КОМПОЗИЦИЯ, СТАБИЛЬНО СОДЕРЖАЩАЯ МОЛЕКУЛУ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/113 A61K31/7088 A61K47/12 A61K48/00 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую биологической активностью, например, молекулу нуклеиновой кислоты, которая контролирует экспрессию гена-мишени или функцию белка-мишени, которая представляет новую композицию, в частности, фармацевтическую композицию, обеспечивающую улучшенную стабильность молекулы нуклеиновой кислоты, и также к способу ее получения и способу стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в жидкой композиции.

Уровень техники

[0002]

Известны короткие молекулы нуклеиновой кислоты, обладающие биологической активностью, такие как антисмысловая нуклеиновая кислота, siРНК, shРНК, микроРНК (миRNA), нуклеиновая кислота-ловушка, рибозим, аптамер и т.п., и продолжается разработка фармацевтических продуктов, с их использованием (например, патентные документы 1-3).

Поскольку данные нуклеиновые кислоты склонны к разложению в растворах и нестабильны, то манипулирование с ними при температуре окружающей среды является чрезвычайно сложным. Таким образом, обычно применяют лиофилизацию и способ, включающий добавление 50% этанола в буфер Трис-ЭДТА (TЭ), и хранение без замораживания при -20°С.

Список документов

Патентные документы

[0003]

патентный документ 1: JP-B-2708960

патентный документ 2: JP-B-3626503

патентный документ 3: патент США № 7511131

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

[0004]

В таких обстоятельствах требуется разработка стабильного препарата нуклеиновой кислоты, с которым легко манипулировать, и способного стабильно сохранять нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента при температуре окружающей среды.

Проблема настоящего изобретения заключается в обеспечении фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента, которая представляет новую фармацевтическую композицию с улучшенной стабильностью активного ингредиента, и способа ее получения.

Способы решения проблем

Заявители настоящего изобретения провели интенсивные исследования в попытке решить вышеуказанную проблему и установили, что стабильность нуклеиновой кислоты можно существенно и неожиданно повысить с использованием буфера, способного доводить значение рН раствора молекулы нуклеиновой кислоты для попадания в определенный диапазон, что привело к завершению настоящего изобретения.

Следовательно, настоящее изобретение представляет следующее.

[1] Композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты и буфер и имеющая следующие признаки:

(а) находится в форме раствора при температуре окружающей среды; и

(b) содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 25°С, 60% относительной влажности в течение 4 недель, составляет не ниже 80% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

[2] Композиция по п. [1], где содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 40°С, 75% относительной влажности в течение 4 недель составляет не ниже 80% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

[3] Композиция по пп. [1] или [2], где содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 60°С в течение 4 недель составляет не ниже 60% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

[4] Композиция по любому из пп. [1]-[3], где буфер доводит рН композиции до значения не ниже 4,0 и не выше 9,0.

[5] Композиция по любому из пп. [1]-[3], где буфер доводит рН композиции до значения не ниже 5,5 и не выше 7,5.

[6] Композиция по любому из пп. [1]-[3], где буфер доводит рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0.

[7] Композиция по любому из пп. [1]-[6], где буфер содержит один или более буферных агентов, выбранных из гидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия, динатрия гидрофосфата, хлорида натрия, аргинина гидрохлорида, цитрата натрия, тринатрия цитрата дигидрата, L-глутамата мононатрия, ацетата натрия, карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, лактата натрия, фосфата монокалия, гидроксида натрия, меглюмина, глицина, лимонной кислоты и уксусной кислоты.

[8] Композиция по любому из пп. [1]-[7], где буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.

[9] Композиция по любому из пп. [1]-[8], где вышеуказанная молекула нуклеиновой кислоты представляет молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

[10] Композиция по любому из пп. [1]-[9], где вышеуказанная молекула нуклеиновой кислоты представляет молекулу ДНК, молекулу РНК или молекулу химерной нуклеиновой кислоты ДНК и РНК.

[11] Композиция по любому из пп. [1]-[10], где число нуклеотидов в вышеуказанной молекуле нуклеиновой кислоты составляет 10-300.

[12] Композиция по любому из пп. [1]-[11], где вышеуказанная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, которая контролирует экспрессию гена-мишени или функцию белка-мишени.

[13] Композиция по любому из пп. [1]-[11], содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, которая контролирует экспрессию гена-мишени.

[14] Композиция по любому из пп. [1]-[13], где вышеуказанная молекула нуклеиновой кислоты представляет антисмысловую нуклеиновую кислоту, siРНК или shРНК, миРНК, рибозим, нуклеиновую кислоту-ловушку или аптамер.

[15] Композиция по любому из пп. [1]-[14], которая представляет фармацевтическую композицию.

[16] Способ получения композиции по любому из пп. [1]-[15], включающий растворение вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, доведение рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.

[17] Способ стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции, включающий растворение вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, доведение рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.

