничтожения заражения насекомыми на поверхности или внутри растений, то есть способах, которые являются видоспецифичными, экологически инертными, нестойкими и биодеградируемыми, и которые хорошо согласуются со схемами борьбы устойчивостью к вредителям.

[0004] Другим подходом, который используется для борьбы с вредителями, является РНК-интерференция (РНКи, РНК-опосредованная супрессия гена). В беспозвоночных подавление гена на основе РНКи впервые была продемонстрирована у нематод (Fire et al., (1998) Nature, 391:806-811; Timmons & Fire (1998) Nature, 395:854). Впоследствии супрессия генов беспозвоночных на основе РНКи с использованием технологии рекомбинантной нуклеиновой кислоты была описана у ряда видов, в том числе сельскохозяйственных или экономически важных вредителях из различных таксонов насекомых и нематод.

[0005] Leptinotarsa spp. образуют род, включающий ряд видов, заражающих коммерчески важные растения, в том числе многие пасленовые (например, картофель, помидоры, баклажаны, перец, табак и петунию). Например, Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук, КЖ) представляет собой ранне- и среднесезонного вредителя, поражающего пасленовые растения, такие как картофель. Колорадские жуки питаются в первую очередь надземными частями растения, а дефолиация приводит к снижению урожайности клубней. Способы и композиции для борьбы с насекомыми-вредителями, в частности с Leptinotarsa spp., которые заражают культурные растения, являются востребованными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Представленные варианты реализации изобретения относятся к борьбе с видами рода Leptinotarsa, особенно с теми, которые представляют собой экономически или сельскохозяйственно важных вредителей. В различных вариантах реализации изобретения виды рода Leptinotarsa представляют собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, включающей Leptinotarsa behrensi, Leptinotarsa collinsi, Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук), Leptinotarsa defecta, Leptinotarsa haldemani (зеленый картофельный жук), Leptinotarsa heydeni, Leptinotarsa juncta (ложный картофельный жук), Leptinotarsa lineolata, Leptinotarsa peninsularis, Leptinotarsa rubiginosa, Leptinotarsa texana, Leptinotarsa tlascalana, Leptinotarsa tumamoca и Leptinotarsa typographica. В конкретных вариантах реализации изобретения виды рода Leptinotarsa представляют собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, включающий Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук), Leptinotarsa juncta (ложный картофельный жук), Leptinotarsa haldemani (зеленый картофельный жук) и Leptinotarsa lineolata.

[0007] Композиции и способы, описанные в данном документе, включают рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, такие как рекомбинантные ДНК-конструкции для получения трансгенных растений, устойчивых к заражению видами рода Leptinotarsa, и одно- или двухцепочечные ДНК или РНК молекулы, именуемые в данном документе как "триггеры", которые полезны для борьбы или предотвращения заражения растения этими видами рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидные триггеры предлагаются в качестве агентов локального применения для борьбы или предотвращения заражения растения видами Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются пасленовые растения с улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa, такие как трансгенные пасленовые растения (включая семена или пропагативные части, такие как клубни), экспрессирующие полинуклеотидный триггер. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются пасленовые растения (включая семена или пропагативные части, такие как клубни), которые были локально обработаны композицией, содержащей полинуклеотидный триггер (например, пасленовые растения, которые были опрысканы раствором молекул дцРНК). Также предлагаются композиции, содержащие полинуклеотид, которые локально применялись к видам рода Leptinotarsa или к растению, к части растения или к семенам, которые должны быть защищены от заражения видами Leptinotarsa.

[0008] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к супрессии целевого гена в видах Leptinotarsa с помощью полинуклеотидного триггера. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам выбора целевых генов Leptinotarsa, которые могут быть эффективными мишенями для РНКи-опосредованного контроля видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены, отобранные для РНКи-опосредованной супрессии, представляют собой гены, которые не являются повторяемыми и избыточными в геноме видов рода Leptinotarsa, или которые имеют низкое нуклеотидное разнообразие, или которые эволюционно или функционально ограничены по способности иметь больше синонимичных (K_s), чем несинонимичных (К_а) нуклеотидных замен. В данном документе предлагаются нуклеотидные последовательности, именуемые в данном документе как "группа последовательностей целевого гена", которая состоит из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830 и SEQ ID № 1087-1094. Также предлагаются нуклеотидные последовательности, именуемые в данном документе как "группа триггерных последовательностей", которая состоит из SEQ ID № 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 989, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1049, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1096, 1097, 1098, 1099, 1100, 1101, 1102, 1103, 1104, 1105, 1110, 1111, 1112, 1113 и 1114.

[0009] В одном аспекте способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности) с соответствующим фрагментом ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт с полинуклеотидом достигается путем локального применения полинуклеотида, или композиции или раствора, содержащих полинуклеотид (например, путем опрыскивания, или опыления, или замачивания), непосредственно к видам рода Leptinotarsa, или на поверхность или матрикс (например, на растение или в почву), контактирующие с видами рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт с полинуклеотидом достигается при условии, что полинуклеотид проглатывается видами рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт с полинуклеотидом достигается при условии трансгенного растения, которое экспрессирует полинуклеотид к видам рода Leptinotarsa.

[0010] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу борьбы c заражением растения видами рода Leptinotarsa путем обеспечения рациона видов рода Leptinotarsa агентом, включающим полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности) с соответствующим фрагментом ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК, и причем агент функционирует так, чтобы при проглатывании видами рода Leptinotarsa ингибировать биологическую функцию внутри видов рода Leptinotarsa, и тем самым бороться с заражением видами рода Leptinotarsa. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает обеспечение рациона видов рода Leptinotarsa полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, разработан для применения на полях культурных растений, например, в распыляемых растворах или эмульсиях, в резервируемых смесях или в порошках. В некоторых вариантах реализации изобретения агент производится биологически, например, в форме продукта микробной ферментации или экспрессируется в клетке трансгенного растения.

[0011] В другом аспекте предлагается способ, вызывающий смертность или задержку развития у личинок видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается по меньшей мере одна РНК, содержащая по меньшей мере один элемент сайленсинга, для рациона личинок видов рода Leptinotarsa, причем проглатывание РНК личинками видов рода Leptinotarsa приводит к смертности или задержке развития у личинок видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa, причем целевой ген выбран из группы, состоящей из генов группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения способ, вызывающий смертность или задержку развития у личинок видов рода Leptinotarsa, включает обеспечение рациона личинок по меньшей мере одним ​​полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий 21 смежный нуклеотид, комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу, вызывающему смертность или снижение плодовитости у видов рода Leptinotarsa, включающему обеспечение рациона видов рода Leptinotarsa по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa, причем проглатывание РНК видами рода Leptinotarsa приводит в результате к смертности или снижению плодовитости у видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген выбран из группы, состоящей из генов группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения способ приводит к снижению скорости метаморфоза или к уменьшению активности питания. В некоторых вариантах реализации изобретения способ полезен для обеспечения повышенной устойчивости растений к заражению видами рода Leptinotarsa.

[0012] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включающему локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности) с соответствующим фрагментом ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения способ обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В одном варианте реализации изобретения способ обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, таким образом, что эффективное количество полинуклеотида проглатывается видами рода Leptinotarsa, питающимися на растении; полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. Несколько вариантов реализации изобретения относятся к композициям, содержащим полинуклеотид, разработанным для применения на полях культурных растений, например, в распыляемых растворах или эмульсиях, в резервируемых смесях или в порошках.

[0013] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции для борьбы с видами рода Leptinotarsa, содержащей эффективное для инсектицидного действия количество по меньшей мере одной молекулы полинуклеотида, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или комплементарностью последовательности) с соответствующим фрагментом ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула полинуклеотида содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №: 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула полинуклеотида представляет собой рекомбинантный полинуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула полинуклеотида представляет собой РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула полинуклеотида представляет собой двухцепочечную РНК. Связанные варианты реализации изобретения включают инсектицидные композиции, содержащие молекулу полинуклеотида, разработанные для применения на полях культурных растений, например, в распыляемых растворах или эмульсиях, в резервируемых смесях или в порошках, и, необязательно, содержащие один или более дополнительных компонентов, таких как агент носитель, поверхностно-активное вещество, катионный липид, кремнийорганический материал, кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, полинуклеотидная гербицидная молекула, неполинуклеотидная гербицидная молекула, неполинуклеотидный пестицид, антидот и регулятор роста насекомых.

[0014] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включающему экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или комплементарностью последовательности с) к соответствующему фрагменту ДНК, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК.

[0015] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к рекомбинантной ДНК-конструкции, содержащей гетерологический промотор, функционально связанный с элементом ДНК, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности) с соответствующим фрагментом ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент ДНК кодирует двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечная РНК содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. Связанные варианты реализации изобретения включают хромосому или пластиду растения, или рекомбинантный растительный вирусный вектор, или рекомбинантный бакуловирусный вектор, содержащие рекомбинантную ДНК-конструкцию или содержащие элемент ДНК без гетерологического промотора.

[0016] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, кодирующую РНК, которая супрессирует экспрессию целевого гена у видов рода Leptinotarsa, который контактирует с РНК или проглатывает ее внутрь, причем РНК содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, комплементарных фрагменту целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген выбран из группы последовательностей целевого гена. Конкретный вариант реализации изобретения представляет собой трансгенную клетку пасленового растения, имеющую в своем геноме рекомбинантную ДНК, кодирующую РНК для сайленсинга одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов экзоцисты, генов рибосомных белков и генов протеосомы. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей.

[0017] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к изолированной рекомбинантной молекуле РНК, которая приводит к смертности или задержке роста у видов рода Leptinotarsa при проглатывании или контакте с видом Leptinotarsa, причем рекомбинантная молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу комплементарные (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% комплементарности последовательности с) соответствующей ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная молекула РНК представляет собой двухцепочечную РНК. Конкретные варианты реализации изобретения включают изолированную рекомбинантную молекулу РНК для супрессии экспрессии рибосомного белка, такого как рибосомный белок L7 или белка, кодируемого SEQ ID №: 730, и изолированную рекомбинантную молекулу двухцепочечной РНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 989, 988, 1104 или 1105.

[0018] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включающему обеспечение растения по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или комплементарностью последовательности с) к соответствующему фрагменту целевого гена, выбранного из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения способ обеспечения улучшенной устойчивости растения к заражению видами рода Leptinotarsa, включает обеспечение растения по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена или к РНК, транскрибируемой с целевого гена, причем целевой ген выбран из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК.

[0019] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающему контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны (например, сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или комплементарностью последовательности с) к соответствующему фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы c заражением растения видами рода Leptinotarsa, включает контакт видов рода Leptinotarsa с эффективным количеством двухцепочечной РНК, одна цепь которой комплементарная по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду гена, который кодирует рибосомный белок, при этом индуцируется РНК-интерференция и наблюдается смертность. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечная РНК содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы триггерных последовательностей.

[0020] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу выбора целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга из генома растения или из генома животного. В различных вариантах реализации изобретения способ обеспечивает подмножество целевых генов, которые присутствуют в конкретном геноме как одно- или низкокопийные (не повторяющиеся и не избыточные), или которые имеют низкое нуклеотидное разнообразие, или которые имеют отношение K_s>>К_а синонимичных (K_s) к несинонимичным (К_а) нуклеотидным заменам.

[0021] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к искусственным композициям, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены препараты, используемые для локального применения к растениям, или вещества, необходимые для защиты от заражения видами рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены рекомбинантные генетические конструкции и векторы, полезные для получения трансгенных клеток пасленовых растений и трансгенных пасленовых растений. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены препараты и покрытия полезные для обработки пасленовых растений, семян пасленовых растений или пропагативных частей, таких как клубни. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены товарные продукты и пищевые продукты, полученные из таких пасленовых растений, семян, или пропагативных частей, обработанных полинуклеотидом или содержащих его, как описано в данном документе (в особенности товарные продукты и пищевые продукты, имеющие детектируемое количество полинуклеотида, как описано в данном документе). Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам, которые связываются с белком, который кодируется последовательностью или фрагментом последовательности, выбранными из группы последовательностей целевого гена. Другой аспект относится к поликлональным или моноклональным антителам, которые связываются с белком, который кодируется последовательностью или фрагментом последовательности, выбранными из группы триггерных последовательностей или комплементарных им. Такие антитела сделаны обычными способами, известными любому специалисту в данной области техники.

[0022] В различных вариантах реализации изобретения, описанных в данном документе, растение может быть любым растением, которое подлежит заражению видами рода Leptinotarsa. Особый интерес представляют варианты реализации изобретения, в которых растение представляет собой пасленовое растение (семейство Пасленовых). Примеры включают растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой семя непроросшего пасленового растения, пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой "посадочный картофель", что означает клубень картофеля или часть клубня картофеля, которые могут развиваться в новые растения картофеля.

[0023] Другие аспекты и специфические варианты реализации настоящего изобретения раскрыты в нижеследующем подробном описании.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0024] Если не указано иное, все использованные технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно понимается любым специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае, когда термин предложен в единственном числе, изобретатели также предусматривают аспекты изобретения, описанного множественным числом данного термина. В случае, когда имеются расхождения в терминах и определениях, используемых в ссылках, которые включены посредством ссылки, термины, используемые в настоящей заявке, должны иметь определения, приведенные в данном документе. Другие использованные технические термины имеют свое обычное значение в области техники, в которой они используются, как приведено в примерах различных технико-специфических словарей, например, "The American Heritage® Science Dictionary" (Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Houghton Mifflin Harcourt, Boston and New York), the “McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms” (6th edition, 2002, McGraw-Hill, New York) или the “Oxford Dictionary of Biology” (6th edition, 2008, Oxford University Press, Oxford and New York). Изобретатели не намереваются ограничиваться механизмом или способом действия. Ссылка на них предлагается исключительно в иллюстративных целях.

[0025] Если не заявляется иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения даются, при чтении слева направо, в направлении от 5' к 3' концу. Специалист в данной области техники будет осознавать, что данная последовательность ДНК понятна для определения соответствующей последовательности РНК, которая идентична последовательности ДНК за исключением замены тиминовых (Т) нуклеотидов ДНК на урациловые (U) нуклеотиды. Таким образом, предоставление специфической последовательности ДНК понятно для определения точного РНК эквивалента. Данная первичная последовательность полинуклеотида, будь-то ДНК или РНК, дополнительно определяет последовательность его точного комплемента (который может быть ДНК или РНК), вторичного полинуклеотида, который полностью гибридизуется с первичным полинуклеотидом путем формирования пар оснований Уотсона-Крика. Для ДНК: ДНК дуплексов (гибридизованные цепи) пары оснований представляют собой аденин: тимин или гуанин: цитозин, для ДНК: РНК дуплексов пары оснований представляют собой аденин: урацил или гуанин: цитозин. Таким образом, нуклеотидная последовательность двухцепочечного полинуклеотида с тупыми концами, который полностью гибридизуется (где имеется "100% комплементарность" между цепями или где цепи "комплементарные"), однозначно определяется при предоставлении нуклеотидной последовательности одной цепи, данной либо как ДНК, либо как РНК. "По существу идентичный" или "по существу комплементарный" по отношению целевому гену или фрагменту целевого гена означает, что полинуклеотидная цепь (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) предназначена для гибридизации (как правило, при физиологических условиях, присущих живой клетке растения или животного) с целевым геном или фрагментом целевого гена, или с транскриптом целевого гена или фрагмента целевого гена; специалисту в данной области техники будет понятно, что для такой гибридизации не обязательно требуется 100% идентичность или комплементарность последовательности. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является "функционально" связанной или "связанной" со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи с второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промоторная последовательность является "функционально связанной" с ДНК, если промотор обеспечивает транскрипцию или экспрессию ДНК. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными.

[0026] Термин "полинуклеотид" обычно относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей многократное число нуклеотидов и, как правило, относится как к "олигонуклеотидам" (полинуклеотидная молекула длиной 18-25 нуклеотидов), так и к более длинным полинуклеотидам, с 26-ю или более нуклеотидами. Полинуклеотиды также включают молекулы, содержащие многократное число нуклеотидов, включающих неканонические нуклеотиды или химически модифицированные нуклеотиды, обычно практикуемые в данной области техники; см., например, химические модификации, описанные в техническом руководстве “RNA Interference (RNAi) and DsiRNAs”, 2011 (Integrated DNA Technologies Coralville, IA). Как правило, полинуклеотиды, как описано в данном документе, представляющие собой ДНК или РНК, или ту и другую, и представляющие собой одно- или двухцепочечную молекулу, включают по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов (или, в случае двухцепочечных полинуклеотидов, по меньшей мере 18 смежных пар оснований), которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентного размера ДНК целевого гена или РНК транскрипту целевого гена. На протяжении всего настоящего описания, «по меньшей мере 18 смежных» означает «от около 18 до около 10000, включая любое целое число в промежутке между точками». Таким образом, варианты реализации настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, имеющие длину 18-25 нуклеотидов (18-меры, 19-меры, 20-меры, 21-меры, 22-меры, 23-меры, 24-меры или 25-меры), или полинуклеотиды средней длины, имеющие длину 26 или более нуклеотидов (полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды, имеющие длину, большую чем около 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от около 300 до около 400 нуклеотидов, от около 400 до около 500 нуклеотидов, от около 500 до около 600 нуклеотидов, от около 600 до около 700 нуклеотидов, от около 700 до около 800 нуклеотидов, от около 800 до около 900 нуклеотидов, от около 900 до около 1000 нуклеотидов, от около 300 до около 500 нуклеотидов, от около 300 до около 600 нуклеотидов, от около 300 до около 700 нуклеотидов, от около 300 до около 800 нуклеотидов, от около 300 до около 900 нуклеотидов, или около 1000 нуклеотидов в длину, или даже свыше, чем около 1000 нуклеотидов в длину, например, вплоть до всей длины целевого гена, включая кодирующий или некодирующий, или как кодирующий, так и некодирующий отрезки целевого гена). Если полинуклеотид является двухцепочечным, его длина может быть аналогичным образом описана в терминах пар оснований.

[0027] Полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (оц) или двухцепочечными (дц). "Двухцепочечный" относится к спариванию оснований, которое происходит между достаточно комплементарными, антипараллельными цепями нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, как правило, при физиологически соответствующих условиях. Варианты реализации изобретения включают такие, в которых полинуклеотид выбран из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной ДНК (оцДНК), смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечной гибридной ДНК/РНК, антисмысловой оцДНК или антисмысловой оцРНК; может быть использована смесь полинуклеотидов любого из этих типов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК с длиной большей, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК (например, таких как эндогенно продуцируемые миРНК и зрелые микроРНК). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной по меньшей мере около 30 смежных пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной от около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид может включать отличные от стандартных рибонуклеотидов компоненты, например, один вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит концевые дезоксирибонуклеотиды.

[0028] В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как те, которые встречаются в ДНК и РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие главным образом из рибонуклеотидов, но с одним или более концевыми дезоксирибонуклеотидами или с одним или более концевыми дидезоксирибонуклеотидами, или синтетические полинуклеотиды, состоящие главным образом из дезоксирибонуклеотидов, но с одним или более концевыми дидезоксирибонуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники; см., например, публикацию патента США 2011/0171287, публикацию патента США 2011/0171176, публикацию патента США 2011/0152353, публикацию патента США 2011/0152346 и публикацию патента США 2011/0160082 публикации, которые включены в данный документ в качестве ссылки. Иллюстративные примеры включают, но не ограничиваются этими, встречающийся в природе фосфодиэфирный остов олигонуклеотида или полинуклеотида, который может быть частично или полностью модифицирован с помощью фосфоротиоатной, фосфородитиоатной или метилфосфонатной модификаций межнуклеотидной связи, в синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида могут быть использованы модифицированные нуклеозидные основания или модифицированные сахара, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут быть помечены флуоресцентным компонентом (например, флуоресцеином или родамином) или другой меткой (например, биотином).

[0029] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотиду, содержащему по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения количество смежных нуклеотидов составляет по меньшей мере 18, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения количество смежных нуклеотидов больше, чем 18, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый сегмент, содержащийся в полинуклеотиде, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК, например, каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина полинуклеотида или длина каждого сегмента, содержащегося в полинуклеотиде, меньше суммарной длины ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина полинуклеотида находится в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид, экспрессируемый в растении, представляет собой РНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарную им, или представляет собой РНК шпильку, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид экспрессируется в растении. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид локально предоставляется на поверхность растения или к видам рода Leptinotarsa.

[0030] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотидам, которые разработаны для модулирования экспрессии путем индукции регуляции или супрессии целевого гена видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотиды разработаны так, чтобы иметь нуклеотидную последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную нуклеотидной последовательности целевого гена видов рода Leptinotarsa или его кДНК (например, группа последовательностей целевого гена), или последовательности РНК, транскрибируемой с целевого гена видов рода Leptinotarsa, которая может быть кодирующей последовательностью или некодирующей последовательностью. Эти эффективные полинуклеотидные молекулы, которые модулируют экспрессию, могут называться в данном документе как "полинуклеотид", "полинуклеотидный триггер", "триггер" или "триггеры".

[0031] Эффективные полинуклеотиды любого размера могут быть использованы поодиночке или в комбинации, в различных способах и композициях, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения единичный полинуклеотидный триггер используется для того, чтобы составить композицию (например, композицию для локального применения или рекомбинантную ДНК конструкцию, пригодную для создания трансгенного растения). В других вариантах реализации изобретения используется смесь или пул различных полинуклеотидных триггеров; в таких случаях полинуклеотидные триггеры могут применяться для единичного целевого гена или для множественных целевых генов.

[0032] Используемый в данном документе термин "изолированный" относится к отделению молекулы от других молекул, обычно связанных с ней по своей природе или в естественном состоянии. Таким образом, термин "изолированный" может относиться к молекуле ДНК, которая была отделена от других(ой) молекул(ы) ДНК, которые обычно связаны с ней по своей природе или в естественном состоянии. Такая молекула ДНК может быть представлена в рекомбинантном состоянии, как например, рекомбинантная молекула ДНК. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с такими регуляторными или кодирующими последовательностями, с которыми они обычно не связаны, например, в результате рекомбинантных технологий, считаются изолированными, даже когда интегрированы в качестве трансгена в хромосому клетки или находятся с другими молекулами ДНК.

[0033] Используемый в данном документе термин "группа последовательностей целевого гена" относится к группе последовательностей, состоящей из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830 и SEQ ID № 1087-1094). Используемый в данном документе термин "группа триггерных последовательностей " относится к группе последовательностей, состоящей из SEQ ID № 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 989, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1049, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1096, 1097, 1098, 1099, 1100, 1101, 1102, 1103, 1104, 1105, 1110, 1111, 1112, 1113 и 1114.

[0034] В различных вариантах реализации изобретения виды рода Leptinotarsa представляют собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, состоящей из Leptinotarsa behrensi, Leptinotarsa collinsi, Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук), Leptinotarsa defecta, Leptinotarsa haldemani (зеленый картофельный жук), Leptinotarsa heydeni, Leptinotarsa juncta (ложный картофельный жук), Leptinotarsa lineolata, Leptinotarsa peninsularis, Leptinotarsa rubiginosa, Leptinotarsa texana, Leptinotarsa tlascalana, Leptinotarsa tumamoca и Leptinotarsa typographica. В конкретных вариантах реализации изобретения виды рода Leptinotarsa представляют собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, состоящей из Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук), Leptinotarsa juncta (ложный картофельный жук), Leptinotarsa haldemani (зеленый картофельный жук) и Leptinotarsa lineolata.

БОРЬБА С ЗАРАЖЕНИЯМИ LEPTINOTARSA ПУТЕМ КОНТАКТИРОВАНИЯ С ПОЛИНУКЛЕОТИДОМ

[0035] В данном документе предлагаются способы борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa путем контакта видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с соответствующим фрагментом ДНК или целевым геном, выбранными из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере 21 смежный нуклеотид со 100% идентичности с соответствующим фрагментом целевого гена, имеющего последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечная РНК) химически синтезирован или получен путем экспрессии в микроорганизме, или путем экспрессии в растительной клетке. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых полинуклеотид кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, кодируемого нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую цепь, имеющей последовательность, выбранную из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения в способе используется полинуклеотид, содержащий один сегмент из 127 смежных нуклеотидов (SEQ ID №: 831), который представляет собой антисмысловую (обратно комплементарную) последовательность из 127 смежных нуклеотидов целевого гена, кодируемого SEQ ID №: 825. В некоторых вариантах реализации изобретения в способе используется полинуклеотид, содержащий сегменты из 409 и 403 смежных нуклеотидов (SEQ ID №: 937 и SEQ ID №: 938, соответственно), которые являются антисмысловыми (обратно комплементарными) последовательностям из 409 и 403 смежных нуклеотидов, соответственно, целевого гена, кодируемого SEQ ID №: 732. Полинуклеотиды, используемые в данном способе, могут быть разработаны для множества целевых генов. Связанные аспекты изобретения включают изолированные полинуклеотиды, используемые в данном способе, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую данным способом.

[0036] В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830, и SEQ ID № 1087-1094, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичны фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности с соответствующим фрагментом целевого гена, имеющим последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №: 1087-1094, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает "нейтральную" последовательность (последовательность, не имеющую идентичности или комплементарности целевому гену) в дополнение к одному или более сегментам из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности с соответствующим фрагментом целевого гена, и, следовательно, полинуклеотид в целом имеет гораздо меньшую суммарную идентичность последовательности с целевым геном.

[0037] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к полинуклеотиду, разработанному для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Термин “ген” относится к любой части нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт. «Ген» может включать, но не ограничиваться этим, промоторную область, 5' нетранслируемые области, области, кодирующие транскрипт, которые могут включать интронные области, 3' нетранслируемые области, или комбинации из этих областей. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В других вариантах реализации изобретения целевой ген имеет последовательность идентичную или комплементарную матричной РНК, например, в некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген представляет собой кДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген кодируется последовательностью ДНК, выбранной из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген кодируется последовательностью, выбранной из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии многочисленных целевых генов из данной группы, или для направления к различным областям одного или более из этих целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает многочисленные сегменты из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый сегмент может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает многочисленные сегменты в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый сегмент состоит из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевых генов, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты могут быть из различных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[0038] Общая длина полинуклеотида, используемого в данном способе, может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Иными словами, общая длина полинуклеотида может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, полинуклеотид может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида не является на 100% идентичной или комплементарной последовательности смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющем последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[0039] Полинуклеотид, используемый в данном способе, обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации.

[0040] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в данном способе, предлагается в качестве изолированного ДНК или РНК фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в данном способе, не является частью экспрессионной генетической конструкции и не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие полинуклеотиды могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные полинуклеотиды в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых полинуклеотид кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[0041] В различных вариантах реализации изобретения по способу контакт включает применение к поверхности видов рода Leptinotarsa подходящей композиции, содержащей полинуклеотид, используемый в данном способе; такая композиция может быть предложена, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. Контакт может быть в форме обработки семян, или в форме обработки клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт включает внесение полинуклеотида в композицию, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого как, описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт включает внесение полинуклеотида в композицию, которая дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В одном варианте реализации изобретения контакт включает внесение полинуклеотида в композицию, которая может проглатываться или иным способом поглощаться внутрь видов рода Leptinotarsa.

[0042] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, используемых в данном способе, (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что композиция, содержащая один или более полинуклеотидов и один или более неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, вызывает синергический эффект, улучшая профилактику или борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa.

БОРЬБА С ЗАРАЖЕНИЯМИ LEPTINOTARSA ПУТЕМ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДА В РАЦИОНЕ

[0043] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающему предоставление в рационе видов рода Leptinotarsa агента, содержащего полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена или комплементарных им ДНК, причем агент функционирует при проглатывании его видами рода Leptinotarsa, ингибирует биологическую функцию в пределах видов рода Leptinotarsa и тем самым борется с заражением видами рода Leptinotarsa. Полинуклеотид может быть длиннее чем сегмент или сегменты, которые он содержит, но каждый сегмент полинуклеотида и соответствующий фрагмент ДНК имеют эквивалентную длину. Полинуклеотиды, используемые в данном способе, могут быть разработаны для множества целевых генов. Варианты реализации изобретения включают те, в которых агент содержит дцРНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых агент содержит полинуклеотид или РНК, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В одном варианте реализации изобретения предлагается способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающий предоставление в рационе видов рода Leptinotarsa полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечная РНК) является химически синтезированным или полученным путем экспрессии в микроорганизме или путем экспрессии в растительной клетке. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид представляет собой дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. Связанные аспекты изобретения включают изолированные полинуклеотиды, используемые в данном способе, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую данным способом.

[0044] В различных вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, содержит микробную клетку или продуцируется микроорганизмом. Например, агент может включать или может быть получен в клетках бактерий или дрожжей. В других вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид включает трансгенную клетку растения или продуцируется в растительной клетке (например, клетка растения транзиентно экспрессирующая полинуклеотид); такие растительные клетки могут быть клетками растения, или клетками, выращенными в культуре ткани или в клеточной суспензии.

[0045] В различных вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, предоставляется для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме, подходящей для проглатывания, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированном или микроинкапсулированном препарате, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. Агент, включающий полинуклеотид, может быть предложен для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa путем применения агента к растительному объекту, который заражается видами рода Leptinotarsa, или путем применения агента к семенам растения, например, путем опрыскивания, опыления или покрытия растения, или путем пропитывания почвы, или путем применения искусственного питания. Агент, содержащий полинуклеотид, может быть предложен для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa при искусственном рационе питания, разработанном для удовлетворения конкретных потребностей питания для поддержания видов рода Leptinotarsa, причем искусственный рацион дополняется определенным количеством полинуклеотида, полученного из отдельного источника, такого как химический синтез или очищенный после микробной ферментации; такой вариант реализации изобретения может быть полезным, например, для определения времени и количества режимов эффективной обработки полинуклеотидом. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, предлагается для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме растительной клетки, или компонентов растительной клетки, или микроорганизма (такого как бактерия или дрожжи), или продукта микробной ферментации, или синтетического или искусственного рациона. В одном варианте реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, предлагается в форме приманки, которая поглощается видами рода Leptinotarsa. Агент, содержащий полинуклеотид, может быть предложен для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме обработанного семени, или в форме обработанных клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть включены в агент, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, содержит по меньшей мере один имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частиц, катышка или капсулы, имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает имплантацию в растение имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, содержащий полинуклеотид, содержит по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает обработку агентом семени пасленового растения, клубня картофеля или части клубня картофеля.

[0046] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, используемых в данном способе, (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что композиция, содержащая один или более полинуклеотидов и один или более неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, вызывает синергический эффект, улучшая профилактику или борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa, когда предоставляется в рационе видов рода Leptinotarsa.

[0047] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых полинуклеотид кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[0048] В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичны фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности с соответствующим фрагментом целевого гена, имеющим последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №: 1087-1094, или комплементарной к ней ДНК; в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает "нейтральную" последовательность (не имеющую идентичности или комплементарности целевому гену) в дополнение к сегменту из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности с соответствующим фрагментом целевого гена, и, следовательно, полинуклеотид в целом имеет гораздо меньшую суммарную идентичность последовательности с целевым геном.

[0049] Полинуклеотид, используемый в данном способе, как правило, разработан для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Термин «ген» относится к любой части нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт. «Ген» может включать, но не ограничиваться этим, промоторную область, 5' нетранслируемые области, области, кодирующие транскрипт, которые могут включать интронные области, 3' нетранслируемые области, или комбинации из этих областей. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В других вариантах реализации изобретения целевой ген имеет последовательность идентичную или комплементарную матричной РНК, например, в некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген представляет собой кДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии многочисленных целевых генов из данной группы, или для направления к различным областям одного или более из этих целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает многочисленные сегменты из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый сегмент может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает многочисленные сегменты в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый сегмент состоит из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевых генов, или комплементарной к ней ДНК; сегменты могут быть из различных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды,

которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[0050] Общая длина полинуклеотида, используемого в данном способе, может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Иными словами, общая длина полинуклеотида может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, полинуклеотид может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида не является на 100% идентичной или комплементарной последовательности смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющем последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере два сегмента из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[0051] Полинуклеотид, используемый в данном способе, обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации.

[0052] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в данном способе, предлагается в качестве изолированного ДНК или РНК фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в данном способе, не является частью экспрессионной генетической конструкции и не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие полинуклеотиды могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные полинуклеотиды в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

БОРЬБА С ЗАРАЖЕНИЯМИ LEPTINOTARSA ПУТЕМ ОБЕСПЕЧЕНИЯ РНК В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ

[0053] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ, вызывающий смертность или задержку развития у личинок видов рода Leptinotarsa путем предоставления в рационе личинок по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечная РНК) является химически синтезированным или полученным путем экспрессии в микроорганизме или путем экспрессии в растительной клетке. В одном варианте реализации изобретения предлагается способ, вызывающий смертность или задержку развития у личинок видов рода Leptinotarsa, включающий предоставления в рационе личинок видов рода Leptinotarsa по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa, причем последовательность целевого гена выбрана из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и причем проглатывание РНК личинками видов рода Leptinotarsa приводит в результате к смертности или задержке развития у личинок видов рода Leptinotarsa. Родственный аспект настоящего изобретения представляет собой РНК, содержащую по меньшей мере один элемент сайленсинга, в котором по меньшей мере один элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa, причем последовательность целевого гена выбрана из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. РНК может быть длиннее чем элемент сайленсинга или элементы сайленсинга, которые он содержит, но каждый элемент сайленсинга и соответствующий фрагмент целевого гена имеют эквивалентную длину. РНК, используемые в данном способе, могут быть разработаны для множества целевых генов; варианты реализации изобретения включают РНК, содержащие по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарную им, или в которых элемент сайленсинга кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. Варианты реализации изобретения включают те, в которых РНК включает дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. В родственном аспекте предлагается способ, вызывающий смертность или снижение плодовитости у видов рода Leptinotarsa, включающий предоставление в рационе видов рода Leptinotarsa по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa; причем последовательность целевого гена выбрана из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; и причем проглатывание РНК видами рода Leptinotarsa приводит в результате к смертности или снижению плодовитости у видов рода Leptinotarsa. Родственные аспекты изобретения включают изолированные РНК, используемые в данном способе, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую данным способом.

