СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОКОНТЕЙНЕРОВ ДЛЯ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2020 года по МПК A61K33/00 A61K9/10 A61K9/14 B82B1/00 B82B3/00 B82Y5/00 

Область техники

Изобретение относится к области фармакологии и медицины. Более конкретно настоящее изобретение относится к биомедицинским применениям наночастиц, конкретнее к методу приготовления и загрузки наночастиц противоопухолевыми препаратами с низкой степенью растворимости в водной среде, такими как салиномицин.

Уровень техники

Из современного уровня развития биологии и медицины хорошо известны технические решения, основанные на применении различных видов наночастиц.

Использование наночастиц в терапии обосновано их способностью перемещаться внутри живых организмов даже по самым тонким капиллярам и проникать в клетки путем эндоцитоза, а также возможностью прикрепления к ним молекул различных веществ и созданием, таким образом, нанокомпозитов «наночастица/биологически активная оболочка» со способностью селективно концентрироваться в требуемом месте организма и притягиваться к тому или иному типу клеток. Такой подход потенциально позволяет существенно снизить побочные эффекты химиотерапии за счет снижения вводимых доз, и, в то же время, повысить концентрацию препарата в необходимой области организма, обеспечивая тем самым существенный терапевтический эффект и положительную исход лечения.

Нановакцины и наночастицы широко используются в противораковой терапии. Исследованы средства, содержащие платину с паклитакселом и альбумином (патент на изобретение RU 2589513) для лечения плоскоклеточной карциномы немелкоклеточного рака легких, а также с таксаном и белок-носителем (патент на изобретение RU 2452482). Широко изучено использование наночастиц в качестве активаторов или сенсибилизаторов гипертермии. Так, известен способ плазмонно-резонансной фототермической терапии опухолей с помощью многократного введения раствора золотых наностержней, покрытых полиэтиленгликолем и облучения инфракрасным лазером (патент на изобретение RU 2614507).

Важной проблемой при лечении рака химиотерапевтическим препаратами является ряд побочных эффектов, связанных с ранним выделением лекарств в организме человека и их воздействием на здоровые клетки. Тем не менее, до сих пор в медицинской практике нет достаточно эффективной замены химиотерапии. Наиболее страдают при этом костныймозг, лимфатическая система, эпителий желудочно-кишечного тракта, кожи, волосяных фолликулов и репродуктивные органы. Поддерживающей терапии посвящена значительная часть процедуры лечения. Одним из возможных путей минимизации влияния противоопухолевых антибиотиков на организм является их направленная доставка до клеток-мишеней в опухоли. Такой метод позволяет предотвратить распространение цитотоксичных веществ в здоровые области организма.

Так, например, проверена возможность использования для лечения и профилактики рака магнитных наночастиц железа и его оксидов при активации высвобождения терапевтически активного вещества переменным магнитным полем (патент на изобретение RU 2490027). Другим способом является сорбция противопухолевых агентов в наночастицах из синтетических полимеров (Luo, М. et al. A STING-activating nanovaccine for cancer immunotherapy. Nat. Nanotechnol. 12, 648-654 (2017)). В изобретении RU 2610170 наночастицы магнетита покрывают гидрофильным полимером, содержащим в своем составе векторный фрагмент из группы растительных лектинов, способный связываться с углеводными фрагментами на мембране раковых клеток, что также дает возможность использовать данные наночастицы для доставки цитотоксичного препарата. В заявке WO 2014178468 как средство направленной доставки предложена противораковая наночастица из порфиринового соединения с лекарственным средством и сывороточным альбумином. Известны также решения, направленные на снижение побочных эффектов противораковой терапии. В частности в заявке WO 2007069272 представлены 27 композиций, способствующих снижению алопеции, с использованием паклитаксела и доцетаксела, их производных и аналогов.

