Способ получения фармацевтически подходящих лекарственных форм и их применение в комбинированной химиотерапии и фотодинамической терапии злокачественных новообразований Российский патент 2024 года по МПК A61K9/51 A61K45/06 A61P35/00 B82B3/00 

Изобретение относится к наномедицине, а именно к лекарственным формам в виде наночастиц, способу синтеза таких наночастиц, и их использованию в области терапии злокачественных образований, а именно адресной доставки терапевтических агентов релевантных для целей химиотерапии и фотодинамической терапии у млекопитающих с использованием указанных наночастиц.

Злокачественные новообразования (далее – ЗНО) являются одной из ведущих причин смерти в мире, которая, по данным на 2020 год, унесла более 10 млн жизней, что делает их социально значимыми заболеваниями [Global Cancer Observatory: Cancer Today/ Ferlay J, Ervik M, Lam F, Colombet M, Mery L, Piñeros M. // International Agency for Research on Cancer. – 2020]. Оптимизация существующих протоколов лечения, а также использование персонализированного подхода к назначению терапии пациентам с ЗНО являются одними из приоритетных направлений в здравоохранении.

Персонализированный подход подразумевает использование специфичных, адресных препаратов с учетом индивидуальных характеристик пациента, что позволяет адаптировать лечение под конкретного пациента, обеспечивая наилучшую эффективность терапии и снижая риски возникновения побочных эффектов. Это особенно актуально при применении комбинированного метода лечения ЗНО с помощью фотодинамической терапии (далее – ФДТ) и химиотерапии.

Разработка новых лекарственных форм направленной доставки химиопрепаратов и фотосенсибилизаторов для комбинированной терапии позволит существенно повысить эффективность лечения ЗНО и улучшить качество жизни пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями [Cell-based drug delivery and use of nano-and microcarriers for cell functionalization / A.S. Timin, M.M. Litvak, D.A. Gorin, E.N. Atochina-Vasserman, D.N. Atochin, G.B. Sukhorukov // Advanced healthcare materials. – 2017. – URL: 10.1002/adhm.201700818].

Таким образом, в области лечения онкологических заболеваний существует потребность в разработке инновационных подходов создания новых лекарственных форм для повышения эффективности терапии ЗНО. Научные достижения последних лет позволили открыть новые возможности в области исследования человеческого организма. Так, развитие нанотехнологий и возникновение наномедицины как области естественных наук позволило расширить возможности терапии онкологических заболеваний путем воздействия на организм на клеточном и субклеточном уровнях.

Одним из наиболее перспективных подходов к диагностике и терапии ЗНО является использование наночастиц в качестве основных носителей лекарственных препаратов и их комбинаций. [Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis / I. Brigger, C. Dubernet, P. Couvreur // Advanced drug delivery reviews. – 2012. – Vol. 64. – P. 24-36. – URL: https://doi.org/10.1016/j.addr.2012.09.006].

При исследовании наночастиц и их взаимодействия с биологическими объектами становится ясна необходимость модификации систем наночастиц в сторону уменьшения их размеров. По сравнению с крупными частицами, наноразмерные системы (100 нм и ниже) обладают такими важными для терапии онкологических заболеваний свойствами, как свободное перемещение по кровотоку, склонности к аккумуляции в местах активного кровоснабжения (чем обычно являются солидные образования) и эффективный клеточный захват [Triantafyllos stylianopoulos / EPR-effect: utilizing size-dependent nanoparticle delivery to solid tumors // Therapeutic delivery. – Vol. 4, № 4. – 2013. – URL: https://doi.org/10.4155/tde.13.8].

Таким образом, необходимо создать стабильные нетоксичные и эффективные наноразмерные системы, среди которых за счет своих высоких адсорбционных свойств, удерживающей способности, а также возможностью безопасного вывода из организма, может быть представлен наноразмерный карбонат кальция. Однако синтез таких структур зачастую сложен в силу необходимости создания нетипичных условий для роста и стабилизации таких наночастиц. Существуют основные требования, предъявляемым к созданию наноструктурированных носителей лекарственных препаратов:

1. Высокая воспроизводимость синтеза и экономичность (возможность получения больших количеств раствора с высокой концентрацией наночастиц с использованием низкозатратной технологии);

2. Получение носителей с размером частиц < 100 нм и узким распределением частиц по размерам (не более 20-30% от среднего размера частиц);

3. Высокая стабильность получаемых носителей в биологических средах;

4. Высокая адсорбционная емкость;

5. Биосовместимость и биодеградируемость;

6. Оптимальные фармакокинетические характеристики;

7. Высокая тропность к опухоли.