[0054] В различных вариантах реализации изобретения, рацион, обеспечивающий РНК, включает микробные клетки или производится в микроорганизме. Например, рацион, обеспечивающий РНК, может включать или может быть получен в бактериях или дрожжевых клетках. В аналогичных вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, включает трансгенную клетку растения или продуцируется в растительной клетке (например, клетка растения транзиентно экспрессирующая полинуклеотид); такие растительные клетки могут быть клетками растения, или клетками, выращенными в культуре ткани или в клеточной суспензии.

[0055] В одном варианте реализации изобретения предлагается рацион, обеспечивающий РНК, в виде любого растения, которое подлежит заражению видами рода Leptinotarsa, в котором РНК содержится в или на растении. Такие растения могут быть стабильно трансгенными растениями, экспрессирующими РНК, или не трансгенными растениями, которые транзиентно экспрессируют РНК, или теми, которые были обработаны РНК, например, путем опрыскивания или покрытия. Стабильно трансгенные растения, как правило, содержат интегрированную в их геном рекомбинантную генетическую конструкцию, которая кодирует РНК. Особый интерес представляют варианты реализации изобретения, в которых растение представляет собой пасленовое растение (семейство пасленовых). Примеры включают растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой семя непроросшего пасленового растения, пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой "посадочный картофель", что означает клубень картофеля или часть клубня картофеля, которые могут развиваться в новые растения картофеля.

[0056] В различных вариантах реализации изобретения предлагается рацион, обеспечивающий РНК, в форме, подходящей для проглатывания видами рода Leptinotarsa, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированном или микроинкапсулированном препарате, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. Рацион, обеспечивающий РНК, может быть предложен путем применения пищи к растительному объекту, который заражается видами рода Leptinotarsa, например, путем опрыскивания, опыления или покрытия растения, или путем пропитывания почвы, или путем применения искусственного питания. В одном варианте реализации изобретения предоставляется рацион, обеспечивающий рекомбинантную РНК, в форме приманки, которая поглощается видами рода Leptinotarsa. Рацион, обеспечивающий РНК, может быть искусственным рационом, разработанным для удовлетворения конкретных потребностей питания для поддержания видов рода Leptinotarsa, причем искусственный рацион дополняется определенным количеством РНК, полученной из отдельного источника, такого как химический синтез или очищенная после микробной ферментации; такой вариант реализации изобретения может быть полезным, например, для определения времени и количества режимов эффективной обработки полинуклеотидом. В некоторых вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, предоставляется в виде растительной клетки, или в компонентах растительной клетки, или в микроорганизме (таком как бактерия или дрожжи), или как продукт микробной ферментации, или как синтетический рацион. В одном варианте реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, предлагается в форме приманки, которая поглощается видами рода Leptinotarsa. Рацион, обеспечивающий РНК, может быть предложен в форме обработанного семени, или в форме обработанных клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть включены в рацион, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В некоторых вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, включает по меньшей мере один имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частиц, катышка или капсулы, имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает имплантацию в растение имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения рацион, обеспечивающий РНК, включает по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает обработку агентом семени пасленового растения, клубня картофеля или части клубня картофеля.

[0057] Предполагается, что комбинация определенных РНК, используемых в данном способе, (например, дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только РНК или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что композиция, содержащая одну или более РНК и один или более неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, вызывает синергический эффект, улучшая профилактику или борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa.

[0058] РНК, используемая в данном способе, может быть одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц). Варианты реализации изобретения по способу включают такие, в которых РНК представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), антисмысловой одноцепочечной (оцРНК) или двухцепочечной РНК (дцРНК); может быть использована смесь РНК любого из этих типов. В одном варианте реализации изобретения используется двухцепочечный ДНК/РНК гибрид. РНК может включать компоненты, отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, один вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит концевые дезоксирибонуклеотиды.

[0059] РНК содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга, причем элемент сайленсинга является по существу идентичным (как РНК эквивалент) или по существу комплементарным фрагменту целевого гена личинок видов рода Leptinotarsa, причем последовательность целевого гена выбрана из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга имеет последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга в точности (100%) идентичный или в точности (100%) комплементарный (как РНК эквивалент) фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК, содержащая элемент(ы) сайленсинга, имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена.

[0060] В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена эквивалентной длины. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит более чем 18 смежных нуклеотидов, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый элемент сайленсинга, содержащийся в РНК, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК, например, каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина РНК или длина каждого элемента сайленсинга, содержащегося в РНК, меньше суммарной длины целевой последовательности (ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина РНК находится в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения РНК представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. Варианты реализации изобретения включают те, в которых РНК представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им; или в которых РНК кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[0061] РНК, используемая в данном способе, как правило, разработана для супрессии одного или более генов ("целевые гены"). Термин «ген» относится к любой части нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт. «Ген» может включать, но не ограничиваться этим, промоторную область, 5' нетранслируемые области, области, кодирующие транскрипт, которые могут включать интронные области, 3' нетранслируемые области, или комбинации из этих областей. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В других вариантах реализации изобретения целевой ген имеет последовательность идентичную или комплементарную матричной РНК, например, в некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген представляет собой кДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения РНК разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии многочисленных генов из данной группы, или для направления к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения РНК включает многочисленные элементы сайленсинга, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или 100% комплементарности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый элемент сайленсинга может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения РНК может включает многочисленные элементы сайленсинга в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый элемент сайленсинга состоит по меньшей мере из одного сегмента из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или 100% комплементарности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена; сегменты могут быть из различных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[0062] Общая длина РНК может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к элементам сайленсинга, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Иными словами, общая длина РНК может быть больше, чем длина элемента сайленсинга, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, РНК может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» элемент сайленсинга, по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными элементами сайленсинга, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения РНК включает дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения РНК включает дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости от одного или более элемента сайленсинга из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения РНК включает один такой элемент сайленсинга с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающие к элементу сайленсинга. В другом варианте реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всей РНК не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере два элемента сайленсинга каждый из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы 4 последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два элемента сайленсинга разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два элемента сайленсинга расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[0063] В некоторых вариантах реализации изобретения РНК состоит из рибонуклеотидов, встречающихся в природе. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК включает компоненты, иные чем рибонуклеотиды, например, синтетические РНК, состоящие главным образом из рибонуклеотидов, но с одним или более концевыми дезоксирибонуклеотидами или одним или более концевыми дидезоксирибонуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК включает неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК включает химически модифицированные нуклеотиды.

[0064] РНК, используемая в данном способе, обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых РНК является химически синтезированной (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученной путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации.

[0065] В некоторых вариантах реализации изобретения РНК предлагается в качестве изолированной РНК, которая не является частью экспрессионной генетической конструкции и не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие РНК могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные РНК в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных РНК), или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных РНК). В альтернативном варианте РНК может быть предложена в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включена в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы разработаны для включения дополнительных элементов, например, как для включения дополнительной РНК, кодирующей аптамер или рибозим, или экспрессионной кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

СПОСОБЫ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ, ИМЕЮЩИХ УЛУЧШЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАРАЖЕНИЯМ LEPTINOTARSA, И РАСТЕНИЙ, ЧАСТЕЙ РАСТЕНИЙ И СЕМЯН, ПРЕДОСТАВЛЕННЫХ ТАКИМ СПОСОБОМ

[0066] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, таким способом, что растение, обработанное композицией, содержащей полинуклеотид, демонстрирует улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, по сравнению с необработанным растением. В одном варианте реализации изобретения по меньшей мере один полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентичные фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. Полинуклеотид может быть длиннее чем сегмент или сегменты, которые он содержит, но каждый сегмент и соответствующий фрагмент целевого гена имеют эквивалентную длину. В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, таким способом, что эффективное количество полинуклеотида поглощается видами рода Leptinotarsa, питающимися на растении, полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предлагается способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающий локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, таким способом, что эффективное количество полинуклеотида поглощается видами рода Leptinotarsa, питающимися на растении, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; причем виды рода Leptinotarsa представляют собой вид Leptinotarsa decemlineata; и причем целевой ген имеет последовательность SEQ ID №: 730, или причем полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, имеющую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 989, 988, 1104 или 1105. Полинуклеотиды, используемые в данном способе, могут быть разработаны для множества целевых генов. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид включает сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых полинуклеотид кодируется последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. Варианты реализации изобретения включают те, в которых композиция содержит дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. Связанные аспекты изобретения включают композиции для локального применения, и изолированные полинуклеотиды, используемые в данном способе, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую данным способом.

[0067] "Локальное применение" означает применение к поверхности или внешней части объекта, такой как поверхность или внешняя часть растения, например, применение к поверхностям части растения, такой как лист, стебель, цветок, плод, побег, корень, семя, клубень, цветы, пыльники или пыльца, или применение ко всему растению, или к надземной или подземной части растения. Локальное применение может быть осуществлено на неживых поверхностях, например, применение к почве, или к поверхности, или к матриксу, на которых насекомые Leptinotarsa могут вступать в контакт с полинуклеотидом. В различных вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к растению в подходящей форме, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированноого препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. В некоторых вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к надземным частям растения, например, путем опрыскивания или опыления листьев, стеблей и цветущих частей растения. Варианты реализации изобретения по способу включают локальное применение опрыскивания листвы (например, опрыскивание жидкой композицией, содержащей полинуклеотид, листьев пасленового растения) или опыления листвы (например, опыление пасленового растения композицией, содержащей полинуклеотид, в форме порошка или носителей частиц). В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к подземным частям растения, таким как корни, например, с помощью пропитывания почвы. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к семени, которое образовано в растении. Локальное применение может быть в форме локальной обработки плодов пасленовых растений или семян из плодов пасленовых растений, или в форме локальной обработки клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, содержащую полинуклеотид, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, представляет собой по меньшей мере один локально имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частицы, катышка или капсулы, локально имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает локальную имплантацию в растение локального имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, представляет собой по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для локального применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, может проглатываться или иным способом впитываться внутрь видов рода Leptinotarsa. Например, композиция, содержащая полинуклеотид, может быть в форме приманки. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В одном варианте реализации изобретения композиция дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения локально применяемая композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В альтернативном варианте такие дополнительные компоненты или пестицидные агенты могут быть предложены отдельно, например, при раздельном локальном применении или путем трансгенной экспрессии в растении. В альтернативном варианте растение локально обрабатывали композицией, содержащей полинуклеотид, а также с отдельным (предшествующим, следующим или одновременным) применением вещества, которое улучшает эффективность композиции, содержащей полинуклеотид. Например, при первом локальном применении растение может быть опрыскано раствором, содержащим неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, с последующим вторым локальным применением композиции, содержащей полинуклеотид, или наоборот.

[0068] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, полезных для композиции, содержащей полинуклеотид, (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, предлагается в качестве трансгенного растения, экспрессирующего один или более полинуклеотидов и один или более генов, кодирующих неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, причем обнаружено, что трансгенное растение демонстрирует синергически улучшенную устойчивость к заражениям видами рода Leptinotarsa.

[0069] Полинуклеотид, полезный для композиции, содержащей полинуклеотид, предоставляется с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации.

[0070] Во многих вариантах реализации изобретения полинуклеотид, полезный для композиции, содержащей полинуклеотид, предлагается в качестве изолированного ДНК или РНК фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, полезный для композиции, содержащей полинуклеотид, не является частью экспрессионной генетической конструкции и не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие полинуклеотиды могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные полинуклеотиды в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. Такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[0071] Полинуклеотид, полезный для композиции, содержащей полинуклеотид, имеет по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID №: 726-830, и SEQ ID №: 1 087-1094, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичные фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[0072] Полинуклеотид, полезный для композиции, содержащей полинуклеотид, содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения сегмент содержит более чем 18 смежных нуклеотидов, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый сегмент, содержащийся в полинуклеотиде, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК, например, каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина полинуклеотида или длина каждого сегмента, содержащегося в полинуклеотиде, меньше суммарной длины целевой последовательности (ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина полинуклеотида находится в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им; или полинуклеотид кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[0073] Полинуклеотид для локального применения, как правило, разработан для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид для локального применения разработан для супрессии одного или более генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии множества генов из данной группы, или направляться к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения содержит множество отрезков или сегментов, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения может включать многочисленные отрезки в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или SEQ ID № 726-830, или SEQ ID № 1087-1094, или комплементарной к ней ДНК; сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[0074] Общая длина полинуклеотида для локального применения может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Иными словами, общая длина полинуклеотида для локального применения может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, полинуклеотид для локального применения может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения включает дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения включает дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце, или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид для локального применения представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида для локального применения не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид для локального применения содержит по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарными им ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[0075] В родственном аспекте настоящее изобретение касается растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, обеспеченную по данному способу, который включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, таким способом, что растение, обработанное композицией, содержащей полинуклеотид, демонстрирует улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, по сравнению с необработанным растением. В одном варианте реализации изобретения пасленовое растение, имеющее улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, обеспечивается путем локального применения к растению или к семени, сформировавшимся на растении, (или в случае, когда растение представляет собой растение картофеля, к посадочному картофелю, сформировавшемуся на растении картофеля) дцРНК триггера, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или дцРНК триггера, который кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В еще одном аспекте настоящее изобретение касается семени (в особенности семени, дающего трансгенное потомство), полученного из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, которое предложено по данному способу. Также рассматривается товарный продукт, полученный из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, которое предложено по данному способу, и товарный продукт, полученный из семени, дающего трансгенное потомство, такого растения.

ИНСЕКТИЦИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ БОРЬБЫ С ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA

[0076] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается инсектицидная композиция для борьбы с видами рода Leptinotarsa, содержащая эффективное, для инсектицидного действия, количество по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В данном контексте "борьба" включает стимулирование физиологического или поведенческого изменения у видов рода Leptinotarsa (взрослой особи или личинки), такого как, но не ограничиваясь этим, задержка роста, возрастание смертности, снижение репродуктивной способности, снижение или прекращение пищевого поведения или движения, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза. "Эффективный, для инсектицидного действия" означает эффективный для стимулирования физиологического или поведенческого изменения у видов рода Leptinotarsa (взрослой особи или личинки), такого как, но не ограничиваясь этим, задержка роста, возрастание смертности, снижение репродуктивной способности и снижение плодовитости, снижение или прекращение пищевого поведения или движения, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза; в некоторых вариантах реализации изобретения применение эффективного, для инсектицидного действия, количества РНК к растению улучшает устойчивость растения к заражению видами рода Leptinotarsa. РНК может быть длиннее, чем сегмент или сегменты, которые в ней содержатся, но каждый сегмент и соответствующий фрагмент целевого гена имеют эквивалентную длину. РНК, используемые в данном способе, могут быть разработаны для множества целевых генов. Варианты реализации изобретения включают те, в которых инсектицидная композиция содержит эффективное, для инсектицидного действия, количество полинуклеотида, содержащего по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №: 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; или эффективное, для инсектицидного действия, количество по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один элемент сайленсинга, который комплементарный по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена, причем целевой ген имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094; или эффективное, для инсектицидного действия, количество по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один сегмент, который идентичный или комплементарный по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №: 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; или молекулу РНК, которая приводит к смертности или задержке роста у видов рода Leptinotarsa при поглощении или контакте с видами рода Leptinotarsa, причем молекула РНК содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №№: 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; или инсектицидная двухцепочечная молекула РНК, которая приводит к смертности или задержке роста у видов рода Leptinotarsa при поглощении или контакте с видами рода Leptinotarsa, причем по меньшей мере одна цепь инсектицидной двухцепочечной молекулы РНК сдержит 21 смежный нуклеотид, который комплементарный целевому гену, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена, причем целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID №№: 1087-1094; или эффективное, для инсектицидного действия, количество по меньшей мере одной двухцепочечной РНК, содержащей последовательность, выбранную из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечная РНК) является химически синтезированным или полученным путем экспрессии в микроорганизме, или путем экспрессии в клетке растения. Варианты реализации изобретения включают инсектицидные композиции, содержащие дцРНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им; или в которых инсектицидная композиция содержит полинуклеотид или РНК, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. Варианты реализации изобретения включают те, в которых инсектицидная композиция содержит дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. В одном варианте реализации данного изобретения предлагается инсектицидная композиция для борьбы с видами рода Leptinotarsa, содержащая эффективное, для инсектицидного действия, количество двухцепочечной молекулы РНК, которое приводит к смертности или задержке роста у видов рода Leptinotarsa при поглощении или контакте с видами рода Leptinotarsa, причем инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент, который комплементарный к 21 смежному нуклеотиду ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, которая транскрибируется с ДНК, и причем молекула двухцепочечной РНК имеет длину по меньшей мере 50 пар оснований или длину в пределах от около 100 до около 500 пар оснований. В одном варианте реализации данного изобретения предлагается инсектицидная композиция для борьбы с видами рода Leptinotarsa, содержащая эффективное, для инсектицидного действия, количество двухцепочечной молекулы РНК, причем по меньшей мере одна цепь двухцепочечной РНК является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду гена, который кодирует рибосомный белок, или к РНК, которая транскрибируется с гена; в котором вид рода Leptinotarsa представляет собой Leptinotarsa decemlineata; и в котором индуцируется РНК-интерференция и наблюдается смертность Leptinotarsa decemlineata; и в котором рибосомный белок представляет собой рибосомный белок L7 или белок, который кодируется SEQ ID №: 730 или в котором двухцепочечная РНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 989, 988, 1104 или 1105. Связанные аспекты настоящего изобретения включают изолированные РНК, используемые в данной композиции, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую обработкой данной композицией.

[0077] В различных вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция для борьбы с видом рода Leptinotarsa представлена по меньшей мере в одной форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, содержащую нуклеотид, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. Вид рода Leptinotarsa, с которым борются, как правило, представляет собой вид, который заражает растение. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция представляет собой по меньшей мере один имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частиц, катышка или капсулы, имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает имплантацию в растение имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция представляет собой по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В одном варианте реализации изобретения инсектицидная композиция может проглатываться или иным способом впитываться внутрь видов рода Leptinotarsa. Например, инсектицидная композиция может быть в форме приманки. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого как, описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В одном варианте реализации изобретения инсектицидная композиция дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В альтернативном варианте такие дополнительные компоненты или пестицидные агенты могут быть предложены отдельно, например, при раздельном локальном применении или путем трансгенной экспрессии в растении. В альтернативном варианте растение локально обрабатывали инсектицидной композицией, а также с отдельным (предшествующим, следующим или одновременным) применением вещества, которое улучшает эффективность инсектицидной композиции. Например, при первом локальном применении растение может быть опрыскано раствором, содержащим неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, с последующим вторым локальным применением инсектицидной композиции, или наоборот.

[0078] Предполагается, что комбинация определенных РНК, используемых в данном способе, (например, дцРНК триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только РНК или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что инсектицидная композиция, содержащая одну или более РНК и один или более неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, вызывает синергический эффект, улучшая профилактику или борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa.

[0079] Вид рода Leptinotarsa, с которым борются, как правило, представляет собой вид, который заражает растение. Растение может быть любым растением, которое подлежит заражению видом Leptinotarsa. Особый интерес представляют варианты реализации изобретения, в которых растение представляет собой пасленовое растение (семейство пасленовых). Примеры включают растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой семя непроросшего пасленового растения, пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой "посадочный картофель", что означает клубень картофеля или часть клубня картофеля, которые могут развиваться в новые растения картофеля. В некоторых вариантах реализации изобретения использование инсектицидной композиции приводило в результате к борьбе с видами рода Leptinotarsa, например, задержке росте, возрастанию смертности, снижению репродуктивной способности, снижению или прекращению пищевого поведения или движения, или снижению или прекращению стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах реализации изобретения борьба с видами рода Leptinotarsa наблюдается как улучшение роста или повышение урожайности пасленовых растений, обработанных инсектицидной композицией, по сравнению с растениями, не обработанными инсектицидной композиции. В некоторых вариантах реализации изобретения борьба с видами рода Leptinotarsa наблюдается как снижение числа яиц, личинок или взрослых особей видов рода Leptinotarsa, снижение дефолиации или других повреждений растения, или повышение урожайности заготавливаемых плодов (например, томатов или баклажанов) или клубней (например, картофеля).

[0080] В различных вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция содержит микробную клетку или продуцируется микроорганизмом. Например, инсектицидная композиция может включать или может быть получена в бактериях или дрожжевых клетках. В аналогичных вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция содержит трансгенную клетку растения или получена в растительной клетке (например, клетке растения, транзиентно экспрессирующей полинуклеотид); такие растительные клетки могут быть клетками растения, или клетками, выращенными в культуре ткани или в клеточной суспензии.

[0081] Инсектицидная композиция может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa путем применения композиции к растению или поверхности объекта, который заражается видами рода Leptinotarsa, например, путем опрыскивания, опыления или покрытия растения, или семени растения, или посадочного картофеля, или путем пропитывания почвы или обработкой в борозду, или путем применения искусственного питания. Инсектицидная композиция может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa при искусственном рационе питания, разработанном для удовлетворения конкретных потребностей питания для поддержания видов рода Leptinotarsa, причем искусственный рацион дополняется определенным количеством РНК, полученной из отдельного источника, такого как химический синтез или очищенный после микробной ферментации; такой вариант реализации изобретения может быть полезным, например, для определения времени и количества режимов эффективной обработки РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция предоставляется для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме растительной клетки, или компонентов растительной клетки, или микроорганизма (такого как бактерия или дрожжи), или продукта микробной ферментации, или синтетического рациона. В одном варианте реализации изобретения инсектицидная композиция предлагается в форме приманки, которая поглощается видами рода Leptinotarsa. Инсектицидная композиция может быть предоставлена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa ​​в форме обработанного семени (или посадочного картофеля).

[0082] В одном варианте реализации изобретения инсектицидная композиция предложена в форме любого растения, которое подлежит заражению видом рода Leptinotarsa, в котором РНК содержится в или на растении. Такие растения могут быть стабильно трансгенными растениями, экспрессирующими РНК, или не трансгенными растениями, которые транзиентно экспрессируют РНК, или теми, которые были обработаны РНК, например, путем опрыскивания или покрытия. Стабильно трансгенные растения, как правило, содержат интегрированную в их геном рекомбинантную генетическую конструкцию, которая кодирует РНК. Особый интерес представляют варианты реализации изобретения, в которых растение представляет собой пасленовое растение (семейство пасленовых). Примеры включают растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой семя непроросшего пасленового растения, пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой "посадочный картофель", что означает клубень картофеля или часть клубня картофеля, которые могут развиваться в новые растения картофеля.

[0083] РНК полезные для инсектицидной композиции может быть одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц). Варианты реализации изобретения включают такие, в которых РНК представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), антисмысловой одноцепочечной (оцРНК) или двухцепочечной РНК (дцРНК); может быть использована смесь РНК любого из этих типов. В одном варианте реализации изобретения используется двухцепочечный ДНК/РНК гибрид. РНК может включать компоненты, отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, один вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит концевые дезоксирибонуклеотиды.

[0084] РНК в инсектицидной композиции имеет по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту целевого гена эквивалентной длины или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичны фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[0085] РНК в инсектицидной композиции содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения сегмент содержит более чем 18 смежных нуклеотидов, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый сегмент, содержащийся в РНК, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК, например, каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина РНК или длина каждого сегмента, содержащегося в РНК, меньше суммарной длины целевой последовательности (ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина РНК находится в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных РНК) или пар оснований (для двухцепочечных РНК). В некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере одну цепь РНК в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов в длину. Варианты реализации изобретения включают те, в которых РНК содержит по меньшей мере один сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им; или в которых РНК кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[0086] РНК в инсектицидной композиции, как правило, разработана для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения РНК разработана для супрессии одного или более генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработана для супрессии множества генов из данной группы, или направляться к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения РНК содержит множество отрезков или сегментов, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения РНК может включать многочисленные отрезки в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[0087] Общая длина РНК в инсектицидной композиции может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. Иными словами, общая длина РНК может быть больше, чем длина отрезка или сегмента РНК, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, РНК может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения РНК содержит дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения РНК содержит дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения РНК включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липких концов, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотиды для образования 3’- липких концов. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всей РНК не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющем последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения РНК содержит по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[0088] В различных вариантах реализации изобретения РНК в инсектицидной композиции состоит из встречающихся в природе рибонуклеотидов. Варианты реализации изобретения включают, например, синтетические РНК, состоящие полностью из рибонуклеотидов или в основном из рибонуклеотидов, но с одним или более концевыми дезоксирибонуклеотидами или одним или более концевыми дидезоксирибонуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК включает неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК включает химически модифицированные нуклеотиды. (а) РНК в инсектицидной композиции обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых РНК является химически синтезированной (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученной путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации.

[0089] В некоторых вариантах реализации изобретения РНК предлагается в качестве изолированной РНК, которая не является частью экспрессионной генетической конструкции. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК предлагается в качестве изолированной РНК, которая не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие РНК могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные РНК в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных РНК), или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных РНК). В альтернативном варианте РНК может быть предложена в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включена в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы разработаны для включения дополнительных элементов, например, как для включения дополнительной РНК, кодирующей аптамер или рибозим, или экспрессионной кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

СПОСОБ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ, ИМЕЮЩИХ УЛУЧШЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАРАЖЕНИЯМ ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA, И РАСТЕНИЯ И СЕМЕНА, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЕ ТАКИМ СПОСОБОМ

[0090] В другом аспекте настоящее изобретение касается способа предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающего экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, таким способом, что полученное растение демонстрирует улучшенную устойчивость к видам рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, в котором полинуклеотид не экспрессируется. В одном варианте реализации изобретения способ включает экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту целевого гена эквивалентной длины или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарной к ней ДНК. В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094. "Экспрессия полинуклеотида в растении", как правило, означает "экспрессию РНК-транскрипта в растении", например, экспрессию в растении РНК, содержащей рибонуклеотидную последовательность, которая является антисмысловой или по существу комплементарной по меньшей мере фрагменту целевого гена или ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или причем полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой РНК шпильку, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. Однако, полинуклеотид, экспрессированный в растении, также может быть ДНК (например, ДНК, полученной в растении в ходе репликации генома), или РНК, которая кодируется такой ДНК. Связанные аспекты изобретения включают изолированные полинуклеотиды, используемые в данном способе, и растения, имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспечиваемую данным способом.

[0091] Способ включает экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид доставляется в растение в форме ДНК (например, в форме изолированной молекулы ДНК, или в качестве экспрессионной генетической конструкции, или в качестве вектора для трансформации), а полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой вторичный полинуклеотид (например, РНК транскрипт первичного полинуклеотида) в растении. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид экспрессируется в растении через экспрессию трансгена, то есть через стабильную интеграцию полинуклеотида в геноме растения, с которого он может экспрессироваться в клетке или клетках растения. В одном варианте реализации изобретения первичный полинуклеотид (например, рекомбинантная ДНК конструкция, содержащая промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена) стабильно интегрирован в геном растения, с которого в клетке или клетках растения экспрессируются вторично полученные полинуклеотиды (например, РНК транскрипт, содержащий транскрипт сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). Способы получения стабильно трансформированных растений предложены в разделе, озаглавленном "Создание и использование трансгенных клеток растения и трансгенных растений".

[0092] В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии (то есть экспрессия не является результатом стабильной интеграции последовательности в геном растения). В таких вариантах реализации изобретения способ может включать этап введения полинуклеотида (например, дцРНК или дцДНК) в растение обычными технологиями, известными в данной области техники. Например, транзиентная экспрессия может быть достигнута посредством инфильтрации раствора с полинуклеотидом в лист растения при помощи шприца без иглы.

[0093] В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид, доставляется в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученный вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении. В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид представляет собой один или более, выбранный из: а) одноцепочечной молекулы РНК (оцРНК), б) одноцепочечной молекулы РНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы РНК, в) двухцепочечной молекулы РНК (дцРНК), г) одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК), д) одноцепочечной молекулы ДНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы ДНК, е) одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, ж) двухцепочечной молекулы ДНК (дцДНК), з) двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, и и) двухцепочечной гибридной молекулы РНК/ДНК, или их комбинаций. В конкретных вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид вводится в растение путем локального применения к растению композиции, содержащей полинуклеотид, в подходящей форме, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян пасленового растения или обработка посадочного картофеля. Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В таких вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, может дополнительно включать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых; в одном варианте реализации изобретения композиция дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения локально применяемая композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В альтернативном варианте такие дополнительные компоненты или пестицидные агенты могут быть предложены отдельно, например, при раздельном локальном применении или путем трансгенной экспрессии в растении. В альтернативном варианте растение локально обрабатывали композицией, содержащей полинуклеотид, а также с отдельным (предшествующим, следующим или одновременным) применением вещества, которое улучшает эффективность композиции, содержащей полинуклеотид. Например, при первом локальном применении растение может быть опрыскано раствором, содержащим неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, с последующим вторым локальным применением композиции, содержащей полинуклеотид, или наоборот.

[0094] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, используемых в данном способе, (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что трансгенное растение, экспрессирующее по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена или ДНК, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах), и один или более генов, кодирующих неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, демонстрируют синергически улучшенную устойчивость к заражениям видами рода Leptinotarsa.

[0095] В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид, доставлятся в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученый вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении; участок применения первичного полинуклеотида не обязательно должен быть тем же участком, на котором вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется. Например, первичный полинуклеотид может быть доставлен к растению путем локального применения на лист, или путем инъекции в стебель, а вторичный полинуклеотид может транзиентно экспрессироваться в другом месте растения, например, в корнях или по всему растению. В некоторых вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к надземным частям растения, например, путем опрыскивания или опыления листьев, стеблей и цветущих частей растения. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к подземным частям растения, таким как корни, например, с помощью пропитывания почвы. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к семенам (или, в случае картофеля, локально применяется к посадочному картофелю), которые формируются на растении, имеющем улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессируемый в растении, представляет собой РНК, которая может быть одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц) РНК, или их комбинацией.

[0096] В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид (ДНК или РНК, или та и другая) доставляется к растению, а вторичный полинуклеотид, имеющий последовательность, соответствующую (одинаковую или комплементарную) первичному полинуклеотиду, в последствии экспрессируется в растении. В таких вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой РНК транскрипт, который может быть оцРНК или дцРНК, или их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид доставляется в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученный вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении; в таких вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид представляет собой один или более, выбранный из: а) одноцепочечной молекулы РНК (оцРНК), б) одноцепочечной молекулы РНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы РНК, в) двухцепочечной молекулы РНК (дцРНК), г) одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК), д) одноцепочечной молекулы ДНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы ДНК, е) одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, ж) двухцепочечной молекулы ДНК (дцДНК), з) двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, и и) двухцепочечной гибридной молекулы РНК/ДНК, или их комбинаций. В таких вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид может состоять из встречающихся в природе нуклеотидов, таких как те, которые встречаются в ДНК и РНК. В таких вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид может быть химически модифицированным или содержать химически модифицированные нуклеотиды. Первичный полинуклеотид обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых первичный полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации. Первичный полинуклеотид может быть предложен в качестве РНК или ДНК фрагмента. В альтернативном варианте первичный полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор; такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[0097] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой молекулу РНК и может быть относительно коротким, как например, одно- или двухцепочечные РНК в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных РНК), или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных РНК). В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[0098] Полинуклеотид, экспрессированный в растении, имеет по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена или комплементарных им ДНК. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичные фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[0099] Полинуклеотид, экспрессированный в растении, как правило, разработан для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, разработан для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, разработан для супрессии одного или более генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии множества генов из данной группы, или направляться к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит множество отрезков или сегментов, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, может включать многочисленные отрезки в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК; сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[00100] Общая длина полинуклеотида, экспрессированного в растении, может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Иными словами, общая длина полинуклеотида, экспрессированного в растении, может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, полинуклеотид, экспрессированный в растении, может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (то есть имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце, или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида, экспрессированного в растении, не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[00101] В родственном аспекте настоящее изобретение касается растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, обеспеченную путем экспрессии в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, в следствии чего полученное растение имеет улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, в котором полинуклеотид не экспрессируется. В родственном аспекте настоящее изобретение касается растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, обеспеченную путем экспрессии в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, в следствии чего полученное растение имеет улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, в котором полинуклеотид не экспрессируется. Вариант реализации изобретения представляет собой пасленовое растение, имеющее улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, обеспеченную путем экспрессии в растении РНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или экспрессии в растении РНК шпильки, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В еще одном аспекте настоящее изобретение касается семени (в особенности семени, дающего трансгенное потомство), полученного из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, которое предложено по данному способу. Также рассматривается товарный продукт, полученный из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, которое предложено по данному способу, и товарный продукт, полученный из семени, дающего трансгенное потомство, такого растения.