Известно, что многие неорганические наночастицы могут почти беспрепятственно перемещаться в организме, за исключением мозга, ограниченного малопроницаемым гематоэнцефалическим барьером, но существенным недостатком большинства подобных систем доставки является токсичность и способность накапливаться в организме, что влечет за собой дополнительные побочные эффекты (Garnett, М.С. & Kallinteri, Р. Nanomedicines and nanotoxicology: Some physiological principles. Occup.Med. (Chic. Ill). 56, 307-311 (2006)).

Данные недостатки полностью отсутствуют при использовании наночастиц, основанных на химически чистом кремнии, которые при попадании в организм выводятся оттуда в виде ортокремниевой кислоты (Дурнев, А.Д. et al. Исследование генотоксической и тератогенной активности нанокристаллов кремния. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 4, 429-433 (2010)).

Из уровня техники известен патент на изобретение US 5,914,183, в котором описаны слои пористого кремния и раскрыт способ их изготовления с помощью жидкостного электрохимического травления. Известен патент US 6,666,214, а также патенты US 7,186,267 и US 7,332,339, где показано, что некоторые виды кремниевых наноструктур и наночастиц являются биосовместимыми и даже биоактивными. В патенте RU 2504403 описан способ получения водной суспензии биосовместимых пористых кремниевых наночастиц, которые способны проникать в живые клетки, сохраняя свои полезные биологические свойства и люминесценцию. В ряде статей была показана биосовместимость наночастиц кремния, и, как следствие, удобство их применения в биомедицине как фотосенсибилизаторов при фотодинамической терапии рака или в качестве матрицы для лекарственного средства системы доставки (Anenkova, K.А., Petrova, G.P., Osminkina, L.А. & Tamarov, K.P. Biocompatibility of Silicon Nanoparticles as a New Material for Diagnostics and Treatment of Common Diseases. WDS'13 Proc. Contrib. Pap. 3, 180-183 (2013); Mishchenko, T.A. et al. Biocompatibility of Bare Nanoparticles Based on Silicon and Gold for Nervous Cells. KnE Energy Phys. 2018, 232-239 (2018)). Уникальность физико-химических свойств пористого кремния выражается и в отсутствии токсичности материалов на его основе при проверке на клетках (in vitro), органах и тканях (in vivo) (Liu, D., Shahbazi, M., Bimbo, L.M., Hirvonen, J. & Santos, H.A. Biocompatibility of porous silicon for biomedical applications. Porous silicon for biomedical applications (Woodhead Publishing Limited, 2014)).

Все вышесказанное свидетельствует о том, что наночастицы кремния являются биодеградируемым низкотоксичным материалом, перспективным для широкого использования в биомедицине.

Близким аналогом к данному изобретению является заявка на изобретение ЕА 201700214, в которой раскрыт метод получения наночастиц нитрида бора для доставки противоопухолевых препаратов, что также предотвращает возникновение токсичности наноконтейнеров для клеток. Также способом, обеспечивающим низкую токсичность контейнера, является изобретение по патенту RU 2635865 «Способ получения наночастиц полистирольных ионообменников для доставки противоопухолевых препаратов». В патенте описан способ приготовления водного раствора наночастиц, отделение суспензии и добавления к ней ионогенного лекарственного вещества. При этом благодаря повышению активности поглощения клетками наноконтейнеров с противоопухолевым веществом вследствие поверхностных особенностей используемых наночастиц достигается повышение эффективности противоопухолевой терапии. Другим близким аналогом к данному изобретению является патент RU 2625722, предлагающий использование кремнийорганических ниосом с бактерицидными и парамагнитными свойствами для адресной доставки лекарств. Тем не менее, токсические эффекты от высокого содержания серебра в данном препарате препятствуют его использованию в организме. В качестве средства доставки противоопухолевого препарата доксорубицин в патенте RU 2026687 предлагается использовать альфа-фетопротеин, полученный из сыворотки пуповинной крови человека.