[18] Способ по любому из пп. [16] или [17], где буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.

[19] Способ по любому из пп. [16]-[18], где композиция представляет фармацевтическую композицию.

Эффект изобретения

[0007]

Согласно настоящему изобретению может быть обеспечена новая композиция, в частности, фармацевтическая композиция, с которой проще манипулировать, где молекула нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента имеет повышенную стабильность.

Краткое описание фигур

[0008]

На фиг. 1 представлены результаты теста оценки стабильности при 25°С раствора PH-0009, приготовленного с использованием буфера при каждом значении рН.

На фиг.2 представлены результаты теста оценки стабильности при 40°С раствора PH-0009, приготовленного с использованием буфера при каждом значении рН.

На фиг. 3 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С раствора PH-0009, приготовленного с использованием буфера при каждом значении рН.

На фиг.4 представлены результаты теста оценки стабильности при 40°С раствора PH-0009, приготовленного с использованием цитратного буфера при каждой концентрации.

На фиг.5 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С раствора PH-0009, приготовленного с использованием цитратного буфера при каждой концентрации.

На фиг.6 представлены результаты теста оценки стабильности раствора PH-0009 с концентрацией 10 мг/мл.

На фиг. 7 представлены результаты теста оценки стабильности раствора NK-7006, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг.8 представлены результаты теста оценки стабильности раствора NK-7007, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг.9 представлены результаты теста оценки стабильности раствора PK-7006, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг.10 представлены результаты теста оценки стабильности PK-7015, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 11 представлены результаты теста оценки стабильности раствора PH-7069, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 12 представлены результаты теста оценки стабильности раствора Kynamro-7001, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 13 представлены результаты теста оценки стабильности раствора PH-7081, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг.14 представлены результаты теста оценки стабильности раствора NI-7001, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 15 представлены результаты теста оценки стабильности раствора NM-7001, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 16 представлены результаты теста оценки стабильности раствора Macugen-7001, приготовленного с использованием 0,05 М цитратного буфера.

На фиг. 17 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов PK-7006, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 18 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов NK-7006, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 19 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов PH-7069, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 20 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов NI-7001, полученных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 21 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов NM-7001, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 22 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов Kynamro-7001, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

На фиг. 23 представлены результаты теста оценки стабильности при 60°С растворов Macugen-7001, приготовленных с использованием 0,05 М цитратного буфера, 0,05 М фосфатного буфера и 0,05 М цитратно-фосфатного (5:5) буфера при каждом значении рН.

Описание вариантов осуществления

[0009]

Настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, способную стабильно сохранять молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую биологической активностью, в форме раствора при температуре окружающей среды (далее также относится к «композиции по настоящему изобретению»). Как здесь используется, термин «температура окружающей среды» означает диапазон температур 15-30°С, и «стабильно сохранять» означает, что не ниже 80% молекулы нуклеиновой кислоты относительно содержания на время начала закладки на хранение (при приготовлении композиции) сохраняется без разложения в течение (1) не менее 4 недель, предпочтительно (2) не менее 12 недель (примерно 3 месяца), более предпочтительно (3) не менее 200 недель (примерно 3,7 года). Такая стабильность при хранении может быть подтверждена или прогнозирована по результатам следующего теста оценки стабильности.

(1) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 25°С, 60% относительной влажности в течение 4 недель составляет не ниже 80% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

(2) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 40°С, 75% относительной влажности в течение 4 недель составляет не ниже 80% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

(3) Содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 60°С в течение 4 недель составляет не ниже 60%, предпочтительно не ниже 70%, более предпочтительно не ниже 80% относительно содержания на время начала закладки на хранение.

Как здесь используется, содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции определяют с использованием раствора (100%), полученного растворением молекулы нуклеиновой кислоты в таком же количестве, что и испытуемый образец в воде для инъекций, и раствора, полученного смешиванием указанного раствора и воды для инъекций в соотношении 9:1, 8:2, 7:3 и 6:4 (90%, 80%, 70% и 60% соответственно) в качестве образцов для построения калибровочной кривой с использованием 10 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой для ВЭЖХ для измерения площадей пиков, построения графиков измеренных значений соответствующих образцов калибровочной кривой с теоретическим содержанием (%) по горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), получения линейной регрессии (Y=aX+b) (калибровочная кривая) методом наименьших квадратов, и наложением площади пика исследуемого образца, измеренной ВЭЖХ в тех же условиях, к калибровочной кривой, чтобы дать теоретическое содержание (%). Условия измерения вышеуказанной ВЭЖХ следующие:

детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

температура колонки: 40°C

подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрила

подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

подача подвижной фазы: градиент концентрации контролируется путем изменения соотношения смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В следующим образом.

[0010]

Таблица 1 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

[0011]

Предпочтительно композиция по настоящему изобретению имеет содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции после хранения при 60°С в течение 4 недель не ниже 60%, предпочтительно не ниже 70%, более предпочтительно не ниже 80%, еще более предпочтительно не ниже 85%, особенно предпочтительно не ниже 90%, относительно содержания на время начала закладки на хранение.

