ПЕПТИД С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ И ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P3/04 A61P3/10 

Область техники

Настоящее изобретение относится к пептиду с эффективностью против ожирения и противодиабетической эффективностью и к его применению.

Предшествующий уровень техники

В последнее время с развитием экономики и вестернизацией пищевого рациона в Корее повысилось потребление жиров в рационе, и из-за недостаточной физической активности увеличилось развитие метаболических заболеваний, таких как ожирение, диабет, гиперлипидемия, гипертензия, атеросклероз и жировая дистрофия печени. Кроме того, ожирение не только вредит красоте молодых людей, которым нравится стройная фигура, но также связано с различными нарушениями по мере развития ожирения.

В настоящее время терапевтические средства против ожирения можно в широком смысле классифицировать на лекарственные средства, которые действуют на центральную нервную систему для влияния на аппетит, и лекарственные средства, которые действуют на желудочно-кишечный тракт, ингибируя поглощение. Лекарственные средства, действующие на центральную нервную систему, коммерчески доступны в виде лекарственных средств против ожирения, которые ингибируют серотонинэргическую (5-HT) нервную систему, такие как фенфлурамин и дексфенфлурамин, действуют через норадренергическую нервную систему, такие как эфедрин и кофеин, и действуют на обе нервных системы, серотонинэргическую и норадренергическую, такие как недавно разработанный сибутрамин, согласно их соответствующим механизмам. Кроме того, представителями лекарственных средств против ожирения, действующих на желудочно-кишечный тракт, являются орлистат и т.д., одобренные в качестве терапевтического средства против ожирения, которые ингибируют кишечную липазу для снижения захвата жиров

Однако есть проблемы с некоторыми из существующих лекарственных средств. Например, такие лекарственные средства, как фенфлурамин недавно были запрещены для продажи из-за побочного эффекта, вызывающего первичную легочную гипертензию или порок клапана сердца, а другие лекарственные средства также нельзя использовать у пациентов, страдающих от сердечной недостаточности или заболевания почек из-за возникновения пониженного артериального давления или молочнокислого ацидоза.

Диабет представляет собой тип метаболического нарушения, возникающий при недостаточной секреции или функции инсулина (DeFronzo, 1988), и характеризуется гипергликемией с высокими уровнями глюкозы в крови, которые вызывают ряд симптомов и признаков, включая выделение глюкозы с мочой. В последнее время, происходит взрыв заболеваемости диабетом из-за повышения частоты ожирения, особенно ожирения по абдоминальному типу.

В 2000 году число диабетических пациентов по всему миру было определено как 170 миллионов, и ожидают, что их число достигнет 370 миллионов к 2030 году. Однако недавно сообщили, что число диабетических пациентов в 2008 уже достигло 350 миллионов по всему миру, что намного хуже, чем ожидалось (Danaei et al., 2011). Сообщается, что более чем приблизительно 80% пациентов с диабетом типа 2 страдают ожирением, в то время как лишь менее 10% тучных пациентов имеют диабет (Harris et al., 1987).

Связь между диабетом и ожирением объясняется тем фактом, что адипокины и свободные жирные кислоты секретируются нерегулярно, вызывая накопление жирных кислот в чувствительных к инсулину тканях, таких как бета-клетки, почки, печень, сердце и т.д., что приводит к липотоксичности. Если хроническую гипергликемию не лечить должным образом, она сопровождается различными патологическими симптомами в организме, такими как ретинопатия, почечная дисфункция, нейропатия и сосудистое нарушение. Необходим эффективный контроль сахара в крови для предотвращения таких осложнений.

В настоящее время, контроль уровней сахара в крови проводят путем улучшения образа жизни (например, диетотерапия и лечебная физкультура), лекарственной терапии и т.д. Однако диетотерапию и лечебную физкультуру трудно контролировать и применять, и существуют ограничения по их воздействиям. Таким образом, большинство пациентов с диабетом полагаются на контроль уровня сахара в крови при помощи лекарственных средств, таких как инсулин, стимуляторы секреции инсулина, инсулин, усилители чувствительности рецепторов к инсулину и гипогликемические средства, а также коррекцию образа жизни.

Инсулин, производимый рекомбинантным способом, является необходимым лекарственным средством для пациентов с диабетом типа 1 и пациентов с диабетом типа 2, которые не в состоянии контролировать уровни сахара в крови, и им удобно контролировать уровни сахара в крови. Однако, он имеет недостатки, такие как неприязнь к использованию инъекционных игл, сложности со способом введения, риск гипогликемии и увеличение массы.

Меглитиниды, тип стимуляторов секреции инсулина, представляют собой средства короткого действия, которые принимаются перед едой, и включают NovoNorm (репаглинид), Fastic (натеглинид) и Glufast (митиглинид) и т.п.. Усилители чувствительности рецепторов к инсулину характеризуются тем, что практически не вызывают гипергликемию при приеме в виде монотерапии, и включают препараты бигуанидов, такие как метформин, и препараты тиазолидиндионов, такие как Avanida (розиглитазон) и Actos (пиоглитазон) и т.п.

Недавно были разработаны агонисты GLP-1 были недавно разработаны, использующие действие глюкагоноподобного пептида-1, который является стимулирующим секрецию инсулина гормоном, и включающие эксенатид и Victoza (лираглутид). Кроме того, недавно разработанными лекарственными средствами являются ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), которые ингибируют действие DPP-4, фермента, который быстро инактивирует GLP-1, и их типичным представителем является Januvia (название ингредиента: ситаглиптин).

Однако, сообщают, что эти лекарственные средства имеют такие побочные эффекты, как гепатотоксичность, желудочно-кишечные нарушения, сердечно-сосудистые заболевания и канцерогенность. Ежегодная стоимость лечения этими эти лекарственные средства также высока, создавая преграду для лечения диабета. Фактически, затраты на здравоохранение для предиабета и диабета близки приблизительно к 200 триллионам корейских вон в США в 2007 (Dall et al., 2010), и затраты на здравоохранение для ожирения также оценивают приблизительно в 150 триллионов корейских вон в США в 2008(Finkelstein et al., 2009). Таким образом, существует острая необходимость в разработке лекарственного средства, которое может эффективно снижать уровни сахара в крови для применения для лечения и диабета, и диабета тучных с меньшим количеством побочных эффектов.