Перспективным противоопухолевым препаратом для загрузки наноконтейнеров является полиэфирный ионофорный антибиотик салиномицин. Клинические исследования доказали способность салиномицина эффективно устранять раковые стволовые клетки и индуцировать частичную клиническую регрессию сильно обработанных и устойчивых к терапии раковых заболеваний (Naujokat, С. & Steinhart, R. Salinomycin as a drug for targeting human cancer stem cells. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 44-46 (2012)).

Недавние исследования показали возможность еще более активного уничтожения клеток рака груди производными салиномицина благодаря накоплению и секвестрации железа в лизосомах (Mai, Т.Т. et al. Salinomycin kills cancer stem cells by sequestering iron in lysosomes. Nat. Chem. 9, 1025-1033 (2017)). Преимущество салиномицина заключается в том, что он обладает избирательной токсичностью в отношении опухолевых стволовых клеток, действуя как ингибитор ряда белков, индуцируя апоптоз раковых клеток (Москалева, Е.Ю. & Северин, С.Е. Противоопухолевая активность ионофорного антибиотика салиномицина: мишень - опухолевые стволовые клетки. Молекулярная медицина 6, (2012).). Известен способ загрузки салиномицина в детонационные наноалмазы - углеродные наноструктуры (Коноплянников, А.Г. и др. Комплексы детонационных наноалмазов с ингибиторами раковых стволовых клеток или с паракринными продуктами мезенхимальных стволовых клеток как новые потенциальные лекарственные средства. Кристаллография 60, 831-836 (2015)).

Дополнительно было показано, что добавление к салиномицину наночастиц серебра усиливает апоптоз и аутофагию в клетках рака яичников человека (Zhang, X.-F. & Gurunathan, S. Combination of salinomycin and silver nanoparticles enhances apoptosis and autophagy in human ovarian cancer cells: an effective anticancer therapy. Int. J. Nanomedicine 11, 3655-75 (2016)). Различными группами проводилась загрузка салиномицина в PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот) нановолокна с сохранением высокой противоопухолевой активности (Norouzi, М., Abdali, Z., Liu, S. & Miller, D.W. Salinomycin-loaded Nanofibers for Glioblastoma Therapy. Sci. Rep. 8, 10 (2018); Zhang, Y., Zhang, Q., Sun, J., Liu, H. & Li, Q. The combination therapy of salinomycin and gefitinib using poly (d, l -lactic-co-glycolic acid) - poly (ethylene glycol) nanoparticles for targeting both lung cancer stem cells and cancer cells. Onco. Targets. Ther. 10, 5653-5666 (2017)).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ загрузки салиномицина в детонационные наноалмазы - углеродные наноструктуры (Коноплянников, А.Г. и др. Комплексы детонационных наноалмазов с ингибиторами раковых стволовых клеток или с паракринными продуктами мезенхимальных стволовых клеток как новые потенциальные лекарственные средства. Кристаллография 60, 831-836 (2015). Согласно данному способу комплексы наноалмазов смешивают с водным раствором салиномицина и вводят животным на девятые сутки после перевивки опухоли (карцинома легких Льюис, штамм LLC) однократно внутрибрюшинно 0.2 мл суспензии полученного комплекса или такое же количество салиномицина, суспендированного в воде. Было установлено, что введение комплекса существенно повышает противоопухолевый эффект салиномицина, что объясняется постепенным освобождением данного препарата, связанного с поверхностью наноалмазов. К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие биодеградируемости наноалмазов, что может приводить к нежелательным последствиям при их накоплении в организме, а также отсутствием пористой структуры у таких наноконтейнеров, что ограничивает возможность доставки больших количеств салиномицина и не позволяет контролировать процесс выхода препарата из наноконтейнеров.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание способа получения твердотельных пористых наноконтейнеров на основе наночастиц кремния для доставки и контролируемого выделения противоопухолевых препаратов.