РЕКОМБИНАНТНЫЕ КОНСТРУКЦИИ ДНК ДЛЯ БОРЬБЫ С ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA

[00102] Другой аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантной ДНК конструкции, содержащей гетерологический промотор, функционально связанный с элементом ДНК, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция содержит гетерологический промотор, функционально связанный с: а) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; или б) ДНК, содержащей 21 или более смежных нуклеотидов, имеющих 100% идентичность фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094, или комплементарным к ним ДНК; или в) ДНК, кодирующей по меньшей мере один элемент сайленсинга, который является комплементарным по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена, причем целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 730, SEQ ID №: 807, SEQ ID № 1-725, SEQ ID № 726-729, SEQ ID № 731-806, SEQ ID № 808-830 и SEQ ID № 1087-1094; или г) ДНК, кодирующей по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который является комплементарным целевому гену, выбранному из генов в группе последовательностей целевых генов, или к РНК, транскрибируемой с целевого гена; или д) ДНК, кодирующей РНК, содержащей по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который является комплементарным к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы триггерных последовательностей, или комплементарных им, или ортологичной нуклеотидной последовательности из видов рода Leptinotarsa или видов рода Tribolium, причем ортологичная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере около 95% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы триггерных последовательностей, причем процент идентичности последовательности рассчитывают для такой же длины; или е) ДНК, кодирующей РНК, содержащую по меньшей мере одну область двухцепочечной РНК, по меньшей мере одна цепь которой содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, который является комплементарным к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы триггерных последовательностей, или комплементарных им, или ортологичной нуклеотидной последовательности из видов рода Leptinotarsa или видов Tribolium, причем ортологичная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере около 95% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы триггерных последовательностей, причем процент идентичности последовательности рассчитывают для такой же длины; или ж) ДНК, кодирующей РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы триггерных последовательностей, или комплементарных им. Варианты реализации изобретения включают рекомбинантную ДНК конструкцию, содержащую гетерологический промотор, функционально связанный с элементом ДНК, кодирующей РНК, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или содержащую гетерологический промотор, функционально связанный с элементом ДНК, кодирующей РНК шпильку, который кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. Варианты реализации изобретения включают рекомбинантную ДНК конструкцию, содержащую гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, которая кодирует дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. Рекомбинантные ДНК конструкции могут быть использованы для получения растений, имеющих улучшенную устойчивость заражению видами рода Leptinotarsa, например, путем экспрессии в растении транскрипта такой рекомбинантной ДНК конструкции. Рекомбинантные ДНК конструкции могут быть также использованы в производстве полинуклеотидов, полезных для составления композиций, которые могут быть применены к растению, семени, пропагативным частям растения, почве или полям, или поверхности, нуждающихся в защите от заражения видами рода Leptinotarsa. Связанные аспекты настоящего изобретения включают композиции, содержащие рекомбинантную ДНК конструкцию; хромосому растения, или пластиду, или рекомбинантный растительный вирусный вектор или рекомбинантный бакуловирусный вектор, содержащие рекомбинантную ДНК конструкцию; трансгенную клетку пасленового растения, имеющую в своем геноме рекомбинантную ДНК конструкцию, необязательно содержащую в своем геноме ДНК, кодирующую по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, и трансгенное пасленовое растение, включая трансгенную клетку пасленового растения, или плод, семя, или пропагативную частб трансгенного пасленового растения; и растения имеющие улучшенную устойчивость к Leptinotarsa, обеспеченную путем экспрессии или обработки рекомбинантной ДНК конструкцией, или РНК, которая ей кодируется.

[00103] Рекомбинантная ДНК конструкция, содержащей гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов имеет последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичные фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения ДНК имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности с ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[00104] Следовательно, рекомбинантная ДНК конструкция содержит гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, разработанных для супрессии экспрессии целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения ДНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения сегмент содержит более чем 18 смежных нуклеотидов, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения ДНК, кодирующая РНК, содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения ДНК кодирует двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый сегмент, который содержится в ДНК, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина ДНК или длина каждого сегмента, содержащегося в полинуклеотиде, меньше суммарной длины целевой последовательности (ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина ДНК находится в пределах около 50 до около 500. В некоторых вариантах реализации изобретения ДНК кодирует РНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[00105] Рекомбинантная ДНК конструкция включает гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, как правило, разработана для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция разработана для супрессии одного или более генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработана для супрессии множества генов из данной группы, или направляться к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция содержит гетерологический промотор, функционально связанный с множеством отрезков или сегментов, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция может включать гетерологический промотор, функционально связанный с множеством отрезков в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[00106] Рекомбинантная ДНК конструкция включает гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, которая может иметь общую длину, которая свыше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды, в дополнение к сегменту, по меньшей мере к одному сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих последовательность от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. Иными словами, общая длина ДНК может быть больше, чем длина сегмента ДНК, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, ДНК может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, содержащей дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, содержащей дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, содержащей один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, которая кодирует двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липких концов. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всей ДНК, функционально связанной с гетерологическим промотором, не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, содержащей по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК.

[00107] В рекомбинантных ДНК конструкциях гетерологический промотор является функционально связанным с ДНК, кодирующей транскрипт, который может быть одноцепочечным (оц) или двухцепочечным (дц), или их комбинацией. Варианты реализации изобретения по способу включают те, в которых ДНК кодирует транскрипт, включающий смысловую одноцепочечную РНК (оцРНК), антисмысловую оцРНК или двухцепочечную РНК (дцРНК), или комбинацию любых из них.

[00108] Рекомбинантная ДНК конструкция обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых рекомбинантную ДНК конструкцию синтезируют in vitro, получают путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), получают путем экспрессии в клетке растения, или получают путем микробной ферментации.

[00109] Гетерологический промотор, используемый в рекомбинантных ДНК конструкциях, выбран из группы, состоящей из промотора, функционального в растении, промотора, функционального в прокариотах, промотора, функционального в клетке грибов, и бакуловирусного промотора. Не ограничивающие примеры промоторов описаны в разделе, озаглавленном "Промоторы".

[00110] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкцию содержит второй промотор, также функционально связанный с ДНК. Например, ДНК, содержащая по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, может фланкирована двумя промоторами, расположенными таким образом, что промоторы транскрибируют в противоположных направлениях и сходящимся способом, давая противоположные цепи транскриптов ДНК, которые являются комплементарными между собой и способны гибридизоваться друг с другом с образованием двухцепочечной РНК. В одном варианте реализации изобретения ДНК расположена между двумя корне-специфическими промоторами, которые делают возможной транскрипцию ДНК в противоположных направлениях, что в результате приводит к образованию дцРНК.

[00111] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция содержит другие элементы ДНК, в дополнение к гетерологическому промотору, функционально связанному с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им ДНК. Такие элементы ДНК известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются этими, интроны, сайты узнавания рекомбиназы, аптамеры или рибозимы, дополнительные и дополнительные экспрессионные кассеты для экспрессии кодирующих последовательностей (например, для экспрессии трансгена, такого как инсектицидный белок или селективный маркер) или некодирующих последовательностей (например, для экспрессии дополнительных супрессорных элементов). Включение одного или нескольких сайтов узнавания для связывания и гидролиза малых РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которая экспрессируется только в определенной клетке или ткани) ведет к более точному характеру экспрессии в растении, причем экспрессия рекомбинантной ДНК конструкции супрессируется, когда малые РНК экспрессируются.

[00112] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция предложена в рекомбинантном векторе. Под "рекомбинантным вектором" подразумевают рекомбинантную полинуклеотидную молекулу, которая используется для передачи генетической информации от одной клетки к другой. Варианты реализации, подходящие для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются этими, рекомбинантные плазмиды, рекомбинантные космиды, искусственные хромосомы и рекомбинантные вирусные векторы, такие как рекомбинантные растительные вирусные векторы и рекомбинантные бакуловирусные векторы. Альтернативные варианты реализации изобретения включают рекомбинантные плазмиды, рекомбинантные космиды, искусственные хромосомы и рекомбинантные вирусные векторы, такие как рекомбинантные растительные вирусные векторы и рекомбинантные бакуловирусные векторы, содержащие элемент ДНК без гетерологического промотора.

[00113] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная ДНК конструкция предложена в хромосоме растения или пластиде, например, в трансгенной клетке растения или в трансгенном растении. Таким образом, настоящим изобретением также охватывается трансгенная клетка растения, имеющая в своем геноме рекомбинантную ДНК конструкцию, а также трансгенное растение или частично трансгенное растение, включающие такую трансгенную клетку растения. Частично трансгенные растения включают, например, нетрансгенный привой, привитый на трансгенном подвое, включающем трансгенную клетку растения. Варианты реализации изобретения включают трансгенный подвой томата, включающий трансгенную клетку растения. Растение может быть любым растением, которое подлежит заражению видами рода Leptinotarsa. Особый интерес представляют варианты реализации изобретения, в которых растение представляет собой пасленовое растение (семейство Пасленовых). Примеры включают растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой семя непроросшего пасленового растения, пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых растение представляет собой "посадочный картофель", что означает клубень картофеля или часть клубня картофеля, которые могут развиваться в новые растения картофеля. В еще одном аспекте настоящее изобретение касается семени (в особенности семени, дающего трансгенное потомство), полученного из трансгенного растения, имеющего в своем геноме рекомбинантную ДНК конструкцию, как описано в данном документе. Варианты реализации изобретения также охватывают трансгенный посадочный картофель, имеющий в своем геноме рекомбинантную ДНК конструкцию, как описано в данном документе. Также рассматривается товарный продукт, полученный из такого трансгенного растения, и товарный продукт, полученный из семени, дающего трансгенное потомство, от такого трансгенного растения.

[00114] Рекомбинантная ДНК конструкция может быть предложена в композиции для локального применения к поверхности растения или семени растения, или для локального применения к любому субстрату, нуждающихся в защите от заражения видами рода Leptinotarsa. Также рекомбинантная ДНК конструкция может быть предложена в композиции для локального применения к видам рода Leptinotarsa, или в композиции для проглатывания видами рода Leptinotarsa. В различных вариантах реализации изобретения такие композиции, содержащие рекомбинантную ДНК конструкцию, предложены в форме по меньшей мере одной, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. Локальное применение может быть в форме локальной обработки плодов пасленовых растений или семян из плодов пасленовых растений, или в форме локальной обработки клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть включены в композицию, содержащую рекомбинантную ДНК конструкцию, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция для локального применения, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, представляет собой по меньшей мере один локально имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частицы, катышка или капсулы, локально имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает локальную имплантацию в растение локального имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция для локального применения, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, представляет собой по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для локального применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В одном варианте реализации изобретения композиция для локального применения, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, может проглатываться или иным способом впитываться внутрь видов рода Leptinotarsa. Например, композиция для локального применения, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, может быть в форме приманки. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

[00115] Предполагается, что комбинация определенных рекомбинантных ДНК конструкций, описанных в данном документе, (например, рекомбинантных ДНК конструкций, включающих полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) либо при трансгенной экспрессии, либо при локальном применении с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами, либо при трансгенной экспрессии, либо при локальном применении, приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только рекомбинантных ДНК конструкций или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что рекомбинантная ДНК конструкция для экспрессии одного или более полинуклеотидов, а также одного или более генов, кодирующих неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, демонстрируют синергически улучшенную устойчивость к заражениям видами рода Leptinotarsa в растениях, экспрессирующих рекомбинантную ДНК конструкцию. Вариант реализации изобретения относится к рекомбинантной ДНК конструкции для экспрессии РНК, содержащей сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085 и 1095, а также один или более генов, кодирующих неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

[00116] Композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa путем применения композиции к растению или поверхности объекта, который заражается видами рода Leptinotarsa, например, путем опрыскивания, опыления или покрытия растения, или путем пропитывания почвы, или путем применения искусственного питания. Композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa при искусственном рационе питания, разработанном для удовлетворения конкретных потребностей питания для поддержания видов рода Leptinotarsa, причем искусственный рацион дополняется определенным количеством рекомбинантной ДНК конструкции, полученной из отдельного источника, такого как синтез in vitro, или очищенной после микробной ферментации, или другого биологического источника; такой вариант реализации изобретения может быть полезным, например, для определения времени и количества режимов эффективной обработки. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, предлагается для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме растительной клетки, или компонентов растительной клетки, или микроорганизма (такого как бактерия или дрожжи), или продукта микробной ферментации, или синтетического рациона. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, предлагается в форме приманки, которая поглощается видами рода Leptinotarsa. Композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме обработанного семени.

[00117] В различных вариантах реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, содержит микробную клетку или продуцируется микроорганизмом. Например, композиция, для содержания рекомбинантной ДНК конструкции, может включать или может быть получена в клетках бактерий или дрожжей. В аналогичных вариантах реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную ДНК конструкцию, включает трансгенную клетку растения или продуцируется в растительной клетке (например, клетка растения транзиентно экспрессирующая рекомбинантную ДНК конструкцию); такие растительные клетки могут быть клетками растения, или клетками, выращенными в культуре ткани или в клеточной суспензии.

ТРАНСГЕННЫЕ КЛЕТКИ ПАСЛЕНОВОГО РАСТЕНИЯ

[00118] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к трансгенным клеткам пасленового растения, экспрессирующим полинуклеотид, полезный в способах, описанных в данном документе, для супрессирования экспрессии целевого гена у видов рода Leptinotarsa или для борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa. В одном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В одном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует РНК, содержащую по меньшей мере один элемент сайленсинга по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности целевого гена личинок ​​видов рода Leptinotarsa, причем последовательность целевого гена выбрана из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В одном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует РНК, которая супрессирует экспрессию целевого гена у видов рода Leptinotarsa, который контактирует или проглатывает РНК, причем РНК включает по меньшей мере один элемент сайленсинга, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, комплементарный фрагменту целевого гена, и причем целевой ген выбран из группы, состоящей из генов в группе последовательностей целевых генов. Конкретный вариант реализации изобретения относится к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует РНК, которая супрессирует экспрессию целевого гена у видов рода Leptinotarsa, который контактирует или проглатывает РНК, причем РНК включает по меньшей мере один элемент сайленсинга, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, комплементарный фрагменту одного или более целевых генов экзоцисты; подходящие целевые гены экзоцисты включают гены экзоцисты Leptinotarsa, предложенные в таблице 4, или гомологичные последовательности, определенные из других видов насекомых. В одном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует РНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных их, или рекомбинантную ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109; варианты реализации изобретения включают трансгенную клетку пасленового растения, имеющую в своем геноме рекомбинантную ДНК, которая кодирует дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей.Такие трансгенные клетки пасленового растения полезны для обеспечения трансгенного пасленового растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, по сравнению с контрольным растением не имеющим таких растительных клеток. Трансгенная клетка пасленового растения может быть изолированной трансгенной клеткой пасленового растения, или трансгенной клеткой пасленового растения, выращенной в культуре, или трансгенной клеткой любого трансгенного пасленового растения, которое является объектом заражения видами рода Leptinotarsa. Примеры включают трансгенное пасленовое растение, выбранное из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана. Варианты реализации изобретения включают те, в которых трансгенное пасленовое растение представляет собой семя непроросшего трансгенного пасленового растения, трансгенное пасленовое растение на вегетативной стадии развития, или трансгенное пасленовое растение на репродуктивной стадии развития. Варианты реализации изобретения включают те, в которых трансгенное пасленовое растение представляет собой клубень картофеля или часть клубня картофеля ("посадочный картофель"), которые могут развиваться в новые трансгенные растения картофеля.

[00119] В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная ДНК является стабильно интегрированной в геном трансгенного пасленового растения, с которого она может экспрессироватся в клетке или клетках трансгенного пасленового растения. Способы получения стабильно трансформированных растений предложены в разделе, озаглавленном "Создание и использование трансгенных клеток растения и трансгенных растений".

[00120] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к трансгенной клетке пасленового растения, имеющей в своем геноме рекомбинантную ДНК, кодирующую РНК, которая супрессирует экспрессию целевого гена у видов рода Leptinotarsa, который контактирует с РНК или проглатывает ее внутрь, причем РНК содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга комплементарный целевому гену, и причем последовательность целевого гена выбрана из группы последовательностей целевого гена, или комплементарных им. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один из 18 или более смежных нуклеотидов, способных гибридизоваться in vivo или гибридизоваться при физиологических условиях (например, таких как физиологические условия, которые обычно встречаются в клетках видов рода Leptinotarsa) фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Количество смежных нуклеотидов составляет по меньшей мере 18, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20 -30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения количество смежных нуклеотидов больше, чем 18, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый элемент сайленсинга, содержащегося в РНК, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В конкретных вариантах реализации изобретения РНК имеет длину в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения РНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или РНК кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109.

[00121] В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенная клетка пасленового растения дополнительно способна экспрессировать дополнительные последовательности гетерологической ДНК. В одном варианте реализации изобретения трансгенная клетка пасленового растения имеет геном, который дополнительно содержит рекомбинантную ДНК, кодирующую по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В конкретных вариантах реализации изобретения трансгенная клетка пасленового растения имеет в своем геноме стабильно интегрированную (I) рекомбинантную ДНК, кодирующую по меньшей мере одну РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 831-1085 и 1095, и (II) ДНК, кодирующую по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

[00122] В родственном аспекте настоящее изобретение относится к трансгенному пасленовому растению, включающему трансгенную клетку пасленового растения, к товарному продукту, полученному из трансгенного пасленового растения, и к семени пасленового растения, дающего трансгенное потомство, или к трансгенной пропагативной части трансгенного пасленового растения. Варианты реализации изобретения включают трансгенное растение томата, подвой трансгенного томата, трансгенный баклажан или трансгенное растение картофеля, имеющие улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa. Также рассматривается товарный продукт, полученный из трансгенного пасленового растения, и товарный продукт, полученный из семени, дающего трансгенное потомство, от такого трансгенного пасленового растения.

ИНСЕКТИЦИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ БОРЬБЫ С ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA

[00123] В другом аспекте настоящего изобретения предложена инсектицидная композиция для борьбы с видами рода Leptinotarsa, причем инсектицидная композиция состоит по существу из молекулы РНК, которая приводит к смертности или задержке роста у видов рода Leptinotarsa при проглатывании или контакте с видами рода Leptinotarsa, и причем молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу комплементарные фрагменту ДНК, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В данном контексте "борьба" с видами рода Leptinotarsa включает стимулирование физиологического или поведенческого изменения у видов рода Leptinotarsa (взрослой особи или личинки), такого как, но не ограничиваясь этим, задержка роста или возрастание смертности. В некоторых вариантах реализации изобретения "борьба" с видами рода Leptinotarsa достигается путем снижения репродуктивной способности, снижения или прекращения пищевого поведения или движения, или снижения или прекращения стадии развития метаморфоза у видов рода Leptinotarsa. Как правило, молекулу РНК изолируют, то есть по существу очищают от смеси, например, из ферментационной смеси или из после синтеза in vitro. В одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу комплементарные фрагменту ДНК, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или им комплементарных, или в которых молекула РНК, кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК представляет собой двухцепочечную, и по меньшей мере один сегмент имеет длину в пределах от около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК представляет собой дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается инсектицидная композиция для борьбы с видами рода Leptinotarsa, причем инсектицидная композиция содержит двухцепочечную РНК, причем по меньшей мере одна цепь двухцепочечной РНК является комплементарной по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду гена, который кодирует рибосомный белок, или к РНК, которая транскрибируется с гена; в котором вид Leptinotarsa представляет собой Leptinotarsa decemlineata; и в котором индуцируется РНК-интерференция и наблюдается смертность Leptinotarsa decemlineata; и в котором рибосомный белок представляет собой рибосомный белок L7 или белок, который кодируется SEQ ID №: 730 или в котором двухцепочечная РНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 989, 988, 1104 или 1105.

[00124] Варианты реализации изобретения по молекуле РНК включает те, в которых сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов имеет последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% комплементарности фрагменту ДНК, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к нему ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) комплементарные фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% комплементарности с ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[00125] Варианты реализации изобретения по молекуле РНК включают по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, разработанных для супрессии экспрессии целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. Количество смежных нуклеотидов в сегменте по меньшей мере 18, например, в промежутках между 18-24, или между 18-28, или между 20-30, или между 20-50, или между 20-100, или между 50-100, или между 50-500, или между 100-250, или между 100-500, или между 200-1000, или между 500-2000, или даже свыше. В некоторых вариантах реализации изобретения количество смежных нуклеотидов больше, чем 18, например, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, или свыше чем 30, например, около 35, около 40 около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 350, около 400, около 450, около 500, или свыше, чем 500 смежных нуклеотидов. В конкретных вариантах реализации изобретения молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения РНК представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК) с одной цепью, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности последовательности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; при экспрессии в качестве пар оснований, такая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежной, точно совпадающей пары оснований, которая соответствует фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения каждый сегмент, содержащийся в молекуле РНК, имеет длину большую, чем та, которая является типичной для встречающихся в природе регуляторных малых РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый сегмент имеет длину по меньшей мере около 30 смежных нуклеотидов (или пар оснований). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина молекулы РНК или длина каждого сегмента, содержащегося в молекуле РНК, меньше суммарной длины целевой последовательности (ДНК или целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения общая длина молекулы РНК находится в пределах от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция состоит по существу из эффективного, для инсектицидного действия, количества двухцепочечной молекулы РНК с одной цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или состоит по существу из эффективного, для инсектицидного действия, количества РНК шпильки, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция состоит по существу из эффективного, для инсектицидного действия, количества двухцепочечной молекулы РНК с одной цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы триггерных последовательностей.

[00126] Молекула РНК, как правило, разработана для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или те и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения молекула РНК разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения молекула РНК разработана для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и может быть разработан для супрессии многочисленных генов из данной группы, или для направления к различным областям одного или более из этих генов. Варианты реализации изобретения по молекуле РНК включают по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих последовательность, разработанную для супрессии одного или более генов, причем каждый ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает многочисленные отрезки или сегменты, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% комплементарности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности. Например, в одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает многочисленные отрезки в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок состоит по меньшей мере из одного сегмента из 21 смежного нуклеотида со 100% комплементарности последовательности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК; сегменты могут быть из различных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[00127] Молекула РНК может иметь большую общую длину, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к сегменту, по меньшей мере к одному сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов, имеющему последовательность от около 95% до около 100% комплементарности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ним ДНК. Иными словами, общая длина молекулы РНК может быть больше, чем длина сегмента, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, молекула РНК может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент, по меньшей мере один сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с ДНК или целевым геном, имеющими последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ним ДНК, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости от одного или более сегментов из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В одном варианте реализации изобретения молекула РНК включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце или обоими, прилегающие к сегменту. В другом варианте реализации изобретения молекула РНК представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всей молекулы РНК не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в ДНК или целевом гене, имеющими последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК содержит по меньшей мере два сегмента каждый из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК, имеющим последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевого гена, или комплементарной к ней ДНК.

[00128] Молекула РНК может быть одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц) или комбинацией обоих. Варианты реализации изобретения по молекуле РНК включают смысловую одноцепочечную РНК (оцРНК), антисмысловую оцРНК или двухцепочечную РНК (дцРНК), или комбинацию любых из них. РНК может включать компоненты, отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, один вариант реализации изобретения представляет собой РНК, которая содержит концевые дезоксирибонуклеотиды. В различных вариантах реализации изобретения молекула РНК состоит из рибонуклеотидов, встречающихся в природе. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетическая молекула РНК, состоящая главным образом из рибонуклеотидов, но с одним или более концевыми дезоксирибонуклеотидами или одним или более концевыми дидезоксирибонуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК включает неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК включает химически модифицированные нуклеотиды.

[00129] Молекула РНК обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых молекулу РНК синтезируют in vitro, получают путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), получают путем экспрессии в растительной клетке или получают путем микробной ферментации.

[00130] В некоторых вариантах реализации изобретения молекула РНК включает другие элементы РНК, такие как РНК аптамеры или рибозимы, дополнительный некодирующие РНК (например, дополнительные супрессорные элементы), или один или более сайтов узнавания для связывания и гидролиза малых РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которая экспрессируется только в определенном клетки или ткани).

[00131] Инсектицидная композиция может быть предложены для локального применения к поверхности растения или семени растения, или для локального применения к любому субстрату, нуждающихся в защите от заражения видами рода Leptinotarsa. Также инсектицидная композиция может быть предложена для локального применения к видам рода Leptinotarsa, или в композиции для проглатывания видами рода Leptinotarsa. В различных вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция предложена в форме по меньшей мере одной, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса. Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть включены в инсектицидную композицию, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. Наряду с тем, что инсектицидная композиция состоит по существу из молекулы РНК, в некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная композиция дополнительно включает по меньшей мере один неинсектицидный агент, выбранный из группы, состоящей из агента носителя, соли, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы и антидота. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая рекомбинантную молекулу РНК, дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. Кроме того, инсектицидная композиция может быть использована в комбинации с последующей или предшествующей обработкой полинуклеотидной гербицидной молекулой, неполинуклеотидной гербицидной молекулой, неполинуклеотидным пестицидом (например, по меньшей мере одним пестицидным агентом, выбранным из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus). Связанные композиции включают комбинации молекулы РНК с полинуклеотидной гербицидной молекулой, неполинуклеотидной гербицидной молекулой, неполинуклеотидным пестицидом.

[00132] Инсектицидная композиция может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa путем применения композиции к растению или поверхности объекта, который заражается видами рода Leptinotarsa, например, путем опрыскивания, опыления или покрытия растения, или путем пропитывания почвы, или путем применения искусственного питания. Инсектицидная композиция может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa при искусственном рационе питания, разработанном для удовлетворения конкретных потребностей питания для поддержания видов рода Leptinotarsa, причем искусственный рацион дополняется определенным количеством рекомбинантной молекулы РНК, полученной из отдельного источника, такого как синтез in vitro, или очищенной после микробной ферментации, или другого биологического источника; такой вариант реализации изобретения может быть полезным, например, для определения времени и количества режимов эффективной обработки. Инсектицидная композиция может быть предложена для диетического поглощения видами рода Leptinotarsa в форме обработанного семени.

СПОСОБЫ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ, ИМЕЮЩИХ УЛУЧШЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАРАЖЕНИЯМ ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA, И РАСТЕНИЙ, ЧАСТЕЙ РАСТЕНИЙ И СЕМЯН, ПРЕДОСТАВЛЕННЫХ ТАКИМ СПОСОБОМ

[00133] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу предоставления растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающему обеспечение растения по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ получения растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий обеспечение растения по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере к 21 смежному нуклеотиду целевого гена или к РНК, транскрибируемой с целевого гена, причем целевой ген выбран из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов или РНК, транскрибируемой с целевого гена. В вариантах реализации изобретения эти целевые гены идентифицированы по названиям в таблицах 1, 2 и 4, и включают гены, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, а также родственных генов, включая ортологи из родственных видов насекомых, например, родственные гены из других видов рода Leptinotarsa, видов Tribolium, или других родственных родов. Примеры таких родственных целевых генов включают гены Tribolium castaneum, перечисленные в таблице 1. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечной РНК) химически синтезированы или получены путем экспрессии в микроорганизме или путем экспрессии в растительной клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный последовательности, выбранной из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарных им, или в которых полинуклеотид кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы триггерных последовательностей.

[00134] В одном варианте реализации изобретения способ включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, в результате чего растение, обработанное полинуклеотидной композицией, демонстрирует улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с необработанным растением. "Локальное применение" означает применение к поверхности или внешней части объекта, такой как поверхность или внешняя часть растения, например, применение к поверхностям части растения, такой как лист, стебель, цветок, плод, побег, корень, семя, клубень, цветы, пыльники или пыльца, или применение ко всему растению, или к надземной или подземной части растения. Локальное применение может быть осуществлено на неживых поверхностях, например, применение к почве, или к поверхности, или к матриксу, на которых насекомые Leptinotarsa могут вступать в контакт с полинуклеотидом. В различных вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к растению в подходящей форме, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированноого препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян. В некоторых вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к надземным частям растения, например, путем опрыскивания или опыления листьев, стеблей и цветущих частей растения. Варианты реализации изобретения по способу включают локальное применение опрыскивания листвы (например, опрыскивание жидкой композицией, содержащей полинуклеотид, листьев пасленового растения) или опыления листвы (например, опыление пасленового растения композицией, содержащей полинуклеотид, в форме порошка или носителей частиц). В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к подземным частям растения, таким как корни, например, с помощью пропитывания почвы. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, локально применяется к семени, которое образовано в растении. Локальное применение может быть в форме локальной обработки плодов пасленовых растений или семян из плодов пасленовых растений, или в форме локальной обработки клубней или частей клубня "посадочного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия или опыления посадочного картофеля). Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, содержащую полинуклеотид, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, представляет собой по меньшей мере один локально имплантируемый препарат, выбранный из группы, состоящей из частицы, катышка или капсулы, локально имплантированных в растение; в таких вариантах реализации изобретения способ включает локальную имплантацию в растение локального имплантируемого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, представляет собой по меньшей мере один препарат для применения в борозду, выбранный из группы, состоящей из порошка, гранулы, катышка, капсулы, спрея или смачивателя, или любых других форм, подходящих для локального применения в борозду; в таких вариантах реализации изобретения способ включает обработку в борозду препаратом для применения в борозду. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, может проглатываться или иным способом впитываться внутрь видов рода Leptinotarsa. Например, композиция, содержащая полинуклеотид, может быть в форме приманки. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых. В одном варианте реализации изобретения композиция дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения локально применяемая композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В альтернативном варианте такие дополнительные компоненты или пестицидные агенты могут быть предложены отдельно, например, при раздельном локальном применении или путем трансгенной экспрессии в растении. В альтернативном варианте растение локально обрабатывали композицией, содержащей полинуклеотид, а также с отдельным (предшествующим, следующим или одновременным) применением вещества, которое улучшает эффективность композиции, содержащей полинуклеотид. Например, при первом локальном применении растение может быть опрыскано раствором, содержащим неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, с последующим вторым локальным применением композиции, содержащей полинуклеотид, или наоборот.

[00135] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов (например, полинуклеотидных триггеров, описанных в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что композиция, содержащая один или более полинуклеотидов и один или более неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, вызывает синергический эффект, улучшая профилактику или борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa, при локальном применении к растению.

[00136] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Полинуклеотид, локально применяемый к растению, может быть одноцепочечным (оц) или двухцепочечным (дц).

[00137] Полинуклеотид, локально применяемый к растению, обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации.

[00138] Во многих вариантах реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, предлагается в качестве изолированной ДНК или РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, не является частью экспрессионной генетической конструкции и не имеет дополнительных элементов, таких как промоторные или терминаторные последовательности. Такие полинуклеотиды могут быть относительно короткими, как например, одно- или двухцепочечные полинуклеотиды в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК в пределах от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длиной как любой из дцРНК триггеров, раскрытых в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. Такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[00139] Полинуклеотид, локально применяемый к растению, имеет по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, или которые имеют последовательность от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичные или комплементарные фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту ДНК целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов.

[00140] Полинуклеотид, локально применяемый к растению, как правило, разработан для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид разработан для супрессии одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Варианты реализации изобретения по генам, идентифицированным в группе последовательностей целевых генов, включают, но не ограничиваются этими, кДНК последовательности, выбранные из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, разработан для супрессии одного или более генов, причем каждый ген выбран из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, может быть разработан для супрессии многочисленных генов из данной группы, или для направления к различным областям одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, содержит многочисленные отрезки или сегменты, каждый из которых содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, может включать многочисленные отрезки в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежного нуклеотида со 100% идентичности или 100% комплементарности последовательности фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов; сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям кДНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы в промежутках между или рядом с сегментами.

[00141] Общая длина полинуклеотида, локально применяемого к растению, может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к по меньшей мере одному сегменту смежных нуклеотидов, имеющему последовательность по существу идентичную или комплементарную фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Иными словами, общая длина полинуклеотида, локально применяемого к растению, может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, разработанного для супрессии одного или более целевых генов, причем каждый целевой ген выбран из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, полинуклеотид, локально применяемый к растению, может иметь нуклеотиды, фланкирующие «активный» сегмент по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'-конце, или на обоих 5'- и 3'-концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, содержит дополнительные нуклеотиды, которые не связываются специфически (то есть имеющие последовательность не комплементарную или не идентичную) с целевым геном, выбранным из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры, или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, содержит дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегменту из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности с целевым геном, выбранным из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, включает один такой сегмент с дополнительным G на 5' конце или дополнительным C на 3' конце, или обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для образования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида для образования 3’- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида, локально применяемый к растению, не является на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в целевом гене, выбранном из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, локально применяемый к растению, содержит по меньшей мере два сегмента каждого из 21 смежного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, причем (1) по меньшей мере два сегмента разделены друг от друга одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в целевом гене, выбранном из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов.

[00142] В родственном аспекте настоящее изобретение касается растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, обеспеченную по данному способу, который включает локальное применение к растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, таким способом, что растение, обработанное композицией, содержащей полинуклеотид, демонстрирует улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, по сравнению с необработанным растением. В еще одном аспекте настоящее изобретение касается семени (в особенности семени, дающего трансгенное потомство), полученного из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видом Leptinotarsa, которое предложено по данному способу. Также рассматривается товарный продукт, полученный из растения, имеющего улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, которое предложено по данному способу, и товарный продукт, полученный из семени, дающего трансгенное потомство, такого растения.

[00143] В другом варианте реализации изобретения способ включает экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту целевого гена эквивалентной длины, выбранным из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, в результате чего растение, экспрессирующее полинуклеотид, демонстрирует улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с растением не экспрессирующим полинуклеотид. В одном варианте реализации изобретения способ включает экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В вариантах реализации изобретения эти целевые гены идентифицированы по названиям в таблицах 1, 2 и 4, и включают гены, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из группы последовательностей целевого гена, а также родственных генов, включая ортологи из родственных видов насекомых, например, родственные гены из других видов рода Leptinotarsa, видов Tribolium, или других родственных родов. Примеры таких родственных целевых генов включают гены Tribolium castaneum, перечисленные в таблице 1. "Экспрессия полинуклеотида в растении", как правило, означает "экспрессию РНК транскрипта в растении". Тем не менее, полинуклеотид, который экспрессирован в растении, также может быть ДНК, например, ДНК, полученной в растении во время геномной репликации.