[0012]

1. Молекула нуклеиновой кислоты

Молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в композиции по настоящему изобретению, особым образом не ограничивается, при условии, что она представляет олигонуклеотид или полинуклеотид, содержащий дезоксирибонуклеотид (ДНК) и/или рибонуклеотид (РНК) в качестве составляющего звена(ев), и может состоять только из ДНК или РНК, или химерной нуклеиновой кислоты ДНК и РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Когда это двухцепочечная молекула, то она может представлять любую из двухцепочечной ДНК, двухцепочечной РНК, гибрида ДНК-РНК. Кроме того, данный термин широко применим к структурам, полученным из нуклеиновой кислоты (молекулярная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты, такой как LNA, ДНК, РНК и тому подобное, в частности, химерная нуклеиновая кислота, гетерополимерная двухцепочечная нуклеиновая кислота или структура с тройной цепью нуклеиновой кислоты и т.д.).

[0013]

Количество оснований в молекуле нуклеиновой кислоты, содержащейся в композиции по настоящему изобретению, обычно составляет 10-300, предпочтительно 10-200, более предпочтительно 10-150, еще более предпочтительно 15-100, наиболее предпочтительно 20-80. В настоящем описании «siРНК», «shРНК», «миРНК» и «рибозим», если не указано иное, получили свои названия на основе функции, которые могут состоять исключительно из РНК, или один или более (например, 1-30, 1-20, 1-10, 1-5 (1, 2, 3, 4, 5)) нуклеотидов необязательно замещены ДНК.

[0014]

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в композиции по настоящему изобретению, представляет молекулу, обладающую биологической активностью, такую как молекула, содержащая нуклеотидную последовательность, которая контролирует экспрессию гена-мишени или функцию белка-мишени и тому подобное. Как здесь используется, термин «контроль» включает как повышающую регуляцию (усиление экспрессии или функции), так и понижающую регуляцию (подавление экспрессии или функции). Примеры молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая контролирует экспрессию гена-мишени, включают антисмысловую нуклеиновую кислоту, siРНК, shРНК, миРНК, рибозим и тому подобное. Примеры молекулы нуклеиновой кислоты, которая подавляет функцию белка-мишени, включают аптамер, нуклеиновую кислоту-ловушку и тому подобное.

[0015]

Антисмысловая нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, состоящей из мРНК-мишени (или ее первичного продукта транскрипции), или последовательности оснований, способной гибридизоваться с миРНК-мишенью (или ее первичным продуктом транскрипции) в физиологических условиях клетки, которая экспрессирует мРНК-мишень или миРНК-мишень, и способной ингибировать трансляцию в белок, кодируемый мРНК, стерическим препятствием или разложением мРНК-мишени (или ингибированием сплайсинга первичного продукта транскрипции) или способной ингибировать контроль экспрессии гена миРНК путем ингибирования или разложение миРНК-мишени.

[0016]

Длина области-мишени антисмысловой нуклеиновой кислоты особым образом не ограничивается, при условии, что трансляция в белок и контроль экспрессии гена под действием миРНК могут ингибироваться гибридизацией антисмысловой нуклеиновой кислоты и, например, короткая длина составляет примерно 10 оснований, и длинная длина представляет собой полную последовательность мРНК или первичного продукта транскрипции. С учетом простого синтеза, антигенности, переноса внутрь клеток и тому подобное, предпочтительной является длина примерно 10-40 оснований, в частности, в пределах примерно от 15 до примерно 30 оснований, хотя, длина не ограничивается этими значениями.

[0017]

В качестве антисмысловой нуклеиновой кислоты можно использовать нуклеиновую кислоту, нацеленную на любую известную мРНК. Предпочтительным примером является антисмысловая нуклеиновая кислота против мРНК, кодирующей белок, который потенциально становится мишенью для поиска препарата для лечения заболевания человека. Конкретные примеры антисмысловой нуклеиновой кислоты, относящиеся к заболеванию человека, включают, не ограничиваясь этим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, нацеленную на мРНК (или ее первичный продукт транскрипции) ApoB100 (гиперхолестеринемия), дистрофин (мышечная дистрофия), STAT3 (злокачественная лимфома) и тому подобное, и антисмысловую нуклеиновую кислоту, нацеленную на миРНК и подобно miR-122 (гепатит С), и тому подобное.

[0018]

Более конкретные примеры антисмысловой нуклеиновой кислоты включают, не ограничиваясь этим, мипомерсен, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 1 (торговое название: Kynamro; при условии, что РНК является 2'-O-метоксиэтилированной, и цитозин и урацил являются 5-метилированными в поступающих на рынок лекарственных препаратах) (антисмысловая нуклеиновая кислота против мРНК ApoB100).