Патент [CN №109481696, опубл. 22.12.2018] охраняет технологию синтеза наночастиц, эффективных для фотодинамической терапии и химиотерапии размером от 40 до 120 нм. Эти частицы, так же, как и заявляемые наноразмерные носители, могут стабильно участвовать во внутренней циркуляции живого организма, оказывать прицельное действие на раковые ткани, облегчать транспортировку лекарств и лечение рака. Однако, синтез данных частиц многоступенчатый и длительный, порядка 12 часов. При синтезе используется большое количество сложных химических соединений. Сначала синтезируют супрамолекулярные каркасы, необходимые для наночастиц, и затем вводят реагенты mPEG-b-PEBP и RGD-PEG-b-PEBP для образования наночастиц вместе с надмолекулярными каркасами, которые содержат производные тетрапиридилпорфирина или производные тетрапиридина металлопорфирина и рецепторы Pt (II).

Патент [CN №109966513, опубл. 28.12.2017] охраняет технологию синтеза многофункциональных микропузырьков, эффективных для фотодинамической терапии/химиотерапии. Мембранные компоненты включают липиды, содержащие функциональные группы фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии и амфифильные лекарственные конъюгаты и обычные фосфолипиды для химиотерапии.

Соотношение фотосенсибилизирующих препаратов и химиотерапевтических препаратов регулируется по мере необходимости. Под действием ультразвука многофункциональные микропузырьки могут осуществлять направленный взрыв с фиксированной точкой на участках опухоли для преобразования в наночастицы, значительно улучшают накопление и поглощение лекарств в участках опухоли, а также эффективно улучшают фотодинамический/химиотерапевтический комбинированный эффект ингибирования роста опухоли.

Однако, в отличии от заявляемых наночастиц щелочноземельных металлов с органическими стабилизаторами, липидные молекулы имеют высокую стоимость и, следовательно, делают синтез экономически нерентабельным. При этом, в отличии от предлагаемого носителя, размер микропузырьков составляет 200 нм – 8 мкм, что не соответствует требованиям по размеру частиц 100 нм и менее для эффективной циркуляции внутри организма. [Enhanced primary tumor penetration facilitates nanoparticle draining into lymph nodes after systemic injection for tumor metastasis inhibition / J. Liu, H.-J. Li, Y.-L. Luo, C.-F. Xu, X.-J. Du, J.-Z. Du, J. Wang // ACS Nano. – 2019. – URL: https://doi.org/10.1021/acsnano.9b03472].

Патент [EP №3206987, опубл. 14.10.2005] охраняет технологию синтеза металлоорганических каркасов (далее – МОК), содержащих фотосенсибилизаторы и включающие фрагменты, способные поглощать рентгеновские лучи и применяться в фотодинамической терапии, индуцированной рентгеновским излучением, либо с одновременным введением, либо без совместного введения одного или нескольких иммунотерапевтических агентов и/или одного или нескольких химиотерапевтических агентов. Однако, в отличие от заявленных наночастиц, данные структуры имеют форму эллипсоида размером 10 на 100 нм, что негативно влияет на гидродинамику частиц в организме, при этом площадь поверхности для адсорбции лекарственных веществ приблизительно в 3 раза меньше (~ 11 000 нм²), чем предлагаемые частицы сферического размера в среднем 100 нм (~ 32 000 нм²).

Патент [EP №1675570, опубл. 26.01.2004] охраняет технологию синтеза керамических наночастиц, в которые заключено светочувствительное лекарство/краситель. Полученные наночастицы, легированные лекарственным средством, так же, как и заявленные наночастицы, имеют сферическую форму, высокую монодисперсность и стабильность в водной системе. Облучение светом подходящей длины волны фотосенсибилизирующего препарата, заключенного внутри наночастиц, приводило к генерации синглетного кислорода, который мог диффундировать наружу через поры керамической матрицы. Наполненные лекарственным средством керамические наночастицы можно использовать в качестве носителей лекарственного средства для фотодинамической терапии.

Керамические наночастицы получают путем формирования мицеллярной композиции красителя, и керамические наночастицы осаждают щелочным гидролизом. Осажденные наночастицы, в которые захвачен светочувствительный краситель/лекарство, могут быть выделены диализом. Однако, в отличии от заявленных наночастиц, синтез данных частиц многоступенчатый и включает в себя этапы: приготовление мицелл, улавливающих светочувствительные препараты; добавление алкоксиорганосилана к мицеллам с образованием комплексов кремнезема и мицелл; подвергание комплексов кремнезема и мицелл щелочному гидролизу для осаждения наночастиц кремнезема, в которых заключены молекулы светочувствительного лекарственного средства; и выделение осажденных наночастиц диализом.

