Способ получения инактивированной вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных Российский патент 2020 года по МПК A61K39/09 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине и может быть использовано при промышленном производстве инактивированной вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных. Вакцина содержит бактериальную массу штамма Streptococcus pneumoniae. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, обеспечивает надежную защиту молодняка продуктивных животных от легочных заболеваний.

Выпускаемая в настоящее время коммерческая вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят обладает невысокой эффективностью. Это объясняется тем, что указанная вакцина, содержащая антиген только из штамма энтерококка серогруппы D, не предохраняет от стрептококков серологических групп В и С, которые наиболее часто являются этиологическим фактором легочных заболеваний молодняка продуктивных животных.

Однако способ получения вакцины является лабораторным, малопроизводительным, трудоемким и непригодным для промышленного производства. Культивирование стрептококков осуществляется в мясо-пептонном бульоне в стеклянных баллонах в стационарных условиях. Длительность культивирования составляет 18-24 часа, накопление бакмассы не выше 4 млрд.м.т./см³. Способ культивирования неуправляемый, в силу чего не позволяет получать стандартную полноценную в антигенном отношении культуру в больших количествах.

Известен способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза крупного рогатого скота [5].

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является известный из документа US 2012128719 А1, 24.05.2012 «Способ изготовления вакцины против заболеваний и инфекций, в том числе стрептококковых крупного рогатого скота». Вакцина может содержать адъювант, например, гидроокись алюминия. Способ изготовления вакцины включает культивирование в питательной среде Streptococcus agalactiae, Streptococcus zooepidemicus, Enterococcus faecalis, инактивацию микроорганизмов и добавление адъюванта, например гидроокиси алюминия [6]. Отличием заявленного в формуле изобретения от ближайшего аналога является то, что при изготовлении вакцины проводят:

1) культивирование микроорганизма в ферментере;

2) инактивацию формальдегидом при температуре 43-47°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,03-0,07%;

3) получение инактивированной культуры при исходной концентрации 4-7 млрд.м.т./см³;

4) снижение окислительно-восстановительного потенциала культуральной жидкости до –200 - -150 мВ;

5) до окончания процесса культивирования поддерживают рО₂ в культуральной жидкости на уровне 15-25% от насыщения кислородом воздуха;

6) рН культуральной жидкости регулируют на уровне 6,8-7,2;

7) дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05-0,20%.

Способ изготовления гидроокисьалюминиевой вакцины, содержащей несколько штаммов бактерий против инфекционных заболеваний, в том числе вызванными стрептококками по известному документу (RU 2191598 С2. 27.10.2002) очевиден для свиней и нельзя гарантировать ее эффективность для вакцинации телят, ягнят и поросят представленных в ее описании [1].

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения резистентности организма молодых животных к легочным заболеваниям стрептококковой этиологии. Заявляемая вакцина для молодняка продуктивных животных обладает высокой профилактической эффективностью.

Технический результат изобретения достигается в способе изготовления вакцины против стрептококкоза молодняка продуктивных животных путем включения в состав заявляемой вакцины в качестве антигена бактериальной массы штамма Streptococcus pneumoniae, при исходной концентрации микроорганизма 4-7 млрд.м.т./см³, а культивирование штамма стрептококков проводят в ферментере при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости - 200÷-150 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 15-25%. от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 6,8-7,2, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05-0,2%) при лимитировании роста стрептококка глюкозой, инактивацию культуры стрептококка проводят формальдегидом при температуре 43-47°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,03-0,07%.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа изготовления вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных, аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ изготовления вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных, где повышается качество целевого продукта за счет увеличения резистентности организма молодняка продуктивных животных к заболеваниям стрептококковой этиологиии; заявляемая вакцина обладает высокой профилактической эффективностью при определенных условиях, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Целью заявляемого изобретения является создание высокоиммуногенной инактивированной вакцины, обеспечивающей надежную защиту молодняка продуктивных животных от пневмонийных заболеваний стрептококковой этиологии.

Эта цель достигнута введением в состав вакцины антигена производственного штамма, осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и щадящих режимов инактивации.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильный ферментер загружают жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера.

Питательную среду в ферментере засевают маточной культурой (Streptococcus pneumonia), выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, культивируют при температуре (37±1)°С в течение 6-8 часов.

После засева ферментера окислительно - восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до (-150)÷(-200) мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают рО₂ в культуральной жидкости на уровне 15-25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 6,8-7,2 ед. рН, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05-0,2% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, характеризующемся резким повышением рО₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости. Выращивание стрептококков проводят в соответствии с патентом (1).