5'-GCCUCagtctgcttcGCACC-3' (SEQ ID NO: 1)

(прописные буквы показывают РНК, и строчные буквы - ДНК)

[0019]

Антисмысловую нуклеиновую кислоту можно получить определением последовательности-мишени на основе последовательности кДНК или последовательности геномной ДНК и синтезом комплементарной ей последовательности с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора ДНК/РНК (Applied Biosystems, Beckman Instruments и т.д.).

[0020]

siРНК представляет собой двухцепочечную олиго-РНК, состоящую из РНК, имеющую последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности мРНК гена-мишени или ее частичной последовательности (далее по тексту нуклеотидная последовательность-мишень), и ее комплементарную цепь. Кроме того, одноцепочечная РНК, в которой последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности-мишени (первая последовательность) и ее комплементарная последовательность (вторая последовательность), связаны посредством участка «петля-шпилька», и двухцепочечная структура первой последовательности и второй последовательности образована структурой типа «петли-шпильки» (короткая РНК, образующая шпильку: shРНК), также является одним из предпочтительных вариантов осуществления siРНК. Кроме того, нуклеиновая кислота типа «гантели», в которой оба конца двухцепочечной структуры первой последовательности и второй последовательности замкнуты петлевой структурой, также является одним из предпочтительных вариантов осуществления.

[0021]

siРНК/shРНК может иметь «свисающий конец» на 5'-конце или 3'-конце одной или обеих смысловой цепи и антисмысловой цепи. «Свисающий конец» образуется добавлением от одного до нескольких (например, 1, 2 или 3) оснований к концу смысловой цепи и/или антисмысловой цепи.

[0022]

Несмотря на то, что длина оснований siРНК/shРНК особым образом не ограничивается, при условии, что может быть индуцирована РНК-интерференция, например, одна боковая цепь имеет длину из 10-50 оснований, предпочтительно 15-30 оснований, более предпочтительно длину 21-27 оснований.

[0023]

В качестве siРНК/shРНК может быть использована siРНК/shРНК, нацеленная на любую известную мРНК, и, например, siРНК/shРНК против мРНК, кодирующей белок, который потенциально становится мишенью для поиска препарата для лечения заболевания человека, является предпочтительной. Конкретные примеры siРНК/shРНК, относящиеся к заболеваниям человека, включают, не ограничиваясь этим, siРНК/shРНК и т.п., нацеленные на фактор роста соединительной ткани (CTGF) (фиброз), нуклеокапсид респираторно-синцитиального вируса (RSV) (RSV-инфекции), RTP801 (диабетический макулярный отек), транстиретин (амилоидоз), коллагенспецифический молекулярный шаперон (HSP47) (цирроз) и тому подобное.

[0024]

siРНК может быть получена химическим синтезом с использованием обычного известного способа или получением с использованием технологии рекомбинации генов. Также возможно использовать коммерчески доступную нуклеиновую кислоту, если это подходит.

[0025]

Например, siРНК может быть соответствующим образом сконструирована с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (например, RNAi Designer, Invitrogen) на основе информации о последовательности оснований мРНК, которая является мишенью. Она может быть получена синтезом каждой из смысловой цепи и антисмысловой цепи последовательности-мишени в мРНК с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора ДНК/РНК (Applied Biosystems, Beckman Instruments и др.), их денатурирацией в подходящем буфере для отжига при температуре примерно от 90°С до примерно 95°С в течение примерно 1 мин и их отжига при температуре примерно от 30 до 70°С в течение примерно от 1 до примерно 8 ч.

[0026]

миРНК представляет собой эндогенную некодирующую РНК (нк РНК) примерно из 20-25 оснований, которая кодируется в геноме. Она не расщепляет мРНК-мишень, как это делает siРНК, но контролирует трансляцию путем распознавания 3'-нетранслируемой области (UTR) мРНК-мишени. миРНК в настоящем изобретении включает эндогенную миРНК, которая воздействует на мРНК-мишень в цитоплазме и ингибирует трансляцию в белок, и, которая действует в ядре и разлагает мРНК подобно H-зависимой РНКазе с помощью гапмерной структуры, содержащей олигомеры РНК на обоих концах и олигомер ДНК в центральной части.

В качестве миРНК можно использовать любую известную миРНК. Предпочтительной является, например, миРНК, нацеленная на мРНК, кодирующую белок, которая потенциально становится мишенью для поиска препарата для лечения заболевания человека, или ее предшественник. Конкретные примеры миРНК, относящиеся к заболеванию человека, включают, не ограничиваясь этим, let-7 (рак легких), miR-15a (В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз), miR-143 (колоректальный рак), miR-139 (рак поджелудочной железы) и их предшественники и тому подобное.

[0028]

Более конкретные примеры миРНК включают, не ограничиваясь этим, предшественник let7a-1 человека, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 2.