Патент [CN №107899013, опубл. 17.10.2017] охраняет способ получения наноносителей для фотодинамической терапии, который описывает получение системы доставки лекарств с эффектом переключения фотодинамической терапии и эффектом молекулярного распознавания на основе мезопористых нанометровых частиц диоксида марганца.

Способ приготовления наночастиц включает в себя растворение додецилбензолсульфоната натрия и KMnO₄ в сверхчистой воде, добавление раствора азотной кислоты, проведение центрифугирования, сушку и прокаливание осадка с получением мезопористых наночастиц MnO₂, взвешивание метанольного раствора монометилового эфира гематопорфирина, добавление метанольного раствора мезопористых наночастиц MnO2 и последовательное проведение равномерного перемешивания, ультразвуковой обработки и центрифугирования с получением мезопористых наночастиц MnO₂, загруженных фотосенсибилизатором монометиловым эфиром гематопорфирина, взвешивание одноцепочечной ДНК 5'-HS-TTTCCCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGG и получение шпилечных аптамеров нуклеиновых кислот; и добавление аптамеров в мезопористые наночастицы MnO₂, загруженные фотосенсибилизатором монометиловым эфиром гематопорфирина, для реакции, позволяющей иммобилизовать как можно больше аптамеров на поверхности мезопористых наночастиц MnO₂, загруженных фотосенсибилизатором монометиловым эфиром гематопорфирина. В отличии от предлагаемых носителей способ получения таких наночастиц многоступенчатый, а размер частиц порядка 200 нм.

Среди основных проблем синтеза предлагаемых наноносителей на основе неорганических соединений щелочноземельных металлов и их анионов является созревание по Оствальду [Controlling nucleation and growth of nano-CaCO₃ via CO₂ sequestration by a calcium alkoxide solution to produce nanocomposites for drug delivery applications / N.G. M. Palmqvist, J.-M. Nedelec, G. A. Seisenbaeva, V. G. Kessler // Acta Biomaterialia. – 2017. – Vol. 57. – P. 426-434. – URL:https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.05.006].

Этот процесс связан с растворением мельчайших частиц с наибольшей поверхностной энергией и переносом массы на более крупные, что приводит к полидисперсности и увеличению размера частиц. Таким образом, это процесс, который необходимо предотвратить, чтобы сохранить размер частиц как можно меньшим и однородным. Для этой цели важно снизить растворимость образующей зародыш соли или подвижность составляющих ее ионов. Это может быть достигнуто множеством способов: охлаждением среды раствора, добавлением ионов-наблюдателей, добавлением поверхностно-активного вещества или биомолекулярной матрицы.

Для получения наночастиц карбоната кальция чаще всего используется процесс карбонизации, осуществляемый в реакторах при подаче газообразных продуктов реакции при поддержании постоянной температуры, постоянного перемешивания, равномерной подачи газа и определенных размеров барботирующих сопел [Formation of CaCO₃ nanoparticles in the presence of terpineol / L. Xiang, Y. Xiang, Y. Wen, F. Wei // Materials Letters. – 2004. – Vol. 58, № 6. – P. 959-965. – URL: 10.1016/j.matlet.2003.07.034], что является усложнением процесса.

Однако после проведения реакции карбонизации выход конечного продукта не является 100% и, следовательно, остается большое количество органических и неорганических непрореагировавших ионов, при попадании которых в другие среды, может образовываться фаза микрометровых частиц, так как микрометровые аллотропные модификации карбоната кальция являются более стабильными в растворах, нежели нанометровые. Также в статье не сказано о стабильности частиц и разрушении их в различных средах, так как это критично для понимания свойств и применения наночастиц. Также не была исследована токсичность частиц и органического стабилизатора терпинеола, в отличие от токсичности предлагаемых носителей, которая составляет не более 10 % на 100 000 клеток при добавлении 3 мг частиц.

В работе [Synthesis of hydrophobic CaCO₃ nanoparticles / C. Wang, Y. Sheng, X. Zhao, Y. Pan, Hari-Bala, Z. Wang // Materials letters. – 2006. – Vol. 60, № 6, – P. 854-857. – URL: 10.1016/j.matlet.2005.10.035] осуществлялся синтез гидрофобных наночастиц CaCO₃ методом карбонизации, имитируя биоминерализацию. В данной работе раствор C₁₇H₃₅COONa, синтезированный C₁₇H₃₅COOH и NaOH, использовался в качестве органического субстрата и среды для выращивания CaCO₃. Среди недостатков данного синтеза перед предполагаемыми носителями является то, что полученный размер частиц слишком мал (порядка 10 нм, отношение диаметра к длине около 1:4), а также вытянутая форма не является эффективной для инкапсуляции и биораспределения в виду невозможности эффективно инкапсулировать лекарственный препарат из-за малой адсорбционной емкости таких частиц.

