Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала Российский патент 2020 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие папилломавирусной инфекции с целью выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК вирусов папилломы человека 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 типов высокого канцерогенного риска методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанного типа вируса папилломы человека в биологическом материале с высокой точностью.

В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК вируса папилломы человека различных типов высокого канцерогенного риска в биологических материалах, в частности ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска.

Известны способы, которые обеспечивают возможность детектировать до пятнадцати типов ВПЧ в одном мультиплексном тесте, а именно ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и 73. Эти способы частично основаны на присутствии или отсутствии ДНК и РНК ВПЧ. (Processes and compositions for detecting human papilloma virus types. № публ. WO/2012/047897, дата публ. 12.04.2012, заявители: STOERKER, SEQUENOM, INC. [US/US]) США.

Известен метод, основанный на количественном ПЦР, который позволяет обнаруживать 30 типов ВПЧ (6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 66, 68, 70, 72, 73, 81, 82 и 83). (Human papilloma virus detection method. Заявители: JIANGSU MOLE BIOSCIENCE CO., LTD., номер публикации: 104630384, дата публикации: 20.05.2015) Китай.

Известен метод обнаружения ДНК ВПЧ в клетках на цитологических мазках по Папаниколау, который указывает что пациент имеет повышенный риск рака. Метод основан на использовании полноразмерных ДНК-зондов к ВПЧ 16, 18, 31, 35 и 51. (Detection of human papilloma virus in papanicolaou (Pap) smears. Заявители: Ventana Medical Systems, Inc., номер публикации: 20050014133, дата публикации: 20.01.2005).

Известен способ основанный на ПЦР, позволяющий обнаруживать 14 типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68), которые классифицируются как ВПЧ высокого онкогенного риска, а также обнаруживать кандидата в ВПЧ высокого онкогенного риска (ВПЧ 67). (New detection method for cervical HPVs. Заявители: Self-screen B.V., номер публикации: 2007360826, дата публикации: 27.05.2010).

Известны праймеры, зонды, наборы праймеров, наборы праймеров и зондов, способы и наборы реагентов для обнаружения вирусов папилломы человека, последовательностей бета-глобина человека и вирусов папилломы человека и последовательностей бета-глобина человека исследуемом образце (Праймеры и зонды для детекции последовательностей вируса папилломы человека в исследуемых образцах. № публ.: 0002530550, дата публикации: 10.10.2014).

Известно изобретение, направленное на ПЦР-амплификацию в реальном времени, в которой задействованы химические принципы системы Taq-Man, для того чтобы одновременно обнаруживать большее количество типов ВПЧ, чем существует каналов детекции. В данной системе анализа задействован набор праймеров/зондов для обнаружения каждого типа ВПЧ, для обнаружения которого сконструирована эта система анализа. Различные серотипы, которые можно успешно обнаруживать с помощью этого анализа, включают, например, ВПЧ типов 33, 39, 51, 56, 58, 59, 66 и 68. (Система анализа для обнаружения близкородственных серотипов вируса папилломы человека (впч). Патент на изобретение №: 2558236, Дата публикации: 2015).

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в области амплификации - Е6 gene, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

Существенным отличием работы с данными праймерами является:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области Е6 gene рибосомальной ДНК позволяет выявить ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм ЮНИ» и «МагноПрайм ФАСТ» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильно высушенных реакционных смесей.

Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска, в состав которых входят:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР-буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ, и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.

Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки цервикального канала) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки цервикального канала) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.

На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.

Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска с высокой точностью.

Пример 3. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки цервикального канала) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска с высокой точностью.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала методом полимеразной цепной реакции, включающий праймеры и зонд с флуоресцентной меткой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале. 3 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 51 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

GTTATAGCAGGTCTGTGTATGGTA Seq.N1

AGGCCCAAGTGGTCTTTGA Seq.N2

ATGTCAAAGACCACTTGGGCCT Seq.N3