[00144] Способ включает экспрессию по меньшей мере одного полинуклеотида в растении, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид доставляется в растение в форме ДНК (например, в форме изолированной молекулы ДНК, или в качестве экспрессионной генетической конструкции, или в качестве вектора для трансформации), а полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой вторичный полинуклеотид (например, РНК транскрипт первичного полинуклеотида) в растении. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид экспрессируется в растении через экспрессию трансгена, то есть через стабильную интеграцию полинуклеотида в геноме растения, с которого он может экспрессироватся в клетке или клетках растения. В одном варианте реализации изобретения первичный полинуклеотид (например, рекомбинантная ДНК конструкция, содержащая промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов) стабильно интегрирован в геном растения, с которого в клетке или клетках растения экспрессируются вторично полученные полинуклеотиды (например, РНК транскрипт, содержащий транскрипт сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов). Способы получения стабильно трансформированных растений предложены в разделе, озаглавленном "Создание и использование трансгенных клеток растения и трансгенных растений".

[00145] В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии (то есть экспрессия не является результатом стабильной интеграции последовательности в геном растения). В таких вариантах реализации изобретения способ может включать этап введения полинуклеотида (например, дцРНК или дцДНК) в растение обычными технологиями, известными в данной области техники. Например, транзиентная экспрессия может быть достигнута посредством инфильтрации раствора с полинуклеотидом в лист растения при помощи шприца без иглы.

[00146] В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид, доставляется в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученный вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении. В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид представляет собой один или более, выбранный из: а) одноцепочечной молекулы РНК (оцРНК), б) одноцепочечной молекулы РНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы РНК, в) двухцепочечной молекулы РНК (дцРНК), г) одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК), д) одноцепочечной молекулы ДНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы ДНК, е) одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, ж) двухцепочечной молекулы ДНК (дцДНК), з) двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, и и) двухцепочечной гибридной молекулы РНК/ДНК, или их комбинаций. В конкретных вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид вводится в растение путем локального применения к растению композиции, содержащей полинуклеотид, в подходящей форме, например, в форме твердого вещества, жидкости (в том числе гомогенных смесей, таких как растворы, и негомогенных смесей, таких как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированноого препарата, в или на микрогранулах или других частицах носителей, на пленке или покрытии, или на или внутри матрикса, или как обработка семян пасленового растения или обработка посадочного картофеля. Подходящие связывающие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, могут быть необязательно включены в композицию, как это известно специалистам в области разработки рецептур пестицидов и семенных обработок. В таких вариантах реализации изобретения композиция, содержащая полинуклеотид, может дополнительно включать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (такого, как описанный в примере 18 опубликованной патентной заявки США 2011/0296556, которая включена в данный документ посредством ссылки), кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых; в одном варианте реализации изобретения композиция дополнительно содержит неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, имеющее CAS номер 27306-78-1 и EPA номер: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, в настоящее время доступное в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В некоторых вариантах реализации изобретения локально применяемая композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. В альтернативном варианте такие дополнительные компоненты или пестицидные агенты могут быть предложены отдельно, например, при раздельном локальном применении или путем трансгенной экспрессии в растении. В альтернативном варианте растение локально обрабатывали композицией, содержащей полинуклеотид, а также с отдельным (предшествующим, следующим или одновременным) применением вещества, которое улучшает эффективность композиции, содержащей полинуклеотид. Например, при первом локальном применении растение может быть опрыскано раствором, содержащим неионное кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, например, как поверхностно-активные вещества торговой марки SILWET®, например, поверхностно-активное вещество марки SILWET L-77®, с последующим вторым локальным применением композиции, содержащей полинуклеотид, или наоборот.

[00147] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, используемых в данном способе, (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет в результате к синергетическому улучшению при профилактике или борьбе с заражениями видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным от применения только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицидного агента. В одном варианте реализации изобретения обнаружено, что трансгенное растение, экспрессирующее по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в таблице 1 (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах), и один или более генов, кодирующих неполинуклеотидный пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus, демонстрируют синергически улучшенную устойчивость к заражениям видами рода Leptinotarsa.

[00148] В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид, экспрессированный в растении, экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид, доставляется в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученный вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении; участок применения первичного полинуклеотида не обязательно должен быть тем же участком, на котором вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется. Например, первичный полинуклеотид может быть доставлен к растению путем локального применения на лист, или путем инъекции в стебель, а вторичный полинуклеотид может транзиентно экспрессироваться в другом месте растения, например, в корнях или по всему растению. В некоторых вариантах реализации изобретения по способу композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к надземным частям растения, например, путем опрыскивания или опыления листьев, стеблей и цветущих частей растения. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к подземным частям растения, таким как корни, например, с помощью пропитывания почвы. В других вариантах реализации изобретения композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, локально применяется к семенам (или, в случае картофеля, локально применяется к посадочному картофелю), которые формируются на растении, имеющем улучшенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa.

[00149] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессируемый в растении, представляет собой РНК, которая может быть одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц) РНК, или их комбинацией.

[00150] В некоторых вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид (ДНК или РНК, или та и другая) доставляется к растению, а вторичный полинуклеотид, имеющий последовательность, соответствующую (одинаковую или комплементарную) первичному полинуклеотиду, в последствии экспрессируется в растении. В таких вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой РНК транскрипт, который может быть оцРНК или дцРНК, или их комбинацией. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид доставляется в растение в форме РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК, а вторично полученный вторичный полинуклеотид транзиентно экспрессируется в растении; в таких вариантах реализации изобретения первичный полинуклеотид представляет собой один или более, выбранный из: а) одноцепочечной молекулы РНК (оцРНК), б) одноцепочечной молекулы РНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы РНК, в) двухцепочечной молекулы РНК (дцРНК), г) одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК), д) одноцепочечной молекулы ДНК, которая самостоятельно гибридизуется с образованием двухцепочечной молекулы ДНК, е) одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, ж) двухцепочечной молекулы ДНК (дцДНК), з) двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, который транскрибируется в молекулу РНК, и и) двухцепочечной гибридной молекулы РНК/ДНК, или их комбинаций. В таких вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид может состоять из встречающихся в природе нуклеотидов, таких как те, которые встречаются в ДНК и РНК. В таких вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид экспрессируется путем транзиентной экспрессии, первичный полинуклеотид может быть химически модифицированным или содержать химически модифицированные нуклеотиды. Первичный полинуклеотид обеспечивается с помощью подходящих способов, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых первичный полинуклеотид является химически синтезированным (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), полученным путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (таких как клетки растений или насекомых, выращенные в культуре), полученным путем экспрессии в растительной клетке, или полученным путем микробной ферментации. Первичный полинуклеотид может быть предложен в качестве РНК или ДНК фрагмента. В альтернативном варианте первичный полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор; такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[00151] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, представляет собой молекулу РНК и может быть относительно коротким, как например, одно- или двухцепочечные РНК в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных РНК), или в пределах от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных РНК). В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предложен в более сложных конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или быть включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или в рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные генетические конструкции или векторы могут быть разработаны для включения дополнительных элементов, таких как экспрессионные кассеты для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[00152] Полинуклеотид, экспрессированный в растении, имеет по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена эквивалентной длины, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые существенно идентичны или комплементарны фрагменту целевого гена эквивалентной длины, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту целевого гена эквивалентной длины, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды в точности (100%) идентичные или комплементарные фрагменту целевого гена эквивалентной длины, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессированный в растении, имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% идентичности или комплементарностью фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов.

[00153] Полинуклеотид, экспрессирующийся в растении как правило предназначен для супресии одного или более генов ("целевых генов"). Такие целевые гены могут включать кодирующие или некодирующие последовательности, или и те, и другие. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, предназначен для супрессии одного или нескольких целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, предназначен для супрессии одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, и может быть предназначен для супрессии нескольких генов из этой группы, или направлен на различные области одного или более из этих генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, включает несколько отрезков или сегментов, каждый из которых включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В таких случаях каждый отрезок может быть идентичным или различным по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, может включать несколько отрезков в тандемных или повторяющихся расположениях, причем каждый отрезок содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов; эти сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену, могут быть необязательно использованы между или рядом с этими сегментами.

[00154] Общая длина полинуклеотида, экспрессирующегося в растении, может быть более, чем 18 смежных нуклеотидов, и в дополнение к смежным нуклеотидам может включать нуклеотиды, имеющие последовательность с от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Другими словами, общая длина полинуклеотида, экспрессирующегося в растении, может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, предназначенного для супрессии одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, может иметь нуклеотиды, примыкающие к «активному» сегменту по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который подавляет целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'- конце или на обоих 5'- и 3'- концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, содержит дополнительные нуклеотиды, которые не связанны специфично (имеют последовательность не комплементарную или не идентичную) с целевым геном, выбранным из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, содержит дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегментам из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, содержит один такой сегмент с дополнительным G на 5’- конце или дополнительным C на 3’- конце, или с обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), содержащую дополнительные нуклеотиды, которые образуют липкий конец, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотида, которые формируют 3'-липкий конец. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения, нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида, экспрессирующегося в растении, является не на 100% идентичной или комплементарной фрагменту смежных нуклеотидов в целевом гене, выбранном из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, экспрессирующийся в растении, содержит по меньшей мере два сегмента из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью со 100% идентичности или 100% комплементарности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, причем (1) по меньшей мере два сегмента отделены друг от друга одним или несколькими спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в целевом гене, выбранном из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов.

[00155] В родственном аспекте данное изобретение относится к растению, обладающему улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa, которая обеспечивается за счет экспрессии в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, вследствие чего полученное растение обладает улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, в котором данный полинуклеотид не экспрессируется. В родственном аспекте данное изобретение относится к растению, обладающему улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa, которая обеспечивается за счет экспрессии в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до 100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, вследствие чего полученное растение обладает улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, в котором данный полинуклеотид не экспрессируется. Один из вариантов реализации изобретения представляет собой пасленовое растение, обладающее улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa по сравнению с контрольным растением, которое обеспечивается за счет экспрессии в растении РНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085 и 1095. В еще одном аспекте реализации данное изобретение относится к семени или пропагативным частям (в особенности семени, дающем трансгенное потомство, или пропагативным частям), получаемым из растений, обладающих повышенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa, что обеспечивается данным способом. Также рассматривается товарный продукт, полученный из растения, обладающего улучшенной устойчивостью к заражению видами рода Leptinotarsa, что обеспечивается данным способом, и товарный продукт, полученный из семени или частей, способных к размножению, такого растения.

СПОСОБЫ БОРЬБЫ С ЗРАЖЕНИЕМ РАСТЕНИЯ ВИДАМИ РОДА LEPTINOTARSA

[00156] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающему контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или комплементарны фрагменту ДНК целевого гена эквивалентной длины, выбранному из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В этом контексте термин "контролирующей" включает индуцирование физиологических или поведенческих изменений у видов рода Leptinotarsa (взрослых особей или личинок), таких как, но не ограничиваясь этим, задержку развития, увеличение смертности, снижение репродуктивной способности, снижение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадий метаморфоза. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов или РНК, транскрибируемой с целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид (например, двухцепочечная РНК) химически синтезирован, или получен путем экспрессии в микроорганизме, или путем экспрессии в растительной клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую цепи, содержащие последовательность, выбранную из Группы триггерных последовательностей. В одном варианте реализации изобретения способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa включает контакт видов рода Leptinotarsa с эффективным количеством двухцепочечной РНК, одна цепь которой комплементарна по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду в гене, который кодирует рибосомный белок, причем индуцирется РНК-интерференция, что приводит к гибели. Варианты целевых генов идентифицируются по названию в таблицах 1, 2 и 4 и включают гены, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей Группы последовательностей целевых генов, а также родственных генов, включая ортологи из родственных видов насекомых, например, родственные гены из других видов рода Leptinotarsa, видов рода Tribolium, или других связанных родов жесткокрылых. Примеры таких родственных генов включают гены Tribolium castaneum, перечисленные в таблице 1. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, который по существу идентичный или комплементарный фрагменту целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из Группы последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает РНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарную им, или РНК шпильку, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из Группы триггерных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение относится к способу борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающий контакт видов рода Leptinotarsa с эффективным количеством раствора, содержащего двухцепочечную РНК, в которой по меньшей мере одна цепь двухцепочечной РНК комплементарна по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду в гене, который кодирует рибосомный белок или РНК, которая транскрибируется с этого гена, причем виды рода Leptinotarsa представляют собой Leptinotarsa decemlineata, и причем индуцируется РНК-интерференция, и происходит гибель Leptinotarsa decemlineata, и причем рибосомный белок представляет собой рибосомный белок L7 или белок, кодируемый SEQ ID №: 730, или в котором двухцепочечная РНК включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 989, 988, 1104 или 1105; в некоторых вариантах реализации изобретения раствор дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из поверхностно-активного вещества или кремнийорганического катионного липида.

[00157] В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды имеют последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения смежные нуклеотиды полностью (100%) идентичные или комплементарные фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранной из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид имеет общую последовательность с около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99%, или около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранной из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает по меньшей мере один сегмент из 21 последовательного нуклеотида с последовательностью со 100% идентичности или комплементарности с соответствующим фрагментом целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов; в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает "нейтральную" последовательность (которая не имеет идентичности или комплементарности последовательности целевого гена) в дополнение к сегменту из 21 последовательного нуклеотида со 100% идентичности соответствующему фрагменту целевого гена и, следовательно, целый полинуклеотид имеет гораздо более низкую общую идентичность последовательности целевого гена.

[00158] Полинуклеотид, использованный в этом способе, как правило предназначен для супрессии одного или более генов ("целевых генов"). Термин «ген» относится к любой части нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт. Термин “ген” может включать, но не ограничиваясь этим, промоторную область, 5'-нетранслируемые области, области, кодирующие транскрипт, которые могут включать интронные области, 3' нетранслируемые области, или комбинации этих областей. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены могут включать кодирующую или некодирующую последовательность, или обе. В других вариантах реализации изобретения целевой ген имеет последовательность, идентичную или комплементарную информационной РНК, например, в некоторых вариантах реализации изобретения целевой ген представляет собой кДНК. В конкретных вариантах реализации изобретения полинуклеотид предназначен для супрессии одного или нескольких целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В различных вариантах реализации изобретения полинуклеотид предназначен для супрессии одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, и может быть предназначен для супрессии нескольких целевых гены из этой группы, или воздействовать на разные области одного или более из этих целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает несколько сегментов из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью со 100% идентичности фрагменту ДНК или целевого гена эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из Группы последовательностей целевых генов, или ДНК, комплементарными им. В таких случаях каждый сегмент может быть одинаковым или отличаться по размеру или последовательности, и может быть смысловым или антисмысловым по отношению целевому гену. Например, в одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает несколько сегментов, расположенных последовательно или повторов, причем каждый сегмент включает 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов; эти сегменты могут быть из разных областей целевого гена, например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена, и между этими сегментами или рядом с ними могут быть необязательно использованы "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гену.

[00159] Общая длина полинуклеотида, используемого в данном способе, может быть больше, чем 18 смежных нуклеотидов, и может включать нуклеотиды в дополнение к смежным нуклеотидам, имеющим последовательность от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Другими словами, общая длина полинуклеотида может быть больше, чем длина отрезка или сегмента полинуклеотида, предназначенной для супрессии одного или более целевых генов, выбранных из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, полинуклеотид может иметь нуклеотиды, примыкающие к “активному” сегменту по меньшей мере одного сегмента из 18 или более смежных нуклеотидов, который супрессирует целевой ген, или включать "спейсерные" нуклеотиды между активными сегментами, или может иметь дополнительные нуклеотиды на 5'- конце или на 3'- конце или на обоих 5'- и 3'- концах. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, которые не связаны (имеют последовательность, которая не комплементарна или не идентична) с целевым геном, выбранным из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов, например, нуклеотиды, которые обеспечивают стабилизацию вторичной структуры или для удобства клонирования или производства. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид может включать дополнительные нуклеотиды, расположенные в непосредственной близости к одному или более сегментам из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности или комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает один такой сегмент с дополнительным G на 5'- конце или дополнительным C на 3'-конце или с обоими, прилегающими к сегменту. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для формирования липкого конца, например, дцРНК, содержащую 2 дезоксирибонуклеотиды для формирования 3'- липкого конца. Таким образом, в различных вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность всего полинуклеотида не на 100% идентична или комплементарна последовательности смежных нуклеотидов в целевом гене, выбранном из группы, состоящей из генов, идентифицированных в группе последовательностей целевых генов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит по меньшей мере два сегмента из 21 смежных нуклеотидов каждый с последовательностью со 100% идентичности фрагменту эквивалентной длины целевого гена, причем (1) по меньшей мере два сегмента, разделены одним или более спейсерными нуклеотидами, или (2) по меньшей мере два сегмента расположены в порядке, отличном от того, в котором соответствующие фрагменты встречаются в ДНК, имеющей последовательность, выбранную из Группы последовательностей целевых генов, или ДНК, комплементарными им.

[00160] Полинуклеотид, используемый в этом способе, создается с помощью подходящих средств, известных в данной области техники. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид химически синтезирован (например, путем транскрипции in vitro, такой как транскрипция с использованием полимеразы Т7 или другой полимеразы), получен путем экспрессии в микроорганизме или в культуре клеток (такой, как растительные клетки или клетки насекомых, выращенные на культуре), получен путем экспрессии в растительной клетке или получен путем микробного ферментирования.

[00161] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в этом способе, создается как изолированный фрагмент ДНК или РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, используемый в этом способе, не является частью экспрессионной генетической конструкции и в нем отсутствуют дополнительные элементы, такие как промоторные или терминаторные последовательности. Такие полинуклеотиды могут быть относительно короткими, такие как одно- или двухцепочечные полинуклеотиды из от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечного полинуклеотида) или от около 18 до около 300 или от около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид представляет собой дцРНК из от около 100 до около 500 пар оснований, такую как дцРНК длины равной любому из триггеров дцРНК, описанных в таблицах 3, 5, 8, 9 и 10. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид представляет собой дцРНК, включающую сегмент, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарную им, или в которых полинуклеотид представляет собой петлю РНК, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В альтернативном варианте полинуклеотид может быть предоставлен в более сложных генетических конструкциях, например, как часть рекомбинантной экспрессионной генетической конструкции, или включен в рекомбинантный вектор, например, в рекомбинантный растительный вирусный вектор или рекомбинантный бакуловирусный вектор. В некоторых вариантах реализации изобретения такие рекомбинантные экспрессионные конструкции или векторы предназначены для включения дополнительных элементов, таких как кассеты экспрессии для экспрессии целевого гена (например, инсектицидного белка).

[00162] В различных вариантах реализации данного способа контакт включает применение к поверхности видов рода Leptinotarsa подходящей композиции, содержащей полинуклеотид, используемый в этом способе; такая композиция может быть представлена, например, в виде твердого вещества, жидкости (включая однородные смеси, такие как растворы, и неоднородные смеси, такие как суспензии, коллоиды, мицеллы и эмульсии), порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного или микроинкапсулированного препарата, внутри или на поверхности микрогранул или других частиц носителей, в пленке или в форме покрытия, или на поверхности или внутри матрицы, или путем обработки семян. Контакт может быть в форме обработки семян, или в форме обработки клубней или частей клубней "семенного картофеля" (например, путем замачивания, покрытия, или напыления на семенной картофель). В композицию могут, но необязательно, быть включены подходящие связующие вещества, инертные носители, поверхностно-активные вещества и тому подобное, как это известно специалистам в области разработки пестицидов и обработки семян. В некоторых вариантах реализации изобретения контакт включает получение полинуклеотида в композиции, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида (как, например, описано в примере 18 публикации заявки на патент США № 2011/0296556, который включен в данный документ посредством ссылки), органического кремния, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора развития насекомых. В вариантах реализации изобретения контакт включает получение полинуклеотида в композиции, которая дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка из Xenorhabdus, инсектицидного белка из Photorhabdus, инсектицидного белка из Bacillus laterosporous и инсектицидного белка из Bacillus sphaericus. В одном варианте реализации изобретения контакт включает получение полинуклеотида в композиции, которая может поедаться или иным способом поглощаться внутрь видами рода Leptinotarsa.

[00163] Предполагается, что комбинация определенных полинуклеотидов, используемых в этом способе (например, полинуклеотидные триггеры, описанные в рабочих примерах) с одним или более неполинуклеотидными пестицидными агентами приведет к синергетическому улучшению профилактики или борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным отдельно с полинуклеотидом или отдельно неполинуклеотидным пестицидным агентом. В одном варианте реализации изобретения композиция, содержащая один или более полинуклеотидов и один или более неполинуклеотидных пестицидных агентов, выбранных из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка из Xenorhabdus, инсектицидного белка из Photorhabdus, инсектицидного белка из Bacillus laterosporous и инсектицидного белка из Bacillus sphaericus, обнаруживает синергитический эффект улучшения профилактики и борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa.

СПОСОБЫ ОТБОРА ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ

[00164] Еще один аспект этого изобретения относится к способу неслучайного отбора целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга. В одном варианте реализации изобретения данный способ относится к разновидности целевых генов, которые присутствуют в одно- или низкокопийных количествах (не повторяющиеся и безизбыточные) в конкретном геноме. Такие целевые гены могут представлять собой гены из генома растений или гены из генома животного. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены представляют собой гены беспозвоночных вредителей, например, беспозвоночных вредителей растения или беспозвоночных вредителей позвоночных. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены могут представлять собой гены насекомых-вредителей растения или нематод-вредителей растений. В некоторых вариантах реализации изобретения целевые гены представляют собой гены из видов рода Leptinotarsa. Дополнительные аспекты включают производство полинуклеотида (например, триггера одноцепочечной РНК (оцРНК) или дцРНК, например, как триггеры дцРНК, описанные в рабочих примерах, или рекомбинантной генетической конструкции ДНК, используемой для получения трансгенных растений) на основе целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, отобранных с помощью любого из способов, описанных в данном документе.

[00165] В одном варианте реализации изобретения способ включает этап идентификации одно- и низкокопийных генов в выбранном геноме, или в альтернативном варианте идентификации одно- и низкокопийных генов в базе данных ортологичных генов от родственных организмов с целью предсказать какие гены будут однокопийными/низкокопийными в выбранном организме. Низкокопийные гены, и, в частности, однокопийные гены, выбираются в качестве целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга. В одном варианте реализации изобретения идентификация одно- или низкокопийных генов осуществляется путем сравнения последовательностей между набором генов от первого вида и набором генов из второго вида, причем набор генов от второго вида определен как одно- или низкокопийный во втором виде. В одном варианте реализации изобретения идентификация одно- или низкокопийных генов осуществляется путем применения алгоритма, выполняемого компьютером, к набору генов из первого вида с целью идентифицировать разновидность одно- или низкокопийных генов в наборе генов от первого вида с последующим сравнением набора генов от второго вида с разновидностью одно- или низкокопийных генов из первого вида с целью идентифицировать соответствующие одно- или низкокопийные гены из второго вида. Одно- или низкокопийые гены из второго вида используются в качестве целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга; последовательности этих целевых генов используются для создания полинуклеотидов (например, триггера оцРНК или дцРНК, таких как тригерров дцРНК, описанных в рабочих примерах, или рекомбинантных генетических конструкций ДНК для получения трансгенных растений) и способов их использования для профилактики или борьбы с заражением вторым видом.

[00166] Варианты реализации этого способа включают дополнительный этап оценивания нуклеотидного разнообразия генов низко-/однокопийных генов в популяции выбранного организма и отбор тех низко-/однокопийных генов, которые дополнительно имеют наименьшее нуклеотидное разнообразие. Низко-/однокопийные гены, дополнительно имеющие низкое нуклеотидное разнообразие, выбраны в качестве целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга.

[00167] Варианты данного способа включают дополнительный этап сравнения отношения синонимичных замен нуклеотидов (K_s) к несинонимичным (K_a) в качестве оценки функциональной или эволюционной устойчивости. В одном варианте реализации изобретения способ включает этап отбора генов, для которых K_s по меньшей мере равна или больше, чем К_а. В одном варианте реализации изобретения способ включает этап отбора генов, для которых K_s>>K_a.

[00168] Родственный аспект этого изобретения представляет собой набор целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, идентифицированных из генома с помощью любого из способов отбора генов, описанных в данном документе. Один вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранных из генома путем идентификации одно- и низкокопийных целевых генов из большего набора генов из этого генома. Один вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранных из генома беспозвоночных генома путем идентификации одно- и низкокопийных целевых генов из большего набора генов из этого генома беспозвоночных. Конкретный вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга в видах рода Leptinotarsa, выбранных из генома Leptinotarsa путем идентификации одно- и низкокопийных целевых генов из большего набора генов из этого генома Leptinotarsa. Конкретный вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга в видах рода Leptinotarsa, выбранных из генома Leptinotarsa путем идентификации одно- и низкокопийных целевых генов из большего набора генов из этого генома Leptinotarsa, причем набор последовательностей представляет собой группу, состоящую из SEQ ID № 1-725, или ДНК, комплементарные им.

[00169] Родственные аспекты этого изобретения представляют собой способы и композиции, использующие набор целевых генов, состоящих из SEQ ID № 1-725, или ДНК, комплементарные им. Они включают: (I) способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающий контакт видов рода Leptinotarsa с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности сегменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или с ДНК, комплементарными им; (II) способ борьбы с заражением растения видами рода Leptinotarsa, включающий введение в рацион питания видов рода Leptinotarsa агента, включающего полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности сегменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или с ДНК, комплементраными им, причем агент функционирует при его поедании видами рода Leptinotarsa путем ингибирования биологической функции у видов рода Leptinotarsa, тем самым препятствуя заражению видами рода Leptinotarsa; (III) способ вызывания гибели или задержки роста у личинок видов рода Leptinotarsa, включающий введение в рацион питания личинок видов рода Leptinotarsa по меньшей мере одной рекомбинантной РНК, которая содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга, который по существу идентичный или по существу комплементарный целевому гену личинок видов рода Leptinotarsa, причем последовательность целевого гена выбирают из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725; (IV) способ получения растения, имеющего улучшенное сопротивление к заражению видами рода Leptinotarsa, включающий поверхностное нанесение на растение композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, имеющий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности сегменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или с ДНК, комплементарными им; (V) композицию для борьбы с видами рода Leptinotarsa, содержащую по меньшей мере один рекомбинантный полинуклеотид, содержащий по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентична или комплементарной сегмента эквивалентной длине ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725; (VI) способ получения растения, имеющего улучшенное сопротивление заражению видами рода Leptinotarsa, включающей экспрессию в растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или комплементарны сегменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725; (VII) рекомбинантную конструкцию ДНК, содержащую гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности сегменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или с ДНК, комплементарными им; и (VIII) клетку трансгенного пасленового растения, имеющую в своем геноме рекомбинантную ДНК, кодирующую РНК, которая супрессирует экспрессию целевого гена в видах Leptinotarsa, контактируют или поедают эту РНК, причем РНК включает по меньшей мере один элемент сайленсинга, комплементарный целевому гену и причем последовательность целевого гена представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725, или комплементарных им.

[00170] Еще один вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранных из генома путем оценивания нуклеотидного разнообразия для данного набора генов в популяции особей видов, имеющих этот геном, и отбора тех генов, которые имеют низкое нуклеотидное разнообразие. Один вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранного из генома беспозвоночных путем оценивания нуклеотидного разнообразия для данного набора генов в популяции особей беспозвоночных, имеющих этот геном, и отбора тех генов, которые имеют наиболее низкое нуклеотидное разнообразие. Другой вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранного из генома беспозвоночных путем оценивания нуклеотидного разнообразия для низко-/однокопийных генов в популяции особей беспозвоночных, имеющих этот геном, и отбора тех низко-/однокопийных генов, которые дополнительно имеют наиболее низкое нуклеотидное разнообразие.

[00171] Еще один вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранных из генома путем сравнения отношения синонимичных замен нуклеотидов (K_s) к несинонимичным (К_а) в генах этого генома и отбора тех генов, в которых K_s по меньшей мере равна или выше чем К_а. В одном варианте реализации изобретения набор целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга представляет собой гены, в которых K_s по меньшей мере равна или выше чем К_а. В одном варианте реализации изобретения набор целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга представляет собой гены, в которых где K_s>>K_a. Вариант реализации изобретения относится к набору целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга, выбранных из генома беспозвоночных и в случае, когда для выбранных генов K_s>>K_a.

[00172] В одном варианте реализации изобретения одно- или низкокопийные целевые гены представляют собой группу целевых генов из первого вида беспозвоночных, выбранных из большего набора генов из первого вида беспозвоночных, причем отбор осуществляется путем сравнения последовательностей, выполняемого компьютером, между большим набором генов от первого вида беспозвоночных и набором генов от второго вида беспозвоночных, которые были идентифицированы как одно- или низкокопийные в втором виде беспозвоночных. В конкретном варианте реализации изобретения одно- или низкокопийные целевые гены представляют собой группу целевых генов Leptinotarsa decemlineata, выбранных из большего набора целевых генов Leptinotarsa decemlineata, причем выбор осуществляется путем сравнения последовательностей, выполняемого компьютером, между большими набором целевых генов Leptinotarsa decemlineata и набором генов из второго вида беспозвоночных, которые были идентифицированы как одно- или низкокопийные во втором виде беспозвоночных. Одно- и низкокопийные целевые гены Leptinotarsa decemlineata, выбранные с помощью этого способа, в частности используются в создании полинуклеотидов данного изобретения, в том числе - рекомбинантных генетических конструкций ДНК, которые используются, например, для получения растений, имеющих повышенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, и изолированных рекомбинантных молекул РНК, которые используются, например, при создании композиций для поверхностной обработки растений или видов рода Leptinotarsa, с целью обеспечить предотвращение или борьбу с заражением видами рода Leptinotarsa. В одном варианте реализации изобретения одно- и низкокопийные целевые гены Leptinotarsa decemlineata, выбранные с помощью данного способа, представляют собой гены, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725.

[00173] Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой поликлональные или моноклональные антитела, которые связываются с белком, который кодируется последовательностью или фрагментом последовательности, выбранной из группы, состоящей из Группы последовательностей целевых генов, и поликлональные или моноклональные антитела, которые связываются с белком, который кодируется последовательностью или фрагментом последовательности, выбранной из Группы триггерных последовательностей или комплементарной им; такие антитела получают с помощью рутинных способов, которые известны любому специалисту в данной области техники, например, с использованием обычных рутинных протоколов, как описано в “Antibody Methods and Protocols” (Proetzel and Ebersbach, editors, 2012, Humana Press, New York) или “Making and Using Antibodies” (Howard and Kaser, editors, 2006, CRC Press, Boca Raton).

Отбор эффективных полинуклеотидов с помощью "Тайлинга"

[00174] Полинуклеотиды, используемые в вариантах реализации изобретения, описанных в данном документе, не обязательно должны быть равными полной длине целевого гена, и во многих вариантах намного короче, чем целевой ген. Примером технологии, которая может использоваться для выбора эффективных полинуклеотидов, является "тайлинг" или определение полинуклеотидов, соответствующих примыкающим друг к другу или частично перекрывающимся сегментам целевого гена.

[00175] В некоторых вариантах реализации изобретения эффективные полинуклеотидные триггеры могут быть определены с помощью "тайлинга" целевых генов в выбранных фрагментах, например, фрагментах длиной 200-300 нуклеотидов, с частично перекрывающимися областями, например, около 25 нуклеотидов, по длине целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательности полинуклеотидных триггеров созданы таким образом, что они для соответствуют (имеют нуклеотидную идентичность или комплементарность) областям, которые являются уникальными для целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения выбранная область целевого гена может включать кодирующую последовательность или некодирующую последовательности (например, промоторные области, 3'-нетранслирующие области, интроны и тому подобное) или их комбинацию.

[00176] В случае, когда интерес представляет создание мишени, эффективной в супрессии нескольких целевых генов, выравнивают несколько последовательностей целевого гена и создают полинуклеотидные триггеры таким образом, чтобы они соответствовали областям с высокой гомологией последовательности в целом среди нескольких целей. И наоборот, в случае, когда интерес представляет создание мишени, эффективной для селективной супрессии одной из нескольких целевых последовательностей, выравнивают несколько последовательностей целевого гена и создают полинуклеотидные триггеры таким образом, чтобы они соответствовали областям с отсутствием или низкой гомологией последовательности в общем среди нескольких целей.

Рассмотрение термодинамики при отборе эффективных полинуклеотидов

[00177] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидные триггеры могут быть разработаны или их последовательность оптимизирована с использованием термодинамических соображений. Например, полинуклеотидные триггеры могут быть выбраны, на основе термодинамических свойств, контролирующих гибридизацию между одной цепью нуклеиновой кислоты (например, триггерный полинуклеотид или индивидуальный малая интерферирующая РНК (миРНК), и другой (например, транскрипт целевого гена).

[00178] В данной области техники известны способы и алгоритмы для прогнозирования нуклеотидных последовательности, которые могут быть эффективными при РНКи-опосредованном сайленсинге целевого гена. Не ограничивающие примеры таких способов и алгоритмов включают "i-score" ("i-счетчик"), описанный у Ichihara et al. (2007) Nucleic Acids Res., 35(18): 123e; “Oligowalk”, находящийся в открытом доступе по ссылке rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk и описанный у Lu et al. (2008) Nucleic Acids Res 36:. W104-108; и "счетчик Рейнольдса", описанный у Khovorova et al. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330.