Описание

Техническая задача

По причине этого, авторы настоящего изобретения недавно обратили внимание на механизмы регулирования энергетического обмена для того чтобы найти улучшенный способ лечения ожирения, и провели исследование сигналов, ответственных за накопление жира, и белков, воздействующих на накопление жира у людей после приема рационов с повышенным содержанием жиров, предполагая что разрабатываемое соединение должно иметь более высокую безопасность соединение (более низкую токсичность). В результате исследования сигналов, подавляющих экспрессию белков, ответственных за накопление жиров и за разрушение уже накопленных жиров, и белков, участвующих в передаче сигнала, авторам настоящего изобретения удалось разработать пептиды, которые способствуют липолизу.

Таким образом, целью настоящего изобретения является создание пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Другой целью настоящего изобретения является создание пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, с активностью против ожирения или противодиабетической активностью.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения ожирения, содержащей один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения диабета, содержащей один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Техническое решение

В результате усилий по разработке ряда превосходных пептидов с биологически эффективной активностью авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение на основании того факта, что пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7, демонстрируют не только воздействие на ожирение, ингибируя накопление жира, вызванное рационом с высоким содержанием жиров, и разрушая уже накопленные жиры, но также выдающиеся профилактические и/или терапевтические воздействия на диабет, диабет тучных и осложнения диабета.

Далее в настоящем документе изобретение будет описано более подробно.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, с активностью против ожирения и/или противодиабетической активностью.

Пептиды по настоящему изобретению можно модифицировать с N-конца и/или C-конца для того чтобы выбрать некоторые области аминокислотных последовательностей и повысить их активность. Путем таких N-концевых и/или C-концевых модификаций можно значительно улучшить стабильность пептидов по настоящему изобретению и, например, можно повысить полувыведение пептида после введения in vivo.

N-концевую модификацию можно проводить, связывая пептиды с защитной группой, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группой, формильной группой, пальмитоильной группой, миристильной группой, стеарильной группа, и полиэтиленгликолем (ПЭГ) на N-конце. Защитная группа защищает пептиды по настоящему изобретению от атаки фермента, расщепляющего белки, in vivo.

C-концевую модификацию можно проводить, связывая пептиды с гидроксильной группой (-OH), аминогруппой (-NH₂), азидной группой (-NHNH₂), или т.п., на C-конце.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, демонстрирует ингибирующий эффект на накопление жиров из-за рациона с высоким содержанием жиров и разрушает уже накопленные жиры.

Пептид снижает экспрессию адипогенных маркеров: рецептора гамма, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), ацетил-CoA карбоксилaзы (ACC), и/или специфичного для жирных тканей белка 2, связывающего жирные кислоты (aP2).

Пептид повышает экспрессию липолитических факторов: фосфорилированной гормон-чувствительной липазы (pHSL), АМФ-активированной протеинкиназы α1 (AMPK-α1), белка гена 58, полученного путем сравнительной идентификации (CGI-58), и/или жировой триглицеридлипазы (ATGL). Пептид уменьшает размеры адипоцитов.

Кроме того, пептид повышает липолиз, ингибирует адипогенез, снижает уровни сахара в крови, уменьшает размеры адипоцитов и снижает уровни холестерина в крови.

Эти результаты указывают на то, что пептиды по настоящему изобретению имеют превосходную эффективность при лечении ожирения, диабета и диабета тучных.

Пептид по настоящему изобретению, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, сответствует пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5, соответственно, за исключением того, что остаток Ser замещен на остаток Cys. Соответствующие парные пептиды практически идентичны в отношении активности против ожирения и/или противодиабетической активности.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пептидному комплексу, обладающему активностью против ожирения и/или противодиабетической активностью и содержащему два или более пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7.

Пептидный комплекс содержит один или несколько пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и может дополнительно содержать один или несколько пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

Например, пептидный комплекс может быть комбинацией следующих пептидов:

(a) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3; и

(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

Кроме того, пептидный комплекс может быть комбинацией следующих пептидов:

(a) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4; и

(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

Пептидные комплексы, а также пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-7, имеют превосходную активность против ожирения и/или противодиабетическую активность.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения ожирения, содержащей в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Пептиды превосходно функционируют для ингибирования адипогенеза и разрушения липидов, и, таким образом, могут быть использованы для профилактики и/или лечения ожирения.

Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения ожирения может дополнительно содержать один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

Еще один дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения диабета, содержащей в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Пептиды демонстрируют эффективность или эффективное снижение повышенных уровней сахара в крови на моделях диабета на животных, и, таким образом, могут быть использованы для профилактики и/или лечения диабета.

Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения диабета может дополнительно содержать один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и SEQ ID NO: 7.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая композиция для профилактики или лечения ожирения или диабета может содержать: (a) фармацевтически эффективное количество пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4; и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемые носители представляют собой носители, которые широко используются в составах, и в качестве неограничивающих примеров включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, смолу гуммиарабика, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению may дополнительно содержать в дополнение к указанным выше ингредиентам, но не ограничивается нижеперечисленными, смазочное средство, увлажнитель, подсластитель, ароматизирующее средство, эмульгатор, суспендирующее средство и консервант.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители и средства описаны подробно в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Для парентерального введения, ее можно вводить путем, но не ограничиваясь нижеперечисленными, внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, интраперитонеальной инъекции, местного введения, чрезкожного введения или т.п.

Доза вводимой фармацевтической композиции будет меняться в зависимости от различных факторов, в том числе лекарственной формы, способа введения, возраста, массы тела, пола, и медицинского состояния пациента, рациона питания, времени и пути введения, скорости экскреции, чувствительности и т.д. Например, диапазон доз может представлять собой, в качестве неограничивающих примеров, от 0,0001 до 1,000 мкг в сутки, от 0,001 до 1000 мкг в сутки, от 0,01 до 1000 мкг в сутки, 0,1 до 1000 мкг в сутки или 1,0 до 1000 мкг в сутки.

Фармацевтическую композицию можно формулировать в виде упаковок с однократной дозой или с многократными дозами, с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента, в соответствии со способом, который может быть легко выполнен специалистами в данной области.

Состав может быть в форме раствора, суспензии, или эмульсии в масляной или водной среде, или в форме экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы, и может дополнительно содержать диспергирующее средство и/или стабилизатор.

Как применяют в настоящем документе, термин «пептид» относится к линейной молекуле, образованной за счет связывания аминокислотных остатков друг с другом посредством пептидных связей. Пептиды по настоящему изобретению можно получать с использованием известных в данной области способов химического синтеза, в частности, способов твердофазного синтеза (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); и Stewart, et al., Solid-phase peptide synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) или способов синтеза в жидкой фазе (патент США № 5516891).

