СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИХ БИОМАТЕРИАЛОВ ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ Российский патент 2020 года по МПК A61K35/32 A61L27/36 A01N1/00 A61F2/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления остеопластических биоматериалов из костной ткани для оперативного замещения костных дефектов при деструкции костной ткани, удалении кист, злокачественных и доброкачественных костных опухолей, исправления врожденных костных аномалии, изменений, вызванные посттравматическими и ортопедическими осложнениями, а также стимуляции регенеративных процессов при восстановлении объема костной ткани человека.

Способы получения костно-пластических материалов должны соответствовать современным требованиям безопасности: получение костного материала от сельскохозяйственных животных, прошедших ветеринарный контроль, в течение 24 ч после забоя или от трупов-доноров в течение 24 ч после смерти, а также исключение заражения донорским материалом. Рост числа инфекционных заболеваний, в том числе ВИЧ человека неуклонно повышают вероятность инфекционного заражения костными алломатериалами. Животные же с момента своего рождения и до забоя помещены в условия, где за ними обеспечивается строгий ветеринарный контроль. Возможность инфицирования пациента через имплантируемый материал минимизируется. Потребность в костнопластических материалах, при тенденции увеличения количества операций с использованием костнопластического материала, с каждым годом возрастает. Ксеногенные костные имплантаты высокого качества можно производить в значительно больших объемах, чем аллогенные, что позволяет полностью удовлетворять потребности клиник и снижать коммерческую стоимость ксеноимплантов. Все это, а также учет этических соображений, обуславливают предпочтительность использования ксеноимплантов.

В костной ткани происходит постоянный процесс обновления, при котором происходит замещение старой ткани на новую, т.е. одновременное разрушение и восстановление костного материала. При имплантации донорского материала ремоделируется старая ткань, на ее месте образуется новая ткань. Этот процесс облегчается, когда имплантированный материал по своей структуре более близок к замещаемой кости. Известно, что успешному вживлению костного трансплантанта в разной степени способствуют депротенизация и деминерализация костной ткани. Получение ксеногенных биоматериалов близких по структуре как к губчатой, так и к кортикальной костной ткани, при исполнении их как в виде как пластин, так и крошки, обеспечивает широкий спектр их использования.

Известен способ получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки RU 2456003, опубл. 20.07.2012, в котором после механической очистки и фрагментации костной ткани проводят ее обработку водным раствором 2% неионного детергента Tween-80 в течение 12-24 ч, затем материал обрабатывают 24-48 ч смесью изопропанол-хлороформ 1:1 в ультразвуковой ванне, отмывают водой, выполняют деминерализацию раствором 0,6 М соляной кислоты, в течение 30-90 мин, и далее материал промывают дистиллированной водой, этиловым спиртом, высушивают и дополнительно измельчают до необходимых размеров.

Недостатком этого способа является то, что удаление жировой компоненты костной ткани путем обработки смесью изопропанол-хлороформ сопровождается удалением воды из матрикса, при этом его избыточное высушивание, проводит к его хрупкости, а изменение его межмолекулярной структуры усиливает реакцию организма на имплантат, ускоряет его резорбцию, нарушает остеокондуктивные свойства материала.

Известен способ получения остеопластического материала RU 2609201, опубл. 30.01.2017, согласно которому губчатую костную ткань после механической обработки и фрагментации обрабатывают гипертоническим раствором хлористого натрия 1-10% в течение 1-8 суток, затем выполняют глубокую очистку и делипидизацию методом сверхкритической флюидной экстракции, с последующими деминерализацией раствором соляной кислоты 0,5-4,0 М в течение 15-300 минут и лиофилизацией в течение 1-48 ч.

Недостатком этого способа является то, что обработка в сверхкритической жидкости двуокиси углерода при обеспечении глубокой очистке материала, вызывает значительное повреждение структуры коллагенового матрикса.

Наиболее близким, принятым за прототип, является способ получения биоматериалов из костной ткани и полученный этим способом материал для остеопластики и тканевой инженерии RU 2342162, опубл. 27.12.2008, в котором костную ткань после механической очистки и фрагментации отмывают нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером с рН 5,8-6,0, затем обрабатывают в растворе 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 24 часов, затем промывают водой при 40-80°С, обрабатывают раствором 0,4 М щелочи в течение 10-24 часов, отмывают в проточной воде, высушивают и обезжиривают в смесях этанол-хлороформ, проводят частичную или полную декальцинацию в кислотной среде, обрабатывают раствором пероксида водорода, отмывают водой, высушивают, упаковывают и стерилизуют.