Также синтез наночастиц карбоната кальция методом золь-гель предлагается в работе [Controlling nucleation and growth of nano-CaCO3 via CO2 sequestration by a calcium alkoxide solution to produce nanocomposites for drug delivery application / N.G. Martin Palmqvist, J.-M. Nedelec, G.A. Seisenbaeva, V.G. Kessler // Acta biomaterialia. – 2017. – Vol. 57. – P. 426-434. – URL: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.05.006]. Твердый кальций оставляли для реакции при низкой температуре нагревания (около 40 °C) с сухим этанолом в течение 24 часов в атмосфере сухого азота. Когда металлический Са прореагировал с образованием оксида кальция, раствор удаляли декантацией с остаточных комков окисленного кальция. Гомогенный раствор приводили в контакт с окружающей атмосферой и через него барботировали диоксид углерода. В течение всего процесса контролировали рН. Таким образом, можно было получить очень маленькие и довольно однородные по размеру однофазные наночастицы кальцита CaCO₃. Однако, частицы образуют крупные агрегаты размером 400–800 нм при высушивании и последующем переносе в водную среду. При этом данный метод является долгим и требует поддержания необходимых условий в течение 24 часов.

В работе китайских ученых [N.G. Martin Palmqvist, J.-M. Nedelec, G. A. Seisenbaeva, V. G. Kessler / Controlling nucleation and growth of nano-CaCO₃ via CO₂ sequestration by a calcium alkoxide solution to produce nanocomposites for drug delivery applications // Acta biomaterialia. – 2017. – Vol. 57. – P. 426-434. – URL: https://doi.org/10.1002/adfm.201808146] раскрывается синтез наночастиц аморфного CaCO₃ с использованием полиакриловой кислоты (далее - ПАК) в качестве стабилизатора. Упомянутая методика основывается на поэтапном смешивании солей хлорида кальция (0,1М), карбоната натрия (0,1М) и ПАК (0,1М) в водных растворителях. Наночастицы охарактеризован как «сфероподобные» частицы аморфного карбоната кальция с размерами в диапазоне от 48 до 62 нм. Однако от заявленных наночастиц они отличаются тем, что не являются стабильными в средах с различной кислотностью, а также ограниченностью в выборе загружаемого терапевтического агента.

Наиболее близким из уровня техники выбрана патентная заявка [KR № 10-2022-0154395, опубл. 13.05.2021], в которой раскрыта методика получения наночастиц на основе карбоната кальция (CaCO₃) с добавкой полиакриловой кислоты в качестве стабилизатора размера частиц. Описанная выше методика получения таких носителей является наиболее близкой к настоящему изобретению по совокупности существенных признаков: наночастицы получены с применением солей неорганических соединений щелочноземельных металлов; наночастицы получены с применением полиакриловой кислоты в качестве стабилизатора; наночастицы имеют размер в нанометровой области (10-150 нм); наночастицы получены в присутствии терапевтического агента. При этом имеется ряд отличий от заявляемого изобретения:

1. Данная методика синтеза требует многостадийного процесса (4-5 стадий синтеза);

2. Данная методика предполагает синтез носителей в условиях повышенной температуры (100°С и более) и пониженной температуры (4°С), что делает невозможным загрузку многих биологически активных веществ, в том числе релевантных для ФДТ;

3. Полученный материал стабилен при постоянных условиях комнатной температуры и влажности на протяжении нескольких месяцев, однако стабильность при различных кислотностях среды не была доказана;

4. Эффективности инкапсуляции биологически активного компонента не превышает 80%.

Таким образом, существует задача получения наноструктурированных лекарственных форм для доставки терапевтических агентов, создания новых или оптимизации существующих способов получения наноструктурированных лекарственных форм, подходящих для использования в комбинированной ФДТ.

Сущность заявляемого изобретения заключается в получении наночастиц, характеризующихся сферической формой, пористой поверхностью и возможностью контроля размера в диапазоне от 20 до 500 нм.

Изобретение представляет собой наноструктурированные лекарственные формы, способ их получения, который позволяет эффективно включать в их структуру широкий спектр терапевтических химиопрепаратов, фотосенсибилизаторов и их комбинацию для использования в комбинированной химиотерапии и ФДТ ЗНО.