Полученную бактериальную массу производственного штамма стрептококков с известной концентрацией бактерий перекачивают в отдельный заранее приготовленный стерильный реактор (или стеклянные баллоны) и добавляют при постоянном перемешивании дробно формальдегид до его конечной концентрации 0,03-0,07%, доводят рН до 7,1-7,2 ед. рН добавлением 10%-ного раствора гидроокиси натрия, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 43-47°С в течение 3-5 суток.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидрата окиси алюминия, доведенного до рН (7,2±0,1) из расчета 130 см на каждый 1 дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 43-47°С в течение 2 суток, ежедневно перемешивая 3-4 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидрате окиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию микробных тел (4-7)⋅10⁹ м.т./см³.

Культуру стрептококка после инактивации и адсорбции на гидрате окиси алюминия подают в оснащенный перемешивающим устройством реактор-смеситель.

Бактериальную массу из штамма Streptococcus pneumoniae, тщательно перемешивают и с соблюдением условий асептики при постоянном перемешивании расфасовывают в стерильную стеклотару.

Технологические параметры изготовления инактивированной вакцины против пневмоний молодняка продуктивных животных стрептококковой этиологии, приведены в таблице.

Пример 1. Способ изготовления вакцины против стрептококкоза молодняка продуктивных животных включал культивирование в питательной среде микроорганизма Streptococcus pneumoniae, инактивацию микроорганизма и добавление адъюванта - гидроокиси алюминия, в качестве антигена содержал бактериальную массу штамма Streptococcus pneumoniae, при исходной концентрации микроорганизма 3 млрд.м.т./см³, а культивирование культуры стрептококка проводили при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости - 200 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживали рО₂ в культуральной жидкости на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулировали на уровне 6,8, а дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,05% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культур стрептококков проводили формальдегидом при температуре 41°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляла 0,03%.

Вакцину применили телятам двукратно в неблагополучной по стрептококкозу ферме. Резистентность организма животных к заболеванию стрептококковой этиологии продолжалась в течение 3 месяцев после последней вакцинации, в последствие телята подвергались инфицированию и заболевали стрептококкозом.

Пример 2. Способ изготовления вакцины против стрептококкоза молодняка продуктивных животных включал культивирование в питательной среде микроорганизмов Streptococcus pneumonia, инактивацию микроорганизма и добавление адъюванта - гидроокиси алюминия, в качестве антигена содержал бактериальную массу штамма Streptococcus pneumoniae, при исходной концентрации микроорганизма 5 млрд.м.т./см³, а культивирование культуры стрептококков проводили при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -175 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживали рО₂ в культуральной жидкости на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулировали на уровне 7,0, а дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,125% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культуры стрептококка проводили формальдегидом при температура 43°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляла 0,05%.

Вакцину применили телятам двукратно в неблагополучной по стрептококкозу ферме. Иммунитет у животных наступал через 13-15 суток после первого введения вакцины и продолжался не менее 12 месяцев после последней иммунизации.

Из представленных данных видно, что проведенная вакцинация заявляемой вакциной позволила обеспечить 100% сохранность в неблагополучной по стрептококкозу ферме.

Пример 3. Вакцина изготавливалась по прототипу. Культуру штамма микроорганизмов вводили в вакцину при исходной концентрации микроорганизма 8 млрд.м.т./см³, а культивирование культуры стрептококков проводили при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -150 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживали рО₂ в культуральной жидкости на уровне 25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,20% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культур стрептококков проводили формальдегидом при температура 45°С в течение 5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляла 0,07%.

Вакцину применили телятам двукратно в неблагополучной по стрептококкозу ферме. Резистентность организма животных к заболеванию стрептококковой этиологии продолжалось в течение 12 месяцев. Иммунитет у животных наступал через 13-15 суток после первого введения вакцины и продолжался не менее 12 месяцев после последней иммунизации.

Из представленных данных видно, что проведенная вакцинация заявляемой вакциной позволила обеспечить 100% сохранность в неблагополучной по стрептококкозу ферме.

Пример 4. Вакцина изготовлена по аналогу. Культуру микроорганизма вводили в вакцину при исходной концентрации микроорганизма 14,0 млрд.м.т./см³, а культивирование культуры стрептококка проводили при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости 175 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживали рО₂ в культуральной жидкости на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулировали на уровне 7,0, а дробную подачу глюкозы осуществляли дозами до концентрации 0,125%) при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культур стрептококков проводили формальдегидом при температура 45°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляла 0,05%.