5'-UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCA

CCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3' (SEQ ID NO: 2)

[0029]

миРНК можно получить выделением из клетки млекопитающего (клетки человека и т.д.) с использованием обычного известного метода или химическим синтезом, или получением с использованием технологии рекомбинации генов. Также возможно использовать коммерчески доступную нуклеиновую кислоту, если это подходит.

[0030]

В отношение миРНК, то например, двухцепочечную миРНК или ее одноцепочечный предшественник можно получить на основе информации о последовательности оснований целевой миРНК из базы данных miRBase и т.д. и, основываясь на информации, таким же образом, как было описано выше для химического синтеза siРНК.

[0031]

Аптамер представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую активностью связываться с молекулой-мишенью, такой как белок и тому подобное, и контролировать (как правило, ингибировать) его функции.

[0032]

Длина аптамера особым образом не ограничивается и, как правило, может составлять примерно от 16 до примерно 200 нуклеотидов. Например, она может составлять не более 100 нуклеотидов, предпочтительно не более примерно 50 нуклеотидов, более предпочтительно не более примерно 40 нуклеотидов.

[0033]

В качестве аптамера можно использовать аптамер, нацеленный на любой известный белок. Предпочтительным является, например, аптамер, нацеленный на белок, который потенциально становится мишенью для поиска препарата для лечения заболевания человека. Конкретные примеры аптамера к белку, связанному с заболеванием человека, включают, не ограничиваясь этим, аптамеры к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF) (возрастная макулярная дегенерация), фактору IXa (ингибирование свертывания крови при болезни коронарных артерий), фактору роста нервов (NGF) (боль), основному фактору роста фибробластов (FGF2) (ревматоидный артрит) и тому подобное, и тому подобное.

[0034]

Более конкретные примеры аптамера включают, не ограничиваясь этим, пегаптаниб, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 3 (торговое название: макуген (зарегистрированная торговая марка); все пиримидиновые нуклеотиды являются 2'-фторированными, и часть пуриновых нуклеотидов является 2'-метоксилированными) (аптамер к белку VEGF).

5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3' (SEQ ID NO: 3)

(t представляет 3',3'-dT)

[0035]

Аптамер может быть получен, например, с использованием следующих процедур. То есть олигонуклеотиды (например, примерно 60 оснований) вначале синтезируют произвольно с использованием автоматического синтезатора ДНК/РНК и получают пул олигонуклеотидов. Затем олигонуклеотиды, связанные с целевым белком, разделяют на аффинной колонке. Разделенные олигонуклеотиды амплифицируют с помощью ПЦР, и вышеуказанный процесс отбора выполняют вновь. Данный процесс повторяют примерно 5 раз или более для выбора аптамеров, обладающих высокой аффинностью к целевому белку.

[0036]

Рибозим представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую ферментативной активностью для расщепления нуклеиновой кислоты. Самосплайсирующаяся РНК, найденная в инфекционной РНК, такой как РНК вироида, вирусоида и т.п., и типа «головки молотка», типа «шпильки» и тому подобное, являются известными рибозимами, имеющими самую широкую применимость. Может быть специфически расщеплена только сама мРНК-мишень образованием последовательности, комплементарной желаемому сайту расщепления мРНК, с несколькими основаниями каждого на обоих концах (всего примерно 10 оснований), смежных с фрагментом, имеющим структуру «головки молотка».

[0037]

Рибозим можно получить определением последовательности-мишени на основе последовательности кДНК или последовательности геномной ДНК и синтезом последовательности, комплементарной им, с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора ДНК/РНК (Applied Biosystems, Beckman Instruments и т.д.).

[0038]

Нуклеиновая кислота-ловушка представляет двухцепочечную молекулу ДНК, имеющую длину примерно 20 оснований и имеющую нуклеотидную последовательность, с которой специфически связывается фактор транскрипции, и контролирует (подавляет в случае фактора активации транскрипции, активирует в случае ингибирующего фактора транскрипции) экспрессию гена-мишени фактора транскрипции путем захвата фактора транскрипции.

[0039]

В качестве нуклеиновой кислоты-ловушки можно использовать нуклеиновую кислоту-ловушку, нацеленную на любой известный фактор транскрипции. Предпочтительной является, например, нуклеиновая кислота-ловушка, нацеленная на фактор транскрипции, который потенциально становится мишенью для поиска препарата для лечения заболевания человека. Конкретные примеры нуклеиновой кислоты-ловушки к фактору транскрипции, относящемуся к заболеванию человека, включают, не ограничиваясь этим, нуклеиновую кислоту-ловушку к NFκB (атопический дерматит, сосудистый рестеноз, ревматоидный артрит) и тому подобное, и тому подобное.

[0040]

Нуклеиновая кислота-ловушка может быть получена химическим синтезом с использованием обычного известного метода.