Технический результат достигается за счет получения наночастиц мезопористого кремния с заданными размерами, морфологией и химическим составом покрытия внутренней поверхности пор, позволяющими осуществить их полную загрузку противоопухолевыми препаратами (за счет устойчивого внедрения молекул противоопухолевого препарата в поры наночастиц мезопористого кремния), и его замедленное высвобождение в водной среде, являющееся подтверждением пролонгированного выделения препарата для щадящей химиотерапии рака.

Перечисленные преимущества доказаны проведенными экспериментами как по физико-химическому анализу полученных наноконтейнеров и процессов высвобождения препаратов из них, так и результатами исследований in vivo. Получаемые заявляемым способом наночастицы имеют смешанное оксидно-гидридное покрытие внутренней поверхности пор, что обеспечивает как их гидрофильные свойства, выражающиеся в способности формирования устойчивых водных суспензий, так и высокую эффективность связывания с лекарственными препаратами, имеющими низкую степень растворимости в воде. Указанные суспензии могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение не менее одного месяца.

Оригинальность используемого метода заключается в выборе в качестве исходного материала мезопористого кремния определенной пористости и состава поверхностного покрытия кремниевых наночастиц, последующего их измельчения в шаровой планетарной мельнице, что обеспечивает получение водной суспензии мезопористых наночастиц кремния, которые можно заполнить противоопухолевыми препаратами, в том числе с низкой степенью растворимости в водной среде.

Способ получения водных суспензий мезопористых кремниевых наночастиц для биомедицинских применений включает формирование на поверхности пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм*см пленок мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм, пористостью от 50 до 80% и размером пор от 2 до 10 нм. Формирование пленки производят методом электрохимического травления пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм*см в растворе, содержащем водный раствор плавиковой кислоты с концентрацией 40-50% и этиловый спирт в объемном соотношении от 1:1 до 1:5, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см². После этого полученные пленки мезопористого кремния отделяют от подложки кратковременным воздействием электрического тока от 1 до 5 секунд с увеличением плотности тока до 500-600 мА/см², а отслоенные пленки пористого кремния, промывают в дистиллированной воде в течение от 1 до 2 минут, затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Полученные в результате мезопористые пленки заливают дистиллированной водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергают механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, таких как оксид циркония, нержавеющая сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин. В результате образуется концентрированная водная суспензия наночастиц мезопористого кремния с поперечными размерами от 50 до 100 нм.

Способ получения наноконтейнеров с химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом включает загрузку наноконтейнеров противоопухолевым препаратом путем перемешивания его водной суспензии с полученной суспензией наночастиц мезопористого кремния в массовом соотношении от 1:1 до 10:1 в течение промежутка времени от 1 до 5 часов при комнатной температуре, дальнейшим отделением загруженных наночастиц центрифугированием и промыванием водой или физраствором с последующим высушиванием на воздухе при комнатной температуре или в лиофильной сушке с получением порошкообразной формы препарата.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлено изображение полученных наночастиц в просвечивающем электронном микроскопе. На фиг. 2 представлена картина дифракции электронов в просвечивающем электронном микроскопе на наночастицах мезопористого кремния, подтверждающая наличие пор и кремниевых нанокристаллов в полученных образцах. На фиг. 3 - спектры ИК пропускания слоев наночастиц мезопористого кремния (кривая 1) и пленок, из которых они были получены (кривая 2), свидетельствующие о присутствии на их поверхности как гидридных (кремний-водородных, Si-H_x, х=1, 2, 3), так и оксидных (кремний-кислородных, Si-O) и смешанных осигидридных (O-Si-H_x, х=1, 2, 3) молекулярных групп. Таким образом, фиг. 3 демонстрирует смешанный оксидно-гидридный состав покрытия поверхности пор в полученных наночастицах, что обеспечивает сочетание их гидрофильных свойств, обеспечивающих существование устойчивых водных суспензий наночастиц, и эффективной загрузки противоопухолевыми лекарственными препаратами, в том числе, имеющими низкую степень растворимости в воде. На фиг. 4 представлены временные зависимости количества вышедшего салиномицина из наночастиц мезопористого кремния для образцов 1-3 в воде при 37°С. На фиг. 5 - результаты эксперимента по измерению объема опухоли карциномы Льюиса, привитой лабораторным мышам без какого-либо воздействия (контрольный образец) и после внутриопухолевого введения наночастиц кремния и наночастиц кремния, загруженных салиномицином.