Как применяют в настоящем документе, термин «стабильность» относится к стабильности при хранении (например, стабильность во время хранения при комнатной температуре) а также стабильности in vivo.

Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически эффективное количество» означает достаточное количество для достижения вышеуказанной эффективности или действия пептида.

Полезные эффекты изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду с эффективностью против ожирения и противодиабетической эффективностью и к композиции для профилактики или лечения ожирения или диабета, содержащей такой пептид, и пептид по настоящему изобретению демонстрирует превосходную эффективность при диабете и при диабете тучных. Подавление передачи сигнала инсулина связано с накоплением жиров при рационе с высоким содержанием жиров или накоплением жиров в печени и мышцах а индуцированная резистентность к инсулину вызывает диабет. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению можно использовать для профилактического или терапевтического применения при таком диабете и диабете тучных.

Описание чертежей

Фиг. 1a показывает накопленные жиры при анализе с окрашиванием масляным красным О после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 1b показывает накопленные жиры при анализе с окрашиванием масляным красным О после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 2a представляет собой график, показывающий результаты накопления жира при анализе с окрашиванием масляным красным О после обработки различными концентрациями концентрации пептидных комплексов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 2b представляет собой фотографию, показывающую результаты накопления жира при анализе с окрашиванием масляным красным О после обработки различными концентрациями концентрации пептидных комплексов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 3a показывает результаты измерения уровней экспрессии гена aP2, который участвует в адипогенезе, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 3b показывает результаты измерения уровней экспрессии гена aP2, который участвует в адипогенезе, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 4 представлены результаты измерения уровней экспрессии генов PPARγ, ACC и aP2, которые играют важную роль в адипогенезе, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 5a показывает результаты измерения уровней экспрессии белка PPARγ, который играет важную роль в адипогенезе, и белка фосфо-HSL, который играет важную роль в липолизе, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 5b представляет собой график, показывающий результаты измерения уровней экспрессии белка PPARγ, который играет важную роль в адипогенезе, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 5c представляет собой график, показывающий результаты измерения уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который играет важную роль в липолизе, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 6a показывает результаты измерения уровней экспрессии генов AMPK-α1 и CGI58, которые участвуют в разложении накопленных жиров, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6b показывает результаты измерения уровней экспрессии генов AMPK-α1 и CGI58, которые участвуют в разложении накопленных жиров, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6c показывает результаты измерения уровней экспрессии генов AMPK-α1 и CGI58, которые участвуют в разложении накопленных жиров, после обработки пептидными комплексами в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 7a представляет собой фотографию, показывающую результаты измерения уровней экспрессии белка ATGL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 7b представляет собой график, показывающий результаты измерения уровней экспрессии белка ATGL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 8a показывает результаты измерения уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, при анализе путем иммуноокрашивания.

Фиг. 8b показывает результаты измерения уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, при анализе путем иммуноокрашивания.

Фиг. 8c показывает результаты измерения уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки пептидными комплексами в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, при анализе путем иммуноокрашивания.

На фиг. 9 представлены результаты измерения уровней произведенного глицерина после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению.

Фиг. 10a показывает результаты измерения разрушенных жировых тканей после обработки различными концентрациями пептидных комплексов по настоящему изобретению на экспериментальной модели мышей с ожирением.

Фиг. 10b показывает результаты измерения количества и размеров разрушенных жировых тканей после обработки пептидными комплексами по настоящему изобретению на экспериментальной модели мышей с ожирением.

На фиг. 11 представлены результаты измерения уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который участвует в разложении накопленных жиров, после обработки пептидными комплексами по настоящему изобретению, при анализе путем иммуноокрашивания.

На фиг. 12 представлены результаты измерений изменений (a) массы тела и (b) потребления пищи мышами с ожирением после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению.

На фиг. 13 представлены результаты измерений изображений мышей с ожирением после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению.

На фиг. 14 представлены результаты измерений распределения жира по анализу изображений микро-КТ после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

На фиг. 15 представлены наблюдаемые результаты полученных жировых тканей после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

Фиг. 16a показывает наблюдаемые результаты морфологических изображений адипоцитов из полученных жировых тканей после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

Фиг. 16b показывает наблюдаемые результаты размеров адипоцитов из полученных жировых тканей после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

Фиг. 16c представляет собой график, наблюдаемые результаты размеров адипоцитов из полученных жировых тканей после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

На фиг. 17 представлены наблюдаемые результаты уровней экспрессии белка фосфо-HSL, который участвует в липолизе, в адипоцитах из полученных жировых тканей после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

На фиг. 18 представлены результаты измерений уровней холестерина в полученных образцах крови после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

На фиг. 19 представлен результаты измерений уровней сахара в крови в полученных образцах крови после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у модели мышей с ожирением, индуцированным потреблением пищи с высоким содержанием жира у мышиной модели C57BL/6, которая является экспериментальной животной моделью.

На фиг. 20 представлены измеренные результаты изменений уровней сахара в крови в полученных образцах крови после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у мышиных моделей db/db с индуцированным диабетом.

На фиг. 21 представлены измеренные результаты изменений уровней холестерина в полученных образцах крови после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению у мышиных моделей db/db с индуцированным диабетом.

На фиг. 22 представлены измеренные результаты изменений уровней сахара в крови в полученных образцах крови после лечения пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 у мышиных моделей db/db с индуцированным диабетом в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 23 представлены измеренные результаты изменений уровней сахара в крови в полученных образцах крови после лечения пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, у мышиных моделей db/db с индуцированным диабетом в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. с 24a по 24d показывают измеренные результаты изменений уровней сахара в крови в полученных образцах крови у диабетических пациентов с высокими уровнями сахара в крови после лечения пептидными комплексами по настоящему изобретению в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Лучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Далее в настоящем документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на последующие примеры. Однако, примеры приведены только для иллюстрации настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример синтеза 1: Пептидный синтез