Допустимые несоответствия

[00179] Под "по существу идентичный" или "по существу комплементарный" понимается, что полинуклеотид (или, по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) имеет достаточную идентичность или комплементарность целевому гену или РНК, которая транскрибируется с целевого гена (например, транскрипту) для супрессии экспрессии целевого гена (например, для вызова снижение уровней или активности транскрипта целевого гена и/или кодируемого белка). Полинуклеотиды, описанные в данном документе, не обязательно должны иметь 100-процентную идентичность или комплементарность целевому гену или РНК, которая транскрибируется с целевого гена для супрессии экспрессии целевого гена (например, для вызова снижения уровней или активности транскрипта целевого гена или кодируемого белка, или для обеспечения борьбы с видами рода Leptinotarsa). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид или его часть создан по существу идентичным или по существу комплементарным последовательности из по меньшей мере 18 или 19 смежных нуклеотидов либо в целевом гене, либо в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид или его часть создан на 100% идентичным или на 100% комплементарным одной или более последовательностям из 21 смежных нуклеотидов либо в целевом гене либо в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения "по существу идентичный" полинуклеотид имеет 100 процентов идентичности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов идентичности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов либо в эндогенном целевом гене, либо в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения "по существу комплементарный" полинуклеотид имеет 100 процентов комплементарности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов комплементарности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов либо в целевого гене, либо в РНК, транскрибируемой с этого целевого гена.

[00180] В некоторых вариантах композиций и способов, описанных в данном документе, могут быть использованы полинуклеотиды, содержащие несоответствия целевым генам или транскриптам. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид включает по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 или по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины в целевом гене или транскрипте этого целевого гена. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид из 21 или более смежных нуклеотидов, который является по существу идентичным или по существу комплементарным сегменту эквивалентной длины в целевом гене или транскрипте целевого гена, может иметь 1 или 2 несоответствия в целевом гене или транскрипте (то есть 1 или 2 несоответствия между 21 смежным нуклеотидом в полинуклеотиде и сегменте эквивалентной длины в целевом гене или транскрипте целевого гена). В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид из около 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или более нуклеотидов, который содержит цепь из 21 смежных нуклеотидов, идентичную или комплементарную сегменту эквивалентной длины в целевом гене или транскрипте этого целевого гена, может иметь 1 или 2 или более несоответствий в целевом гене или транскрипте.

[00181] При создании полинуклеотидов с несоответствиями эндогенному целевому гену или РНК, которая транскрибируется из этого целевого гена, могут быть использованы несоответствия некоторых типов и в некоторых позициях, которые скорее всего могут быть допустимы. В некоторых вариантах реализации изобретения используются несоответствия, образованные между остатками аденина и цитозина или гуанозина и урацила, как описано у Du et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 1671-1677. В некоторых вариантах реализации изобретения, несоответствия, охватывающие в 19 пар оснований, расположены в позициях с низким допуском 5, 7, 8 или 11 (от 5'- конца 19-нуклеотидной мишени), в позициях со средним допуском 3, 4 и 12-17 (от 5'-конца 19-нуклеотидной мишени), и/или в позициях с высоким допуском на обоих концах комплементарной области, т.е. позициях 1, 2, 18, и 19 (от 5'- конца 19-нуклеотидной мишени), как описано у Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. Допустимые несоответствия могут быть определены эмпирически в рутинных анализах, например, с помощью тестов питания личинок видов рода Leptinotarsa in vitro.

Встраивание элементов сайленсинга в нейтральные последовательности

[00182] В некоторых вариантах реализации изобретения элемент сайленсинга, содержащий последовательность, соответствующую целевому гену, и который отвечает за наблюдаемую супрессию целевого гена, встраивается в "нейтральную" последовательность, т. е. вставляется в дополнительные нуклеотиды, которые не имеют идентичности или комплементарности последовательности целевого гена. Нейтральная последовательность может быть предпочтительной, например, для увеличения общей длины полинуклеотида. Например, может быть предпочтительно, чтобы полинуклеотид был определенного размера по причинам стабильности, экономической эффективности в производстве, или биологической активности. В некоторых вариантах реализации изобретения нейтральные последовательности также используются в формировании петли шпильке-триггере или в качестве спейсера между триггерными областями.

[00183] Сообщается, что в другом виде жесткокрылых, Diabrotica virgifera, для проявления биологической активности в биотестах при искусственном питании необходима дцРНК, большая или равная около 60 парам оснований (ПО); см Bolognesi et al. (2012) PLoS ONE 7 (10): e47534. DOI: 10.1371/journal.pone.0047534. Таким образом в одном варианте реализации изобретения элемент сайленсинга, состоящий из дцРНК из 21 пары оснований, соответствующий целевому гену в таблице 1, который, как было обнаружено, обеспечивает борьбу с заражениями видами рода Leptinotarsa, встроен в нейтральную последовательность из дополнительных 39 пар оснований, образуя полинуклеотид из около 60 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения дцРНК триггер включает нейтральную последовательность с от около 60 до около 500, или от 100 до около 450 пар оснований, в которых встроен по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью со 100% идентичности или 100% комплементарности фрагменту эквивалентная длины целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830 и SEQ ID № 1087-1094. В другом варианте реализации изобретения один элемент сайленсинга из 21 пар оснований с последовательностью со 100% идентичности или 100% комплементарности фрагменту эквивалентной длины целевого гена проявляет эффективность в случае, когда он включен в более крупные отрезки нейтральной последовательности, например, когда общая длина полинуклеотида составляет от около 60 до около 300 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 21 смежного нуклеотида с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарной им, встроен в более крупные области нейтральной последовательности с целью получить эффективный полинуклеотид. В другом варианте реализации изобретения сегменты из нескольких последовательностей (или нескольких копий сегмента из одной или нескольких последовательностей), выбранные из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарной им, встроены в более крупные отрезки нейтральной последовательности с целью получить эффективный полинуклеотид. В вариантах реализации изобретения, в которых полинуклеотид включает области нейтральной последовательности, полинуклеотид будет иметь относительно низкую идентичность всей последовательности при сравнении с целевым геном; например, дцРНК с общей длиной 210 пар оснований, содержащая один триггер из 21 пары оснований (100% идентичности или комплементарности фрагменту целевого гена из 21 нуклеотида), встроенный в 189 дополнительных пар оснований нейтральной последовательности, будет иметь общую идентичность последовательности с целевым геном около 10%.

ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫЕ МОЛЕКУЛЫ РНК

[00184] Другой аспект этого изобретения относится к инсектицидной двухцепочечной молекуле РНК, которая вызывает гибель или прекращение роста видов рода Leptinotarsa при поедании или контактировании с видами рода Leptinotarsa, причем инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов, которые, по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины целевого гена или ДНК (кДНК), имеющему последовательность, выбранную из группы последовательностей целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК составляет от около 50 до около 500 пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит несколько сегментов из 18 или более смежных нуклеотидов, которые, по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины целевого гена или ДНК (кДНК), имеющей последовательность, выбранную из группы последовательностей целевых генов, причем сегменты расположены в разных областях целевого гена (например, сегменты могут соответствовать различным экзонным областям целевого гена и "спейсерные" нуклеотиды, которые не соответствуют целевому гена могут быть необязательно использованы между этими сегментами или примыкать к ним), или из разных целевых генов. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит несколько сегментов из 18 или более смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины целевого гена или ДНК (кДНК), имеющей последовательность, выбранную из Группы последовательностей целевых генов, причем эти сегменты относятся к разным областям целевого гена и расположены в инсектицидной двухцепочечной молекуле РНК в порядке, который отличается от порядка естественного расположения этих сегментов в целевом гене. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит несколько сегментов из 21 смежных нуклеотидов каждый с последовательностью со 100% идентичности или 100% комплементарности сегменту эквивалентной длины целевого гена или ДНК (кДНК), имеющему последовательность, выбранную из Группы последовательностей целевых генов, причем эти сегменты относятся к разным областям целевого гена и расположены в инсектицидной двухцепочечной молекуле РНК в порядке, который отличается от порядка естественного расположения этих сегментов в целевом гене. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная молекула РНК включает одну цепь, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 831-1085, 1095-1104 и 1110-1114, или комплементарной им, или содержит РНК шпильку, которая кодируется последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID № 1105-1109. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидная двухцепочечная РНК содержит дцРНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из Группы триггерных последовательностей. Инсектицидная двухцепочечная молекула РНК может быть локаьно нанесена на растение, в особенности - на пасленовое растение, такое как томат, баклажан, или картофель с целью борьбы или предотвращения заражения видами рода Leptinotarsa. Инсектицидная двухцепочечная молекула РНК может быть получена в форме, подходящей для поедания или прямого контакта с видами рода Leptinotarsa, например, в виде спрея или порошка, или приманки. Другие способы и подходящие композиции для получения инсектицидной двухцепочечной молекулы РНК, аналогичны тем, которые описаны в предыдущих абзацах для других аспектов этого изобретения.

[00185] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к баковой смеси, содержащей один или более инсектицидных полинуклеотидов и воды или другого растворителя, который необязательно включает катионный липид или кремнийорганическое поверхностно-активное вещество или оба эти вещества. Варианты реализации изобретения включают препарат полинуклеотида для баковой смеси и необязательно по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. Варианты реализации таких композиций включают те, в которых один или более инсектицидных полинуклеотидов получают в живых или мертвых микроорганизмах, таких как бактерии, или грибы, или дрожжевые клетки, или получают в качестве продукта микробной ферментации, или получают в живых или мертвых растительных клетках, или получают в качестве синтетического рекомбинантного полинуклеотида. В одном варианте реализации изобретения композиция включает непатогенный штамм микроорганизма, который содержит полинуклеотид, описанный в данном документе; поедание или всасывание этого микроорганизма вызывает задержку развития или гибель видов рода Leptinotarsa; не ограничивающие примеры подходящих микроорганизмов включают E. coli, B. thuringiensis, Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Serratia entomophila и родственные виды Serratia sp., B. sphaericus, B. cereus, B. laterosporus, B. popilliae, Clostridium bifermentans и другие виды Clostridium, или другие спорообразующие грамположительные бактерии. В одном варианте реализации изобретения композиция включает вектор вируса растений, содержащий полинуклеотид, описанный в данном документе; кормление видов рода Leptinotarsa на растении, обработанном вектором вируса растений вызывает задержку развития или гибель видов рода Leptinotarsa. В одном варианте реализации изобретения композиция включает вектор бакуловируса, который включает полинуклеотид, описанный в данном документе; поедание или всасывание вектора вызывает остановку роста или гибель видов рода Leptinotarsa. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, описанный в данном документе, инкапсулируют в синтетической матрице, такой как полимер, или прикрепляют к гранулам и локально наносят на поверхность растения; кормление видов рода Leptinotarsa на локально обработанном растении вызывает задержку развития или гибель видов рода Leptinotarsa. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид, описанный в данном документе, получают в виде растительной клетки (например, клетке трансгенного пасленового растения по данному изобретению), которая экспрессирует этот полинуклеотид; поедание растительной клетки или содержимого растительной клетки видами рода Leptinotarsa приводит к задержке развития или смертности видов рода Leptinotarsa.

[00186] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, снабжены соответствующими склеивателями и смачивателями, необходимыми для эффективной листовой обработки, а также УФ-протекторами для защиты полинуклеотидов, таких как дцРНК, от УФ лучей. Такие добавки обычно используются в биоинсектицидной промышленности и известны специалистам в данной области техники. Композиции для почвенного применения могут включать препараты в гранулах, которые служат в качестве приманки для личинок видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, дополнительно снабжены агентом-носителем, поверхностно-активным веществом, катионным липидом (так как описанный примере 18 публикации заявки на патента США 2011/0296556, включенный в данный документ посредством ссылки), органический кремний, кремнийорганическое поверхностно-активное вещество, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, антидот и регулятор роста насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция дополнительно включает по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

[00187] Такие композиции применяются любым удобным способом, например, путем опрыскивания или напыления на непосредственно на виды рода Leptinotarsa, или опрыскивания или напыления на растение или в окружающей среде, в которой необходимо предотвращение или борьба с заражением этими видами рода Leptinotarsa, или путем нанесения покрытия на поверхность растение, или нанесения покрытия на семя (или семенной картофель) при подготовки к посадке семян, либо путем пропитки почвы вокруг корней растения, для которого необходимо предотвращение или контроль заражения видами рода Leptinotarsa.

[00188] Эффективное количество полинуклеотида, описанного в данном документе, представляет собой количество, достаточное для того, чтобы обеспечить борьбу с видами рода Leptinotarsa или для предотвращения заражения видами рода Leptinotarsa; определение эффективных количеств полинуклеотида проводят с использованием обычных анализов, таких как те, которые описаны в примерах 5 и 6. Хотя не существует верхнего предела концентраций и дозировок инсектицидного полинуклеотида, которые могут быть использованы в способах и композициях, представленных в данном документе, в целях эффективности и экономии, как правило, будут требоваться минимальные эффективные количества и дозировки. Не ограничивающие варианты эффективных количеств полинуклеотида включают диапазон от около 10 нанограмм на миллилитр до около 100 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в жидкой форме, распыляемого на растении, или от около 10 миллиграммов на акр до около 100 граммов на акр полинуклеотида, применяемого к полю, на котором произрастают растения, или от около 0,001 до около 0,1 мкг на миллилитр полинуклеотида в искусственном рационе для кормления видов рода Leptinotarsa. В случае, когда полинуклеотиды, описанные в данном документе, локально применяются к растению, их концентрации могут быть скорректированы с учетом объема спрея или обрабатывающего средства, применяемого к листьям растения или других частей поверхности растения, такие как цветочные лепестки, стебли, клубни, фрукты, пыльники, пыльца, листья, корни или семена. В одном варианте реализации изобретения эффективная обработка для травянистых растений с использованием 25-мерных полинуклеотидов, описанных в данном документе, составляет около 1 наномоль (нмоль) полинуклеотидов на растение, например, от около 0,05 до 1 нмоль полинуклеотидов на растение. Другие варианты реализации изобретения для травянистых растений включают эффективные диапазоны от около 0,05 до 100 нмоль, или от около 0,1 до около 20 нмоль, или от около 1 нмоль до 10 нмоль полинуклеотидов на растение. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется от около 40 до 50 нмоль полинуклеотида, содержащего оцДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется от около 0,5 нмоль до около 2 нмоль дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется композиция, содержащая от около 0,5 до около 2,0 мг на миллилитр или около 0,14 миллиграмма на миллилитр дцРНК или оцДНК (21-мер). В некоторых вариантах реализации изобретения применяется композиция, содержащая от около 0,5 до около 1,5 мг на миллилитр полинуклеотида из данного изобретения, состоящего из дцРНК, содержащей от около 50 до около 200 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения к растению применяется от около 1 нмоль до 5 нмоль дцРНК из данного изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотидная композиция, которая локально применяется к растению, содержит по меньшей мере один полинуклеотид из данного изобретению в концентрации от около 0,01 до около 10 миллиграммов на миллилитр или от около 0,05 до около 2 миллиграммов на миллилитр, или от около 0,1 до около 2 миллиграммов на миллилитр. Очень крупные растения, деревья, или лозы могут потребовать соответственно больших количеств полинуклеотидов. При использовании длинных молекул дцРНК из данного изобретения, которые могут быть переработаны в несколько олигонуклеотидов (например, несколько триггеров, кодируемых одной рекомбинантной молекулой ДНК из данного изобретения), могут быть использованы более низкие концентрации. Не ограничивающие примеры эффективных режимов полинуклеотидной обработки включают обработку в пределах от около 0,1 до около 1 нмоль полинуклеотидной молекулы на растение, или от около 1 нмоль до 10 нмоль полинуклеотидной молекулы на растение, или от около 10 нмоль до 100 нмоль полинуклеотидных молекулы на растение.

[00189] В некоторых вариантах реализации изобретения один или несколько полинуклеотидов снабжены "переносчиком", который представляет собой средство, которое позволяет локально нанесенному полинуклеотиду проникать в клетки организма. Такие переносчики могут быть включены как часть композиции, включающей полинуклеотид, описанный в данном документе, или могут быть применены заранее, одновременно или после нанесения полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации изобретения переносчик представляет собой средство, которое повышает потребление полинуклеотида из данного изобретения одним из видов рода Leptinotarsa. В некоторых вариантах реализации изобретения переносчик представляет собой средство, которое обеспечивает условия на поверхности растительной ткани, например, семян, листьев, стеблей, корней, цветков или плодов для проникновения полинуклеотидов в клетки растений. В некоторых вариантах реализации изобретения переносчик запускает путь для полинуклеотида через барьеры восковой кутикулы, устьица и/или барьеры клеточной стенки или мембраны в растительных клетках.

[00190] Подходящие переносчики включают средства, которые повышают проницаемость наружной части организма, или которые повышают проницаемость клеток организма для полинуклеотидов. Подходящие переносчики включают химические средства, физические средства или их комбинации. Химические средства для создания условий или передачи включают: а) поверхностно-активные вещества, б) органические растворители или водный раствор или водные смеси органических растворителей, в) окислители, г) кислоты, д) основы, е) масла, ж) ферменты, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах реализации изобретения применение полинуклеотида и переносчика необязательно включает этап инкубации, этап нейтрализации (например, с целью нейтрализовать кислоту, основание или окислитель, или инактивировать фермент), этап промывки или их комбинации. Подходящие переносчики могут быть в форме эмульсии, обратной эмульсии, липосомы или другой мицеллоподобной композиции, или могут вызывать переход полинуклеотида в форму эмульсии, обратной эмульсии, липосомы или другой мицеллоподобной композиции. Варианты переносчиков включают противоионы или другие молекулы, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот, например, ионы неорганического аммония, ионы алкиламмония, ионы лития, полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин, и другие катионы. Варианты переносчиков включают органические растворители, такие как ДМСО, ДМФ, пиридин, N-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропиленгликоль или другие растворители, которые смешиваются с водой или те, которые растворяются, фосфонуклеотиды в неводных системах (таких, которые используются в синтетических реакциях). Варианты переносчиков включают полученные естественным путем или синтетические масла с добавлением или без поверхностно-активных веществ или эмульгаторов, например, масла растительного происхождения,, сельскохозяйственные масла (такие как масла, которые перечислены в 9-м Сборнике гербицидных адъювантов, доступном в свободном доступе он-лайн по ссылке herbicide.adjuvants.com ), парафиновые масла, эфиры полиолов и жирных кислот или масла с короткоцепочечными молекулами, модифицированными амидами или полиаминами, такими как полиэтиленимин или N-пирролидин.

[00191] Варианты переносчиков включают кремнийорганические препараты. Например, подходящий переносчик представляет собой кремнийорганический препарат, который является коммерчески доступным в виде поверхностно-активного вещества под брендом Silwet L-77®, имеющего номер CAS 27306-78-1 и номер EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-АА, и в настоящее время доступного у Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и переносчик, включающий кремнийорганический препарат, такой как Silwet L-77 с концентрацией в интервале от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовых процентов) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массовых процентов). Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид из данного изобретения и переносчик, который включает поверхностно-активное вещество под брендом Silwet L-77® с концентрацией в интервале от около 0,3 до около 1 процентов по массе (массовых процентов) или от около 0,5 до около 1% по массе (массовых процентов).

[00192] Кремнийорганические соединения, подходящие в качестве переносчиков для использования в данном изобретении, включают, но не ограничиваясь этим, соединения, которые включают: (а) концевую группу трисилоксана, которая ковалентно связана с (б) алкильным линкером, который включает, но не ограничиваясь этим, n-пропильный линкер, который ковалентно связан с (в) полигликолевой цепью, которая ковалентно связана с (г) терминальной группой. Концевые группы трисилоксана таких кремнийорганических соединений включают, но не ограничиваются этим, гептаметилтрислоксан. Алкильные линкеры могут включать, но не ограничиваясь этим, n-пропильный линкер. Полигликолевые цепи включают, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Полигликолевые цепи могут включать смесь, в которой средняя длина цепи "n" составляет около "7,5". В некоторых вариантах реализации изобретения средняя длина цепи "n" может варьировать от около 5 до около 14. Концевые группы могут включать, но не ограничиваясь этим, алкильные группы, такие как метильная группа. Кремнийорганические соединения, подходящие в качестве переносчиков, включают, но не ограничиваясь этим, поверхностно-активные вещества трисилоксан этоксилаты или полиалкиленоксид-модифицированный гептаметил трисилоксан. Пример переносчика для использования в данном изобретении представляет собой Соединение I:

(Соединение I: полиалкиленоксид гептаметилтрисилоксан, среднее n=7,5).

[00193], В качестве переносчиков используются подходящие кремнийорганические соединения, например, в свежеприготовленных концентрациях в диапазоне от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовых процентов) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массовых процентов).

[00194] Варианты переносчиков включают одну или более солей, таких как хлорид аммония, бромид тетрабутилфосфония и сульфата аммония, получаемых в композиции, которая включает полинуклеотид, или используемых совместно с ней. В некоторых вариантах реализации изобретения хлорид аммония, бромид тетрабутилфосфония и/или сульфат аммония используют в концентрации от около 0,5% до около 5% (масса/объем), или около 1% до около 3% (масса/объем), или около 2% (масса/объем). В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает аммониевую соль в концентрации, большей или равной 300 миллимоль. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает кремнийорганический переносчик в концентрации от около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовых процентов), а также сульфат аммония в концентрации от около 80 до около 1200 мМ или около 150 мМ до около 600 мМ.

[00195] Варианты переносчиков включают фосфатную соль. Фосфатные соли, используемые в композиции, включающей полинуклеотид, включают, но не ограничиваясь этим, фосфатные соли кальция, магния, калия или натрия. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфатную соль в концентрации по меньшей мере около 5 миллимоль, по меньшей мере около 10 миллимоль, или по меньшей мере около 20 миллимоль. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфатную соль с концентрацией в диапазоне от около 1 мМ до около 25 мМ или в диапазоне от около 5 мМ до около 25 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфат натрия в концентрации по меньшей мере около 5 миллимоль, по меньшей мере около 10 миллимоль, или по меньшей мере около 20 миллимоль. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфат натрия в концентрации около 5 миллимоль, около 10 миллимоль или около 20 миллимоль. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфат натрия с концентрацией в диапазоне от около 1 мМ до около 25 мМ или в диапазоне от около 5 мМ до около 25 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает фосфат натрия с концентрацией в диапазоне от около 10 мМ до около 160 мМ, или в диапазоне от около 20 мМ до около 40 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, включает натрий-фосфатный буфер с рН около 6,8.

[00196] Варианты переносчиков включают поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них. Поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них, включают, но не ограничиваясь этим, натрий или литиевые соли жирных кислот (таких как говяжий жир, или талловое масло, или фосфолипиды) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, скомбинирована с противоионами или других молекулами, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот. Не ограничивающие примеры включают ионы аммония, ионы тетраалкиламмония ионы, ионы триалкилалюминия, ионы сульфония, ионы лития, и полиамины, такие как спермин, спермидин, или путресцин. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, скомбинирована с неполинуклеотидным гербицидом, например, глифосатом, ауксино-подобными гербицидами из бензойной кислоты, которые включают дикамба, хлорамбен, тербутилазин (ТБА), глуфозинат, ауксиноподобный гербициды, которые включают гербицид из феноксикарбоновой кислоты, гербицид из пиридинкарбоновой кислоты, гербицид из хинолинкарбоновой кислоты, гербицид из пиримидинкарбоновой кислоты, беназолинэтиловый гербицид, сульфонилмочевину, имидазолиноны, бромоксинил, делапон, циклохезанедион, ингибиторы протопорфириноген оксидазы и гербициды, ингибирующие 4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназу. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, скомбинирована с неполинуклеотидным пестицидома, например, пататином, растительным лектином, фитоэкдистероидом, инсектицидным белком Bacillus thuringiensis, инсектицидным белком Xenorhabdus, инсектицидным белком Photorhabdus, инсектицидным белком Bacillus laterosporous и инсектицидным белком Bacillus sphaericus. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, включающая полинуклеотид, и неполинуклеотидный пестицид, обеспечивает синергетическое улучшение предотвращения или борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa, по сравнению с результатом, полученным с использованием только полинуклеотида или только неполинуклеотидного пестицида. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая двухцепочечную РНК с цепью, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из Группы триггерных последовательностей, объединена с не-полинуклеотидным пестицидом (например, пататином, растительным лектином, фитоэкдистероидом, инсектицидным белком Bacillus thuringiensis, инсектицидным белком Xenorhabdus, инсектицидным белком Photorhabdus, инсектицидным белком Bacillus laterosporous и инсектицидным белком Bacillus sphaericus), причем, как обнаружено, эта комбинация вызывает синергическое улучшенное предотвращения или борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, получаемый только с двухцепочечной РНК или только с неполинуклеотидным пестицидом.

СМЕЖНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

[00197] Варианты полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, могут включать дополнительные элементы, такие как промоторы, небольшие сайты распознавания РНК, аптамеры или рибозимы, дополнительные кассеты экспрессии для экспрессии кодирующих последовательностей (например, с целью экспрессии трансгена, такого как инсектицидный белок или селективный маркер) или некодирующие последовательности (например, с целью экспрессировать дополнительные элементы супрессии). Например, один из аспектов данного изобретения относится к рекомбинантной генетической конструкции ДНК, включающей гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, включающей по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью с от около 95% до около 100% идентичности фрагменту ДНК эквивалентной длины, имеющему последовательность, выбранную из Группы последовательностей целевого гена или ДНК, комплементарной им. Другой аспект данного изобретения относится к рекомбинантной генетической конструкции ДНК, содержащей гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей шпильку РНК, имеющую антисмысловую область, имеющую последовательность, или фрагмент последовательности, выбранной из группы, выбранной из Группы триггерных последовательностей. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК, содержащая промотор, функционально связана с ДНК, кодирующей: а) РНК элемент сайленсинга для супресии целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов, идентифицированных в таблице 1, и б) аптамер, стабильно встроенный в геном растения, из которого РНК-транскрипты, в том числе РНК аптамер и РНК элемент сайленсинга, экспрессируются в растительных клетках; аптамер служит для направления РНК элемента сайленсинга в нужное место в клетке. В другом варианте реализации изобретения включение одного или более сайтов распознавания для связывания и расщепления малыми РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которая экспрессируется только в определенной клетке или ткани) позволяет более точную экспрессию паттерна в растении, причем экспрессия рекомбинантной генетической конструкции ДНК супрессируется в случае, когда экспрессируется малая РНК. Такие дополнительные элементы описаны ниже.

Промоторы

[00198] Промоторы, используемые в данном изобретении, являются функциональными в клетке, в которой генетическая конструкция должна транскрибироваться. Как правило, эти промоторы представляют собой гетерологические промоторы, используемые в рекомбинантных генетических конструкциях, то есть в природе они не связаны функционально с другими нуклеиновыми элементами, используемыми в генетических конструкциях, описанных в данном документе. В различных вариантах реализации изобретения промотор выбирается из группы, состоящей из конститутивного промотора, пространственно-специфического промотора, время-специфического промотора, промотора, специфического к этапу развития, и индуцибельного промотора. Во многих вариантах реализации изобретения промотор представляет собой промотор, функциональный в растении, например, промотор Pol II, промотор Pol III, промотор Pol IV или промотор Pol V.

[00199] Неконститутивные промоторы, подходящие для использования с рекомбинантными генетическими конструкциями ДНК из данного изобретения, включают пространственно-специфические промоторы, время-специфические промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно-специфические промоторы могут включать промоторы, специфичные к органеллам, клеткам, тканям или органам (например, промоторы, специфичные к пластидам, корню, пыльце или семени для экспрессии в пластидах, корню, пыльце или семени соответственно). Во многих случаях в особенности эффективным является промотор, специфичный к семени, промотор, специфичный к эмбриону, промотор, специфичный к алейрону, или промотор, специфичный к эндосперму. Время-специфические промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию повышать экспрессию на протяжении определенных этапов развития в цикле роста растения, либо в разное время дня и ночи, или в разные времена года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами или условиями окружающей среды, такими как, но не ограничиваясь этим, биологическим или абиотическим стрессам (например, водным дефицитом или засухой, высокой температурой, низкой температурой, высокими или низкими уровнями питательных веществ или солей, высокими или низкими уровнями освещенности, или вредителями или возбудителями инфекции). Эффективными являются промоторы микроРНК, в особенности те, которые имеют время-специфичный, пространственно-специфичный или индуцибельный паттерн экспрессии; примеры промоторов микроРНК, а также способы идентификации промоторов микроРНК, имеющих специфические паттерны экспрессии, приведены в публикациях заявок на патент США 2006/0200878, 2007/0199095 и 2007/0300329, которые специально включены в данный документ посредством ссылки. Промотор для специфической экспрессии также может включать промоторы, которые, как правило, конститутивно экспрессируется, но с разным уровнем "силы" экспрессии, включая промоторы, которые обычно рассматриваются как "сильные промоторы" или как "слабые" промоторы.

[00200] Промоторы, представляющие особый интерес, включают следующие примеры: промотор опалин-синтазы, выделенный из Т-ДНК из Agrobacterium; 35S промотор вируса мозаики цветной капусты; энхансерные промоторные элементы или химерные промоторные элементы, такие как усиленный 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV), связанный с энхансерным элементом (интрон из белка теплового шока 70 из Zea mays); корнеспецифические промоторы, такие как те, которые описаны в патентах США 5837848, 6437217 и 6426446; олеозиновый промотор кукурузы L3, описанный в патенте США 6433252; промотор для гена растительного ядра, кодирующего пластидную альдолазу, описанный в публикации заявки на патент США 2004/0216189; холодо-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6084089; соле-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США № 6140078; свето-индуцируемые промоторы описанные в патенте США 6294714; патоген-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6252138; и промоторы, индуцируемые водным дефицитом, описанные в публикации заявки на патент США 2004/0123347 А1. Все вышеописанные патенты и патентные публикации, описывающие промоторы и их использование, в особенности в рекомбинантных генетических конструкциях ДНК, функционирующих в растениях, включены в данный документ посредством ссылки.

[00201] Целевые промоторы, специфические к растительным сосудам или к флоэме, включают промотор rolC или rolA из Agrobacterium rhizogenes, промотор гена 5 из Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens, промотор гена RSs1 сахаросинтазы риса, промотор вируса листовой гнили кокоса, промотор палочковидного тунгровируса риса, промотор гена GS3A глутамин-синтазы гороха, промоторы invCD111 и invCD141 генов инвертазы картофеля, промотор, выделенный из Arabidopsis, который, как показано, имеет экспрессию, специфическую к флоэме, в табаке согласно Kertbundit et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88:5212-5216, промоторную область VAHOX1, промотор гена инвертазы клеточной стенки гороха, промотор гена кислой инвертазы из моркови, промотор гена переносчика сульфата Sultr1;3, промотор гена сахарозосинтазы растений и промотор гена переносчика сахарозы растений.

[00202] Промоторы, подходящие для использования с рекомбинантной генетической конструкцией ДНК или полинуклеотидом из данного изобретения, включают промоторы полимеразы II ("Pol II") и промоторы полимеразы III ("Pol III"). РНК-полимераза II транскрибирует структурную или каталитическую РНК, которая, как правило, короче чем 400 нуклеотидов в длину, и распознает одиночный цикл остатков Т как сигнал терминации; она была использована, с целью транскрибировать дуплексы миРНК (см., например, Lu et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: e171). Следовательно, промоторы Pol II используются в некоторых вариантах реализации изобретения в случаях, когда необходимо получить короткий транскрипт РНК из рекомбинантной генетической конструкции ДНК из данного изобретения. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК включает промотор Pol II с для экспрессии транскрипта РНК, который фланкируют саморасщепляющиеся последовательности рибозима (например, саморасщепляющиеся молоточковые рибозимы), что приводит к процессингу РНК, такой как одноцепочечная РНК, который связывается с транскриптом целевого гена Leptinotarsa, с четкими 5'- и 3'-концами, свободными от потенциально интерферирующих фланкирующих последовательностей. Альтернативный подход использует промоторы Pol III для создания транскриптов с относительно четкими 5'- и 3'-концами, то есть, для транскрипции РНК с минимальными фланкирующими последовательнастями на 5 'и 3' концах. В некоторых вариантах реализации изобретения промоторы Pol III (например, промоторы U6 или H1) служат для добавления коротких сайтов терминации транскрипции с высоким содержанием АТ, что приводит к образованию выступов из 2 пар оснований (UU) в транскрибируемой РНК; это полезно, например, для экспрессии генетических конструкций типа миРНК. Сообщалось об использовании промоторов Pol III для запуска экспрессии генетических конструкций миРНК сообщалось, см. van de Wetering et al. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, and Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448. В данной области техники известны и комерчески доступны промоторы бакуловируса, такие как промотор полиэдрина бакуловируса и промотор p10; см., например, Invitrogen’s “Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques”, 2002 (Life Technologies, Carlsbad, CA) and F. J. Haines et al. “Baculovirus Expression Vectors”, undated (Oxford Expression Technologies, Oxford, UK).

[00203] Промоторный элемент может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые в природе не являются промоторами или промоторными элементами, или их гомологами, но которые могут регулировать экспрессию гена. Примеры таких "ген-независимых" регуляторных последовательностей включают встречающиеся в природе или искусственно полученные последовательности РНК, которые включают лигандсвязывающую область или аптамер (смотри раздел "Аптамеры" ниже) и регуляторную область (которая может быть цис-действующей). Смотри, например, Isaacs et al. (2004) Nat. Biotechnol., 22: 841-847, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343, Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463, Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23: 109-112, Winkler et al. (2002) Nature, 419: 952-956, Sudarsan et al. (2003) RNA, 9: 644-647, и Mandal and Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11: 29-35. Такие "риборегуляторы" могли бы быть отобраны или созданы для конкретной пространственной или временной специфичности, например, для регуляции трансляции ДНК, которая кодирует элемент сайленсинга для супрессии целевого гена Leptinotarsa только в присутствии (или отсутствии) заданной концентрации соответствующего лиганда. Один из примеров представляет собой риборегулятор, который реагирует на эндогенный лиганд (например, жасминовую кислоту или салициловую кислоту), производимый растением, когда оно находится в условиях стресса (например, абиотического стресса, такого как водный, температурный или питательный стресс, или биотического стресса, такого как контакт с вредителями или патогенами); в условиях стресса уровень эндогенного лиганда возрастает до уровня, достаточного для того, чтобы риборегулятор запустил транскрипцию ДНК, кодирующей элемент сайленсинга для супрессии целевого гена Leptinotarsa.

