ВАКЦИНА ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ПРОДУКТИВНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано при промышленном производстве инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных.

Известен способ изготовления вакцины против паратифа поросят [1] и способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных [4].

Предложенные вакцины против сальмонеллеза обладают рядом недостатков: процесс культивирования довольно продолжителен (12-14 ч), не позволяет использовать современное оборудование, защитная среда для лиофильного высушивания не обеспечивает стабильности вакцины при длительном хранении.

Известен препарат на основе лизатантигенов сальмонелл против сальмонеллеза свиней [2, 3].

Изготовления указанного препарата имеет ряд недостатков: сальмонеллы выращиваются в неуправляемом режиме, инактивация проводится гидраксиламином, который более токсичен, чем формалин. Препарат изготавливается в сухом виде методом лиофильной сушки. Нами предлагается форма вакцины, в качестве адъюванта - гидроокись алюминия. Такая технология значительно снижает себестоимость вакцины.

Задача заявляемого изобретения - получение высокоиммуногенной инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины, обеспечивающей надежную защиту от желудочно-кишечных заболеваний продуктивных животных, вызываемых сальмонеллами, а также повышение качества и стандартности биологических свойств инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины.

Эта задача достигается введением в состав вакцины гидроокиси алюминия, а также осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и щадящих режимов инактивации сальмонелл.

В состав указанной вакцины входят 4 производственных штамма сальмонелл - Salmonella choleraesuis 370, Salmonella typhimurium 371, Salmonella abortusovis 372 и Salmonella dublin 373 [6].

Выращивание сальмонелл проводят следующим образом.

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками [6].

Питательную среду в ферментерах засевают раздельно матровыми расплодками сальмонелл, выращенными в питательной среде на основе перевара Хоттингера. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до (-100)-(-120) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20-30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,6-7,7 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,15)% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Полученную бактериальную культуру двух производственных штаммов сальмонелл с измеренной концентрацией бактерий перекачивают в четыре отдельных, заранее подготовленных реактора (или стеклянные баллоны) и добавляют при постоянном перемешивании дробно 37%-ный водный раствор формальдегида до его конечной концентрации 0,2-0,3%, доводят рН до 7,1-7,2 ед. добавлением 10%-ного раствора NaOH, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 37-41°С в течение 3-7 суток.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию (15,0-25,0)×10⁹ м.т./см³.

После инактивации, адсорбции культур на гидроокиси алюминия и декантации надосадочной жидкости компоненты вакцины смешивают в равных объемах.

Вакцину расфасовывают с соблюдением условий асептики при постоянном перемешивании в стерильных условиях.

После перемешивания вакцину расфасовывают с соблюдением условий асептики при постоянном перемешивании в стерильные флаконы.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения резистентности организма животных к заболеванию сальмонеллезной этиологии. Заявляемая вакцина обладает высокой профилактической эффективностью.

Технический результат изобретения достигается в способе изготовления вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных путем включения в состав заявляемой вакцины в качестве микроорганизмов бактериальной массы четырех штаммов сальмонелл, их раздельное культивирование проводят до исходных концентрациях микроорганизмов 15,0-25,0 млрд.м.т./см³ в ферментерах при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -100÷ -120 мВ, после чего до окончания культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 20-30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 7,6-7,7, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, инактивацию культур сальмонелл проводят формальдегидом при температуре 37-41°С в течение 3-7 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,2-0,3%. После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток, после отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости для получения в осадке заданной концентрации микробных тел каждого штамма сальмонелл (15,0-25,0)×10⁹ м.т./см³, затем проводят смешивание культур штаммов сальмонелл в вакцине в равных объемах.

В патентной научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа изготовления вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Эта цель достигнута подбором и введением в состав вакцины неконкурирующих между собой антигенов производственных штаммов и оптимальным количественным их соотношением, осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и щадящих режимов инактивации.

Пример 1. Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.

Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -120 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,10% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 37°С в течение 3 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,20%.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 15,0 млрд. м.т./см³.

Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см³:

- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella Dublin №373 - 15,0.

Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.

Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -110 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,10% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 39°С в течение 5 суток, причем конечная концентрация формальдегида культуре составляет 0,25%.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 20,0 млрд. м.т./см³.

Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см³:

- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 20,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 20,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 20,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 20,0.

Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.

Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -100 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,7 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 41°С в течение 7 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,30%.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 25,0 млрд. м.т./см³.

Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см³:

- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 25,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 25,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 25,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 25,0.

Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.

Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -130 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,2 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 35°С в течение 1 суток, причем конечная концентрация формальдегида культуре составляет 0,15%.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 15,0 млрд. м.т./см³.

Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см³:

- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 15,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 15,0.

Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями выше максимальных

Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.

Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -90 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,30% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.

Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 43°С в течение 9 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,35%.

После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 30,0 млрд. м.т./см³.

Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см³:

- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 30,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 30,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 30,0;

- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 30,0.

Технологические параметры изготовления инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против сальмонеллеза свиней, указанные в примерах, приведены в таблице.

Вакцина, изготовленная по примерам 1-3, обладает высокой иммуногенной активностью и соответствует требованиям ТУ (СТО), тогда как вакцина, приготовленная по пункту 4, не обладает достаточной иммуногенной активностью, а вакцина, изготовленная по примеру 5, обладает повышенной реактогенностью.

Источники информации

1. «Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против паратифа поросят», утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 18 апреля 1985 г.

Паспорт - Salmonella choleraesuis №370 (ФГБНУ «ВГНКИ»)

Паспорт - Salmonella typhimurium №371 (ФГБНУ «ВГНКИ»)

Паспорт - Salmonella abortusovis №372 (ФГБНУ «ВГНКИ»)

Паспорт - Salmonella dublin №373 (ФГБНУ «ВГНКИ»)

2. Субботин В.В., Сидоров М.А. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококков. // Ветеринария, Москва. 1993.

3. Кудрявцев В.В. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококков. //Автореферат дис. канд. ветнаук, Москва. 1993.

4. Патент РФ №2129016 от 20 апреля 1999 г., А61К 39/112 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».

5. Патент РФ №2191598 от 27 октября 2002 г. А61К 39/102 «Вакцина ассоциированная гидроокисьалюминиевая против инфекционных пневмоний свиней бактериальной этиологии и способ ее изготовления».

6. Павленко И.В. и др. Совершенствование технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят //Вестник Казанского технологического университета» - 2013. №8 - С. 226-232.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ изготовления вакцины инактивированной гидроокисьалюминиевой против сальмонеллеза свиней, включающий раздельное культивирование в жидкой питательной среде в ферментерах культур сальмонелл вакцинных штаммов Salmonell choleraesuis №370, Salmonella typhimurium №371, Salmonella abortusovis №372 и Salmonella dublin №373 с последующей инактивацией формальдегидом, адсорбированием на гидроокиси алюминия, декантированием прозрачной надосадочной жидкости и с получением в осадке заданной концентрации микробных тел каждого штамма сальмонелл 15,0-25,0×10⁹ м.т./см³; затем проводят смешивание культур штаммов сальмонелл в вакцине в равных объемах. Изобретение обеспечивает защиту продуктивных животных от заболеваний салмонеллезной этиологии. 1 табл., 5 пр.

Способ изготовления вакцины инактивированной гидроокисьалюминиевой против сальмонеллеза свиней, включающий засев вакцинных штаммов сальмонелл, их раздельное культивирование в жидкой питательной среде в ферментерах с последующей инактивацией культур сальмонелл, отличающийся тем, что вакцина содержит адсорбированную на гидроокиси алюминия бактериальную массу штаммов Salmonell choleraesuis №370, Salmonella typhimurium №371, Salmonella abortusovis №372 и Salmonella dublin №373, смешанных в равных объемах, раздельно культивируемых до исходных концентраций, млрд м.т./см³:

бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 15,0-25,0;

бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 15,0-25,0;

бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 15,0-25,0;

бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 15,0-25,0,

при этом сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -120 - -100 мВ, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO₂ в культуральной жидкости на уровне 20-30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 7,6-7,7 ед., а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой; полученную бактериальную культуру четырех производственных штаммов сальмонелл с измеренной концентрацией бактерий перекачивают в заранее подготовленные четыре реактора или стеклянные баллоны и добавляют при постоянном перемешивании дробно 37%-ный водный раствор формальдегида до его конечной концентрации 0,2-0,3%, доводят рН до 7,1-7,2 ед. добавлением 10%-ного раствора NaOH, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 37-41°С в течение 3-7 сут; после проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см³, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН 7,2±0,1 ед. из расчета 130 см³ на каждый дм³ культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 сут, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 сут, после отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости для получения в осадке заданной концентрации микробных тел каждого штамма сальмонелл 15,0-25,0×10⁹ м.т./см³, затем проводят смешивание культур штаммов сальмонелл в вакцине в равных объемах.