700 мг хлортритилхлоридных смол (CTL-смолы, Nova biochem Каталожный номер 01-64-0021) помещали в реактор и добавляли к ним 10 мл метиленхлорида (MC), с последующим перемешиванием в течение 3 минут. После удаления раствора добавляли 10 мл диметилформамида (DMF) и перемешивали в течение 3 минут, а затем снова удаляли растворитель. В реактор заливали 10 мл раствора дихлорметана, к нему добавляли 200 мкмоль Fmoc-Asn(Trt)-OH (Bachem, Swiss) и 400 мкмоль диизопропилэтиламина (DIEA) и перемешивали для тщательного растворения, а затем проводили реакцию во время перемешивания в течение 1 часа. После завершения реакции проводили отмывание, а затем проводили реакцию с раствором метанола и DIEA (2:1) в DCM (дихлорметан) в течение 10 минут, затем промывали избытком DCM/DMF (1:1). После этого раствор удаляли, добавляли 10 мл диметилформамида (DMF) и перемешивали в течение 3 минут, а затем растворитель удаляли снова. Заливали в реактор 10 мл раствора для удаления защиты (20% пиперидин/DMF) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем раствор удаляли. После этого добавляли такое же количество раствора для удаления защиты для поддержания реакции в течение 10 минут еще раз, а затем раствор удаляли. После этого дважды отмывали DMF, один раз MC, и один раз DMF в течение 3 минут, соответственно, для получения смол Asn-CTL. В другом реакторе добавляли 200 мкмоль Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Bachem, Swiss), 200 мкмоль HoBt, и 200 мкмоль Bop к 10 мл раствора DMF тщательно растворяли путем перемешивания. 400 мкмоль DIEA добавляли в реактор более двух раз, а затем перемешивали, по меньшей мере, в течение 5 минут до полного растворения твердого вещества. Раствор смеси аминокислот заливали в реактор, содержащий смолы со снятой защитой и оставляли для прохождения реакции в течение 1 часа при комнатной температуре с перемешиванием. После реакции удаляли реакционный раствор путем перемешивания его три раза, каждый раз в течение 5 минут, с раствором DMF. Небольшое количество прореагировавшей смолы забирали и использовали в тесте Кайзера (нингидриновый тест) для оценки степени реакции. Проводили дважды такую же реакцию снятия защиты, как указано выше, с раствором для удаления защиты для получения смол Arg-Asn-CTL. Смолы промывали в достаточном количестве DMF и MC, и еще раз проводили тест Кайзера для проведения экспериментов по присоединению аминокислот ниже, так же, как было описано ранее. В соответствии с выбранными аминокислотными последовательностями, цепные реакции последовательно проводили в последовательном порядке Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH и Fmoc-Leu-OH. Удаляли Fmoc-защитную группу путем реакции прореагировавшей аминокислотной последовательности с раствором для удаления защиты дважды, каждый раз в течение 10 минут, а затем хорошо промывали. Добавляли уксусный ангидрид, DIEA, и HoBt и проводили ацетилирование в течение 1 часа. Полученные пептидильные смолы отмывали DMF, MC, и метанолом три раза, соответственно. Смолы сушили под медленным потоком газообразного азота, а затем полностью высушивали под вакуумом в атмосфере P₂O₅. Проводили реакцию смол с 30 мл замещающего раствора (трифторуксусная кислота 81,5%, дистиллированная вода 5%, тиоанизол 5%, фенол 5%, EDT 2,5%, и TIS 1%) в течение 2 часов при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. Смолы фильтровали и промывали небольшим объемом раствора TFA, после чего объединяли фильтрат с маточной жидкостью. Проводили дистилляцию при пониженном давлении, таким образом, что общий объем сохранялся наполовину, а затем добавляли 50 мл холодного эфира, чтобы вызвать осаждение. Осадки собирали посредством центрифугирования и дважды промывали холодным эфиром. Удаляли маточную жидкость и высушивали в достаточной степени в атмосфере азота для получения 0,85 г неочищенного пептида NH₂-Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO: 1) (выход: 92%). Синтезировали пептиды: 0,78 г NH₂-Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp-Met-Ala-COOH (SEQ ID NO: 2) (выход: 82%), 0,92 г NH₂-Ala-Cys(Ser)Thr-Leu-Pro-His-Pro-Trp-Phe-Cys(Ser)-COOH (SEQ ID NO: 3) (выход: 85%), и 0,76 г NH₂-Cys(Ser)-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(Ser)-COOH (SEQ ID NO: 4) (выход: 88%).Было обнаружено, что пептиды SEQ ID NOS: 1, 2, и 4 имеют молекулярные массы 630,7 (рассчитанная: 630,7), 924,5 (рассчитанная: 924,1), 1236 (рассчитанная: 1236,5), и 1301,5 (рассчитанная: 1301,5), соответственно, при измерении масс-спектрометрией.

[Таблица 1]

SEQ ID NO Аминокислотная последовательность Анализ (Масс-спектрометрия) Измеренная Рассчитанная 1 LKTRN 630,7 630,7 2 KGACTGWMA 924,5 924,1 (908,0) 3 KGASTGWMA 4 ACYLPHPWFC 1236 1236,5 (1269,4) 5 ASYLPHPWFS 6 CDLRRLEMYC 1301,5 1301,5 7 SDLRRLEMYS

С другой стороны, каждый пептид, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, и SEQ ID NO: 7, смешивали смешивали в равном количестве для получения пептидного комплекса и оценивали его эффективность.

Пример 1: Анализ ингибирующей активности по отношению к адипогенезу

1-1. Ингибирование накопления жиров при помощи преадипоцита (окрашивание масляным красным O)

Клетки-преадипоциты 3T3-L1 инкубировали до конфлюэнтности, а затем инкубировали в течение двух суток после обработки различными концентрациями пептидов в среде для дифференцировки, содержащей 10 мкг/мл инсулина, 0,1 мкМ дексаметазона и 0,5 мкМ IBMX. После этого среду меняли каждые двое суток на среду, содержащую 10 мкг/мл инсулина. После индукции дифференцировки в течение 10 суток, образование капель в клетках подтверждали окрашиванием масляным красным О.

Подготовленные преадипоциты 3T3-L1 отмывали PBS, фиксировали 3,7% формалином в течение 1 часа, отмывали 60% изопропанолом, а затем окрашивали раствором масляного красного О при комнатной температуре в течение 20 минут. После завершения окрашивания масляным красным О раствор удаляли, клетки отмывали три раза дистиллированной водой, а затем окрашенные клетки наблюдали в фазово-контрастном микроскопе. Результаты показаны на Фиг. 1a и 1b. Для количественного анализа жиры экстрагировали из клеток при помощи 100% изопропанола, клетки переносили в количестве 200 мкл/лунку в 96-луночные планшеты и измеряли оптическую плотность при 500 нм при помощи ридера для ELISA. Результаты показаны на Фиг. 2.