Рекомбиназные сайты

[00204] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает ДНК, кодирующую один или более сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназой. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК включает по меньшей мере пару сайтов loxP, причем между сайтами loxP происходит сайт-специфическая рекомбинация ДНК при участии рекомбиназы Cre. Положение и относительная ориентация сайтов loxP выбирают таким образом, чтобы достичь желаемой рекомбинации; например, когда сайты loxP находятся в одинаковой ориентации, ДНК между сайтами loxP вырезается в кольцевой форме. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК содержит ДНК, кодирующую одну сайт loxP; в присутствии рекомбиназы Cre и другой ДНК с сайтом loxP, происходит рекомбинация этих двух ДНК.

Аптамеры

[00205] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения содержит ДНК, которая процессируется до РНК-аптамера, то есть РНК, которая связывается с лигандом через механизм связывания, который не основан в первую очередь на спаривании оснований Уотсона-Крика (в отличие, например, от спаривания оснований, которое происходит между комплементарными антипараллельным цепями нуклеиновых кислот с образованием структуры двухцепочечной нуклеиновой кислоты). См., например, Ellington and Szostak (1990) Nature, 346:818-822. Примеры аптамеров можно найти, например, в публичной Базе данных аптамеров, доступной он-лайн по ссылке aptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32(1):D95-100). Аптамеры используемые в данном изобретении, могут, однако, быть одновалентным (связывающиеся с одним лигандом) или мультивалентными (связывающиеся более чем с одним индивидуальным лигандом, например, связывающиеся с одним представителем двух или более различных лигандов).

[00206] Лиганды, используемые в данном изобретении, включают любую молекулу (или часть молекулы), которая может быть распознана и связана со вторичной структурой нуклеиновой кислоты по механизму, который не основывается в первую очередь на спаривании оснований Уотсона-Крика. Таким образом, распознавание и связывание лиганда и аптамеров является аналогичным таковому для антигена и антитела или для биологического раздражителя и рецептора. Лиганды могут включать отдельные молекулы (или часть молекулы) или комбинацию из двух или более молекул (или части молекулы), и могут включать один или несколько макромолекулярных комплексов (например, полимеров, липидных бислоев, липосом клеточных мембран или других клеточных структур, или клеточных поверхностей). Примеры специфических лигандов включают витамины, такие как кофермент B₁₂ и тиамин пирофосфат, флавинмононуклеотид, гуанин, аденозин, S-аденозилметионин, S-аденозилгомоцистеин, коэнзим А, лизин, тирозин, допамин, глюкозамин-6-фосфат, кофеин, теофиллин, антибиотики, такие как хлорамфеникол и неомицин, гербициды, такие как глифосат и дикамбой, белки, в частности вирусные или фаговые белки оболочки и белки эпидермиса или поверхности пищеварительного тракта беспозвоночных и молекулы РНК, в том числе вирусная РНК, транспортные РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), и РНК-полимеразы, такие как РНК-зависимая РНК-полимераза (РЗРП). Один класс РНК-аптамеров, используемых в изобретении, представляет собой "термовыключатели", которые не связываются с лигандом, но которые являются термочувствительными, иными словами, конформация аптамера определяется температурой; см, например, блок 3 в Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463.

Трансгенные единицы транскрипции

[00207] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает трансгенную единицу транскрипции. Трансгенная единица транскрипции включает последовательность ДНК, кодирующую ген интереса, например, природный белок или гетерологический белок. Ген интереса может представлять собой любую кодирующую или некодирующую последовательность из любых видов (в том числе, но не ограничиваясь этим, не эукариот, таких как бактерии и вирусы; грибов, простейших, растений, беспозвоночных и позвоночных животных).Конкретные гены интереса представляют собой гены, кодирующие по меньшей мере одно пестицидное средство, выбранное из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus. Трансгенная единица транскрипции может дополнительно включать 5'- или 3'- последовательность или обе, если это необходимо для транскрипции трансгена.

Интроны

[00208] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает ДНК, кодирующую вырезающийся интрон. Под "интроном" как правило понимается сегмент ДНК (или РНК, которая транскрибируется с такого сегмента), которая расположена между экзонами (белок-кодирующими сегментами ДНК или соответствующий транскрибируемой РНК), причем во время созревания информационной РНК интрон ферментативно "сплайсируется" или удаляется из цепи РНК с помощью процесса расщепления/ лигирования, который происходит в ядре эукариот. Термин "интрон" также применяется к некодирующим последовательностям ДНК, которые транскрибируются в сегменты РНК, которые могут быть сплайсированы из зрелого РНК-транскрипта, но не являются интронами, которые находятся между экзонами, кодирующими белки. Один из примеров этих последовательностей представляет собой самовырезающиеся последовательности, которые имеют способность усиливать экспрессию в растениях (в некоторых случаях особенно в однодольных) нижерасположенной кодирующей последовательности; эти самовырезающиеся последовательности естественным образом расположены в 5'-нетранслируемой области некоторых генов растений, а также в некоторых генах вирусов (например, 5'-лидерная последовательность вируса табачной мозаики или "омега" лидер, описаный как усиливающий экспрессию в растительных генах Gallie and Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20: 4631-4638). Эти вырезающиеся последовательности или "интроны, усиливающие экспрессию" могут быть искусственно вставлены в 5'-нетранслируемую область гена растения между промотором, но до каких-либо белок-кодирующих экзонов. Примеры таких интронов, повышающих экспрессию, включают, но не ограничиваясь этим, алкогольдегидрогеназу кукурузы (Zm-ADH1), интрон, повышающий экспрессию Bronze-1 в кукурузе, инрон актина 1 риса (ОС-ACT1), интрон Shrunken-1 (Sh-1), интрон сахарозосинтазы кукурузы, интрон белка теплового шока 18 (hsp18), и интрон белка теплового шока 82 килодальтон (hsp82). В патентах США 5593874 и 5859347, специально включенных в данный документ посредством ссылки, описаны способы улучшения рекомбинантных генетических конструкций ДНК для использования в растениях путем включения интрона, повышающего экспрессию, полученного из белка теплового шока кукурузы 70 килодальтон (hsp70) в нетранслируемый лидер, расположенный в 3'-направлении от промотора гена и в 5'-направлении от первого белок-кодирующего экзона.

Рибозимы

[00209] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкцию ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает ДНК, кодирующую один или несколько рибозимов. Рибозимы, представляющие особый интерес, включают саморасщепляющийся рибозим, молоточковый рибозим или рибозим, содержащий шпильку. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная генетическая конструкция ДНК содержит ДНК, кодирующую один или несколько рибозимов, которые служат для расщепления транскрибируемой РНК, с целью получить определенные сегменты РНК, такие как элементы сайленсинга для супрессии целевого гена Leptinotarsa.

Элементы супрессии генов

[00210] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает ДНК, кодирующую дополнительный элемент супрессии гена для супрессии целевого гена, отличного от целевого гена Leptinotarsa. Супрессируемый целевой может включать кодирующие или некодирующие последовательности, или обе.

[00211] Подходящие элементы супрессии генов подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, описание которого специально включено в данный документ посредством ссылки, и включают одну или более из:

а) ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по отношению к по меньшей мере одному сегменту гена, который нужно супрессировать;

б) ДНК, которая включает несколько копий по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по отношению к по меньшей мере одному сегменту гена, который нужно супрессировать;

в) ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который представляет собой по меньшей мере один сегмент гена, который нужно супрессировать;

г) ДНК, которая включает несколько копий по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который представляет собой по меньшей мере один сегмент гена, который нужно супрессировать;

д) ДНК, которая транскрибируется в РНК с целью супресси гена, который нужно супрессировать, путем формирования двухцепочечной РНК и содержит по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по отношению к по меньшей мере одиному сегменту гена, который нужно супрессировать, и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который представляет собой по меньшей мере один сегмент гена, который нужно супрессировать;

е) ДНК, которая транскрибируется в РНК с целью супрессии гена, который нужно супрессировать, путем формирования одной двухцепочечной РНК и включает несколько последовательных антисмысловых сегментов ДНК, которые являются антисмысловыми по отношнию к по меньшей мере одному сегменту гена, который нужно супрессировать, и несколько последовательных смысловых сегментов ДНК, которые представляют собой по меньшей мере один сегмент гена, который нужно супрессировать;

ж) ДНК, которая транскрибируется в РНК с целью супрессии гена, который нужно супрессировать, путем формирования нескольких двойных цепей РНК и содержит несколько антисмысловых сегментов ДНК, которые являются антисмысловыми по отношению к по меньшей мере одному сегменту гена, который нужно супрессировать и несколько смысловых сегментов ДНК, которые представляют собой по меньшей мере один сегмент гена, который нужно супрессировать, и причем несколько антисмысловых сегментов ДНК и несколько смысловых сегментов ДНК расположены в виде серий инвертированных повторов;

з) ДНК, которая включает нуклеотиды, полученные из микроРНК растений;

и) ДНК, которая содержит нуклеотиды из миРНК;

к) ДНК, которая транскрибируется в аптамер РНК, способный связываться с лигандом; и

л) ДНК, которая транскрибируется в аптамер РНК, способный связываться с лигандом, и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию гена, который нужно супрессировать, причем это регулирование зависит от конформации регуляторной РНК, и конформация регуляторной РНК аллостерически зависит от состояния связи аптамера РНК.

[00212] В некоторых вариантах реализации изобретения при отсутствии какого-либо белок-кодирующего экзона (кодирующей последовательности) для получения элемента супрессии гена используют интрон. В одном из примеров интрон, такой как интрон, повышающий экспрессию, разрывается путем вставки в этот интрон элемента супрессии гена, причем в результате транскрипции элемент супрессии гена отделяется из интрона. Таким образом белок-кодирующим экзонам не требуется обладать функцией супрессии гена рекомбинантных генетических конструкций ДНК, описанных в данном документе.

Регуляторные элементы транскрипции

[00213] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная конструкция ДНК или полинуклеотид из данного изобретения включает ДНК, кодирующую регуляторный элемент транскрипции. Регуляторные элементы транскрипции включают элементы, которые регулируют уровень экспрессии рекомбинантной генетической конструкции из данного изобретения (по сравнению с ее экспрессией при отсутствии таких регуляторных элементов). Примеры регуляторных элементов транскрипции включают подходящие рибосвитчи (цис- или транс-действия), последовательности, стабилизирующие транскрипт, и сайты распознавания микроРНК, которые подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, публикации специально включенной в данный документ посредством ссылки.

Создание и использование трансгенных растительных клеток и трансгенных растений

[00214] Трансформация растения может включать любой из нескольких хорошо известных способов и композиций. Подходящие способы трансформации растения включают практически любой способ, посредством которого ДНК может быть введена в клетку. Один из способов трансформации растений представляет собой бомбардировку микрочастицами, например, как показано в патентах США 5015580 (соя), 5538880 (кукуруза), 5550318 (кукуруза), 5914451 (соя), 6153812 (пшеница), 6160208 (кукуруза), 6288312 (рис), 6365807 (рис) и 6399861 (кукуруза) и 6403865 (кукуруза), все из которых включены посредством ссылки, для возможности производства трансгенных растений.

[00215] Еще один подходящий способ трансформации растений представляет собой Agrobacterium-опосредованную трансформацию с помощью Agrobacterium, содержащих бинарные системы Ti-плазмиды, причем Agrobacterium несет сначала Ti-плазмиду, потом - химерную плазмиду, содержащую по меньшей мере одну граничную последовательность Т-ДНК Ti-плазмиды дикого типа, промотор, функциональный в трансформированной растительной клетке и функционально связанный с полинуклеотидом или рекомбинантной генетической конструкцией ДНК из данного изобретения. См., например, бинарную систему, описанную в патенте США 5159135, включенный посредством ссылки. Также см. De Framond (1983) Biotechnology, 1:262-269; и Hoekema et al., (1983) Nature, 303:179. В такой бинарной системе наименьшая плазмида, содержащая граничную последовательность или последовательности Т-ДНК, может быть легко сконструирована и введена в подходящего альтернативного хозяина, например, E.coli, и затем перенесена в Agrobacterium.

[00216] Подробные процедуры агробактериальной трансформации растений, в особенности культурных растений, включают процедуры, описанные в патентах США 5004863, 5159135 и 5518908 (хлопок); 5416011, 5569834, 5824877 и 6384301 (соя); 5591616 и 5981840 (кукуруза); 5463174 (крестоцветные, включая рапс), 7026528 (пшеница) и 6329571 (рис), а также в публикациях заявки на патент США 2004/0244075 (кукуруза) и 2001/0042257 A1 (сахарная свекла), все из которых специально включены посредством ссылки для возможности производства трансгенных растений. Публикация заявки на патент США 2011/0296555 описывает в примере 5 описываются трансформационные векторы (в том числе векторные последовательности) и подробные протоколы трансформации кукурузы, сои, рапса, хлопка и сахарного тростника и специально включена посредством ссылки для возможности производства трансгенных растений. Аналогичные способы были показаны для многих видов растений, как однодольных у двудольных и, включая, среди прочего, арахис (Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep., 15: 653); спаржу (Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345); ячмень (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol., 104:37); рис (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology, 6:10; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep., 7:379; пшеницу (Vasil et al. (1992) Bio/Technology,10:667; Becker et al. (1994) Plant J., 5:299), люцерну (Masoud et al. (1996) Transgen. Res., 5:313); и томат (Sun et al. (2006) Plant Cell Physiol., 47:426-431). См. также описание векторов, способов трансформации, и производство трансформированных растений Arabidopsis thaliana, в которых транскрипционные факторы конститутивно экспрессируются промотором 35S ВМЦК, в заявке на патент США 2003/0167537 А1, включенной посредством ссылки. В данной области техники хорошо известны способы трансформации, специально используемые для пасленовых растений. См., например, находящиеся в открытом доступе описанные способы трансформации для томата (Sharma et al. (2009), J. Biosci., 34:423-433), баклажана (Arpaia et al. (1997) Theor. Appl. Genet., 95:329-334), картофеля (Bannerjee et al. (2006) Plant Sci., 170:732-738; Chakravarty et al. (2007) Amer. J. Potato Res., 84:301-311; S. Millam “Agrobacterium-mediated transformation of potato.” Chapter 19 (pp.257-270), “Transgenic Crops of the World: Essential Protocols”, Ian S. Curtis (editor), Springer, 2004), и перцев (Li et al. (2003) Plant Cell Reports, 21: 785-788). Стабильно трансгенный картофель, томаты и баклажаны были коммерчески введены в различных регионах; см., например, K. Redenbaugh et al. “Safety Assessment of Genetically Engineered Fruits and Vegetables: A Case Study of the FLAVR SAVRTM Tomato”, CRC Press, Boca Raton, 1992, и обширная находящаяся в открытом доступе документация по коммерческим генетически модифицированным культурам в Database GM; см: CERA. (2012). GM Crop Database. Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C., доступна в электронной форме по ссылке www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database. В данной области техники хорошо известны различные способы трансформации других видов растений, см., например, энциклопедический справочник “Compendium of Transgenic Crop Plants”, edited by Chittaranjan Kole and Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd., 2008; ISBN 978-1-405-16924-0 (доступен в электронной форме по ссылке mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc), в котором описаны процедуры трансформации для злаков и кормовых трав (рис, кукуруза, пшеница, ячмень, овес, сорго, бажры, дагуссы, холодосезонных кормовых трав и паспалума), масличных культур (сои, масличных крестоцветных, подсолнечника, арахиса, льна, кунжута, и сафлора), бобовых, зерновых и кормовых культур (фасоли обыкновенной, китайской вигны, гороха, конского боба, чечевицы, тепари, азиатского боба, каянуса, вики, нута, люпина, люцерны, и клевера), фруктов и орехов средних широт (яблока, груши, персика, сливы, ягодных культур, вишни, винограда, оливки, миндаля, и грецкого орех), тропических и субтропических фруктов и орехов (цитрусовых, грейпфрута, банана и плантайна, ананаса, папайи, манго, авокадо, киви, маракуи, и хурмы), овощных культур (томата, баклажана, перца, овощных крестоцветных, редьки, моркови, бахчевых, видов лука, спаржи, и листовых овощей), сахарных, клубневых и текстильных культур (сахарного тростника, сахарной свеклы, стевии, картофеля, сладкого картофеля, маниоки, и хлопка), многолетних культур, декоративных растений и рулонных трав (табака, кофе, какао, чая, каучукового дерева, лекарственных растений, декоративных растений и газонных трав) и лесных видов деревьев.

[00217] Способы трансформации для получения трансгенных клеток и трансгенных растений, содержащих стабильно интегрированную рекомбинантную ДНК, предпочтительно практикуют в тканевой культуре на среде и в контролируемых условиях. "Среда" относится к многочисленным питательным смесям, используемым для выращивания клеток in vitro, то есть за пределами интактного живого организма. Реципиентные целевые клетки включают, но не ограничиваясь этим, клетки меристемы, каллус, незрелые эмбрионы или части эмбрионов и клетки-гаметы, такие как микроспоры, пыльца, сперматозоиды и яйцеклетки. Любая клетка, из которой может быть регенерировано фертильное растение, рассматривается в качестве подходящей реципиентной клетки для реализации данного изобретения. Каллус может быть получен из разных тканевых источников, включая, но не ограничиваясь этим, незрелые эмбрионы или части эмбрионов, апикальные меристемы всходов, микроспоры и тому подобное. Клетки, способные к пролиферации в виде каллуса, могут служить в качестве реципиентных клеток для генетической трансформации. Практические способы трансформации и материалы для получения трансгенных растений из данного изобретения (например, различные среды и реципиентные целевые клетки, трансформация незрелых эмбрионов и последующая регенерация фертильных трансгенных растений) описаны, например, в патентах США 6194636 и 6232526 и в публикации заявки на патент США 2004/0216189, которые специально включены посредством ссылки.

[00218] В общей практике трансформации ДНК вводят в только небольшой процент целевых клеток в любом одном эксперименте по трансформации. Для получения эффективной системы идентификации клеток, которые стабильно трансформированны путем получения и встраивания генетической конструкции ДНК в геном как правило использует гены-маркеры. Предпочтительные маркерные гены позволяют получать селективные маркеры, которые придают устойчивость к селективному средству, такому как антибиотик или гербицид. Средством, подходящим для отбора, может быть любой из антибиотиков или гербицидов, к которым растительная клетка обладает устойчивостью. Потенциально трансформированные клетки подвергаются селективному средству. В популяции выживших клеток будут находиться те клетки, в которых ген, обеспечивающий устойчивость, встроен и экспрессирован на уровне, достаточном для обеспечения выживаемости клеток. Клетки могут быть дополнительны проверены с целью подтвердить стабильную интеграцию рекомбинантных ДНК. Широко используемые селективные маркерные гены включают гены, придающие устойчивость к антибиотикам, таким как канамицин или паромомицином (nptII), гигромицин B (aph IV) и гентамицин (aac3 и aacC4) или устойчивость к гербицидам, таким как глюфосинат (bar или pat) и глифосат (EPSPS). Примеры используемых селективных маркерных генов и средств отбора проиллюстрированы в патентах США 5550318, 5633435, 5780708 и 6118047, все из которых специально включены посредством ссылок. Могут быть задействованы маркеры и репортеры, поддающиеся скринигу, такие как маркеры, которые позволяют визуально идентифицировать трансформанты. Примеры маркеров, подходящих для скрининга, включают, например, ген, экспрессирующих белок, который вырабатывает детектируемый цвет при воздействии на хромогенный субстрат (например, бета-глюкуронидазу (GUS) (uidA) или люциферазу (Luc)) или который детектируемый сам по себе, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP) (gfp) или иммуногенная молекула. Специалистам в данной области будет понятно, что для использования доступны многие другие подходящие маркеры или репортеры.

[00219] Обнаружение или измерение транскрипции рекомбинантной генетической конструкции ДНК в трансгенной растительной клетке может быть достигнуто любым подходящим способом, включая способы обнаружения белка (например, вестерн-блоттинги, имуносорбентные ферментые анализы (ИСФА) и другие иммунохимические способы), измерения ферментативной активности или способы обнаружения нуклеиновой кислот (например, саузерн-блоттинги, нозерн-блоттинги, ПЦР, ОТ-ПЦР, флуоресцентная гибридизация in situ).

[00220] Другие подходящие способы обнаружения или измерения транскрипции в растительной клетке рекомбинантного полинуклеотида из данного изобретения, направленные на целевой ген видов рода Leptinotarsa, включают измерение любого другого признака, который является прямым или опосредованным показателем уровня экспрессии целевого гена у видов рода Leptinotarsa по отношению к уровню экспрессии, которая наблюдается при отсутствии рекомбинантного полинуклеотида, например, скорость роста, уровень смертности, или скорость размножения или увеличения численности видов рода Leptinotarsa или измерения уровня повреждений (например, повреждений корней) или потери урожая в растении или поле, зараженном видами рода Leptinotarsa. Как правило, подходящие способы для обнаружения или измерения транскрипции в растительной клетке целевого рекомбинантного полинуклеотида, включают, например, внешние или микроскопические морфологические признаки, скорость роста, урожай, скорость размножения или увеличения численности, устойчивость к вредителям или патогенам, или устойчивость к биотическому или абиотическому стрессу (например, водные дефицит, солевой стресс, питательный стресс, тепловой или холодовой стресс). Такие способы могут использовать прямые измерения фенотипического признака или опосредованные анализы (например, в растениях эти анализы включают анализы частей растений, такие как анализы корней или листьев с целью определить устойчивость к абиотическому стрессу). Такие способы включают прямые измерения устойчивости к беспозвоночным вредителям или патогенам (например, повреждения растительных тканей) или опосредованные анализы (например, оценка урожая растений, или биотесты, такие как биотест личинок западного колорадского жука (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), описанный в международной публикации заявки на патент WO2005/110068 A2 и в публикации заявки на патент США US 2006/0021087 A1, специально включенных посредством ссылки, или биотест соевой нематоды, описанный Steeves et al.(2006) Funct. Plant Biol., 33:991-999, в котором измеряется количество цист на растение, цист на грамм корня, яиц на растение, яиц на грамм корня, и яиц на цисту, или биотест колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), описанное в рабочих примерах.

[00221] Рекомбинантные генетические конструкции ДНК из данного изобретения могут быть соединены с другими рекомбинантными ДНК для придания дополнительных свойств, (например, в случае трансформированных растений, признаков, включающих устойчивость к гербицидам, устойчивость к вредителям, устойчивость к холодовому прорастанию, устойчивость к водному дефициту и тому подобное), например, путем экспрессии или супрессии других генов. Генетические конструкции для согласованного уменьшения и увеличения экспрессии генов описаны в публикации заявки на патент США 2004/0126845 А1 публикации, специально включенного посредством ссылки.

[00222] Семена фертильных трансгенных растений могут быть собраны и использованы для выращивания потомства, в том числе гибридных поколений, трансгенных растений из данного изобретения, которые включают рекомбинантную генетическую конструкцию ДНК в геноме. Таким образом, в дополнение к прямой трансформации растения с рекомбинантной генетической конструкцией ДНК из данного изобретения трансгенные растения из данного изобретения могут быть получены путем скрещивания первого растения, имеющего рекомбинантную ДНК, со вторым растением, в котором эта генетическая конструкция отсутствует. Например, рекомбинантная ДНК может быть введена в линию растений, которая поддается трансформации, для получения трансгенного растения, которое может быть скрещено со второй линией растений с целью интрогрессии рекомбинантной ДНК в полученное потомство. Трансгенное растение из данного изобретения может быть скрещено с линией растений, имеющей другую рекомбинантную ДНК, которая обеспечивает один или более дополнительных признаков (таких как, но не ограничиваясь этим, устойчивость к гербицидам, устойчивость к вредителям или заболеваниям, устойчивость к воздействию окружающей среды, изменение содержания питательных веществ и повышение урожая) для получения потомства растений, имеющих рекомбинантную ДНК, которая обеспечивает как желаемое протекание экспрессии целевой последовательности и дополнительный признак(и).

[00223] При таком отборе с целью объединения признаков дополнительный признак может привносить мужская линия (опылитель) и трансгенное растение, несущие базовые признаки, может представлять собой женскую линию. Потомство от этого скрещивания распределяется таким образом, что некоторые из растений будут нести ДНК обоих родительских признаков, а некоторые будут нести ДНК для одного родительского признака; такие растения могут быть идентифицированы с помощью маркеров, связанных с родительскими рекомбинантными ДНК. Растения-потомки, несущие ДНК обоих родительских признаков, могут быть снова скрещены с женской материнской линией несколько раз, например, как правило на протяжении от 6 до 8 поколений, с целью получить в потомстве гомозиготное растение с генотипом, по существу сходным с таковым у исходной трансгенной родительской линии, а также рекомбинантную ДНК другой трансгенной родительской линии.

[00224] Еще один аспект данного изобретения представляет собой трансгенное растение, выращенное из трансгенного семени (или в случае картофеля, трансгенные семенного картофеля) из данного изобретения. В данном изобретении рассматриваются трансгенные растения, выращенные непосредственно из трансгенного семени, содержащего рекомбинантную ДНК, а также потомство растений, в том числе инбредные или гибридные линии растений, полученные путем скрещивания трансгенного растения, выращенного непосредственно из трансгенных семян, со вторым растением, не выращенным из того же трансгенного семени. Скрещивание может включать, например, следующие этапы:

а) высадить семена первого родительского растения (например, нетрансгенного или трансгенного) и второго родительского растения, которое является трансгенным согласно данному изобретению;

б) вырастить из семена первого и второго родительских растений цветущие растения;

в) опылить цветок первого родителя пыльцой второго родителя; и

г) собрать семена, полученные от на родительском растении, несущем опыленный цветок.

[00225] Часто желательной является интрогрессия рекомбинантной ДНК в элитные сорта, например, путем обратного скрещивания, с целью передать определенную желаемую черту от одного источника к инбредному или другому растению, у которого отсутствует эта черта. Это может быть достигнуто, например, путем первоначального скрещивания основного инбредного растения ("A") (рекуррентного родителя) с донорным инбредным растением ("B") (нерекуррентного родителя), которое несет соответствующий ген(ы) для целевого признака, например, генетическая конструкция, подготовленная согласно данному изобретению. Потомство от этого скрещивания сначала отбирается в полученном потомстве по целевому признаку, который должен быть передан от нереккурентного родителя "B", а потом отобранное потомство опять скрещивается с основным рекуррентным родителем "A". После пяти или более поколений возвратного скрещивания с отбором по целевому признаку потомство может быть по существу гемизиготным для локусов, контролирующих свойство, которое передается, но быть сходным с основным родителем по большинству или почти всем остальным генам. Последнее поколение от возвратного скрещивания будет подвержено самоопылению, чтобы дать потомство, которое представляет собой исключительно результат отбора по передаваемому гену(ам), например, по одной или более трансформациям.

[00226] С помощью серии селективных манипуляций выбранная генетическая конструкция ДНК может быть перенесена из одной линии в совершенно другую линию без необходимости дополнительной рекомбинантной манипуляции. Таким образом можно получать инбредные растения, которые представляют собой истинный результат отбора по одному или нескольким генетическим конструкциям ДНК. Путем скрещивания различных инбредных растений можно получать большое количество различных гибридов с различными комбинациями генетических конструкция ДНК. Таким образом могут быть получены растения, которые имеют целевые агрономические свойства, зачастую связанные с гибридами ("гибридная сила"), и целевые свойства, придаваемые одной или несколькими генетическими конструкциями ДНК.

[00227] В некоторых клетках трансгенного растения и трансгенных растениях из данного изобретения иногда желательно конкурентно экспрессировать целевой ген с одновременным снижением экспрессии целевого гена Leptinotarsa. Таким образом в некоторых вариантах реализации изобретения трансгенное растение содержит рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую элемент экспрессии гена для экспрессии по меньшей мере одного целевого гена, и на транскрипцию рекомбинантной генетической конструкции ДНК из данного изобретения влияет конкурентная транскрипция элемента экспрессии гена.

[00228] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантные генетические конструкции ДНК из данного изобретения транскрибироваться в любой клетке растения или ткани, или в целом растении на любом этапе развития. Трансгенные растения могут быть получены из любого однодольного или двудольного растения, такого как, но не ограничиваясь этим, коммерчески- или сельскохозяйственно-важные растения, такие как сельскохозяйственные культуры (в особенности сельскохозяйственные культуры, используемые для питания человека или корма для животных), деревья для производства древесины или целлюлозы, овощные растения, плодовые растения, и декоративные растения. Примеры растений, представляющих интерес, включают зерновые сельскохозяйственные культуры (например, пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, лебеда, амарант, и гречиха); кормовые сельскохозяйственные культуры (например, кормовые травы и кормовые двудольные растения, в том числе люцерна, вика, клевер и тому подобное); масличные сельскохозяйственные культуры (такие как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лен, арахис и масличная пальма); ореховые деревья (такие как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль и тому подобное); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, оливку, сахарную свеклу, чай и кофе; деревья для производства древесины или целлюлозы; овощные сельскохозяйственные культуры, такие как бобовые (например, бобы, горох, чечевица, люцерна, арахис), салат, спаржа, артишок, сельдерей, морковь, редис, крестоцветные (например, кочанная капуста, кормовая капуста, горчица и другие листовые крестоцветные растения, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, репа, кольраби), пищевые тыквенные растения (например, огурцы, дыни, летние кабачки, зимние кабачки), пищевые виды рода Allium (например, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнит-лук), пищевые представители пасленовых (например, томаты, баклажаны, картофель, перец, физалис) и съедобные представители семейства Chenopodiaceae (например, свекла, мангольд, шпинат, лебеда, амарант); фруктовые растения, такие как яблоки, груши, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), косточковые (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайю, авокадо, ягоды; и растения, выращенные для получения биомассы или биотоплива (например, мискантус, просо, ятрофа, масличная пальма, эукариотические микроводоросли, такие как Botryococcus braunii, Chlorella spp. и Dunaliella spp., и эукариотиские макроводоросли, такие как Gracilaria spp. и Sargassum spp.); и декоративные растения, включая декоративные цветковые растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы.

[00229] Данное изобретение также относится к сырьевым продуктам, произведенным из трансгенной растительной клетки, растения, или семени из данного изобретения, в том числе, но не ограничиваясь этим, срезанным листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты брожения или ферментации, молотые или целые зерна или семена растения, или любая пищевая или непищевая продукция, которая включает такие сырьевые продукты, произведенные из трансгенной растительной клетки, растения или семени из данного изобретения. Обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновых кислот рекомбинантных генетических конструкций ДНК из данного изобретения в одном или более предметах сырья или сырьевых продуктах, рассмотренных в данном документе, де факто является доказательством того, что это сырье или сырьевой продукт содержит или получен из трансгенной растительной клетки, растения, или семени из данного изобретения.

[00230] Как правило, трансгенное растения, имеющие в своем геноме рекомбинантную генетическую конструкцию ДНК из данного изобретения, проявляет повышенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa. В различных вариантах реализации изобретения, например, когда трансгенное растение экспрессирует рекомбинантную генетическую конструкцию ДНК из данного изобретения, которая соединена с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных свойств, это трансгенное растение имеет по меньшей мере один дополнительный измененный признак по сравнению с растением, в котором отсутствует рекомбинантная генетическая конструкция ДНК, выбранный из группы признаков, состоящей из

а) повышенной устойчивости к абиотическому стрессу;

б) повышенной устойчивости к биотическому стрессу;

в) измененной композиции первичных метаболитов;

г) измененной композиции вторичных метаболитов;

д) измененной композиции следовых элементов, каротиноидов или витаминов;

е) повышенного урожая;

ж) улучшенной способности использовать азот, фосфат или другие питательные вещества;

з) измененных агрономических свойств;

и) улучшенных ростовых или репродуктивных свойств; и

к) улучшенного качества уборки, хранения или обработки урожая.

[00231] В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения характеризуется улучшенной устойчивостью абиотическим стрессам (например, устойчивостью к водному дефициту воды или засухе, повышенным температурам, холоду, неоптимальным уровням питательных веществ или солей, неоптимальным уровням освещения) или биотическим стрессам (например, загущение другими растениями, аллелопатия или повреждения); измененной композицией первичных метаболитов (например, жирных кислот, масел, аминокислот, белков, сахаров, или углеводов); измененной композицией вторичных метаболитов (например, алкалоидов, терпеноидов, поликетидов, нерибосомальных пептидов и вторичных метаболитов смешанного пути биосинтеза); измененной композицией следовых элементов (например, железа, цинка), каротиноидов (например, бета-каротина, ликопина, лютеина, зеаксантина или других каротиноидов и ксантофиллов) или витаминов (например, токоферолов); повышение урожая (например, повышение урожая вне стрессовых условий, или повышение урожая в условиях биотического или абиотического стресса); улучшенная способность использовать азот, фосфат или другие питательные вещества; измененные агрономические свойства (например, замедленное созревание; замедленное старение; более раннее или позднее развитие, повышенная теневыносливость; повышенная устойчивость к корневому или стеблевому полеганию; повышенная устойчивость к слому растущего стебля, измененная фотопериодическая чувствительность); измененные ростовые или репродуктивные свойства (например, намеренная карликовость; намеренная мужская стерильность, используемая, например, в улучшенных процедурах гибридизации, повышенная скорость вегетативного роста, повышение всхожести, повышение мужской или женский фертильности); улучшенное качество уборки или хранения урожая (например, повышенная устойчивость к вредителям при хранении, повышенная устойчивость к бою, улучшенный товарный вид); или любая комбинация этих признаков.