Осуществление изобретения

Способ получения наноконтейнеров для комбинированной терапии рака заключается в приготовлении водной суспензии наночастиц мезопористого кремния с заданными размерами, морфологией и химическим составом покрытия внутренней поверхности пор, с последующей их загрузкой лекарственным препаратом путем перемешивания их смеси в водной среде при определенном соотношении по массе препарата и наночастиц с последующим отделением нерастворимой фракции, промывки водой получившихся заполненных препаратом наноконтейнеров и их последующего высушивания. Результатом являются порошки наноконтейнеров, загруженных противоопухолевым препаратом, обладающих свойством постепенного высвобождения при помещении в водную среду или организм человека.

В настоящем изобретении предлагается использовать метод загрузки наночастиц плохо водорастворимыми препаратами, например, такими как салиномицин. Раствор лекарства с наночастицами оптимальной концентрации в течение 1 часа при комнатной температуре интенсивно перемешивают, например, на шейкере Eppendorf, далее центрифугируют в течение 3 минут в режиме 5000 об/мин, после чего три раза промывают осадок деионизованной водой. Анализ концентрации салиномицина в получаемых наноконтейнерах можно проводить по интенсивности полос инфракрасного поглощения света, а именно полос 1703 см^-1, 1554 см^-1, 1456 см^-1, 1040 см^-1 (Преч, Э., Бюльман, Ф., Аффольтер, К. Определение строения органических соединений. Издательство 'Мир', 2006). Учитывая, что полоса 1040 см^-1 может перекрываться с полосами поглощения кремниевых наночастиц, целесообразно для определения содержания салиномицина использовать полосу 1456 см^-1 как узкую и интенсивную, с контролем по полосе 1554 см^-1 (может быть чувствительна к рН). Допустим также контроль по полосе 1703 см^-1 при условии высокого качества регистрации спектров (чувствительна к ошибкам вычитания спектра фонового раствора).

По итогам проведенного нами исследования установлено, что изменяя соотношения масс кремния с противоопухолевым препаратом, можно получать различные степени загрузки салиномицина в наноконтейнерах (Таблица 1). Особенность заявляемого способа применения наночастиц мезопористого кремния в качестве наноконтейнеров заключается в использовании в качестве исходного материала пленок кремния с высокой пористостью не менее 50%, которые можно измельчать в воде при помощи механического измельчения помолом в шаровой мельнице, что сохраняло нанокристаллическую структуру и пористость наночастиц и определяло состав их поверхностного покрытия. Такие наночастицы существуют в виде водных суспензий, безопасных для введения в живые системы.

Предлагаемый метод изготовления наночастиц мезопористого кремния позволяет получать водные суспензии с размерами наночастиц от 50 до 100 нм и концентрации до 10 мг/мл. При этом получаемые заявляемым способом наночастицы имеют смешанное оксидно-гидридное покрытие внутренней поверхности пор, что обеспечивает как их гидрофильные свойства, выражающиеся в способности формирования устойчивых водных суспензий, так и высокую эффективность связывания с лекарственными препаратами, имеющими низкую степень растворимости в воде. Указанные суспензии могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение не менее одного месяца. При этом размеры наночастиц существенно не изменяются. Наночастицы в виде суспензий могут быть введены в культуры клеток и биологические системы, а именно в кровь, соединительные и мышечные ткани для использования их в качестве диагностического и терапевтического средства.