Как показано на Фиг. 1a и 1b, подтвердилось, что степень накопления жиров в клетках снизилась после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, при измерении путем окрашивания масляным красным О.

Как показано на Фиг. 2, подтвердилось, что степень накопления жиров в клетках также снизилась после обработки различными концентрациями пептидных комплексов.

1-2. Подавление экспрессии генов, участвующих в адипогенезе

Клетки 3T3-L1 (пре-адипоциты) высевали с плотностью 3×10⁵ клеток/лунку в 6-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов, клетки инкубировали в течение 14 суток в инкубаторе на 37° после обработки различными концентрациями (0,1, 1, и 10 мкг/мл) пептидов. После этого клетки собирали и обрабатывали раствором для выделения РНК (Easy Blue, Intron) для получения РНК, из которой затем синтезировали кДНК с использованием готовой смеси для обратной транскрипции (Intron). ПЦР проводили с использованием праймеров для адипогенных маркеров (PPARγ, ACC, и aP2), и готовой смеси для ПЦР (Intron). Затем, продукты ПЦР наносили в количестве 5 мкл на гель из 1% агарозы и проводили электрофорез, а затем идентифицировали полосы в Gel-Doc. Результаты показаны на Фиг. 3a и 3b.

Последовательности мишень-специфических праймеров для ПЦР на адипогенные маркеры были следующими:

[Таблица 2]

SEQ ID NO Праймер Последовательность (5'-3') Температура отжига (°С) 8 PPARγ_F TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC 60 9 PPARγ_R AATCCTTGGCCCTCTGAGAT 60 10 ACC_F ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA 60 11 ACC_R GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA 60 12 aP2_F CATCAGCGTAAATGGGGATT 60 13 aP2_R ACACATTCCACCACCAGCTT 60

Как показано на Фиг. 3a и 3b, наблюдали, что у клеточной линии мышиных остеобластов 3T3-L1, которые инкубировали в течение трех суток после обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, были снижены уровни экспрессии адипогенного маркера aP2.

Как показано на Фиг. 4, наблюдали, что когда клеточную линию мышиных остеобластов 3T3-L1 инкубировали в течение трех суток после обработки пептидными комплексами в концентрации 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, и 10 мкг/мл, уровни экспрессии адипогенных маркеров PPARγ, ACC, и aP2 были также снижены как в группе положительного контроля, которую обрабатывали 100 нг/мл TNFα, так и в группе, которую обрабатывали пептидами.

1-3. Наблюдения уровней экспрессии белков, индуцирующих адипогенез и липолиз, с использованием преадипоцита

Клетки 3T3-L1 (пре-адипоциты) высевали с плотностью 3×10⁵ клеток/лунку в 6-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов, клетки инкубировали в течение 14 суток в инкубаторе на 37° после обработки различными концентрациями (0,1, 1, и 10 мкг/мл) пептидных комплексов. Лизаты клеток, полученные при обработке клеток буфером для лизиса, использовали для количественного определения белков, а затем проводили Вестерн-блоттинг с использованием антитела к PPARγ (Santa Cruz Biotechnology, USA), которое является антителом к адипогенному маркеру, и антитела к pHSL (Santa Cruz Biotechnology, USA), которое является антителом к липолитическому фактору.

Как показано на Фиг. 5, наблюдали, что уровни экспрессии адипогенного маркера, белка PPARγ, после обработки различными концентрациями пептидных комплексов были снижены дозо-зависимым образом, и уровни экспрессии липолитического фактора, белка pHSL, были снижены в группе, которую обрабатывали пептидными комплексами.

Пример 2: Анализ липолитической активности

2-1. Повышенные уровни экспрессии генов, участвующих в липолизе

Клетки 3T3-L1 (пре-адипоциты) высевали с плотностью 3×10⁵ клеток/лунку в 6-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов, клетки инкубировали в течение 14 суток в инкубаторе на 37° после обработки различными концентрациями (0,1, 1, и 10 мкг/мл) пептидов (группа положительного контроля: 100 нг/мл TNFα(SIGMA)). После этого, После этого клетки собирали и обрабатывали раствором для выделения РНК (Easy Blue, Intron) для получения РНК, из которой затем синтезировали кДНК с использованием готовой смеси для обратной транскрипции (Intron). ПЦР проводили с использованием праймеров для маркеров (AMPK-α1, CGI58), и готовой смеси для ПЦР (Intron). Затем, продукты ПЦР наносили в количестве 5 мкл на гель из 1% агарозы и проводили электрофорез, а затем идентифицировали полосы в Gel-Doc. Результаты показаны на Фиг. 6.

Последовательности мишень-специфических праймеров для ПЦР на адипогенные маркеры были следующими:

[Таблица 3]

SEQ ID NO. Праймер Последовательность (5'-3') Температура отжига (°С) 14 AMPK-1_F TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA 60 15 AMPK-1_R TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA 60 16 CGI58_F TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT 60 17 CGI58_R GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT 60

Как показано на Фиг. 6a и 6b, наблюдали, что в преадипоцитах (3T3-L1), которые инкубировали после обработки пептидами, уровни экспрессии липолитических факторов AMPK-α1 и CGI-58 были повышены во всех группах, обработанных пептидами.

Как показано на Фиг. 6c, наблюдали, что уровни экспрессии AMPK-α1 и CGI-58 после лечения пептидными комплексами были повышены дозозависимым образом, и уровни экспрессии липолитических факторов были выше по сравнению с группой положительного контроля с 100 нг/мл TNFα.

2-2. Наблюдения уровней экспрессии белков, индуцирующих липолиз, с использованием преадипоцита

Клетки 3T3-L1 (пре-адипоциты) высевали с плотностью 3×10⁵ клеток/лунку в 6-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов, клетки инкубировали в течение 14 суток в инкубаторе на 37° после обработки различными концентрациями (0,1, 1, и 10 мкг/мл) пептидных комплексов (группа положительного контроля: 100 нг/мл TNFα(SIGMA)). Лизаты клеток, полученные при обработке клеток буфером для лизиса, использовали для количественного определения белков, а затем проводили Вестерн-блоттинг с использованием антитела к ATGL (Santa Cruz Biotechnology, USA), которое является антителом к липолитическому фактору.

Как показано на Фиг. 7, подтвердилось, что уровни экспрессии липолитического фактора ATGL были повышены путем обработки пептидными комплексами.