Способ, представленный в настоящем изобретении, позволяет получить наноразмерные носители химиопрепаратов и фотосенсибилизаторов, обладающих рядом преимуществ, недостижимых посредством применения существующих технических решений:

1. Возможность получения суспензии наночастиц с высокой их концентрацией с использованием низкозатратной технологии;

2. Методика синтеза наноразмерных носителей одностадийная и занимает малое количество времени (около 2х часов);

3. Возможность включения широкого спектра химиопрепаратов и фотосенсибилизаторов;

4. Повышенная по сравнению с ближайшим аналогом адсорбционная емкость включения терапевтического соединения;

5. Повышенная агрегативная устойчивость в биологических средах;

6. Оптимальные фармакокинетические параметры и физико-химические характеристики, что позволяет обеспечить локальное воздействие на опухолевую ткань;

7. Размерные характеристики получаемых носителей обеспечивают их захват и удержание опухолевыми клетками, что увеличивает эффективность терапии ЗНО;

8. Полученные носители показывают высокую противоопухолевую активность по отношению к раку шейки матки, меланомы, раку молочной железы и колоректальному раку.

Технический результат заключается в расширении арсенала существующих подходов к созданию стабильных нетоксичных и эффективных лекарственных форм, с высокими адсорбционными свойствами, удерживающей способностью, а также возможностью безопасного выхода из организма, а именно решает задачу создания наноразмерных носителей, состоящих из соединений щелочноземельных металлов, пригодных для доставки в очаг интереса (опухолевую ткань) для комбинированной ФДТ и химиотерапии ЗНО.

Технический результат состоит в получении лекарственной формы, состоящей из наночастиц с размером в диапазоне от 20 до 500 нм для реализации комбинированной ФДТ ЗНО, с возможностью получения суспензии наночастиц, с высокой концентрацией и использованием низкозатратной технологии, одностадийной методикой синтеза наноразмерных носителей, которая занимает малое количество времени (около 2х часов), с возможностью включения широкого спектра химиопрепаратов и фотосенсибилизаторов, повышенной по сравнению с ближайшим аналогом адсорбционной емкостью включения терапевтического соединения, повышенной агрегативной устойчивостью в биологических средах, оптимальными фармакокинетическими параметрами и физико-химическими характеристиками, что позволяет обеспечить локальное воздействие на опухолевую ткань.

Исследования показали, что лекарственные формы, представляющие собой наноструктурированные носители, имеют оптимальные с точки зрения медицинского применения размеры (< 100 нм), имеют высокую адсорбционную емкость, обладают хорошей диспергируемостью и стабильностью в водных растворах, биологической инертностью и биодеградируемостью.

Такие носители обладают лучшими фармакокинетическими свойствами в основных органных системах организма и внутри солидных ЗНО в сравнении с уступающими по характеристикам коммерчески доступными аналогами и могут быть применены в терапии ЗНО.

Полученные в рамках заявляемого продукта частицы могут быть использованы для реализации комбинированной ФДТ ЗНО, обеспечивая возможность доставки в очаг заболевания химиопрепараты и фотосенсибилизирующие агенты с последующим развитием в опухоли фотохимической реакции, разрушающей опухолевые клетки. ФДТ является неинвазивным высокоэффективным методом лечения ЗНО, который отличается точностью локализации и, следовательно, минимальным воздействием на здоровые ткани организма.

Использование заявленного изобретения в качестве носителя терапевтических соединений позволяет сконцентрировать весь терапевтический потенциал непосредственно внутри образования, что приводит к максимальному эффекту терапии при минимальном воздействии на окружающие здоровые ткани.

Существует несколько клинически релевантных примеров:

1) Рак желудка. Статистические данные по ЗНО желудка показали, что более половины пациентов являются людьми пожилого возраста, которым противопоказаны какие-либо оперативные вмешательства. Вследствие этого использование заявленного изобретения является альтернативой хирургическому лечению, позволяя ввести и удержать терапевтические агенты в очаге заболевания.

2) Карцинома шейки матки. Терапия ЗНО шейки матки в большинстве случаев включает в себя комбинацию ФДТ и химиотерапии. Для облегчения процесса лечения без снижения эффективности лечения предлагается использование заявленного изобретения при реализации ФДТ.

3) Рак мочевого пузыря. При терапии поверхностного рака мочевого пузыря важнейшим требованием к методу лечения является точная локализация и минимизация воздействия на окружающие здоровые клетки органа. Метод ФДТ с использованием описываемых носителей позволяет точно локализовать и удержать терапевтическое соединение, что обеспечивает увеличение эффективности терапии и минимальным побочным эффектам.