Данные суспензии мезопористых кремниевых наночастиц, заполненных лекарственным препаратом, таким как, салиномицин, доксорубицин или другими противоопухолевым лекарством, предназначены для введения в биологические системы, а именно, культуры клеток, ткани и кровеносную систему, для последующей активации с помощью света, ультразвука и других физических воздействий для достижения необходимого терапевтического эффекта.

Примеры получения наноконтейнеров

Наноконтейнеры получали следующим образом. Вначале были получены слои мезопористого кремния методом электрохимического травления пластин кристаллического кремния (c-Si) p-типа проводимости с ориентацией поверхности (100) и удельным сопротивлением 10 мОм*см в растворе плавиковой кислоты и этилового спирта (HF(50%):C2H5OH) при плотности тока травления от 50-60 мА/см² в течение 40-60 мин. Это позволяло сформировать на подложке c-Si пленки так называемого мезопористого кремния с пористостью 50-60% и толщиной слоя до 100 мкм. При этом, большее время травления обеспечивало большую толщину слоя. После получения пористого слоя, полученные пленки пористого кремния отслаиваются от подложки кратковременным от 1 до 5 секунд увеличением плотности тока до 500-600 мА/см², а отслоенные пленки промывали в дистиллированной воде в течение 1-2 минут и затем высушивали на воздухе при комнатной температуре. Полученные в результате пористые пленки заливали дистиллированной водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергали механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, таких как оксид циркония, нержавеющая сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин. В результате образуется концентрированная водная суспензия наночастиц пористого кремния с размером пор в диапазоне от 2 до 10 нм, пористостью от 50 до 60% и поперечными размерами наночастиц от 50 до 100 нм (см. фиг. 1). Картины дифракции электронов в виде концентрических окружностей в сочетании с наборами ориентированных по углу рефлексов (см. фиг. 2), полученные в просвечивающем электронном микроскопе для данных наночастиц, указывают на их нанокристаллическое строение.

Используя метод инфракрасной (ИК) спектроскопии с обратным Фурье преобразованием был проведен анализ химического состава покрытия поверхности пор в получившихся наночастицах. Использованная процедура их формирования обеспечивала кислородно-водородное (оксигидридное) покрытие поверхности пор, как проиллюстрировано на ИК-спектрах на фиг. 3.

Содержания салиномицина в водном растворе и в полученных наноконтейнерах находилось из соотношения полос ИК-поглощения данного вещества. ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре Фурье Tensor 27 «Bruker» (Германия), оснащенного МСТ-детектором, охлаждаемым жидким азотом, с термостатом фирмы «Huber» (США). Измерения проводили в термостатируемой ячейке НПВО, (BioATR-II, «Bruker», Германия) с использованием кристалла однократного отражения ZnSe, при 22С и постоянной скорости продувки системы сухим воздухом аппаратом «Jun-Air» (Германия). На кристалл ячейки НПВО наносили аликвоту (30 мкл) образца, спектр регистрировали трижды в интервале от 3000 до 950 см^-1, с разрешением 1 см^-1; производили 70-кратное сканирование и усреднение. Фоновый раствор регистрировали аналогичным образом. Спектры анализировали с помощью программы Opus 7.5.

Далее производилась загрузка салиномицина в мезопористые частицы кремния в воде. Была оценена степень включения салиномицина и определено необходимое число промывок. Исследовались водная суспензия салиномицина (Sal) 10 мг/мл (порошок в стеклянной ампуле) и водная суспензия мезопористых наночастиц кремния (mPSi) с исходной концентрацией 10 мг/мл, размерами наночастиц от 50 до 100 нм, размерами пор 2-5 нм.

Исследовались суспензии с различным соотношением масс пористого кремния к салиномицину: 1:1, 1:2 и 2:1, обозначаемые условно образцами 1, 2 и 3 соответственно (Табл. 2). Образцы помещали на 1 час при температуре 22°С на шейкер Eppendorf, после чего центрифугировали на мини-центрифуге Eppendorf и трижды промывали осадок деионизованной водой. Условия центрифугирования: 3 минуты, 5000 rpm. Для трех образцов, полученных с различными концентрациями салиномицина и мезопористого кремния регистрировали ИК-спектры, которые сравнивались с контрольными спектрами салиномицина. На всех зарегистрированных спектрах подтверждалось наличие салиномицина в порах кремния. Расчеты эффективности включения салиномицина в поры кремния приведены в Табл. 2.