[0041]

Например, нуклеиновая кислота-ловушка может быть соответствующим образом сконструирована на основе информации о последовательности оснований консенсусной последовательности связывания фактора транскрипции, который является мишенью. Она может быть получена синтезом каждой из смысловой цепи и антисмысловой цепи с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора ДНК/РНК (Applied Biosystems, Beckman Instruments и т.д.), их денатурацией в подходящем буфере для отжига примерно при 90-195°C в течение примерно 1 мин и их отжигом при температуре примерно от 30 до 70°С в течение примерно от 1 до примерно 8 ч.

[0042]

В одном предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в композиции по настоящему изобретению, может представлять молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, описанную в WO 2012/017919, WO 2013/103146, WO 2012/005368, WO 2013/077446, WO 2013/133393 и тому подобное.

[0043]

Данные молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты представляют молекулы нуклеиновых кислот, в которых область, содержащая последовательность, которая контролирует экспрессию гена-мишени, и область, содержащая последовательность, комплементарную последовательности, связаны непосредственно или через линкер. Конкретные примеры линкера включают, не ограничиваясь этим, линкер, имеющий ненуклеотидную структуру, содержащую, по меньшей мере, одно из пирролидинового скелета и пиперидинового скелета, линкер, состоящий из нуклеотидного остатка и/или ненуклеотидного остатка, линкер, имеющий ненуклеотидную структуру, такую как аминокислотный остаток, остаток полиамина, остаток поликарбоновой кислоты и тому подобное, и тому подобное. Конкретные примеры вышеуказанной молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей линкер, включают, не ограничиваясь этим, следующие.

[0044]

I. Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, контролирующую экспрессию гена-мишени (далее в некоторых случаях сокращенно «контрольная последовательность экспрессии»), которая содержит линкер, имеющий ненуклеотидную структуру, содержащую, по меньшей мере, одно из пирролидинового скелета и пиперидинового скелета.

(1) молекула ssPN

В качестве одного варианта осуществления вышеуказанной молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты, является молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты (далее по тексту также «молекула ssPN»), содержащая область (X), линкерную область (Lx) и область (Xc), где вышеуказанная линкерная область (Lx) связана с вышеуказанной областью (X) и вышеуказанной областью (Xc),

вышеуказанная область (Xc) является комплементарной вышеуказанной области (X),

по меньшей мере, одна из вышеуказанной области (X) и вышеуказанной области (Xc) содержит вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, и вышеуказанная линкерная область (Lx) содержит ненуклеотидную структуру, содержащую, по меньшей мере, одно из пирролидинового скелета и пиперидинового скелета, которые описаны в WO 2012/017919.

[0045]

В вышеуказанной молекуле ssPN вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии представляет последовательность, которая проявляет, например, активность контролирования экспрессии вышеуказанного гена-мишени, когда молекулу ssPN вводят в клетку in vivo или in vitro. Вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии особым образом не ограничивается и может быть установлена в зависимости от типа гена-мишени. В качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, например, может быть использована последовательность, участвующая в РНК-интерференции, вызванной siРНК. То есть последовательность РНК цепи вышеуказанной siРНК, которая связывается с мРНК-мишенью, может быть использована в качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии.

[0046]

Вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии представляет собой, например, предпочтительно, комплементарную, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно комплементарную, на 95%, еще более предпочтительно комплементарную на 98% и наиболее предпочтительно комплементарную на 100% заранее определенной области вышеуказанного гена-мишени. Когда такая комплементарность выполняется, то, например, нецелевой эффект может быть в достаточной степени снижен.

[0047]

В качестве конкретных примеров, когда геном-мишенью является ген TGF-β1, то, например, в качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, может использоваться последовательность длиной 18 оснований, показанная в SEQ ID NO: 4.

5'-UAUGCUGUGUGUACUCUG-3' (SEQ ID NO: 4)

[0048]

В вышеуказанной молекуле ssPN вышеуказанная линкерная область (Lx) может иметь, например, ненуклеотидную структуру, содержащую вышеуказанный пирролидиновый скелет, или ненуклеотидную структуру, содержащую вышеуказанный пиперидиновый скелет, или обе ненуклеотидную структуру, содержащую вышеуказанный пирролидиновый скелет, и ненуклеотидную структуру, содержащую вышеуказанный пиперидиновый скелет. Вышеуказанная молекула ssPN может подавлять, например, побочные эффекты, такие как индукция интерферона in vivo, и обладает превосходной устойчивостью к нуклеазе.