Таким образом объектом настоящего изобретения является лекарственная форма, представляющая собой наночастицы щелочноземельных металлов и их анионов, способ их синтеза, а также варианты применения указанных наночастиц в области терапии ЗНО.

На иллюстрациях дано:

На фигуре 1 представлены электронные микрофотографии (1) и распределение по размерам (2) наночастиц аморфного карбоната кальция, полученных описанным способом с добавлением полиакриловой кислоты (Далее – ПАК).

На фигуре 2 представлены электронные микрофотографии (3) и распределение по размерам (4) наночастиц аморфного карбоната кальция, полученных описанным способом с добавлением бычьего сывороточного альбумина (Далее – БСА).

На фигуре 3 представлены кривые высвобождения доксорубицина 5 – в слабокислой (рН 6.2) среде, 6 - в кислой среде (рН 5.5.), 7 - в слабощелочной (рН 7.4)

На фигуре 4 представлены результаты токсичности препаратов радахлорина и доксорубицина, инкапсулированных в наноразмерные носители с различными концентрациями, измеренные методом проточной цитометрии. Для сравнения использовались радахлорин и доксорубицин в свободной форме с аналогичными концентрациями. Столбцы под номером 1 характеризуют свободный доксорубицин, столбцы 2 - доксорубицин в наночастицах, 3 – свободный доксорубицин, облученный лазером, 4 – доксорубицин в наночастицах, облученный лазером, 5 – свободный радахлорин, 6 – радахлорин в наночастицах, 7 – свободный радахлорин, облученный лазером, 8 – радахлорин в наночастицах, облученный лазером, 9 – комбинация радахлорина и доксорубицина, облученная лазером. Группа I означает радахлорин 0.17 мкг, доксорубицин 6 мкг. Группа II радахлорин 0.72 мкг, доксорубицин 10 мкг. Группа III радахлорин 1.4 мкг, доксорубицин 14 мкг. Группа IV 5 мкг, доксорубицин 20 мкг.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

Этап 1

Синтез наноразмерных носителей на основе солей неорганических соединений щелочноземельных металлов и их анионов:

1. Изготавливают растворы солей неорганических соединений щелочноземельных металлов и их анионов и органических добавок необходимой молярности;

2. Полученные растворы поэтапно смешивают в равных пропорциях при умеренном перемешивании на магнитной мешалке

3. Полученную суспензию осаждают путем центрифугирования и очищают от непрореагировавших компонентов.

Этап 2

Включение лекарственного препарата в структуру наноразмерных носителей:

1. К наночастицам, полученным на этапе 1, добавляют терапевтический агент в необходимой дозировке;

2. Смесь наночастиц и терапевтического агента инкубируют при умеренном перемешивании на магнитной мешалке;

3. Полученную суспензию осаждают путем центрифугирования для получения осадка из наночастиц, связанных с терапевтическим агентом и очищают от несвязавшегося препарата.

Далее осуществление изобретения показано на конкретных примерах, что не должно восприниматься как ограничение в отношении созданного изобретения.

Пример 1. Синтез наноразмерных носителей на основе карбоната кальция (CaCO₃) с использованием ПАК.

Готовят водные 0,1М растворы солей карбоната натрия и хлорида кальция; для этого 106 мг Na₂CO₃ и 147 мг CaCl₂*2H₂O растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Затем готовят 0,4 мкМ водный раствор ПАК; для этого 30 мг ПАК растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Затем 1 мл раствора хлорида кальция соединяют с 1 мл раствора ПАК и оставляют при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа. Далее к полученной смеси добавляют 1 мл раствора карбоната кальция и также перемешивают в течение 1 часа. При этом появляется заметное помутнение смеси, что свидетельствует об образовании наночастиц. Затем полученную суспензию откручивают на центрифуге при 14000 rps в течение 4 минут для получения осадка из наночастиц аморфного карбоната кальция. Полученный осадок очищается от примесей путем двукратной промывки 96% раствором этанола.

Для синтеза используются: Дигидрат хлорида кальция (CaCl₂, MW = 147,01), безводный карбонат натрия (Na₂CO₃, MW = 105,99), полиакриловая кислота (ПАК, MW = 6900), очищенная вода с удельным сопротивлением выше 18,2 MΩ cm^-1 из трехступенчатой системы очистки Milli-Q Plus 185.

Контроль формирования наночастиц, их размеров и морфологии был проведен методом DLS и сканирующей электронной микроскопии (фигура 1). Наночастицы примерно сферические с близким средним размером (80-120 нм).

Пример 2. Синтез наноразмерных носителей на основе карбоната кальция (CaCO₃) с использованием БСА.