При недостатке салиномицина (образец 3) эффективного включения не наблюдается, 1 мг кремния несет на себе 0,14 мг лекарства. Напротив, при двукратном массовом избытке салиномицина (образец 2) наблюдается высокая степень включения: 1 мг кремния несет такую же массу салиномицина.

Был проведен эксперимент по высвобождению салиномицина при температуре 37°С в течение 6 часов в воде по следующей методике. Результаты показаны на Фиг. 3 Наночастицы, очищенные трехкратной промывкой, ресуспендировали в воде (150 мкл), после чего отбирали пробы по 50 мкл, центрифугировали их и отделяли супернатант, который содержал высвободившийся салиномицин. Регистрировали ИК-спектр супернатанта, определяли по интенсивности полосы поглощения 1553 см^-1 количество высвободившегося салиномицина. Результаты приведены на Фиг..

Образец 3, полученный в недостатке салиномицина, в течение часа высвобождает все содержимое, что указывает на поверхностное расположение салиномицина в порах. Образец 1 характеризуется практически линейным высвобождением препарата на заданном временном интервале до 3 ч. Можно предположить, что все молекулы салиномицина находятся в одинаковом положении в порах кремния, образуя монослой, который при помещении в водную среду медленно десорбируется с поверхности наночастиц.

Ход кривой для образца 2 можно разделить на два линейных участка: 0-60 минут и 60-360 мин., что указывает на присутствие не менее двух популяций молекул салиномицина - приповерхностных и упакованных глубоко в поры. Косвенно на данный факт указывает совпадение «времени перехода» - 60 минут с временем полного высвобождения салиномицина из образца 3 (все молекулы - приповерхностные).

Пример применения наноконтейнеров для противоопухолевой терапии

В экспериментах использовали линейных мышей (С57В1/6), которым перевивали трансплантируемую опухоль - карциному легких Льюис (LLC). Трансплантацию солидной опухоли LLC производили гомогенатом опухолевой ткани в стерильном растворе среды 199. Животных-доноров выводили из эксперимента, вырезали кусочки опухоли без некротических участков и измельчали. Полученную массу опухоли разводили средой 199 и вводили мышам внутримышечно в 0,2-0,4 мл среды 199 для культивирования клеток.

В экспериментах in vivo клетки карциномы легкого Льюис (LLC) трансплантировали внутримышечно в левую заднюю лапу самцов мышей линии C₅₇Bl/6. В каждой группе было по 10-15 животных. На 15 день роста опухоли проводилось внутриопухолевое введение препаратов суспензий наноконтейнеров и раствора салиномицина, а в случае контрольных групп - физраствора.

Перед введением наноконтейнеры на основе наночастиц мезопористого кремния, заполненных салиномицином в весовом соотношении 1:1, разводили в физрастворе (0,9% NaCl в воде) до концентрации 2,5 мг/мл и вводили втутриопухолево в объеме 0,2 мл однократно. Для сравнения также вводили раствор салиномицина в той же дозе. Измерения размеров опухолей проводились на 13 и 24 сутки после введения препарата.

Результаты (фиг. 5) показали двукратное торможение роста опухоли на 13 сутки в случае введения суспензии заполненных салиномицином наночастиц, в то время как при введении чистого салиномицина размеры опухоли были близки к контролю. На 24 сутки после введения препарата эффект торможения роста опухолди по сравнению с контрольной группой и группой с введением только салиномицина сохранялся. Этот пример показывает усиление действия салиномицина при его капсулировании в наноконтейнерах на основе мезопористого кремния по сравнению с салиномицином без наноконтейнеров.