[0049]

В вышеуказанной молекуле ssPN вышеуказанный пирролидиновый скелет может представлять, например, скелет производного пирролидина, где один или более атомов углерода, составляющих 5-членное кольцо пирролидина, являются замещенными, и при замещении, например, атом углерода, отличный от углерода С-2, является предпочтительным. Вышеуказанной атом углерода может быть замещен, например, атомом азота, атомом кислорода или атомом серы. Вышеуказанный пирролидиновый скелет может содержать, например, двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот в 5-членном кольце пирролидина. В вышеуказанном пирролидиновом скелете атом углерода и атом азота, составляющие 5-членное пирролидиновое кольцо, могут быть связаны, например, с атомом водорода или с указанным ниже заместителем. Вышеуказанная линкерная область (Lx) может быть связана, например, с вышеуказанной областью (X) и вышеуказанной областью (Xc) через любую группу в вышеуказанном пирролидиновом скелете, которая предпочтительно представляет собой любой атом углерода или любой атом азота вышеуказанного 5-членного кольца, предпочтительно атом углерода в положении 2 (С-2) или атом азота вышеуказанного 5-членного кольца. Примеры вышеуказанного пирролидинового скелета включают пролиновый скелет, пролиноловый скелет и тому подобное. Поскольку вышеуказанный пролиновый скелет, пролиноловый скелет и тому подобное представляют, например, вещества и их восстановленная форма, имеющиеся in vivo и, то они также являются более безопасными.

[0050]

В вышеуказанной молекуле ssPN, в качестве вышеуказанного пиперидинового скелета можно указать, например, скелет производного пиперидина, где один или более атомов углерода, составляющих 6-членное кольцо пиперидина, могут быть замещены. Когда замещение имеет место, то, например, предпочтительным является атом углерода, отличный от углерода С-2. Вышеуказанный атом углерода может быть замещен, например, атомом азота, атомом кислорода или атомом серы. Вышеуказанный пиперидиновый скелет может также содержать, например, в 6-членном кольце пиперидина, например, двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот. В вышеуказанном пиперидиновом скелете атом углерода и атом азота, составляющие 6-членное кольцо пиперидина, могут быть связаны, например, с атомом водорода или с указанным ниже заместителем. Вышеуказанная линкерная область (Lx) также может быть связана, например, с вышеуказанной областью (X) и вышеуказанной областью (Xc) через любую группу вышеуказанного пиперидинового скелета и предпочтительно с атомом углерода в положении 2 (C-2) и атомом азота вышеуказанного 6-членного кольца.

[0051]

Вышеуказанные линкерные области могут состоять, например, только из ненуклеотидного остатка(ов), имеющего вышеуказанную ненуклеотидную структуру, или могут содержать ненуклеотидный остаток(и), имеющий вышеуказанную ненуклеотидную структуру, и нуклеотидный остаток (и).

[0052]

В вышеуказанной молекуле ssPN вышеуказанная линкерная область представлена, например, следующей формулой (I):

[0053]

(I)

[0054]

в вышеуказанной формуле (I), например,

X¹ и X² каждый независимо представляет H₂, O, S или NH;

Y¹ и Y² каждый независимо представляет простую связь, CH₂, NH, O или S;

R³ представляет атом водорода или заместитель, который связан с C-3, C-4, C-5 или C-6 в кольце A;

L¹ представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен ОН, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aR^b, SH или SR^a; или

L¹ представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;

при условии, что: когда Y¹ представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y¹ в L¹, представляет атом углерода, атом, связанный с OR¹ в L¹, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;

L² представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH или SR^c; или

L² представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;

при условии, что: когда Y² представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y² в L², является атомом углерода, атом, связанный с OR² в L², является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;

R^a, R^b, R^c и R^d каждый независимо является заместителем или защитной группой;

l равно 1 или 2;

m равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;

n равно целому числу в диапазоне от 0 до 30; и

в кольце А один атом углерода, отличный от вышеуказанного С-2 в кольце А, может быть замещен атомом азота, кислорода или серы, и может содержать в вышеуказанном кольце А двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот;

вышеуказанные области (Yc) и (Y) каждая связаны с вышеуказанной линкерной областью (Ly) через -OR¹- или -OR²-,

где R¹ и R² могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R¹ и R² каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (I).

[0055]

В вышеуказанной формуле (I), например, X1 и X2 каждый независимо представляет H2, O, S или NH. В вышеуказанной формуле (I) «X1 представляет H2» означает, что X1 образует CH2 (метиленовую группу) вместе с атомом углерода, с которым связан X1. То же самое относится к X2.

[0056]

В вышеуказанной формуле (II) Y1 и Y2 каждый независимо представляет простую связь, CH2, NH, O или S.

[0057]

В вышеуказанной формуле (I) l в кольце A равно 1 или 2; когда l=1, то кольцо A представляет собой 5-членное кольцо, например, вышеуказанный пирролидиновый скелет. Вышеуказанный пирролидиновый скелет представляет, например, пролиновый скелет, пролиноловый скелет или тому подобное, и иллюстрируется его двухвалентными структурами. Когда l=2, то кольцо A представляет 6-членное кольцо, например, вышеуказанный пиперидиновый скелет. В кольце А один атом углерода, отличный от С-2 в кольце А, может быть замещен атомом азота, кислорода или серы. Кольцо А может содержать, в кольце А, двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот. Кольцо A представляет, например, тип L или тип D.