2-3. Наблюдения при помощи флуоресцентной микроскопии за уровнями экспрессии белков, индуцирующих липолиз, с использованием преадипоцита

Клетки 3T3-L1 (пре-адипоциты) высевали с плотностью 3×10⁵ клеток/лунку в 6-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов, клетки инкубировали в течение 14 суток в инкубаторе на 37° после обработки каждым пептидом или пептидным комплексом (1 мкг/мл) (группа положительного контроля: 100 нг/мл TNFα(SIGMA)). После этого клетки фиксировали 70% этанолом, а затем проводили иммуноокрашивание антителом к фосфо-HSL (Santa Cruz Biotechnology, USA) для того чтобы наблюдать за клеточными уровнями экспрессии фосфо-HSL, липолитического фактора.

Как показано на Фиг. с 8a по 8c, подтвердилось, что уровни экспрессии липолитического фактора фосфо-HSL после обработки каждым пептидом (см. Фиг. 8a и 8b) и пептидным комплексом (см. Фиг. 8c) были повышены.

2-4. Количественная оценка продукта липолиза, глицерина

Жировые ткани забирали из брюшной полости мышей с индуцированным ожирением и помещали в количестве 100 мг/лунку в 24-луночные планшеты для культивирования, а затем инкубировали в среде для культивирования (1 мл буфера Кребса-Рингера, содержащего 25 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкоза, и 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина). Во время инкубации ткани инкубировали в течение 48 часов после обработки 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, и 10 мкг/мл пептидными комплексами, и 100 нг/мл TNFα в качестве положительного контроля. Измеряли количество глицерина, произведенного во время липолиза.

Как показано на Фиг. 9, подтвердилось, что количество глицерина, полученного в результате липолиза после обработки различными концентрациями пептидных комплексов, было повышено в зависимости от дозы. Подтвердилось, что количество глицерина также было выше, чем у группы положительного контроля, обработанной TNFα.

2-5. Липолитическое воздействие на жировые ткани, выделенные у мыши с ожирением

Жировые ткани классифицируют на белый жир и бурый жир в зависимости от цвета и классифицируют на подкожный жир, брюшной жир, мезентеральный жир (внутренний жир) и эпидидимальный жир в зависимости от места. После диссекции каждый жир экстрагировали для выделения белых жиров. Белые жиры помещали в количестве 100 мг/лунку в 24-луночные планшеты для культивирования, а затем инкубировали в среде для культивирования (1 мл буфера Кребса-Рингера, содержащего 25 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкоза, и 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина) после обработки различными концентрациями пептидных комплексов. С жиров делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Размеры адипоцитов сравнивали под микроскопом (TS100, Nikon) с 200-кратным увеличением.

Как показано на Фиг. 10a, подтвердилось, что после лечения различными концентрациями пептидных комплексов жиры уменьшились в размерах по сравнению с контрольной группой.

Как показано на Фиг. 10b, наблюдали, как результат измерения размеров адипоцитов с использованием программы после окрашивания, размер клеток в жировых тканях, имеющих отчетливые клеточные мембранные компартменты, был уменьшен в группе, обработанной пептидным комплексом.

2-6. Наблюдение за липолитическим фактором в жировых тканях

Жировые ткани забирали из брюшной полости мышей с индуцированным ожирением и помещали в количестве 100 мг/лунку в 24-луночные планшеты для культивирования, а затем инкубировали в среде для культивирования (1 мл буфера Кребса-Рингера, содержащего 25 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкоза, и 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина). Во время инкубации ткани инкубировали в течение 48 часов после обработки пептидными комплексами, и 100 нг/мл TNFα в качестве положительного контроля. Подтверждали экспрессию меченого липолитического фактора фосфо-HSL (зеленое флуоресцентное вещество).

Как показано на Фиг. 11, подтвердилось, что уровни экспрессии липолитического фактора фосфо-HSL в жировых тканях были повышены после обработки пептидным комплексом.

Пример 3: Воздействие, подавляющее адипогенез и способствующее липолизу у экспериментального животного

Использовали модель с индуцированным ожирением DIO (ожирение, вызванное рационом), у которой развивается ожирение из-за кормления здоровых мышей C57BL/6 рационами с высоким содержанием жиров, для эксперимента для борьбы с ожирением, в котором в качестве положительного контроля для лекарственного средства использовали 5 мкг/мл TNFα. Для контроля кормили обычным рационом без высокого содержания жиров в этом эксперименте кормили рационом с высоким содержанием жиров в течение 12 недель с одновременным применением пептидных комплексов или положительного контроля для лекарственного средства. Во время экспериментов была подтверждена потеря массы.

TNFα и активные соединения против ожирения вводили интраперитонеально в период от 15:00 до 16:00 каждую неделю в течение 12 недель. Массы тела и количества пищи измеряли сразу после первой инъекции лекарственного средства, а затем измеряли с интервалом через неделю.

Образцы крови собирали из хвостовой вены после окончания эксперимента по введению лекарственного средства, а затем измеряли уровни сахара в крови с использованием Accu-Check Active (Roche), а уровни холестерина анализировали с использованием набора для расчета холестерина (BioVision).

Жировые ткани классифицируют на белый жир и бурый жир в зависимости от цвета и классифицируют на подкожный жир, брюшной жир, мезентеральный жир (внутренний жир) и эпидидимальный жир в зависимости от места. После диссекции каждый жир экстрагировали. Для гистологического исследования жиры фиксировали 10% нейтрально забуференным формалином, погружали в парафиновые блоки, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.

Для анализа степени фосфорилирования липолитического фактора HSL, проводили флуоресцентное окрашивание с использованием антитела к pHSL. Получали образцы ткани, заливали средой для заливки с глицериновым гелем, и покрывали покровным стеклом. Ткани фотографировали при помощи цифровой камеры, встроенной в микроскоп (Nikon, TS100) и наблюдали изображения под микроскопом.

Подтвердилось, что была прибавка веса у мышей от 20,9 г до 28,74 г при питании обычным рационом и от 20,99 г до 49,5 г при питании рационом с повышенным содержанием жиров в течение 12 недель от начала эксперимента до конца эксперимента. Однако подтвердилось, что было увеличение массы и в группе с рационом с повышенным содержанием жиров и в группе, получавшей пептидный комплекс, от 21,1 г до 36,76 г в течение 12 недель от начала эксперимента до конца эксперимента, указывающее на значительное снижение набора массы (174,2%) по сравнению с контрольной группой с рационом с высоким содержанием жиров (235,8%) (см. таблицы 4 и 5 и Фиг. 12). Таблицы 4 и 5 показывают результаты измерений массы тела в граммах (г) и процентах (%) после лечения пептидными комплексами у мышиных моделей с ожирением.