Недостатком известного способа, принятого за прототип, является то, что обработка в растворе 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 24 часов вызывает повреждение коллагенового матрикса материала, переваривает его, нарушая тем самым его структуру и усиливая реакцию организма на материал, снижая тем самым его остеопластический потенциал. Еще одним недостатком является длительная обработка в растворе 0,4 М щелочи, способная вызывать повреждение коллагенового матрикса. Также обработка в смесях этанол-хлороформ вызывает удаление воды из матрикса, высушивает его, делает более хрупким и более чувствительным к повреждающему действию кислотных растворов в последующем процессе деминерализации и в целом усиливает реакцию организма на материал, ускоряет резорбцию материала и снижает его остеопластические свойства.

Задачей изобретения является расширение ассортимента и повышение качества получаемого из костной ткани биоматериала, за счет сохранения структуры костной ткани (структуры костного матрикса и нативных морфогенетических белков), повышение приживляемости таких биоматериалов за счет снижения их антигенных характеристик, повышения биосовместимости и остеоиндуктивности.

Способы получения биоматериалов из костной ткани включают стадии: механическая очистка для удаления мягких тканей, фрагментация, отмывка, обработка ферментом и его удаление, обработка раствором щелочи, обезжиривание, частичная или полная декальцинация в кислотной среде, высушивание, упаковка и стерилизация.

Согласно заявляемому способу получения биоматериалов костный материал преимущественно получают от сельскохозяйственных животных, прошедших ветеринарный контроль, или донорскую кость человека, прошедшую необходимые анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, надкостницы и костного мозга. Фрагментацию проводят для губчатой кости распиливанием на блоки длиной от 1,0 см до 10,0 см, шириной от 0,1 см до 3,0 см, толщиной от 0,1 до 1,0 см или подвергают дроблению для получения частиц размером от 0,5 мм до 3,0 мм; а для кортикальной кости распиливанием на блоки длиной от 5 см до 25 см, шириной от 1 см до 3 см, толщиной от 0,1 см до 1,0 см, причем в костных фрагментах выполняются отверстия диаметром 0,6-0,8 мм при плотности их расположения на поверхности имплантатов - 1 отверстие на 1,0-1,5 см². Геометрические размеры пластин определены опытным путем. Их увеличение по сравнению с заявляемыми приводит к трудностям как с обеспечением полноты ферментной обработкой, так и с полнотой отмывки таких пластин от применяемых по технологии растворов. Уменьшении этих размеров приводит к серьезным проблемам с сохранением их целостности в процессе обработки. Выполнение перфорации фрагментов создает дополнительные центры остеоиндукции для интенсификации процесса регенерации. Заявляемый диаметр сквозных отверстий является оптимальным с точки зрения интенсивности остеоиндуктивности, а заявляемая плотность отверстий позволяет сохранить механическую прочность фрагментов из костной ткани. Определенные опытным путем, продолжительность отмывки фрагментов в дистиллированной воде в течение 2 ч позволяет механически удалить значительную часть миелоидного компонента, а дальнейшее проведение 2 или 3 циклов погружения фрагментов кости в 3% раствор перекиси водорода в соотношении 10 мл к 1 г нативной кости в ультразвуковой установке на 12-16 часов позволяет удалить остатки миелоидного компонента, провести частичное обезжиривание (легкоплавкие жиры) поверхностных областей материала и провести его первичную стерилизацию. Опытным путем была определены параметры проведения при постоянном перемешивании начального обезжиривания последовательным помещением костных фрагментов в растворы липазы и коллагеназы в соответствующих буферах, и определена температура инактивации ферментов. Ферментное обезжиривание необходимо для обеспечения полноты освобождения костных фрагментов от антигенов. Применение буферов создает оптимальные условия воздействия ферментов, сохраняя нативную структуру костного коллагена. Установлено, что применение растворов ферментов в соответствующих буферах при заявляемых параметрах позволяет расщепить жиры на глицерин и высшие жирные кислоты, тем самым достичь ускорения их выхода из толщи костной ткани и эмульгирования в буфере с сохранением структуры коллагенового матрикса, а также эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопртеины. Обработка коллагеназой значительно сокращает продолжительность частичной или полной декальцинации в кислотной среде. При этом параметры обработки раствором коллагеназы позволят регулировать структуру и механические свойства получаемого материала, так при осуществлении обработки раствором колллагеназы получаем биоматериал - имплантат с высокими механическими свойствами, а при получении матрикса обработка коллагеназой не проводится.