[00232] В другом варианте реализации изобретения трансгенное семя или семя, полученное от трансгенного растения, имеет измененную композицию первичных метаболитов (например, жирных кислот, масел, аминокислот, белков, сахаров или углеводов), измененную композицию вторичных метаболитов, измененную композицию следовых элементов, каротиноидов или витаминов, улучшенное качество уборки, хранения или обработки урожая, или их комбинацию. В другом варианте реализации изобретения может быть желательным изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семени трансгенного растения, например, с целью уменьшения уровня аллергенного белка или гликопротеина или токсичного метаболита.

[00233] Для идентификации трансгенных растительных клеток, которые развиваются в трансгенных растениях, имеющих целевой признак, как правило используется скрининг популяции трансгенных растений, регенерированных из трансгенной растительной клетки. Трансгенные растения анализирую с целью обнаружить повышенный признак, например, повышенную эффективность использования воды, повышенную устойчивость к холоду, повышенный урожай, повышенную эффективность использования азота, повышение белка в семени, и повышение масел в семени. Способы скрининга включают прямой скрининг признака в теплице, или полевые испытания, или скрининг суррогатного признака. Такие анализы направлены на обнаружение изменений в химическом составе, биомассе, физиологических свойствах, или морфологии растений. Изменения химической композиции, такой как композиции питательных веществ зерна определяют с помощью анализа композиции семени и содержания белка, свободных аминокислот, масла, свободных жирных кислот, крахмала, токоферолов, или других питательных веществ. Изменения ростовых свойств или показателей биомассы определяют путем измерения высоты растения, диаметра стебля, длины междоузлия, сухого веса корня или надземной части растения, и (для зернообразующих растений, таких как кукуруза, рис или пшеница) длинны и диаметра колоса или семенной шапки. Изменения физиологических свойств определяют путем оценки чувствительности к стрессовым условиям, например, с помощью анализов в условиях стресса, таких как водный дефицит, азотный или фосфатный дефицит, условия выращивания со сниженной или повышенной температурой, воздействие патогенов или насекомых, недостаток света или повышенная густота растений. Другие свойства отбора включают количество дней до цветения, дней до образования пыльцы, дней до созревания плодов, качество плодов или клубней, или их полученное количество, количество дней до выметывания пестичных столбиков у кукурузы, скорость развития листьев, содержание хлорофилла, температура листьев, стеблестой, дружность всходов, длина междоузлия, высота растений, количество листьев, площадь листьев, кущения, опорные корни, время до пожелтения, стеблевое полегание, корневое полегание, жизнеспособность растений, фертильность, слом растущих стеблей и устойчивость к вредителям. Кроме того, могут оцениваться фенотипические свойства собранного плодов, семян или клубней; например, у томата и баклажана этот показатель может включать общее количество или вес собранных плодов или их цвет, кислотность, содержание сахара или вкус таких плодов, а у картофеля этот показатель может включать количество или общий вес собранных клубней и качество таких клубней.

[00234] Конкретные анализы с композициями и способами по данному изобретению могут быть проведены на пасленовых растениях, включая картофель, томат, баклажан и перец, как на гибридных так и инбредных; такие анализы могут быть использованы, например, для идентификации или отбора растений с улучшенной устойчивостью к колорадскому жуку (личинок или взрослых особей), для определения эффективных, для инсектицидного действия, количеств заданных композиций или для определения эффективных режимов обработки. Не ограничивающие примеры таких анализов включают следующее.

[00235]В растениях in planta анализ на колорадского жука (личинок или взрослых особей) проводят с 6 повторностями на одну обработку. Растения томата сорта "Big Cherry" высевают в почву марки "Readi-Earth", содержащей удобрение 14:14:14 (N:P:K) в концентрации 6 фунтов/кубический ярд и содержат в вегетационной камере при температуре 27 градусов по Цельсию и относительной влажности 50% в течение трех недель. В день анализа двухцепочечную РНК разводят в 25 мл раствора для распыления (20 мМ натрий фосфатный буфер (рН 6,8), необязательно содержащий поверхностно-активное вещество, например, 0,2% Silwet L77) до требуемой концентрации и применяют к растениям, используя пульверизатор, в количестве 15 галлонов на акр. Для первоначальной проверки полинуклеотида на активность может быть использована более высокая концентрация (например, 100 мкг/мл) а более низкие концентрации (например, между от около 0,1 до около 1 мкг/мл) могут быть использованы в последующих анализах, таких как те, которые используются для определения по относительной эффективности разных полинуклеотидов. Растения изолируют по одному с помощью сетчатых пакетов и заражают 12 неонатальными личинками Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука). Зараженные растения инкубируют в вегетационной камере (27 градусов по Цельсию, 50% относительной влажности) в течение 12-14 дней. В конце этого периода растения оценивают на уровень дефолиации, который выражается в "процентах контроля" и насекомых собирают с растений и почвы с целью оценить «процент оставшихся жизнеспособных насекомых» и "средний вес оставшихся жизнеспособных насекомых".

[00236] В растениях картофеля in planta анализ на колорадского жука (личинок или взрослых особей) проводят с 9 повторностями на одну обработку. Из зрелых растений картофеля сорта Atlantic готовят черенки путем разрезания стебля под углом ниже второго узла от точки роста. Черенки погружают в стимулятор корнеобразования (Rhizopon №1, 0,1% индолбутильная кислота (ИБА)) и сразу же вставляет в предварительно смоченную почву марки Readi-Earth, содержащую удобрение 14:14:14 (N:P:K) в концентрации 6 фунтов/кубический ярд. Сосуды, куда высажены черенки накрывают, чтобы уменьшить освещенность, и помещают в герметичные пластиковые пакеты, чтобы увеличить влажность. Через неделю покрытие убирают и сосуды вынимают из пластиковых пакетов. Для анализа используют растения, достигшие высоты 6-9 дюймов (обычно 3 недели после срезания). В день анализа двухцепочечную РНК разводят в 25 мл раствора для распыления (20 мМ натрий фосфатный буфер (рН 6,8), необязательно содержащий поверхностно-активное вещество, например, 0,2% Silwet L77) до требуемой концентрации и применяют к растениям, используя пульверизатор, в количестве 15 галлонов на акр. Для первоначальной проверки полинуклеотида на активность может быть использована более высокая концентрация (например, 100 мкг/мл) а более низкие концентрации (например, между от около 0,1 до около 1 мкг/мл) могут быть использованы в последующих анализах, таких как те, которые используются для определения по относительной эффективности разных полинуклеотидов. Растения изолируют по одному с помощью сетчатых пакетов и заражают 6 неонатальными личинками Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука). Зараженные растения инкубируют в вегетационной камере (27 градусов по Цельсию, 50% относительной влажности) в течение 12-14 дней. В конце этого периода растения оценивают на уровень дефолиации, который выражается в "процентах контроля" и насекомых собирают с растений и почвы с целью оценить «процент оставшихся жизнеспособных насекомых" и "средний вес оставшихся жизнеспособных насекомых".

[00237] Следующие примеры представлены в иллюстрационных целях и не должны рассматриваться как ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Создание набора кДНК Leptinotarsa

[00238] Набор кДНК получали из неонатальных личинок Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, "КЖ") как описано ниже. Общую РНК выделяли из 800 личинок (всего тела) Leptinotarsa decemlineata после третьей линьки, используя набор для выделения ДНК Ambion Totally (номер по каталогу AM1910, Life Technologies, Carlsbad, CA) с необязательной процедурой осаждения с LiCl. РНК с PolyA-хвостом выделяли, используя Ambion MicroPoly (A) Purist (каталожный номер AM1919, Life Technologies, Carlsbad, CA). Синтез произвольно праймированной кДНК проводили с использованием набора для синтеза кДНК Superscript Double-Stranded (каталожный номер 11917-010, Life Technologies, Carlsbad, CA) с набором произвольных гексамеров (каталожный номер 12328-032, Life Technologies, Carlsbad, CA). Набор кДНК получали с помощью высокопроизводительного сиквенирования высокой с использованием коммерчески доступной технологии 454 (454 Life Sciences, 15 Commercial St., Branford, CT 06405, USA), как описано у Margulies et al. (2005) Nature, 437:376-380. Это обеспечило 1446014 считываний (в среднем ~ 350 пар оснований в длину), которые были дополнены данными последовательностей Leptinotarsa decemlineata, находящимися в открытом доступе в Национальном центре биотехнологической информации (НЦБИ) (в том числе 8835 считываний последовательностей маркерных экспрессируемых последовательностей, 150 считываний полноразмерных кДНК, 839061 считываний высокой пропускной способности архивных последовательностей ДНК и РНК), чтобы обеспечило в общей сложности 2294087комбинированных считываний. Комбинированные данные последовательностей были de novo собраны в контиги с использованием программного пакета Newbler (версия 2.3) (454 Life Sciences, 15 Commercial St., Branford, CT 06405, USA). Из данных последовательностей было идентифицировано приблизительно 38164 собранных контигов.

Пример 2: Отбор низкокопийных целевых генов

[00239] Последовательности целевых генов Leptinotarsa, предсказанные, как эффективные мишени для РНКи-опосредованного сайленсинга, были определены как описано ниже. В качестве целевых генов для РНКи-опосредованного сайленсинга были выбраны низкокопийные гены и, в частности, однокопийные гены, так как едва ли функция этих генов воспроизводятся с помощью паралога. Открытая для доступа база данных ортологичных генов, OrthoDB6 (доступна по ссылке cegg.unige.ch/orthodb6~~pobj и описанная в Waterhouse et al. (2012) Nucleic Acids Res., PMID:23180791; doi: 10.1093/nar/gks1116) была профильтрована для отбора группы из 766 генов, которые являлись однокопийными или низкокопийными в Tribolium castaneum (хрущак каштановый, вид жесткокрылых), а также однокопийными или низкокопийными в геномах членистоногих, доступных в базе данных (на момент подачи заявки были доступны еще 33 других генома членистоногих). Tribolium castaneum представляет собой вид жесткокрылых и, следовательно, тесно связан с Leptinotarsa, что делает вероятным тот факт, что, однокопийный или низкокопийный ген, который присутствует в базе данных генома Tribolium castaneum, также будет являться однокопийным или низкокопийным геном в геноме Leptinotarsa decemlineata, по меньшей мере для генов, имеющих высокое сходство последовательностей между двумя этими организмами. Из 38164 единичных генов, полученных после сиквенирования и сборки генома Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, КЖ), описанных в примере 1 с помощью поиска транслируемых нуклеотидов BLAST (tblastx) группа из 725 генов была идентифицирована в качестве генов, имеющих высокое сходство последовательности (достоверность или значение е менее или равно 1×10^-15) с 766 одно- и низкокопийными генами Tribolium castaneum в базе даных OrthoDB.

[00240] Для аннотации последовательностей была проведена аннотация SmartBlast с использованием программного обеспечения НЦБИ Blastall 2.2.21 с целью поиска контигов Leptinotarsa decemlineata в находящейся в открытом доступе базе данных uniref90.fasta (ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/uniref/uniref90/). Поиск бластов был проведен в режиме blastx (запрос на поиск транслируемых нуклеотидов Leptinotarsa decemlineata проводился по всей базе данных белков uniref90). Сохраняли только бласты со значением е ниже или равным 9е-9. Для каждого контига Leptinotarsa decemlineata в качестве аннотации использовалась строка описания из uniref90 с наилучшим совпадением. В случае, когда совпадения по SmartBlast не были обнаружены, последовательность была подвергнута дополнительному поиску с помощью Pfam. С целью достижения этого для каждого контига Leptinotarsa decemlineata самая длинная открытая рамка считывания (ОРС) была идентифицирована и использована в качестве поискового запроса в находящейся в открытом доступе базе данных Pfam-A (ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/Pfam/current_release) с использованием находящегося в открытом доступе программного пакета HMMER 3.0 (hmmer.janelia.org/). Контиги Leptinotarsa decemlineata, с совпадениями по Pfam со значениями е ниже или равными 1е-5, аннотировали с названием семейства белков и идентификатором Pfam. Контиги Leptinotarsa decemlineata, не имеющие совпадения по SmartBlast или по Pfam, аннотировали как "новый белок".

[00241] 725 генов Leptinotarsa decemlineata, для которых было определено высокое сходство последовательностей с однокопийными или низкокопийными генами Tribolium castaneum, как описано выше, представлены как SEQ ID № 1-725, с аннотацией каждого гена на основе сходства последовательностей с последовательностями Tribolium castaneum и/или с последовательностями OrthoDB, или по консервативным доменам Pfam. Также для каждого гена Leptinotarsa decemlineata в аннотации определен гомологичный ген Tribolium castaneum и значением е по сходству для каждой пары.

Пример 3 Отбор целевых генов Leptinotarsa

[00242] Последовательности кДНК, соответствующие подходящим целевым генам для борьбы с видами рода Leptinotarsa путем РНКи-опосредованного сайленсинга, были отобраны из последовательностей, полученных после сиквенирования и сборки генома Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, КЖ), описанных в Примере 1. Эта группа последовательностей кДНК или целевых генов представлена в SEQ ID № 726-830. Следует отметить, что аналогичные последовательности могут быть получены из любых других видов рода Leptinotarsa, относящихся к данному документу.

Пример 4 Выбор полинуклеотидных триггеров путем "тайлинга"

[00243] Один неограничивающий пример способа для отбора полинуклеотидного триггера для экспрессии в трансгенном растении или для использования в композиции для местного нанесения на поверхность трансгенного или нетрансгенного растения включает картирование эффективных полинуклеотидных последовательностей (или сегментов последовательностей), используя подход биочипа высокой плотности (тайлинг-биочипа), применяющийся для всего генома (или для полноразмерный эталонной последовательности). Последовательности, выбранные из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830 и SEQ ID № 1087-1094 делят на "тайлинг-последовательности" или сегменты из 200-300 смежных нуклеотидов по всей длине выбранной целевой последовательности. Тайлинг-последовательности могут быть созданы как смежные сегменты выбранной последовательности без перекрытий или с перекрытиями размером около 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов в прилегающих сегментах выбранной последовательности. Для эффективности скрининга синтезируют полинуктеотидные триггеры, соответствующие каждой тайлинг-последовательности из 200-300 нуклеотидов (в смысловой, антисмысловой или в обеих ориентациях).

[00244] Полинуклеотидные триггеры проходят проверку любым удобным способом на эффективность сайленсинга целевого гена видов рода Leptinotarsa. Один пример подходящей проверки представляет собой определение влияния рациона на биологическую активность как, например, описано в примерах 5 и 6. Другая подходящая проверка включает локальное применение полинуклеотидного триггера либо непосредственно на особей Leptinotarsa либо на поверхность растения, которое необходимо защитить от заражения видами рода Leptinotarsa. Один желаемый результат обработки полинуклеотидным триггером представляет собой предотвращение или борьбу с заражением видами рода Leptinotarsa, например, путем вызывания в насекомом Leptinotarsa физиологических или поведенческих изменений, например, но не ограничиваясь этим, остановку роста, повышенную смертность, снижение репродуктивной способности, снижение или прекращение пищевого поведения или движения, или снижение или прекращение метаморфоза. Другой предпочтительный результат обработки полинуклеотидным триггером представляет собой получение пасленового растения, проявляющего повышенную устойчивость к заражению видами рода Leptinotarsa, такого как растение картофеля, томата, баклажана или перца, которое проявляет повышенную устойчивость к заражению видом Leptinotarsa decemlineata (колорадский жук, КЖ) или другими видами рода Leptinotarsa. Полинуклеотидные триггеры могут отбираться по наборам. Например, на растение локально наносят наборы из пяти отдельных полинуклеотидных тригерров, объединенных в одну полинуклеотидную композицию. Наборы, показывающие более высокую эффективность, повторно скринируют, проверяя на эффективность полипептидные триггеры индивидуальных компонентов.

[00245] Если необходимо, процедура тайлинга может быть проведена повторно. Полинуклеотидный триггер, для которого обнаружена желаемая активность, может сам быть проверен с помощью тайлинга. Родительский полинуклеотидный триггер делят на меньшие перекрывающиеся или не перекрывающиеся сегменты по всей длине родительского полинуклеотидного триггера. Например, родительский полинуклеотидный триггер делят на сегменты длиной 50-60 нуклеотидов по всей длине родительского полинуклеотидного триггера. Для эффективности скрининга синтезируют полинуклеотидные триггеры, соответствующие каждой тайлинг-последовательности из 50-60 нуклеотидов (в смысловой, антисмысловой или обеих ориентациях). Могут быть проведены дополнительные циклы тайлинга, в которых тестируются триггеры длиной 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов.

[00246] Эффективные полинуклеотидные триггеры любого размера используют для создания композиции для локального применения или рекомбинантной генетической конструкции ДНК, используемой для создания трансгенного растения.

Пример 5

[00247] Этот пример иллюстрирует неограничивающий анализ, используемый для оценки эффективности полинуклеотидных триггеров в борьбе с Leptinotarsa. Конкретнее, этот пример иллюстрирует двухцепочечные РНК-триггеры, содержащие нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена Leptinotarsa (например, целевому гену, выбранному из Группы последовательностей целевых генов, или имеющему последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-725 и SEQ ID № 726-830 и SEQ ID № 1087-1094, или ДНК, комплементарной им), и биотест, используемый для оценки эффективности этих дцРНК-триггеров в борьбе с Leptinotarsa.

[00248] Для целевых генов Leptinotarsa были созданы триггеры из от около 50 до около 500 пар оснований (конкретнее, от около 100 до около 450 пар оснований) в длину (см. примеры 2 и 3). Для целевых генов, перечисленных в Таблице 1, были произведены тупоконечные двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) с антисмысловыми последовательностями цепей, представленными в SEQ ID № 831-1085.

[00249] дцРНК-триггеры (таблица 1) для супрессии целевых генов Leptinotarsa проверяли с использованием следующей методологии для анализа смертности или остановки роста у личинок Leptinotarsa decemlineata в результате контакта или поедания полинуклеотидных триггеров. Проводили биотесты с колорадским жуком (КЖ), Leptinotarsa decemlineata, с использованием искусственного рациона питания, состоящего из агара (Serva 11393) в концентрации 13,2 г/л, препарата Bio-Serve pre-mix (F9380B) в концентрации 140,3 г/л, КОН в концентрации 5 мл/л (18,3% по массе), и формалина в концентрации 1,25 мл/л (37%). Незадолго до внесения пробы питательная смесь была разлита на аликвоты объемом 200 мкл в 96-луночные планшеты и высушена. В каждую лунку вносили 20 мкл испытуемой пробы, с использованием стерильной водой в качестве необработанного контроля (НОК). Планшеты высушивали перед добавлением личинок насекомых. В каждую лунку с помощью тонкой кисти добавляли одну неонатальную личинку КЖ. Планшеты запечатывали пленкой Mylar и проделывали отверстия для вентиляции энтомологической булавкой. За одну обработку проверяли 32 личинки. Планшеты для биотеста инкубировали в течение 10-12 дней при 27 Со, относительной влажности 60%, в полной темноте. Подсчитывали смертность и остановку роста личинок в планшетах. Данные были проанализированы с использованием статистической программы JMP ^© 4 (SAS Institute, 1995) и проводили полный факториальный дисперсионный анализ ANOVA с помощью теста Дуннетца с целью поиска влияний обработки по сравнению с необработанным контролем (P<0,05). Для сравнения всех пар обработки проводили апостериорный тест Тьюки-Крамера (P<0,05). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 SEQ ID №* Целевой ген SEQ ID № ЦЕЛЕВОГО ГЕНА Результаты биотеста питания КЖ** Концентрация дцРНК
(мд) № экзона 831 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (+) 0,1 1 832 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (-) 0,1 1 833 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (-) 0,1 1 834 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (-) 0,1 1 835 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (-) 0,1 2 836 Актин 821 (-) 0,1 1 837 Актин 821 (-) 0,1 1 838 Актин 821 (-) 0,1 1 839 Актин 821 (-) 0,1 1 840 Актин 821 (-) 0,1 1 841 бета-субъединица коатомера 822 (-) 0,1 1 842 бета-субъединица коатомера 822 (+) 0,1 1 843 бета-субъединица коатомера 822 н. т. 0,1 1 844 бета-субъединица коатомера 822 н. т. 0,1 1 845 бета-субъединица коатомера 822 (-) 0,1 1 846 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (-) 0,1 1 847 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (-) 0,1 1 848 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (-) 0,1 1 849 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (+) 0,1 1 850 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (-) 0,1 2? 851 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 (-) 0,1 1 852 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 (-) 0,1 1 853 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 н. т. 0,1 2? 854 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 н. т. 0,1 1 855 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 н. т. 0,1 1 856 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 (-) 0,1 1 857 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 (-) 0,1 1 858 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 н. т. 0,1 1 859 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 н. т. 0,1 1 860 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 н. т. 0,1 1 861 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 (-) 0,1 1 862 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 (-) 0,1 1 863 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 н. т. 0,1 1 864 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 н. т. 0,1 1 865 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 н. т. 0,1 1 866 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (-) 0,1 1 867 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (-) 0,1 2? 868 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (-) 0,1 2 869 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (-) 0,1 1 870 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (-) 0,1 1 871 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 (-) 0,1 1 872 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 н. т. 0,1 2 873 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 н. т. 0,1 1 874 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 н. т. 0,1 1 875 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 н. т. 0,1 1 876 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 н. т. 0,1 1 877 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 н. т. 0,1 1 878 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 н. т. 0,1 2? 879 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 (-) 0,1 1 880 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 (-) 0,1 1 881 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 н. т. 0,1 2 882 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 н. т. 0,1 1 883 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 (-) 0,1 1 884 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 (-) 0,1 1 885 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 (-) 0,1 1 886 Путативный неописанный белок 813 н. т. 0,1 1 887 Путативный неописанный белок 813 н. т. 0,1 1 888 Путативный неописанный белок 813 (-) 0,1 1 889 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 н. т. 0,1 1 890 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 н. т. 0,1 1 891 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 (-) 0,1 1 892 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 (-) 0,1 1 893 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 н. т. 0,1 1 894 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 н. т. 0,1 1 895 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 н. т. 0,1 1 896 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 н. т. 0,1 1 897 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 н. т. 0,1 2? 898 Белок Sec24, путативный 816 (+) 0,1 2 899 Белок Sec24, путативный 816 (-) 0,1 2? 900 Белок Sec24, путативный 816 (-) 0,1 2? 901 Белок Sec24, путативный 816 (-) 0,1 2? 902 Белок Sec24, путативный 816 (-) 0,1 1 903 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 0,1 1 904 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 0,1 1 905 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 0,1 1 906 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 0,1 1 907 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 0,1 1 908 Белок белкового транспорта sec31A 818 (-) 0,1 1 909 Белок белкового транспорта sec31A 818 (-) 0,1 1 910 Белок белкового транспорта sec31A 818 (+) 0,1 1 911 Белок белкового транспорта sec31A 818 (-) 0,1 2? 912 Белок белкового транспорта sec31A 818 (-) 0,1 1 913 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 (-) 0,1 1 914 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 (-) 0,1 1 915 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 н. т. 0,1 2 916 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 н. т. 0,1 1 917 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 н. т. 0,1 1 918 Белок белкового транспорта sec13 820 (-) 0,1 2 919 Белок белкового транспорта sec13 820 (-) 0,1 1 920 Белок белкового транспорта sec13 820 (-) 0,1 1 921 Белок белкового транспорта sec13 820 (-) 0,1 1 922 Рибосомный белок L13A 741 н. т. 1,0 2 923 Рибосомный белок L13A 741 н. т. 1,0 2 924 60S рибосомный белок L5 728 н. т. 1,0 2 925 60S рибосомный белок L5 728 (+) 1,0 2? 926 Рибосомный белок S7 776 н. т. 1,0 1 927 Рибосомный белок S7 776 (-) 1,0 1 928 Рибосомный белок L9 735 (+) 1,0 2 929 Рибосомный белок L9 735 н. т. 1,0 1 930 Рибосомный белок L3 726 н. т. 1,0 2 931 Рибосомный белок L3 726 (+) 1,0 2 932 60S рибосомный белок L32 755 (+) 1,0 3 933 Рибосомный белок L8 734 н. т. 1,0 2 934 Рибосомный белок L8 734 н. т. 1,0 2 935 Рибосомный белок S15 785 н. т. 1,0 2 936 Рибосомный белок S15 785 н. т. 1,0 2 937 Рибосомный белок L7A 732 (+) 1,0 3 938 Рибосомный белок L7A 732 (+) 1,0 3 939 40S рибосомный белок S14 784 н. т. 1,0 2 940 40S рибосомный белок S14 784 (+) 1,0 2 941 40S рибосомный белок S24 796 (+) 1,0 2? 942 60S рибосомный белок L10A 737 (+) 1,0 1 943 Рибосомный белок L13 740 (+) 1,0 1 944 Рибосомный белок L13 740 (+) 1,0 1 945 Рибосомный белок S13 783 (+) 1,0 3 946 Рибосомный белок S13 783 н. т. 1,0 2 947 Рибосомный белок L4e 727 (+) 1,0 3 948 Рибосомный белок L4e 727 (+) 1,0 2 949 Рибосомный белок S30 803 (+) 1,0 2 950 Рибосомный белок S30 803 (+) 1,0 2 951 Рибосомный белок L26 749 (+) 1,0 2? 952 Рибосомный белок L26 749 (+) 1,0 2? 953 Рибосомный белок L31 754 н. т. 1,0 3 954 60S Рибосомный белок L10 736 н. т. 1,0 2 955 60S Рибосомный белок L10 736 (+) 1,0 2 956 Рибосомный белок S4 772 (+) 1,0 3 957 Рибосомный белок S4 772 (+) 1,0 2 958 Рибосомный белок L11e 738 (+) 1,0 2 959 Рибосомный белок S6 774 (-) 1,0 1 960 Рибосомный белок S11 782 (+) 1,0 3 961 Рибосомный белок S11 782 (+) 1,0 3 962 Рибосомный белок S11 781 н. т. 1,0 3 963 Рибосомный белок S11 781 н. т. 1,0 3 964 Рибосомный белок L12e 739 (+) 1,0 2 965 Рибосомный белок L12e 739 н. т. 1,0 2 966 Рибосомный белок S5 773 (+) 1,0 2 967 Рибосомный белок S5 773 (+) 1,0 3 968 Рибосомный белок S18 790 (+) 1,0 2 969 Рибосомный белок S18 790 (+) 1,0 2 970 Рибосомный белок L23A 747 (+) 1,0 2 971 Рибосомный белок L23A 747 (+) 1,0 2 972 Рибосомный белок L35A 759 н. т. 1,0 1 973 Рибосомный белок L35A 759 (+) 1,0 2 974 Рибосомный белок L21 746 н. т. 1,0 2? 975 Рибосомный белок L21 746 н. т. 1,0 2? 976 Рибосомный белок L21 745 (+) 1,0 1 977 Рибосомный белок L21 745 (-) 1,0 2? 978 Рибосомный белок S8 777 (+) 1,0 2 979 Рибосомный белок S8 777 (+) 1,0 3 980 Рибосомный белок S16 788 н. т. 1,0 1 981 Рибосомный белок S16 799 н. т. 1,0 2 982 Рибосомный белок L18Ae 744 (+) 1,0 2 983 Рибосомный белок S6 775 (+) 1,0 1 984 Рибосомный белок S3 768 н. т. 1,0 2 985 Рибосомный белок S3 768 (+) 1,0 2 986 Рибосомный белок S17 789 н. т. 1,0 2 987 Рибосомный белок S15A 786 (+) 1,0 2 988 Рибосомный белок L7 730 (+) 1,0 2? 989 Рибосомный белок L7 730 (+) 1,0 2 990 Рибосомный белок S4 771 н. т. 1,0 2 991 Рибосомный белок S4 771 (+) 1,0 2 992 40S рибосомный белок S3A 769 (+) 1,0 1 993 40S рибосомный белок S3A 769 н. т. 1,0 1 994 Рибосомный белок L36 760 (+) 1,0 1 995 Рибосомный белок L37 762 (+) 1,0 2 996 Рибосомный белок L37 763 (+) 1,0 2 997 Рибосомный белок S19 792 (+) 1,0 1 998 Рибосомный белок S19 792 н. т. 1,0 1 999 Рибосомный белок S19 792 (+) 1,0 1 1000 Рибосомный белок S20 794 н. т. 1,0 1 1001 Рибосомный белок L15 743 н. т. 1,0 2 1002 Рибосомный белок L35A 758 н. т. 1,0 1 1003 Рибосомный белок L35A 758 н. т. 1,0 1 1004 40S рибосомный белок S21 795 н. т. 1,0 3 1005 Рибосомный белок S29 802 н. т. 1,0 1 1006 Рибосомный белок S8 778 (+) 1,0 1 1007 40S рибосомный белок S3A 770 (+) 1,0 1 1008 Рибосомный белок L24 748 (+) 1,0 2 1009 Рибосомный белок S16 787 (+) 1,0 2 1010 Рибосомный белок L7A 733 (+) 1,0 1 1011 40S рибосомный белок S9 780 н. т. 1,0 2 1012 40S рибосомный белок SA 804 н. т. 1,0 1 1013 40S рибосомный белок SA 804 (+) 1,0 1 1014 Рибосомный белок L37Ae 764 (-) 1,0 2? 1015 60S Рибосомный белок L23 797 н. т. 1,0 1 1016 Рибосомный белок L7 731 н. т. 1,0 2 1017 Рибосомный белок L36 761 н. т. 1,0 1 1018 40S рибосомный белок S9 779 (+) 1,0 2? 1019 Рибосомный белок S26 798 (+) 1,0 3 1020 Рибосомный белок L34A 756 (+) 1,0 2 1021 Рибосомный белок L27Ae 751 н. т. 1,0 1 1022 Рибосомный белок L27Ae 751 (+) 1,0 1 1023 40S рибосомный белок S28 801 (-) 1,0 2? 1024 Рибосомный белок L29 753 (-) 1,0 3 1025 Рибосомный белок L28 752 (+) 1,0 4 1026 Рибосомный белок L28 752 н. т. 1,0 4 1027 Белок рибосомного биогенеза RLP24 765 н. т. 1,0 2 1028 Белок рибосомного биогенеза RLP24 765 (-) 1,0 1 1029 Рибосомный белок L27 750 (+) 1,0 2 1030 Рибосомный белок L27 750 (+) 1,0 2 1031 39S-рибосомный белок L13 766 (-) 1,0 3 1032 39S-рибосомный белок L13 766 (-) 1,0 3 1033 Рибосомный белок S2 767 (+) 1,0 1 1034 40S рибосомный белок S28 800 (-) 1,0 2? 1035 Рибосомный белок L14 742 (+) 1,0 2 1036 Рибосомный белок L6 729 (+) 1,0 2 1037 Бета-субъединица коатомера 822 (+) 1,0 2 1038 Гамма-субъединица коатомера 828 (+) 1,0 2 1039 Миозин VIIa 824 (+) 1,0 2 1040 Миозин VIIa 823 (+) 1,0 1 1041 Актин 821 (+) 1,0 1 1042 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 826 (+) 1,0 2 1043 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 (+) 1,0 2 1044 “кривая шея” 830 н. т. 1,0 1 1045 “кривая шея” 829 (+) 1,0 2 1046 Прогнозируемый путативный белок 827 (+) 1,0 2 1047 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (+) 1,0 2 1048 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit, putative 806 (-) 1,0 2 1049 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 (+) 1,0 1 1050 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 (+) 1,0 2 1051 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 н. т. 1,0 2 1052 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 (-) 1,0 3 1053 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 (+) 1,0 3 1054 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 (+) 1,0 3 1055 Путативный неописанный белок 813 (-) 1,0 2 1056 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 (-) 1,0 2 1057 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 (-) 1,0 2? 1058 Белок Sec24, путативный 816 (+) 1,0 2 1059 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (-) 1,0 1 1060 Белок белкового транспорта sec31A 818 (+) 1,0 2 1061 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 (+) 1,0 2 1062 Белок белкового транспорта sec13 820 (-) 1,0 2? 1063 Белок Sec24B 817 (-) 1,0 1 1064 бета-субъединица коатомера 822 (+) 1,0 2 1065 Гамма-субъединица коатомера 828 (+) 1,0 2 1066 Миозин VIIa 824 (+) 1,0 2 1067 Миозин VIIa 823 (+) 1,0 2 1068 Актин 821 (+) 1,0 1 1069 Не-АТФазная регуляторная субъединица 1 26S протеосомы 825 н. т. 1,0 2 1070 “Кривая шея” 829 (+) 1,0 2 1071 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 805 (-) 1,0 2 1072 Не-АТФазная регуляторная субъединица 12 26S протеосомы 806 (-) 1,0 2 1073 Предполагаемая Не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 (+) 1,0 1 1074 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 (+) 1,0 2 1075 Не-АТФазная регуляторная субъединица 2 26S протеосомы 809 (+) 1,0 2 1076 Не-АТФазная регуляторная субъединица 4 26S протеосомы 810 (-) 1,0 2 1077 регуляторная субъединица 8 26S-протеазы 811 (+) 1,0 3 1078 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 (+) 1,0 3 1079 ГТФазо-активирующий белок АДФ-рибозилирующего фактора, путативный 814 (-) 1,0 2 1080 Гольджи-специфический брефелдин А-устойчивый фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, путативный 815 (+) 1,0 1 1081 Белок Sec24, путативный 816 (+) 1,0 1 1082 Белок белкового транспорта Sec24B 817 (+) 1,0 1 1083 Белок белкового транспорта sec31A 818 (-) 1,0 1 1084 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 (+) 1,0 1 1085 Белок белкового транспорта sec13 820 (+) 1,0 1 *последовательность антисмысловой цепи дцРНК триггера
** (+) остановка роста или смертность достоверна по сравнению с контролем, обработанным водой; (-) остановка роста или смертность не достоверна по сравнению с контролем, обработанным водой; н. т.=либо (1) триггер не тестировали, или (2) имеют место оба следующих факта: в пробе не зафиксирована достоверная остановка роста/смертность и положительный контроль не выявил в исследовании достоверной остановки роста/смертности. Положительный контроль, используемый в данном анализе, представлял собой дцРНК-триггер, воздействующий на бета-коатомер, и имеющий последовательность смысловой цепи SEQ ID №: 1086, описанной ранее в патенте США №7943819 как SEQ ID №: 880.