Готовят водные 0,1М растворы солей карбоната натрия и хлорида кальция; для этого 106 мг Na₂CO₃ и 147 мг CaCl₂*2H₂O растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Затем готовят водный раствор БСА с концентрацией 10 мг/мл; для этого 100 мг БСА растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Затем 1 мл раствора хлорида кальция соединяют с 1 мл раствора БСА и оставляют при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа. Далее к полученной смеси добавляют 1 мл раствора карбоната кальция и также перемешивают в течение 1 часа. При этом появляется заметное помутнение смеси, что свидетельствует об образовании наночастиц. Затем полученную суспензию откручивают на центрифуге при 14000 rps в течение 4 минут для получения осадка из наночастиц аморфного карбоната кальция. Полученный осадок очищается от непрореагировавших компонент путем двукратной промывки 96% этанолом.

Для синтеза используют:

Дигидрат хлорида кальция (CaCl₂, MW = 147,01), безводный карбонат натрия (Na₂CO₃, MW = 105,99), бычий сывороточный альбумин, очищенная вода с удельным сопротивлением выше 18,2 MΩ cm^-1 из трехступенчатой системы очистки Milli-Q Plus 185.

Контроль формирования наночастиц, их размеров и морфологии был проведен методом DLS и сканирующей электронной микроскопии (фигура 2). Наночастицы примерно сферические с близким средним размером (300-400 нм).

Включение лекарственного препарата в структуру носителей

Радахлорин (концентрат, 0,35%), Доксорубицин (концентрат, 20%).

Эффективность включения лекарственного препарата была исследована методом спектрофотометрии, с использованием которого изучали количество высвободившегося лекарственного препарата во времени в различных средах. Для этого частицы с включенным препаратом инкубировали в среде с необходимым уровнем кислотности (кислый буфер, нейтральный буфер, щелочной буфер), отбирая в процессе образцы в определенные временные точки. Таким образом, были запакованы препараты доксорубицина и радахлорина, с эффективностью адсорбции 90% и больше, а также составлены графики высвобождения лекарственных препаратов из частиц во времени (фигура 3).

Эксперименты in vitro.

Клеточная линия меланомы мыши (клетки B16-F10) была получена из коллекции культур американского типа. Клетки культивировали в среде αMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и дополнительных 2 мМ глутамина. Культуру клеток поддерживали в стерильной увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% CO₂, при 37°C. На фигуре 4 представлены графики, отражающие Токсичность препаратов радахлорина и доксорубицина, инкапсулированные в наноразмерные носители с различными концентрациями, измеренные методом проточной цитометрии. Для сравнения использовались радахлорин и доксорубицин в свободной форме с аналогичными концентрациями.

Пример 3. Эксперименты по исследованию токсичности in vitro.

1) Проточная цитометрия

Для изучения токсичности полимерных носителей использовали проточную цитометрию (FACS Aria, BD, США). Для этого клетки B16-F10 высевали в 6-луночный планшет в количестве 1,0×10⁵ клеток на лунку. На следующий день носители добавляли к клеткам. На следующий день клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА и центрифугировали в течение 4 мин при 4000 об/мин, затем ресуспендировали в PBS. Перед исследованием добавляли 1 мкл 7-AAD и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре.

2) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Для изучения токсичности полимерных носителей использовали анализ "live/dead" (живые/мертвые) с использованием кальцеина и пропидия. Для этого клетки B16-F10 высевали в 24-луночный планшет в количестве 25 000 клеток на лунку, в тот же день образцы были добавлены в лунки. На следующий день клетки B16-F10 окрашивали 0,2 мкл кальцемином (окрашивание живых клеток, зеленый цвет) и 3 мкл пропидия йодида (окрашивание мертвых клеток, красный цвет) в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO₂. Затем клетки смотрели под конфокальным микроскопом (Leica TCS SP8). Для визуализации живых клеток использовали аргоновый лазер, излучающий с длиной волны 488 нм. Для визуализации мертвых клеток использовали гелий-неоновый лазер, излучающий с длиной волны 543 нм. Конфокальное отверстие было установлено на 1 единицу Эйри, и изображения были сделаны с помощью объектива HC PL FLUOTAR 10x/ 0,30 PH2.

Эксперименты in vivo.