Опытным путем были установлены параметры обработки костных фрагментов раствором гипохлорита натрия и обезжиривания смесью гексан-этиловый спирт позволяющие достичь требуемой иммуногенности. При этом замена хлороформа на гексан позволяет преодолеть недостаток известной системы, так обработка в смесях этанол-хлороформ вызывает удаление воды из матрикса, высушивает его, делает более хрупким и более чувствительным к повреждающему действию кислотных растворов в последующем процессе деминерализации и в целом усиливает реакцию организма на материал, ускоряет резорбцию материала и снижает его остеопластические свойства. Обработка костных фрагментов в ультразвуковую установку с дистиллированной водой до достижения нейтрального РН важна для успешного проведения частичной или полной декальцинации в кислотной среде.

Техническим результатом изобретения является получение спектра биоматериалов из костной, повышение приживляемости таких биоматериалов, повышения биосовместимости и остеоиндуктивности.

Технический результат достигается за счет проведения механической очистки и фрагментации костной ткани, отмывки, обработки ферментом и его удалением, обработки раствором щелочи, обезжиривания, частичной или полной декальцинации в кислотной среде, высушивания, упаковки и стерилизацию. При этом губчатую кость природного происхождения распиливают на блоки длиной от 1,0 см до 10,0 см, шириной от 0,1 см до 3,0 см, толщиной от 0,1 до 1,0 см или подвергают дроблению для получения частиц размером от 0,5 мм до 3,0 мм; отмывку осуществляют в потоке (проточной) дистиллированной воды в течение 2 ч с дальнейшим проведением 2 или 3 циклов погружения фрагментов кости в 3% раствор перекиси водорода в соотношении 10 мл к 1 г нативной кости в ультразвуковой установке на 12-16 часов; начальное обезжиривание осуществляется при постоянном перемешивании последовательным помещением в раствор липазы в карбонатном буфере рН=9,0 при содержании липазы в количестве 0,05 г на 1 гр. нативной кости в течение 5-10 часов при температуре 37-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой карбонатным буфером, и раствор коллагеназы в буфере TESCA, при содержании коллагеназы в растворе 0,1 мг на 1 г нативной кости в течение 5 часов при температуре 35-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой буфером TESCA, причем инактивация ферментов осуществляется нагревом до 70°С на 15-30 мин., а также проводится заключительная промывка фрагментов кости дистиллированной водой и обработка 3,25% раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин с последующей промывкой деионизированной водой, дальнейшее обезжиривание осуществляется двухкратным погружением в смесь гексана/этилового спирта 96% 1:1 из расчета 10 мл смеси на 1 г нативной кости на 12 часов, далее, после удаления смеси, костные фрагменты помещают в ультразвуковую установку с дистиллированной водой и проводят циклы обработки в течение 5-6 часов до достижения нейтрального РН. В случае кортикальной кости обработка костной ткани выполняется аналогично вышеописанному способу, но фрагментация осуществляется распиливанием на блоки длиной от 5 см до 25 см, шириной от 1 см до 3 см, толщиной от 0,1 см до 1,0 см, причем в костных фрагментах выполняются отверстия диаметром 0,6-0,8 мм при плотности их расположения на поверхности имплантатов - 1 отверстие на 1,0-1,5 см², а также не используются дробление кости и обезжиривание раствором коллагеназы в буфере TESCA.

Способ осуществляется следующим образом.

Получение матрикса.