[Таблица 4]

Неделя Обычный рацион (контроль) Рацион с высоким содержанием жиров (контроль) Высокожировой рацион +положительный контроль Высокожировой рацион+пептидный комплекс 0 20,09 20,99 22,41 21,10 1 20,75 22,32 23,00 21,26 2 21,99 25,25 26,12 23,72 3 18,23 27,35 27,45 24,36 4 23,26 30,20 30,51 25,29 5 23,16 32,76 32,76 28,65 6 23,28 36,78 33,49 28,79 7 24,71 38,31 35,14 30,37 8 25,84 40,12 37,15 31,53 9 25,59 42,14 38,97 32,59 10 28,13 43,02 40,39 33,78 11 27,90 45,70 41,35 35,33 12 28,74 49,50 43,91 36,76

[Таблица 5]

Неделя Обычный рацион (контроль) Рацион с высоким содержанием жиров (контроль) Высокожировой рацион +положительный контроль Высокожировой рацион+пептидный комплекс 0 100 100 100 100 1 103,3 106,3 102,6 100,8 2 109,5 120,3 116,6 112,4 3 90,7 130,3 122,5 115,5 4 115,8 143,9 136,1 119,9 5 115,3 156,1 146,2 135,8 6 115,9 175,2 149,4 136,4 7 123,0 182,5 156,8 143,9 8 128,6 191,1 165,8 149,4 9 127,4 200,8 173,9 154,5 10 140,0 205,0 180,2 160,1 11 138,9 217,7 184,5 167,4 12 143,1 235,8 195,9 174,2

Как показано на Фиг. 13, при анализе фотографий наблюдали, что после завершения 12-недельного эксперимента, размеры тела в группе, получавшей пептидные комплексы, сохранялись сходными с размерами нормальных мышей (обычный рацион) по сравнению с мышами из группы с рационом с повышенным содержанием жиров.

[Таблица 6]

Общий объем (мм³) Общий жир (мм³) Внутренний жир (мм³) Подкожный жир (мм³) Контроль (Обычный рацион) 4958,25 702,72 380,09 322,63 HFD (2 недели) 6530,09 2084,98 1411,14 673,84 HFD (10 недель) 12464,91 8014,03 5821,27 2192,76 HDF (10 недель)
+комплекс (8 недель) 6012,12 1391,75 871,15 520,60 HDF (10 недель)
+ P.C (8 недель) 8240,67 4165,80 2833,72 1332,08

Как показано на Фиг. 14 и Таблица 6, подтвердилось, что в результате исследования при помощи микро-КТ жира (желтый), распределенного на всем протяжении мышиного организма, после 12 недель эксперимента, количество жиров, распределенных на всем протяжении организма мышей из контрольной группы с рационом с повышенным содержанием жиров было заметно повышено по сравнению с жирами у контрольной группы с обычным рационом, в то время как количество жиров, распределенных на всем протяжении организма и у группы, получавшей пептидный комплекс, и у группы с рационом с высоким содержанием жиров было заметно снижено.

Как показано на Фиг. 15, подтвердилось, что в результате сравнения объемов жировых тканей, после того как мыши, у которых завершили микро-КТ, были анатомированы для выделения жировых тканей, распределенных на всем протяжении тела, количество жиров у мышей из контрольной группы с рационом с повышенным содержанием жиров было выше чем у группы с обычным рационом, в то время как количество жиров и у группы с рационом с повышенным содержанием жиров и у группы, получавшей пептидный комплекс, было заметно снижено.

Как показано на Фиг. 16a, подтвердилось, что в результате визуализации размера жиров после выделения жиров и окрашивания гематоксилином и эозином, размеры жиров и у группы с рационом с повышенным содержанием жиров и у группы, получавшей пептидный комплекс, были меньше, чем у контрольной группы с рационом с повышенным содержанием жиров.

Как показано на Фиг. 16b и 16c, подтвердилось, что в результате анализа размера жиров при помощи программы, когда размер жиров у группы с обычным рационом принимали за 100%, размер жира у группы с рационом с повышенным содержанием жиров был повышен до 127%, в то время как размер жира у группы с рационом с повышенным содержанием жиров и у группы, получавшей пептидный комплекс, был снижен до 97%.

Как показано на Фиг. 17, подтвердилось, что в результате измерения уровней экспрессии липолитического фактора фосфо-HSL, экспрессирующегося в жировых тканях, после выделения жиров, уровни экспрессии фосфо-HSL в группе с рационом с повышенным содержанием жиров и в группе, получавшей пептидный комплекс, были повышены.

Как показано на Фиг. 18, подтвердилось, что в результате измерения уровней холестерина в крови у мышей после завершения эксперимента, уровни холестерина в крови составили 2,52 мкг/мл в группе с обычным рационом питания, 3,5 мкг/мл в группе с рационом с повышенным содержанием жиров, и 2,86 мкг/мл в группе с рационом с повышенным содержанием жиров и в группе, получавшей пептидный комплекс. Это указывает на то, что пептидный комплекс снижает уровни холестерина, повышенные из-за ожирения.

Как показано на Фиг. 19, подтвердилось, что в результате измерения уровней сахара в крови после завершения эксперимента, уровни сахара в крови составили 174 мг/дл у мышей в группе с обычным рационом питания, и повысились до 235 мг/дл в группе с рационом с повышенным содержанием жиров, в то время как уровни сахара в крови составили 183 мг/дл в группе с рационом с повышенным содержанием жиров и в группе, получавшей пептидный комплекс, и аналогично снизились в группе с обычным рационом питания.

Пример 4: Контроль уровней сахара в крови

В этом эксперименте на животных использовали самцов C57BL/6 (обычная мышь) (приобретенных у Samtako Bio Korea, Co., Ltd.) и C57BLKS/JLepr (диабетическая мышиная модель, мышь db/db) (приобретенных у Central Lab. Animal Inc.) применяли, а также пептидный комплекс в качестве противодиабетического активного вещества и/или активного вещества против ожирения, и ситаглиптин в качестве положительного контроля для лекарственного средства.

В этом примере, активный комплекс против диабета и/или против ожирения оценивали по неотложной противодиабетической эффективности (однократное введение) у здоровой мышиной модели и у генетически предрасположенной к диабету модели, с использованием GTT (теста на переносимость глюкозы), который представляет собой типичный диагностический способ для диабета.