Изобретение относится к способу получения наноконтейнеров для химиотерапевтических противоопухолевых препаратов, заключающемуся в получении наночастиц мезопористого кремния путем электрохимического травления пластин кристаллического кремния с дальнейшим механическим измельчением полученных пористых слоев, при этом используют пластины кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм⋅см, электрохимическое травление пластин осуществляют с формированием на ее поверхности пленки мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм и пористостью от 50 до 80%, для чего электрохимическое травление пластины осуществляют в растворе, содержащем водный раствор плавиковой кислоты с объемной концентрацией 40-50% и этиловый спирт в соотношении от 1:1 до 1:5 по объему, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см², после чего полученные пленки мезопористого кремния отделяют от пластины, промывают в дистиллированной воде, высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем заливают водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергают механическому измельчению в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, включая оксид циркония, нержавеющую сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин до получения концентрированной водной суспензии наночастиц мезопористого кремния с поперечными размерами от 50 до 100 нм и размером пор от 2 до 10 нм. Изобретение также относится к способу получения наноконтейнеров с химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом для комбинированной терапии рака. Технический результат: предложенным способом получают наночастицы мезопористого кремния с заданными размерами, морфологией и химическим составом покрытия внутренней поверхности пор, позволяющие осуществить их полную загрузку противоопухолевыми препаратами, с замедленным высвобождением в водной среде. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

1. Способ получения наноконтейнеров для химиотерапевтических противоопухолевых препаратов, включающий получение наночастиц мезопористого кремния путем электрохимического травления пластин кристаллического кремния с дальнейшим механическим измельчением полученных пористых слоев, при этом используют пластины кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм⋅см, электрохимическое травление пластин осуществляют с формированием на ее поверхности пленки мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм и пористостью от 50 до 80%, для чего электрохимическое травление пластины осуществляют в растворе, содержащем водный раствор плавиковой кислоты с объемной концентрацией 40-50% и этиловый спирт в соотношении от 1:1 до 1:5 по объему, в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см², после чего полученные пленки мезопористого кремния отделяют от пластины, промывают в дистиллированной воде, высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем заливают водой в соотношении от 1:2 до 1:3 по массе и подвергают механическому измельчению в шаровой планетарной мельнице с использованием шаров с диаметром от 1 до 5 мм из твердых материалов, включая оксид циркония, нержавеющую сталь, карбид вольфрама, и аналогичных размольных стаканов, в течение времени от 15 до 30 мин при частотах вращения от 900 до 1100 об/мин до получения концентрированной водной суспензии наночастиц мезопористого кремния с поперечными размерами от 50 до 100 нм и размером пор от 2 до 10 нм.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что пленки пористого кремния отделяют от пластины кратковременным от 1 до 5 секунд воздействием электрического тока с плотностью тока до 500-600 мА/см².

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что пленки пористого кремния промывают в дистиллированной воде в течение от 1 до 2 минут.

4. Способ получения наноконтейнеров с химиотерапевтическим противоопухолевым препаратом для комбинированной терапии рака, включающий загрузку наноконтейнеров, полученных способом по п. 1, противоопухолевым препаратом путем перемешивания его водной суспензии с полученной суспензией наночастиц мезопористого кремния в массовых долях от 1:1 до 10:1 в течение промежутка времени от 1 до 5 часов при комнатной температуре, дальнейшим отделением загруженных наночастиц центрифугированием и промыванием водой или физраствором с последующим высушиванием на воздухе при комнатной температуре или в лиофильной сушке с получением порошкообразной формы препарата.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве химиотерапевтического противоопухолевого препарата используют салиномицин при соотношении массы салиномицина к массе пористого кремния, находящегося в растворе, 2:1, перемешивание водных суспензий осуществляют в течение 1 часа при температуре 22°С на шейкере, центрифугирование - в течение 3 минут в режиме 5000 об/мин, с последующим трехкратным промыванием осадка деионизованной водой.