Костный материал получают от сельскохозяйственных животных, прошедших ветеринарный контроль по существующим правилам в течение 24 ч после забоя или от трупов-доноров по существующим правилам в течение 24 ч после смерти. После этого кость подвергают механической обработке для удаления мягких тканей и распиливают на блоки длиной от 1,0 см до 10,0 см, шириной от 0,1 см до 3,0 см, толщиной от 0,1 до 1,0 см или подвергают дроблению для получения частиц размером от 0,5 мм до 3,0 мм. Полученные фрагменты промывают в дистиллированной воде в течение 2 ч. Затем для удаления элементов крови фрагменты погружают в 3% раствор перекиси водорода в соотношении 10 мл к 1 г нативной кости в ультразвуковой установке на 48 ч. Смена раствора производится каждые 12 ч. Фрагменты центрифугируют для удаления раствора перекиси водорода. Обезжиривание проводится липазой в карбонатном буфере рН 9,0 при содержании липазы в растворе 0,05 г на 1 г нативной кости течение 5-10 часов, в зависимости от размера костного фрагмента, при температуре 37-38°С при постоянном перемешивании, затем систему нагревают до 70°С на 15-30 мин. для инактивации фермента. Материал промывают карбонатным буфером с целью полного удаления фермента. Далее материал помещают в буфер TESCA, содержащим коллагеназу при содержание коллагеназы в растворе 0,1 мг на 1 г нативной кости в течение 5 часов при постоянном перемешивании и температуре 35-38°С, затем систему нагревают до 70°С на 15-30 мин. для инактивации фермента. Далее материал промывают буфером TESCA и дистиллированной водой. Для удаления неколлагеновых белков кости обрабатывали 100 мл 3.25% раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин при комнатная температура с последующей промывкой деионизированной водой. Для дальнейшего обезжиривания костные фрагменты погружают в смесь гексана/этилового спирта 96% 1:1 на 24 часа. Количество смеси составляет 10 мл на 1 г нативной кости. Смесь меняют каждые 12 ч. Костные фрагменты центрифугируют для удаления смеси и помещают в ультразвуковую установку с дистиллированной водой. Проводится несколько циклов промывки со сменой дистиллированной воды. Проветривают на воздухе в течение 1 суток. Затем костные фрагменты замораживают при температуре -70°С в течение 24 ч. После этого костные фрагменты подвергают лиофилизации в течение 48 ч на установке LZ-9.2, чем достигается остаточная их влажность 5%. Костные фрагменты упаковывают, стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18-25 кГр на ускорителе ЛУЭ-8-5М, У003 MB и маркируют.

Получение трансплантата.

Способ осуществляется согласно вышеописанному, но сос следующими изменениями: фрагментация осуществляется распиливанием на блоки длиной от 5 см до 25 см, шириной от 1 см до 3 см, толщиной от 0,1 см до 1,0 см, причем в костных фрагментах выполняются отверстия диаметром 0,6-0,8 мм при плотности их расположения на поверхности имплантатов - 1 отверстие на 1,0-1,5 см², а дробление кости и обезжиривание раствором коллагеназы в буфере TESCA не используются.

Полная или частичная деминерализация костных фрагментов производится растворами 0,6-1,2 Н соляной кислоты при комнатной температуре, в течение 18-20 часов в зависимости от объема костных фрагментов и от необходимости получения имплантатов с поверхностной или глубокой степенью деминерализации. Соотношение веса костного материала к объему раствора соляной кислоты составляет 1 г нативной кости к 15 мл растворов 0,6 или 1,2 Н соляной кислоты. После завершения процесса деминерализации имплантат помещается в раствор тиосульфата натрия для нейтрализации кислоты на 30-40 мин., 4 раза, со сменой раствора тиосульфата. Затем имплантаты помещаются в дистиллированную воду температурой 16-19°С на 5 часов под контролем РН среды, доводя ее до нейтральной.

Пример выполнения заявляемого способа.

Больной X., 7 лет, диагноз: Перелом головочки мыщелка плечевой кости (ГМПК), формирование ложного сустава ГМПК.

Травма получена в результате падения на плечо бревна. По месту жительства проведена закрытая репозиция, конечность фиксирована гипсовой повязкой. В дальнейшем по результатам рентгенологического наблюдения в течение 1 месяца, диагностировано формирование посттравматического ложного сустава головочки мыщелка левой плечевой кости. Жалобы на боль в области перелома. Было проведено оперативное лечение: экономная резекция ложного сустава, открытая репозиция костных отломков, костная пластика костная аллотрансплантатом изготовленным по способу, представленным в заявке и металлоостеосинтез в аппарате Илизарова. Рана зажила первичным натяжением. На 11-е сутки после операции швы сняты. В ходе динамического контроля явные признаки инкорпорации имплантатов наблюдались через 6 мес. после хирургического вмешательства, больной полностью пользуется конечностью, жалоб нет.

Клиническая тактика подтверждает заявляемые качества биоматериала из костной ткани, изготовленного по заявленному способу: высокая остеоиндуктивная активность при пересадке и низкая антигенность. Это также позволяет в клинической практике сократить сроки лечения больных и резко снизить процент отторжения, что избавит пациентов от неоднократных оперативных вмешательств и психических травм.