Условия окружающей среды для содержания мышей поддерживали при температуре 22-24°С и относительной влажности 50-30%, с четырьмя мышами на клетку. Кроме того, условия окружающей среды поддерживали с освещением 150-300 люкс от 8:00 до 20:00, и двенадцатью часами света и двенадцатью часами темноты в сутки. Мыши получали свободный доступ к обычному рациону (18% белка, произведенного в 2018, Harlan Laboratories Inc, USA). Мыши голодали в течение 4 часов или больше перед экспериментом с ITT (тест на инсулинотолерантность) и в течение 12 часов или больше перед экспериментом с GTT. Сложные составы вводили принудительно перорально при помощи одноразового шприца для перорального введения за час перед экспериментом с GTT. Для эксперимента с GTT мыши получали свободный доступ к рациону с высоким содержанием жиров в час 0 (ноль) эксперимента. Через 40 минут после свободного доступа к рациону с повышенным содержанием жиров собирали образцы крови из хвостовой вены через интервалы 0, 30, 60, 90, 120, и 180 минут для оценки уровней глюкозы в крови. Образцы крови измеряли на уровни глюкозы в крови с использованием Accu-Chek active (Roche). С другой стороны, ситаглипин, применяемый в качестве терапевтического средства для диабета, выбирали в качестве положительного контроля для лекарственного средства и вводили в дозе 100 мг/кг. Сложные составы, выбранные в качестве активных кандидатов против ожирения и/или против диабета, делили на дозы 100 мг/кг для экспериментальных групп, и использовали по четыре мыши для каждой экспериментальной группы.

Как показано на Фиг. 20, наблюдали, что уровни сахара в крови, повышенные из-за рациона с высоким содержанием жиров, были снижены после лечения пептидным комплексом. У моделей мышей с индуцированным диабетом были снижены высокие уровни сахара в крови при диабете.

Как показано на Фиг. 21, подтвердилось, что уровни холестерина в крови и у группы с рационами с повышенным содержанием жиров, и у группы с пептидными комплексами были ниже, чем уровни у контрольной группы с рационами с повышенным содержанием жиров.

Кроме того, после голодания в течение 16 часов, мышей DB/DB с индуцированным диабетом кормили в течение 30 минут, а затем вводили пептиды. Уровни сахара в крови измеряли в динамике, и результаты показаны на Фиг. 22 и 23 и в таблицах 7 и 8.

[Таблица 7]

Здоровые Диабет+высокое содержание жиров PBS SEQ ID NO: 2 Натощак 105 78 181 30 минут 184 227 219 60 минут 181 250 231 120 минут 147 301 174 240 минут 151 247 158 300 минут 135 200 152

[Таблица 8]

Здоровые Диабет+высокое содержание жиров PBS SEQ ID NO: 4 Натощак 115 218 222 30 минут 159 251 249 60 минут 125 255 229 120 минут 121 366 215 240 минут 112 312 180 300 минут 119 253 165

Как показано на Фиг. 22 и 23 и в таблицах 7 и 8, наблюдали, что уровни сахара в крови в группах, которых лечили пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, были снижены в зависимости от времени.

Пример 5: Наблюдение эффекта снижения уровня сахара в крови во время клинического эксперимента

Проводили короткий клинический тест для индивидуумов в возрасте от 45 до 65 лет с уровнем сахара в крови натощак 170 мг/дл или больше. Им давали сложный состав через 30 минут после еды. У индивидуумов собирали образцы крови с интервалами 30, 60, 90, 120, 150 и 180 минут, а затем измеряли уровни сахара в крови с использованием Accu-Chek active (Roche). Результаты показаны на Фиг. 24a и 24b.

Как показано на ФИГ. с 24a по 24d, наблюдали, что уровни сахара в крови были снижены у всех исследуемых индивидуумов при помощи сложного состава.

Промышленная полезность

Настоящее изобретение относится к пептиду с эффективностью против ожирения и противодиабетической эффективностью и к его применению.

Изобретение относится к пептиду, который демонстрирует действие против ожирения, ингибируя накопление жиров и разрушая уже накопленные жиры, а также превосходное противодиабетическое воздействие, эффективно снижая уровни сахара в крови. Пептид по настоящему изобретению снижает экспрессию адипогенных маркеров PPARγ, ACC и/или aP2, повышает экспрессию липолитических факторов pHSL, AMPK-α1, CGI-58 и/или ATGL и уменьшает размеры адипоцитов и уровни холестерина в крови. Превосходная активность и стабильность пептида по настоящему изобретению могут быть эффективно использованы в лекарственных средствах и квазилекарственных продуктах. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 24 ил., 8 табл., 5 пр.

1. Пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, где пептид на N-конце связан с защитной группой, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или

на C-конце с гидроксильной группой (-OH), аминогруппой (-NH₂) или азидной группой (-NHNH₂).

2. Пептид по п. 1, где пептид имеет активность против ожирения или противодиабетическую активность.

3. Пептид по п. 2, где пептид снижает экспрессию одного или нескольких адипогенных маркеров, выбранных из группы, состоящей из рецептора гамма, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), ацетил-CoA карбоксилaзы (ACC) и специфичного для жирных тканей белка 2, связывающего жирные кислоты (aP2).

4. Пептид по п. 1, где пептид повышает экспрессию одного или нескольких липолитических факторов, выбранных из группы, состоящей из фосфорилированной гормон-чувствительной липазы (pHSL), АМФ-активированной протеинкиназы α1 (AMPK-α1), белка гена 58, полученного путем сравнительной идентификации (CGI-58) и жировой триглицеридлипазы (ATGL).

5. Пептид по п. 1, где пептид увеличивает липолиз.

6. Пептид по п. 1, где пептид ингибирует адипогенез.

7. Пептид по п. 1, где пептид снижает уровни сахара в крови.

8. Пептид по п. 1, где пептид уменьшает размеры адипоцитов.

9. Пептид по п. 1, где пептид снижает уровни холестерина в крови.

10. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения ожирения, включающая в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, где пептид на N-конце связан с защитной группой, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или

на C-конце с гидроксильной группой (-OH), аминогруппой (-NH₂) или азидной группой (-NHNH₂).

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, дополнительно включающая один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

12. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, включающая в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, где пептид на N-конце связан с защитной группой, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или

на C-конце с гидроксильной группой (-OH), аминогруппой (-NH₂) или азидной группой (-NHNH₂).

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, дополнительно включающая один или несколько пептидов, выбранных из группы, состоящей из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.