[00250] В случае доступности данных о геноме последовательности количество экзонов, затронутых заданной триггерной последовательностью, было определено и приведено в таблице 1: "1" означает, что триггерная последовательность по всей видимости содержится в одном смежном геномном локусе; "2" означает, что полная длина триггера не была равна геному с отсутствием по меньшей мере 40 пар оснований, что может свидетельствовать о неполноте имеющихся данных геномных последовательностей.

[00251] Дополнительные последовательности кДНК, кодирующие субъединицы комплекса экзоцисты Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука, КЖ), были идентифицированы в качестве целевых генов Leptinotarsa в отдельном проекте сиквенирования и сборки генома. Эти целевые гены экзоцисты Leptinotarsa, SEQ ID № 1087-1094, используется в создании полинуклеотидных триггеров, включающих по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, комплементарный целевому гену экзоцисты, и используемый для борьбы с заражениями видами рода Leptinotarsa и в создании трансгенных растений, экспрессирующих такие полинуклеотидные триггеры для устойчивости к заражению видами рода Leptinotarsa.

[00252] Для каждого из целевых генов экзоцисты Leptinotarsa (SEQ ID № 1087-1094) созданы триггеры, насчитывающие от около 50 до около 500 пар оснований (конкретнее, от около 100 до около 450 пар оснований) в длину, как описано в примере 4. Эти триггеры проверены с использованием той же методологии, которая описана выше для полинуклеотидов в таблице 1.

[00253] В не ограничивающем примере полинуклеотидный триггер, созданный для воздействия на ген Leptinotarsa decemlineata Exo70 (SEQ ID №: 1093), был получен в виде тупоконечной двухцепочечной РНК, имеющей антисмысловую последовательность цепи SEQ ID №: 1095. Этот триггер вызывал достоверную остановку роста и достоверную смертность в обеих испытанных концентрациях, при использовании методологии, описанной выше. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 SEQ ID №* Длина триггера (п.о.) Целевой ген SEQ ID №. ЦЕЛЕВОГО ГЕНА Результаты биотеста питания КЖ** Концентрация дцРНК
(мд) 1095 277 Exo70 1093 (+) 0,1 1095 277 Exo70 1093 (+) 0,033 *последовательность антисмысловой цепи дцРНК триггера
** (+) остановка роста или смертность достоверна по сравнению с контролем, обработанным водой; (-) остановка роста или смертность не достоверна по сравнению с контролем, обработанным водой; NT=либо (1) триггера не был проверен, или (2) имеют место оба следующих факта: в пробе не зафиксирована достоверная остановка роста/смертность и положительный контроль не выявил в исследовании достоверной остановки роста/смертности. Положительный контроль, используемый в данном анализе, представлял собой дцРНК-триггер, воздействующий на бета-коатомер, и имеющий последовательность смысловой цепи SEQ ID №: 1086, описанной ранее в патенте США №7943819 как SEQ ID №: 880.

Пример 6

[00254] Этот пример иллюстрирует не ограничивающие варианты полинуклеотидов из данного изобретения, инсектицидные композиции для борьбы с видами рода Leptinotarsa и типичный анализ, используемый для оценки эффективности таких полинуклеотидов в борьбе с Leptinotarsa.

[00255] Исследовали пять дцРНК-триггеров (с антисмысловыми последовательностями цепи SEQ ID № 989, 1049, 1050, 1078, и 1084; см. таблицу 1) для супрессии целевых генов Leptinotarsa с использованием следующих методологий работы с листовыми пластинками для анализа смертности или остановки роста личинок Leptinotarsa decemlineata при контакте или поедании полинуклеотидных триггеров.

[00256] Для оценки биотеста листовых пластинок со взрослыми насекомыми собирали недавно вылупившихся взрослых особей колорадского жука (КЖ, Leptinotarsa decemlineata) и держали на листьях картофеля до 7 дней, а затем прекращали кормление в течение 6-8 часов до начала биотеста. Было использовано пятнадцать взрослых особей на одну обработку (триггер/доза). На листовые пластинки картофеля (сорт «Atlantic») диаметром 15 мм наносили 10 мкл препарата, содержащего 250, 83,3, 27,8 или 9,3 нг дцРНК триггера в 0,1% растворе Silwet L77 в воде марки UltraPure (Invitrogen); контрольные листовые пластинки обрабатывали либо препаратом 0,1% раствора Silwet L77 либо триггером для отрицательного контроля, предназначенного для сайленсинга зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обработанные листовые пластинки помещали по одной в лунки 6-луночных планшетов, содержащих по 2 мл/лунку 2% водного раствора затвердевшего агар-агара. В каждую лунку помещали по одной взрослой особи КЖ и инкубировали в течение ночи, чтобы позволить КЖ поедать листовую пластинку; в случаях, когда листовая пластинка поедалась не полностью, насекомое предположительно было мертвым или было повреждено при манипуляциях и было исключено из исследований. На следующий день взрослых особей КЖ, подверженных данной обработке триггер/доза, коллективно перемещали в помещение для кормления, изготовленное из закрытого, вентилируемого полупрозрачного пластикового контейнера весом 16 унций, с дном, покрытым фильтровальной бумагой, и содержащим листья картофеля (сорт «Atlantic») со стеблями, вставленными для сохранения свежести в пробирку с водой. Насекомых инкубировали в помещении для кормления в климатической камере (27° С; 60% относительной влажности; 16 ч света/8 ч темноты), добавляя листья картофеля по мере необходимости. Жизнеспособность насекомых контролировали ежедневно. Насекомых регистрировали как активных (жизнеспособных), умирающих (не переворачивается на ноги через 10 секунд после того, как его кладут на спину), или мертвых. Результаты жизнеспособности приведены в Таблице 3.

Таблица 3 Обработка SEQ ID №
целевого гена КЖ Дней после обработки 5 6 7 8 9 10 12 14 16 Препарат-1 н. о. 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Препарат-2 н. о. 93 93 93 93 93 93 86 86 86 SEQ ID № 1115, GFP-1 н. о. 100 100 100 100 100 100 80 80 60 SEQ ID № 1115, GFP-2 н. о. 93 93 87 87 80 80 80 80 80 SEQ ID № 989*, 250 нг 730 87 87 80 33 0 0 0 0 0 SEQ ID № 989*, 83 нг 730 100 100 79 43 29 7 0 0 0 SEQ ID № 989*, 28 нг 730 100 100 80 47 27 0 0 0 0 SEQ ID № 989*, 9 нг 730 93 93 73 60 33 0 0 0 0 SEQ ID № 1049*, 250 нг 807 40 13 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1049*, 83 нг 807 80 7 7 7 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1049*, 28 нг 807 80 13 13 13 13 7 13 7 7 SEQ ID № 1049*, 9 нг 807 87 73 60 60 60 60 53 53 53 SEQ ID № 1050*, 250 нг 808 60 13 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1050*, 83 нг 808 60 20 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1050*, 28 нг 808 86 29 29 14 14 14 14 14 14 SEQ ID № 1050*, 9 нг 808 80 60 60 53 53 53 47 40 40 SEQ ID № 1078*, 250 нг 812 67 27 20 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1078*, 83 нг 812 60 13 7 7 7 7 7 7 7 SEQ ID № 1078*, 28 нг 812 73 33 20 13 13 13 13 13 13 SEQ ID № 1078*, 9 нг 812 100 80 80 67 60 60 53 47 47 SEQ ID № 1084*, 250 нг 819 33 0 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1084*, 83 нг 819 73 33 7 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1084*, 28 нг 819 73 40 33 33 33 33 20 20 20 SEQ ID № 1084*, 9 нг 819 80 60 53 53 53 53 47 47 40 * последовательность анти-смысловой цепи дцРНК триггера, если не указано иное.
"Препарат-1" и "Препарат-2" являются дубликатами нулевого контроля (0,1% водный раствор Silwet). "GFP-1" и "GFP-2" являются дубликатами отрицательного контроля с использованием дцРНК триггера с 377 п.о., воздействующего на зеленый флуоресцентный белок (GFP) и имеющий смысловую цепь с последовательностью SEQ ID №: 1115. "н. о."=не определяли.

[00257] Для биотеста листовых пластинок с личинками использовали неонатантных личинок колорадского жука (КЖ, Leptinotarsa decemlineata), вылупившихся в течение 24 часов до биотеста. Использовали 16 личинок на одну обработку (триггер/доза). На листовые пластинки картофеля (сорт Atlantic) диаметром 15 мм наносили 2 мкл препарата, содержащего 250, 83,3, 27,8 или 9,3 нг дцРНК триггера в 0,1% растворе Silwet L77 в воде марки UltraPure (Invitrogen); контрольные листовые пластинки обрабатывали либо препаратом 0,1% раствора Silwet L77 либо триггером для отрицательного контроля, предназначенного для сайленсинга зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обработанные листовые пластинки помещали по одной в лунки 128-луночных планшетов, содержащих по 0,5 мл/лунку 2% водного раствора затвердевшего агар-агара. В каждую лунку помещали по одной неонатантной личинке КЖ и инкубировали в течение ночи, чтобы позволить ей поедать листовую пластинку; в случаях, когда листовая пластинка поедалась не полностью, насекомое предположительно было мертвым или было повреждено при манипуляциях и было исключено из исследований. На следующий день личинок КЖ, подверженных данной обработке триггер/доза, коллективно перемещали в помещение для кормления, изготовленное из закрытого, вентилируемого полупрозрачного пластикового контейнера весом 16 унций, с дном, покрытым фильтровальной бумагой, и содержащим листья картофеля (сорт «Atlantic») со стеблями, вставленными для сохранения свежести в пробирку с водой. Насекомых инкубировали в помещении для кормления в климатической камере (27 Со; 60% относительной влажности; 16 ч света/8 ч темноты), добавляя листья картофеля по мере необходимости. Жизнеспособность личинок контролировали ежедневно. Личинок отмечали как живых или мертвых. Результаты исследования жизнеспособности приведены в таблице 4.

Таблица 4 Обработка SEQ ID №
целевого гена КЖ Дней после обработки 5 6 7 8 9 10 12 14 16 Препарат-1 н. о. 100 100 100 100 100 100 92 54 15 Препарат-2 н. о. 87 87 87 87 73 73 73 27 20 SEQ ID № 1115, GFP-1 н. о. 69 69 69 69 69 69 69 50 38 SEQ ID № 1115, GFP-2 н. о. 100 100 94 94 75 75 56 19 19 SEQ ID № 989*, 250 нг 730 44 38 31 13 13 0 0 0 0 SEQ ID № 989*, 83 нг 730 19 19 13 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 989* 28 нг 730 69 50 38 13 13 6 6 6 6 SEQ ID № 989*, 9 нг 730 38 13 13 13 6 6 6 6 6 SEQ ID № 1049*, 250 нг 807 20 7 7 7 7 0 0 0 0 SEQ ID № 1049*, 83 нг 807 38 13 13 13 13 13 13 13 13 SEQ ID № 1049*, 28 нг 807 38 13 13 6 6 6 6 6 6 SEQ ID № 1049*, 9 нг 807 57 21 21 21 21 21 21 21 14 SEQ ID № 1050*, 250 нг 808 44 31 31 25 19 19 19 0 0 SEQ ID № 1050*, 83 нг 808 38 19 19 6 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1050*, 28 нг 808 13 13 13 13 13 13 0 0 0 SEQ ID № 1050*, 9 нг 808 0 0 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1078*, 250 нг 812 19 13 0 0 0 0 0 0 0 SEQ ID № 1078*, 83 нг 812 29 14 14 7 7 0 0 0 0 SEQ ID № 1078*, 28 нг 812 50 31 19 13 13 6 6 0 0 SEQ ID № 1078*, 9 нг 812 60 47 40 27 27 27 27 27 13 SEQ ID № 1084*, 250 нг 819 79 43 43 43 29 21 21 14 14 SEQ ID № 1084*, 83 нг 819 56 38 19 19 19 13 13 13 13 SEQ ID № 1084*, 28 нг 819 50 38 25 19 19 19 19 19 19 SEQ ID № 1084*, 9 нг 819 75 50 44 44 38 38 38 31 31 * последовательность анти-смысловой цепи дцРНК триггера, если не указано иное.
"Препарат-1" и "Препарат-2" являются дубликатами нулевого контроля (0,1% водный раствор Silwet). "GFP-1" и "GFP-2" являются дубликатами отрицательного контроля с использованием дцРНК триггера с 377 п. о., воздействующего на зеленый флуоресцентный белок (GFP) и имеющий смысловую цепь с последовательностью SEQ ID №: 1115. "н. о."=не определяли.

Пример 7

[00258] Этот пример иллюстрирует не ограничивающие варианты полинуклеотидных триггеров для супрессии целевых генов Leptinotarsa. Конкретнее, этот пример иллюстрирует варианты тупоконечных дцРНК-триггеров, состоящих из смысловой и отдельной антисмысловой цепи, а также варианты дцРНК-триггеров в форме шпильки (один РНК-транскрипт, содержащий как смысловую, так и антисмысловую область).

[00259] В таблице 5 приведены тупоконечные дцРНК-триггеры с последовательностями, относящимися к "родительскому триггеру" (таблица 1), причем обнаружено, что родительский триггер имеет инсектицидную активность против Leptinotarsa decemlineata (таблицы 1, 3 и 4) и производные триггеры представляют собой тупоконечные молекулы дцРНК, соответствующие субобластям родительского триггера.

Таблица 5 SEQ ID №: триггера* Название целевого гена SEQ ID №: целевого гена SEQ ID №: родительского триггера Действие рациона питания против КЖ (0,1 мд) Действие рациона питания против КЖ (0,025 мд) 1096 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 1084 (-) (-) 1097 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 1084 (-) (-) 1098 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 1084 (+) (-) 1099 ГТФ-связывающий белок SAR1B 819 1084 (+) (-) 1100 Предполагаемая не-АТФазная регуляторная субъединица 3 26S протеосомы 807 1049 (-) (-) 1101 Не-АТФазная регуляторная субъединица 7 26S протеосомы 808 1050 (-) (-) 1102 Не-АТФазная регуляторная субъединица 13 26S протеосомы 812 1078 (-) (-) 1103 Рибосомный белок L7 730 989 (-) (-) 1104 Рибосомный белок L7 730 989 (+) (-) *последовательность антисмысловой цепи дцРНК триггера

В таблице 6 представлены дцРНК-триггеры в форме шпильки (один РНК-транскрипт, содержащий как смысловую, так и антисмысловую область, которая гибридизируется с образованием дцРНК), с последовательностями, полученными из "родительского триггера", или относящимися к нему. (см. таблицу 1), причем обнаружено, что родительский триггер имеет инсектицидную активность против Leptinotarsa decemlineata (таблицы 1, 3 и 4). Триггеры-шпильки подходят для экспрессии in vitro или in vivo, в случае, когда они получены при экспрессии генетической конструкции с соответствующими промоторами или другими элементами, обеспечивающими экспрессию, например, в бактериальной клетке или в растительной клетке. В таблице 6 представлены не ограничивающие варианты реализации изобретения, каждый из которых содержат промотор Т7 (расположен в положениях нуклеотидов 1-17 в каждой последовательности шпильки) и "петлю" или спейсер, расположенный между смысловой и антисмысловой областью; петля содержит неспецифичные (некомплементарные или неидентичные какой-либо части целевого гена) нуклеотиды. Специалисту сразу станет понятно, что смысловые и антисмысловые области шпильки используются в комбинации с различными промоторами, подходящими для экспрессии в данном типе клеток, и с различными спейсерными последовательностями или последовательностями петли (или вообще без них, когда нуклеотиды на стыке смысловых и антисмысловых областей формируют необходимый "изгиб" или минимальную петлю шпильки). Специалисту будет также понятно, что можно легко получить аналогичные рекомбинантные генетические конструкции ДНК для кодирования шпильковых дцРНК-триггеров, которые соответствуют тупоконечным дцРНК триггерам, представленным в таблицах 1-5, или воздействуют на целевые гены, представленные в группе последовательностей целевых генов.

Таблица 6 SEQ ID №: шпилечного триггера* Позиция нуклеотида триггерной антисмысловой области в шпильке SEQ ID №: триггерной антисмысловой области в шпильке Позиция нуклеотида петли или спейсера в шпильке Позиция нуклеотида триггерной смысловой области в шпильке SEQ ID №: дцРНК триггера с тупыми концами SEQ ID №: целевого гена КЖ 1105 21-417 1110 418-566 567-963 989** 730 1106 21-300 1111 301-450 451-730 10886 1107 21-453 1112 454-603 604-1036 1084** 819 1108 21-458 1113 459-608 609-1046 1050** 808 1109 21-448 1114 449-598 599-1026 1038** 828 *последовательность генетической конструкции ДНК, которая кодирует шпильковый дцРНК триггер
** последовательность антисмысловой цепи дцРНК триггера

SEQ ID №: 1086 соответствует смысловой последовательности цепи тупоконечной дцРНК, воздействующей на бета-коатомер, описанный ранее в SEQ ID №: 880 в патенте США 7943819.

[00260] Предполагается, что композиция определенных рекомбинантных РНК, описанных в данном документе (например, дцРНК-триггеров описанных в таблицах 1-6, или их шпильковых эквивалентов или активных фрагментов этих триггеров), с одним или более неполинуклеотидным пестицидным средством будет вызывать синергетическое улучшение предотвращения или борьбы с заражением видами рода Leptinotarsa по сравнению с эффектом, полученным отдельно с рекомбинантной РНК или отдельно с неполинуклеотидным пестицидным средством. Обычные биотесты насекомых, такие как биотесты с применением искусственного рациона питания, описанные в данном документе, используют для определения влияния дозы на смертность или замедление роста личинок при использовании комбинаций полинуклеотидных триггеров и одного или более неполинуклеотидного пестицидного средства (например, пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus). Специалист в данной области техники может проверить комбинации полинуклеотидов и неполинуклеотидных пестицидных агентов с помощью обычных биотестов с целью определения биологически активных комбинаций, которые являются синергическими и предпочтительны для использования при защите растений от заражений видами рода Leptinotarsa.

Пример 8. Эффективность РНКи-опосредованной борьбы с Leptinotarsa decemlineata в полевых условиях.

[00261] Для проверки эффективности локального применения дцРНК-триггеров при борьбе с заражением картофеля Leptinotarsa decemlineata (Колорадским жуком, КЖ) в полевых условиях были проведены полевые испытания. Было проверено 3 дцРНК триггера с использованием локального применения (опрыскивание листьев): тупоконечная РНК, имеющая антисмысловую последовательность цепи SEQ ID №: 989, которая воздействует на рибосомный белок L7 (кодируется SEQ ID №: 730); тупоконечная РНК, имеющая антисмысловую последовательность цепи SEQ ID №: 1049, которая воздействует на вероятную не-АТФазную регуляторную субъединицу 3 протеосомы 26S (кодируется SEQ ID №: 807), и шпильковая дцРНК, кодируемая генетической конструкцией ДНК, имеющей последовательность SEQ ID №: 1105, которая воздействует на рибосомный белок L7 (кодируется SEQ ID №: 730). SEQ ID №: 1105 кодирует шпильковую дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, соответствующую SEQ ID №: 989 (см. пример 7). Эксперимент был разработан с использованием 11 процедур, расположенных в произвольном полном блоке, с четырьмя проворностями. Тестовые участки состояли из растений картофеля (сорт "Superior"), посаженных весной в два ряда по 20 футов с 6-футовым междурядьем; участки содержали согласно стандартными коммерческими методикам выращивания. Дважды проводили обработку путем опрыскивания листьев: первую обработку через 36 дней после посадки, и вторую обработку через 43 дня после посадки. Все обработки листьев проводили с помощью штанги с 4-мя форсунками, оборудованной наконечниками 110003VS, расположенными в 20 дюймах друг от друга и опрыскивающими 2 ряда одновременно, приводимой в действие углекислотным распылителем рюкзачного типа, с давлением 40 фунтов на квадратный дюйм, распыляющей 38 галлонов на акр. Для 10-ти произвольно выбранных стеблей на каждом участке регистрировали все жизненные этапы колорадского в 3 временных точках: через 3 дня после первой обработки путем опрыскивания листьев (39 дней после посадки), через 7 дней после первой обработки путем опрыскивания листьев (43 дней после посадки) и через 3 дня после второй обработки путем опрыскивания листьев (46 дней после посадки). Через 9 дней после первой обработки путем опрыскивания листьев (через 45 дней после посадки измеряли дефолиацию, обусловленную в первую очередь мелкими личинками. В качестве положительного контроля использовали 2 коммерческих синтетических (маленькая молекула) инсектицида: Coragen® (хлорантранилипрол, DuPont) и Radiant® (спинеторам, Dow AgroSciences). Результаты представлены в Таблице 7; статистически различные значения обозначены различными буквами (а, б, в, г, д). Обработки с одинаковой буквой, например, необработанный контроль и обработка SEQ ID №: 989 в концентрации 5 г/ акр через 3 дня после первого опрыскивания, обозначенные буквой "а", не являются статистически различными; в то время как обработки, обозначенные разными буквами, например, необработанный контроль и обработка Coragen® через 3 дня после первого опрыскивания, являются статистически различными. Влияние дцРНК-триггеров увеличилась со временем и выявило дозозависимую реакцию; через 3 дня после второго опрыскивания листьев все обработки дцРНК триггерами кроме самой низкой дозы дцРНК триггера, имеющего антисмысловую последовательность цепи SEQ ID №: 1049, вызвали уменьшение количества крупных личинок, которое не отличалась достоверно от положительных контролей, обработанных синтетическими инсектицидами (обработки Coragen® и Radiant), и которое статистически отличалось от необработанного контроля. Дефолиация также показали дозозависимую реакцию на обработку дцРНК; несколько из обработок дцРНК статистически отличались от необработанного контроля, и все дцРНК-триггеры в самой высокой испытанной дозе обеспечивали защиту от дефолиации, которая по существу не отличалась от защиты в положительных контролях, обработанных синтетическими инсектицидами (обработка Coragen® и Radiant). Снижение числа личинок и снижение дефолиации или повреждения растения указывает на повышение устойчивости растений картофеля, обработанных дцРНК, к Leptinotarsa decemlineata; ожидается, что эти растения с улучшенной устойчивостью к Leptinotarsa decemlineata, будут демонстрировать повышенную урожайность (увеличение количества собираемых клубней).

Таблица 7 Среднее количество колорадских жуков /10 стеблей % дефолиации Мелкие личинки Крупные личинки Обработка К-во
(г/акр) 3 дня после первого опрыскивания 7 дней после первого опрыскивания 3 дня после второго опрыскивания 3 дня после первого опрыскивания 7 дней после первого опрыскивания 3 дня после второго опрыскивания Необработанный контроль н. о. 115,8 a 201,3 a 72,0 aб 0 45,3 aб 108,0 a 72,5 a SEQ ID №: 989* 5 63,5 aб 146,5 aб 98,0 aб 3 8,5 бвг 8,3 б 9,8 гд SEQ ID №: 989* 1 93,3 aб 159,5 a 144,5 a 1,3 33,0 aбвг 21,8 б 28,8 cг SEQ ID №: 989* 0,2 87,8 aб 116,0 абв 118,0 a 0 25,3 aбвг 33,8 б 45,0 aбв SEQ ID №: 1049* 5 66,5 aб 135,5 aбв 126,0 a 0 2,0 вг 12,8 б 15,0 вгд SEQ ID №: 1049* 1 91,0 aб 175,0 a 102,5 aб 0 41,3 aбв 33,8 б 32,5 бвг SEQ ID №: 1049* 0,2 93,5 aб 113,8 aбв 99,3 aб 0,8 59,0 a 80,0 a 68,8 aб SEQ ID №: 1105* 5 61,0 aб 91,3 aбв 117,8 a 0 9,0 бвг 14,0 б 12,5 вгд SEQ ID №: 1105* 1 72,3 aб 104,8 aбв 87,3 aб 0 17,8 бвг 8,8 б 18,8 вг Coragen® 5** 9,8 б 6,0 в 0,3 б 0 0,0 г 0,0 б 0,0 д Radiant 8** 1,3 б 16,8 бв 0,0 б 0 0,5 г 0,0 б 0,0 д P-значение Anova 0,0053 0,0004 0,0009 нс 0,0001 <0,0001 <0,0001 н. о., не определено
нс, не достоверно
*дцРНК-триггеры, примененные в композиции, содержащей 3 мл коммерческого адъюванта для распыления, TACTIC^TM (Loveland Products, Loveland, CO 80538) на 1600 мл воды
**унций жидкости на акр

[00262] Все материалы и способы, описанные и заявленные здесь, могут быть получены и использованы без излишнего экспериментирования в соответствии с инструкциями приведенного выше описания. Хотя материалы и способы по данному изобретению были описаны в форме вариантов реализации изобретения и иллюстративных примеров, специалистам в данной области техники будет понятно, что к материалам и способам, описанным в данном документе, могут быть применены изменения без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Все таковые аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с заражением растения Leptinotarsa decemlineata, предусматривающему применение полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена Leptinotarsa decemlineata. Также раскрыта инсектицидная композиция для борьбы с Leptinotarsa decemlineata, включающая полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена Leptinotarsa decemlineata. Изобретение также относится к рекомбинантному ДНК-конструкту для вызова смертности или замедления роста Liptinotarsa decemlineata, содержащему гетерологический промотор, функционально связанный с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена Leptinotarsa decemlineata, а также к вектору, клетке пасленового растения и трансгенному растению, содержащим вышеуказанный конструкт. Изобретение позволяет эффективно бороться с заражением растения Leptinotarsa decemlineata. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 табл., 8 пр.

1. Способ борьбы с заражением растения Leptinotarsa decemlineata, включающий:

(а) контакт указанной Leptinotarsa decemlineata с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(б) обеспечение в рационе питания указанной Leptinotarsa decemlineata полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(в) вызывание смертности или задержки роста у личинок указанной Leptinotarsa decemlineata путем обеспечения рациона питания указанных личинок по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий 21 смежный нуклеотид, которые комплементарны целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(г) поверхностное применение к указанному растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(д) поверхностное применение к указанному растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, таким образом, что эффективное количество указанного полинуклеотида проглатывается указанной Leptinotarsa decemlineata, питающейся на указанном растении; указанный полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые комплементарны целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(е) экспрессию в указанном растении по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093; или

(ж) обеспечение указанного растения по меньшей мере одним полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена, причем указанный целевой ген выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(з) контакт указанной Leptinotarsa decemlineata с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент, идентичный или комплементарный по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная двухцепочечная РНК является химически синтезированной или полученной путем экспрессии в микроорганизме или путем экспрессии в клетке растения.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная двухцепочечная РНК содержит цепь, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ включает поверхностное применение к указанному растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена, причем указанный целевой ген имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093; и причем указанная композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида, кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ включает контакт указанной Leptinotarsa decemlineata с эффективным количеством раствора, содержащего двухцепочечную РНК, причем по меньшей мере одна цепь двухцепочечной РНК является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду гена, который кодирует рибосомный белок, или РНК, транскрибируемой с указанного гена, в котором индуцируется РНК-интерференция и наблюдается смертность Leptinotarsa decemlineata, и причем указанный рибосомный белок представляет собой рибосомный белок L7, или белок, который кодируется SEQ ID NO: 730, или в котором указанная двухцепочечная РНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 988, 1104 или 1105.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный раствор дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из кремнийорганического поверхностно-активного вещества или катионного липида.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ включает поверхностное применение к указанному растению композиции, содержащей по меньшей мере один полинуклеотид, таким образом, что эффективное количество указанного полинуклеотида проглатывается указанной Leptinotarsa decemlineata, питающейся на указанном растении, причем указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; и причем указанный целевой ген имеет последовательность SEQ ID NO: 730, или отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, имеющую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 988, 1104 или 1105.

9. Инсектицидная композиция для борьбы с Leptinotarsa decemlineata, включающая:

(а) эффективное для инсектицидного действия количество полинуклеотида, содержащего по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые комплементарны целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(б) эффективное для инсектицидного действия количество по меньшей мере одного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один элемент сайленсинга, который является комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена, причем указанный целевой ген имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093; или

(в) эффективное для инсектицидного действия количество по меньшей мере одной РНК, содержащей по меньшей мере один сегмент, который является идентичным или комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(г) эффективное для инсектицидного действия количество молекулы РНК, которая вызывает смертность или задержку роста у указанной Leptinotarsa decemlineata при поглощении или контакте с указанной Leptinotarsa decemlineata, причем указанная молекула РНК содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые являются комплементарными целевому гену, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(д) эффективное для инсектицидного действия количество двухцепочечной молекулы РНК, которая вызывает смертность или задержку роста у указанной Leptinotarsa decemlineata при поглощении или контакте с указанной Leptinotarsa decemlineata, причем по меньшей мере одна нить указанной инсектицидной двухцепочечной молекулы РНК состоит из 21 смежного нуклеотида, которые являются комплементарными целевому гену или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена, причем указанный целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093; или

(е) эффективное для инсектицидного действия количество по меньшей мере одной двухцепочечной РНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105.

10. Инсектицидная композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанная инсектицидная композиция находится по меньшей мере в одной форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсулированного препарата, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрикса, препарата для обработки семян, препарата для пропитывания почвы, имплантируемого препарата или препарата для борозды.

11. Инсектицидная композиция по п. 9, дополнительно содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из агента-носителя, поверхностно-активного вещества, катионного липида, кремнийорганического материала, кремнийорганического поверхностно-активного вещества, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, антидота и регулятора роста насекомых.

12. Инсектицидная композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанная инсектицидная композиция содержит инсектицидную двухцепочечную молекулу РНК, которая вызывает смертность или задержку роста у указанной Leptinotarsa decemlineata при поглощении или контакте с указанной Leptinotarsa decemlineata, причем указанная инсектицидная двухцепочечная молекула РНК содержит по меньшей мере один сегмент, который является комплементарным 21 смежному нуклеотиду ДНК, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанной ДНК, и причем указанная двухцепочечная молекула РНК имеет длину по меньшей мере 50 пар оснований или длину в пределах от около 100 до около 500 пар оснований.

13. Рекомбинантный ДНК-конструкт для вызова смертности или замедления роста Liptinotarsa decemlineata, содержащий гетерологический промотор, функционально связанный с:

(а) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибированной с указанного целевого гена; или

(б) ДНК, содержащей 21 или более смежных нуклеотидов, имеющих 100% идентичность с фрагментом ДНК эквивалентной длины, имеющей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или комплементарной им ДНК; или

(в) ДНК, кодирующей по меньшей мере один элемент сайленсинга, который является комплементарным по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду целевого гена или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена, причем указанный целевой ген имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093; или

(г) ДНК, кодирующей по меньшей мере один элемент сайленсинга, содержащий по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые являются комплементарными целевому гену, выбранному из группы, состоящей из группы SEQ ID NO: 730, 726-729, 732, 733, 735-740, 742, 744, 745, 747-752, 755, 756, 759, 760, 762, 763, 767-773, 775, 777-779, 782-784, 786, 787, 790, 796, 798, 803-805, 807-809, 811, 812, 815-829 и 1093, или РНК, транскрибируемой с указанного целевого гена; или

(д) ДНК, кодирующей РНК, содержащей по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые комплементарны нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105, или комплементарных им, или ортологичной нуклеотидной последовательности из видов рода Leptinotarsa decemlineata или видов рода Tribolium, причем ортологичная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105, причем процент идентичности последовательности рассчитывают для такой же длины; или

(е) ДНК, кодирующей РНК, содержащей по меньшей мере одну область двухцепочечной РНК, по меньшей мере одна цепь которой содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, которые являются комплементарными нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105, или комплементарных им, или ортологичной нуклеотидной последовательности из видов рода Leptinotarsa decemlineata или видов рода Tribolium, причем ортологичная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105, причем процент идентичности последовательности рассчитывают для такой же длины; или

(ж) ДНК, кодирующей РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 989, 1049, 831, 842, 849, 898, 910, 925, 928, 931, 932, 937, 938, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 955, 956, 957, 958, 960, 961, 964, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 973, 976, 978, 979, 982, 983, 985, 987, 988, 991, 992, 994, 995, 996, 997, 999, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1013, 1018, 1019, 1020, 1022, 1025, 1029, 1030, 1033, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1045, 1046, 1047, 1050, 1053, 1054, 1058, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1070, 1073, 1074, 1075, 1077, 1078, 1080, 1081, 1082, 1084, 1085, 1095, 1098, 1099, 1104 и 1105, или комплементарных им.

14. Рекомбинантный растительный вирусный вектор для вызова смертности или замедления роста Liptinotarsa decemlineata, содержащий рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13.

15. Трансгенная клетка пасленового растения для вызова смертности или замедления роста Liptinotarsa decemlineata, несущая в своем геноме рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13.

16. Трансгенная клетка пасленового растения по п. 15, отличающаяся тем, что указанная трансгенная клетка пасленового растения дополнительно имеет в своем геноме ДНК, кодирующую по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

17. Трансгенное пасленовое растение для вызова смертности или замедления роста Liptinotarsa decemlineata, содержащее рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13.

18. Трансгенное растение, имеющее устойчивость к Liptinotarsa decemlineata, где указанное растение содержит рекомбинантный ДНК-конструкт по п. 13.

19. Трансгенное растение по п. 18, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из картофеля, томата и баклажана.