Вакцину применили телятам двукратно в неблагополучной по стрептококкозу ферме. Резистентность организма животных к заболеванию стрептококковой этиологии отсутствовала, и телята заболевали в течение 1-2 месяцев.

Пример 5. Испытание профилактической эффективности заявляемой вакцины на телятах. Вакцины применили, изготовленные по примеру 1 и 2.

В исследованиях использованы две группы телят путем двукратной вакцинации препарата в дозе 1,5-2,0 мл с интервалом 15 суток. Одной группе телят вводили вакцину, изготовленную по примеру 1, другой группе - заявляемую вакцину по примеру 2. Через 20 дней после 2-й вакцинации все телята, в том числе 6 контрольных невакцинированных, были заражены вирулентным штаммом стрептококка в дозе 5-6 млрд микробных клеток. Наблюдение за животными проводили в течение 15 суток, учитывали заболевших, павших, проводили бактериологический анализ из патологического материала от трупов (печень, селезенка, кровь из сердца, красный костный мозг).

Сохранность вакцинированных телят от заболевания стрептококкозами составила 100%, а увеличение привесов составила в этой группе 10-12%. Заболеваемость в контрольной группе составляла 80%.

Пример 6. Определение профилактической эффективности вакцин, изготовленных по прототипу и аналогу.

Исследования проводили с использованием двух групп телят, которые подвергались двукратной иммунизации вакциной изготовленной по прототипу и аналогу, а затем заражению живой вирулентной культурой стрептококка аналогично действиям, указанным в примере №5. Вакцинированные животные заболевали, у них отмечались поражения, характерные для стрептококкоза. Сохранность телят составила только 45% и 30% соответственно прототипу и аналогу. А увеличение привесов не превышала в двух группах 3%. Заболеваемость в контрольной группе составляла 80%.

Таким образом, при применении заявляемой вакцины технический результат заключается в повышении сохранности телят, высоком профилактическом эффекте в течение 12 месяцев при двукратном вакцинировании.

Представленные примеры подтверждают высокое качество и эффективность вакцины, полученной заявленным способом. Применение заявляемой вакцины позволяет предохранить наибольший процент животных от гибели и заболевания молодняка продуктивных животных стрептококкозом по сравнению с известными вакцинами.

Источники информации

1. Патент РФ №2191598 С2 от 27 октября 2002 г. К 39/102 «Вакцина ассоциированная гидроокисьалюминиевая против инфекционных пневмоний свиней бактериальной этиологии и способ ее изготовления» (аналог).

2. Патент РФ №1566533 от 7 апреля 1993 г. А 61 39/102 «Способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц».

3. Патент РФ №2129016 от 20 апреля 1999 г. А61К 39/112 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».

4. Титова М.Н. Усовершенствование лечебно-диагностических мероприятий при стрептококковом мастите коров // Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. Новосибирск. 2013.

5. Патент РФ №2179861 от 27.02.2002 А61К 39/085. Вакцина ассоциированная против стрептококкоза крупного рогатого скота

6. US 2012128719 А1, 24.05.2012 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине. Предложен способ получения инактивированной вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных. Способ включает культивирование в питательной среде Streptococcus pneumonia при исходных концентрациях микроорганизмов 4-7 млрд.м.т./см³, при рН 6,8-7,24, лимитировании роста стрептококков глюкозой; окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -200÷-150 мВ и pO₂ - 5-25% от насыщения кислородом воздуха. Культуру Streptococcus pneumonia инактивировали формальдегидом с конечной концентрацией 0,03-0,07% при 41-45°С в течение 3-5 суток, затем добавляли адъювант – гидроокись алюминия. Изобретение обеспечивает повышение качества вакцины для защиты молодняка продуктивных животных от легочных заболеваний. 1 табл., 6 пр.

Способ получения инактивированной вакцины против легочных заболеваний молодняка продуктивных животных, включающий культивирование в питательной среде микроорганизма - штамма Streptococcus pneumoniae, инактивцию микроорганизма и добавление адъюванта - гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что вакцина в качестве антигена содержит бактериальную массу штамма Streptococcus pneumoniae при исходных концентрациях микроорганизмов 4-7 млрд.м.т./см³, а культивирование штамма стрептококков проводят при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -200÷-150 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 15-25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 6,8-7,2, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05-0,2% при лимитировании роста стрептококков глюкозой, инактивацию культур стрептококков проводят формальдегидом при температура 41-45°С в течение 3-5 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,03-0,07%.