Изобретение относится к медицине. Раскрыт способ получения биоматериалов из костной ткани, включающий ее механическую очистку и фрагментацию, отмывку, обработку ферментом и его удаление, обработку раствором щелочи, обезжиривание, частичную или полную декальцинацию в кислотной среде, высушивание, упаковку и стерилизацию. При этом после очистки кости природного происхождения осуществляют распиливание на блоки заданного размера, причем в костных фрагментах выполняются отверстия диаметром; отмывку осуществляют в потоке дистиллированной воды в течение 2 ч с дальнейшим проведением 2 или 3 циклов погружения фрагментов кости в 3% раствор перекиси водорода в ультразвуковой установке; начальное обезжиривание осуществляется при постоянном перемешивании последовательным помещением в раствор липазы в карбонатном буфере рН 9,0 при содержании липазы в количестве 0,05 г на 1 г нативной кости в течение 5-10 ч при температуре 37-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой карбонатным буфером, и для губчатой кости раствор коллагеназы в буфере TESCA, при содержании коллагеназы в растворе 0,1 мг на 1 г нативной кости в течение 5 ч при температуре 35-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой буфером TESCA, при этом для кортикальной кости обезжиривание раствором коллагеназы в буфере TESCA не используется, а также проводится заключительная промывка фрагментов кости дистиллированной водой и обработка 3,25% раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин с последующей промывкой деионизированной водой, дальнейшее обезжиривание осуществляется двухкратным погружением в смесь гексана/этилового спирта 96% 1:1 из расчета 10 мл смеси на 1 г нативной кости на 12 ч, далее, после удаления смеси, костные фрагменты помещают в ультразвуковую установку с дистиллированной водой и проводят циклы обработки в течение 5-6 ч до достижения нейтрального рН. Изобретение обеспечивает повышение приживляемости, биосовместимости и остеокондуктивности биоматериалов. 1 пр.

Способ получения биоматериалов из костной ткани, включающий ее механическую очистку и фрагментацию, отмывку, обработку ферментом и его удаление, обработку раствором щелочи, обезжиривание, частичную или полную декальцинацию в кислотной среде, высушивание, упаковку и стерилизацию, отличающийся тем, что после очистки кости природного происхождения для губчатой кости осуществляют распиливание на блоки длиной от 1,0 см до 10,0 см, шириной от 0,1 см до 3,0 см, толщиной от 0,1 до 1,0 см или подвергают дроблению для получения частиц размером от 0,5 мм до 3,0 мм, а для кортикальной кости осуществляют распиливание на блоки длиной от 5 см до 25 см, шириной от 1 см до 3 см, толщиной от 0,1 см до 1,0 см, причем в костных фрагментах выполняются отверстия диаметром 0,6-0,8 мм при плотности их расположения на поверхности имплантатов - 1 отверстие на 1,0-1,5 см²; отмывку осуществляют в потоке дистиллированной воды в течение 2 ч с дальнейшим проведением 2 или 3 циклов погружения фрагментов кости в 3% раствор перекиси водорода в соотношении 10 мл к 1 г нативной кости в ультразвуковой установке на 12-16 ч; начальное обезжиривание осуществляется при постоянном перемешивании последовательным помещением в раствор липазы в карбонатном буфере рН 9,0 при содержании липазы в количестве 0,05 г на 1 г нативной кости в течение 5-10 ч при температуре 37-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой карбонатным буфером, и для губчатой кости раствор коллагеназы в буфере TESCA, при содержании коллагеназы в растворе 0,1 мг на 1 г нативной кости в течение 5 ч при температуре 35-38°С с дальнейшей инактивацией фермента и промывкой буфером TESCA, при этом для кортикальной кости обезжиривание раствором коллагеназы в буфере TESCA не используется, причем инактивация ферментов осуществляется нагревом до 70°С на 15-30 мин, а также проводится заключительная промывка фрагментов кости дистиллированной водой и обработка 3,25% раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин с последующей промывкой деионизированной водой, дальнейшее обезжиривание осуществляется двухкратным погружением в смесь гексана/этилового спирта 96% 1:1 из расчета 10 мл смеси на 1 г нативной кости на 12 ч, далее, после удаления смеси, костные фрагменты помещают в ультразвуковую установку с дистиллированной водой и проводят циклы обработки в течение 5-6 ч до достижения нейтрального рН.