Для изучения терапевтической активности наноструктурированных фармацевтически подходящих лекарственных форм были использованы мыши Balb/c в возрасте 3-4 недель с развитой моделью опухолевого заболевания, стерильный шприц со съемной иглой 29 г, изофлуран, золазепама гидрохлорид, ксилазина гидрохлорид, фосфатно-буферный физиологический раствор. К животным применялся метод комбинированная химио- и ФДТ с введение лекарственной формы в терапевтически подходящей концентрации. По результатам 10дневной терапии наблюдался выраженный терапевтический эффект, проявляющийся в отсутствии увеличения объема опухоли по сравнению с контрольными образцами, которые не подвергались лечению. По истечению 10 дней терапии, органы (сердце, легкие, почки, печень и селезенку) были собраны для гистологического анализа, который показал отсутствие поражений здоровых тканей.

Наноразмерные носители химиотерапевтических агентов и фотосенсибилизаторов, обладающих противоопухолевыми свойствами, полученных путем соосаждения солей неорганических соединений щелочноземельных металлов и их анионов в присутствии органических добавок и терапевтических агентов, обладают следующими преимуществами: (1) высокая стабильность в средах с различной кислотностью, (2) высокая емкость и эффективность включения лекарственного препарата и (3) синергизм между химиотерапией и ФДТ. Как следствие, комбинированная химио- и ФДТ показала высокую терапевтическую эффективность против различных ЗНО (рак шейки матки, меланома, рак молочной железы и колоректальный рак) без каких-либо существенных побочных эффектов на здоровые органы (сердце, легкие, почки, печень и селезенку).

Изобретение относится к наномедицине, а именно к лекарственным формам в виде наночастиц, способу синтеза таких наночастиц и их использованию в области терапии злокачественных образований, а именно адресной доставки терапевтических агентов, релевантных для целей химиотерапии и фотодинамической терапии у млекопитающих с использованием указанных наночастиц. Настоящее изобретение расширяет арсенал существующих подходов к созданию стабильных нетоксичных и эффективных лекарственных форм, со сферической морфологией, высокими адсорбционными свойствами, удерживающей способностью, а также возможностью безопасного выхода из организма, а именно решает задачу создания наноразмерных носителей, состоящих из соединений щелочно-земельных металлов, пригодных для доставки в очаг интереса (опухолевую ткань) для комбинированной ФДТ и химиотерапии ЗНО. Технический результат состоит в получении лекарственной формы, состоящей из наночастиц с размером в диапазоне от 20 до 500 нм для реализации комбинированной ФДТ ЗНО, с возможностью получения суспензии наночастиц, с высокой концентрацией и использованием низкозатратной технологии, одностадийной методикой синтеза наноразмерных носителей, которая занимает малое количество времени (около 2 ч), с возможностью включения широкого спектра химиопрепаратов и фотосенсибилизаторов, повышенной по сравнению с ближайшим аналогом адсорбционной емкостью включения терапевтического соединения, повышенной агрегативной устойчивостью в биологических средах, оптимальными фармакокинетическими параметрами и физико-химическими характеристиками, что позволяет обеспечить локальное воздействие на опухолевую ткань. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Способ получения наноструктурированной фармацевтически подходящей лекарственной формы, состоящий в том, что изготавливают 0,1 М водные растворы карбоната натрия и хлорида кальция, водный раствор органической добавки, выбранный из раствора бычьего сывороточного альбумина, в концентрации 10 мг/мл, и 0,4 мкМ водного раствора полиакриловой кислоты, полученные растворы поэтапно смешивают в равных объемных пропорциях в следующем порядке: на первом этапе смешивают 0,1 М водный раствор хлорида кальция и выбранный раствор органической добавки при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 ч, на втором этапе к полученной смеси добавляют 0,1 М водный раствор карбоната натрия и перемешивают смесь в течение 1 ч, из полученной суспензии осаждают наночастицы путем центрифугирования и очищают их от непрореагировавших компонентов, затем полученные наночастицы помещают в водный раствор, содержащий терапевтический агент, состоящий из комбинации химиотерапевтического агента и фотосенсибилизатора, инкубируют смесь при перемешивании на магнитной мешалке, полученную суспензию осаждают путем центрифугирования для отделения осадка из наночастиц, связанных с терапевтическим агентом, и очищают от не связавшегося препарата.

2. Способ по п. 1, в котором химиотерапевтическим агентом является доксорубицин.

3. Способ по п. 1, в котором фотосенсибилизатором является радахлорин.

4. Наноструктурированная лекарственная форма для лечения солидных злокачественных новообразований, характеризующаяся тем, что получена по любому из пп. 1-3 и состоит из аморфных сферических наночастиц карбоната кальция с включенным указанным терапевтическим агентом в эффективном количестве, с контролируемым размером от 60 до 500 нм.

5. Применение наноструктурированной лекарственной формы по п. 4 для доставки указанного терапевтического агента в опухолевую клетку.

6. Применение по п. 5, где опухолевой клеткой является клетка меланомы.