[0058]

В вышеуказанной формуле (I) R3 представляет атом водорода или заместитель, связанный с C-3, C-4, C-5 или C-6 в кольце A. Когда R3 является вышеуказанным заместителем, то заместитель R3 может быть одним или несколькими, или может отсутствовать. Когда присутствует несколько R3, то они могут быть одинаковыми или различными.

[0059]

Заместитель R3 представляет, например, атом галогена, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4, оксогруппу (=O) и тому подобное.

[0060]

R4 и R5 каждый независимо представляют, например, заместитель или защитную группу и могут быть одинаковыми или различными. Примеры вышеуказанного заместителя включают атом галогена, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, гетероарил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклоалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкил, гетероарилалкил, силил, силилоксиалкил и тому подобное. То же самое относится и далее. Заместитель R3 может быть выбран из заместителей, указанных выше.

[0061]

Вышеуказанная защитная группа представляет функциональную группу, которая инактивирует, например, высокореакционноспособную функциональную группу. Примеры защитной группы включают известные защитные группы и тому подобное. В отношение вышеуказанной защитной группы, то, например, здесь может быть включено описание, имеющееся в литературе (J.F.W. McOmie, «Protecting Groups in Organic Chemistry», Prenum Press, London and New York, 1973). Вышеуказанная защитная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают трет-бутилдиметилсилил (TBDMS), бис(2-ацетоксиэтилокси)метил (АСЕ), триизопропилсилилоксиметил (ТОМ), 1-(2-цианоэтокси)этил (CEE), 2-цианоэтоксиметил (CEM), толилсульфонилэтоксиметил (TEM), диметокситритил (DMTr) и тому подобное. Когда R³ представляет OR⁴, то вышеуказанная защитная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают группу TBDMS, группу ACE, группу TOM, группу CEE, группу CEM, группу TEM. Другие примеры защитной группы включают силилсодержащие группы, которые будут описаны ниже. То же самое относится и далее.

[0062]

В вышеуказанной формуле (I) L¹ представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов. Атом(ы) водорода при вышеуказанном атоме(ам) углерода алкилена может быть замещен или не замещен, например, OH, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aR^b, SH или SR^a. Альтернативно, L¹ может представлять полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода. Вышеуказанная полиэфирная цепь представляет, например, полиэтиленгликоль. Когда Y¹ представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y¹ в L¹, является атомом углерода, атом, связанный с OR¹ в L¹, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом. То есть, например, когда Y¹ представляет О, то этот атом кислорода и атом кислорода в L¹ не являются смежными друг с другом, и атом кислорода в OR¹ и атом кислорода в L¹ не являются смежными друг с другом.

[0063]

В вышеуказанной формуле (I) L² представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов. Атом(ы) водорода при вышеуказанном атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен, например, OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH или SR^c. Альтернативно, L² может представлять полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода. Когда Y² представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y² в L², является атомом углерода, атом, связанный с OR² в L², представляет атом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом. То есть, например, когда Y² представляет О, то этот атом кислорода и атом кислорода в L² не являются смежными друг с другом, и атом кислорода в OR² и атом кислорода в L² не являются смежными друг с другом.

[0064]

n в L¹ и m в L² особым образом не ограничиваются, и нижний предел каждого из них может составлять, например, 0, и также верхний предел того же особым образом не ограничивается. Например, n и m могут быть установлены как соответствующие в зависимости от желаемой длины вышеуказанной ненуклеотидной структуры. Например, с точки зрения стоимости производства, выхода и т.п., n и m предпочтительно равны от 0 до 30, более предпочтительно от 0 до 20 и еще более предпочтительно от 0 до 15. Значения n и m могут быть одинаковыми (n=m) или различными. n+m представляет, например, от 0 до 30, предпочтительно от 0 до 20 и более предпочтительно от 0 до 15.

[0065]

Например, R^a, R^b, R^c и R^d каждый независимо представляет заместитель или защитную группу. Примеры вышеуказанного заместителя и вышеуказанной защитной группы являются такими же, как определено выше.

[0066]

В вышеуказанной формуле (I) каждый атом водорода может быть независимо замещен, например, атомом галогена, таким как Cl, Br, F, I и тому подобное.

[0067]

Вышеуказанные области (Хс) и (X) каждая связана с вышеуказанной линкерной областью (Lx), например, через -OR¹- или -OR²-. R¹ и R² могут присутствовать или отсутствовать. Когда R¹ и R² присутствуют, то R¹ и R² каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или структуру, представленную вышеуказанной формулой (I). Когда R¹ и/или R² представляют/представляет вышеуказанный нуклеотидный остаток, то вышеуказанная линкерная область (Lx) образована, например, вышеуказанным ненуклеотидным остатком, имеющим структуру вышеуказанной формулы (I), исключая нуклеотидный остаток R¹ и/или R², и вышеуказанный нуклеотидный остаток(и). Когда R¹ и/или R² представляют/представляет структуру, представленную вышеуказанной формулой (I), то структура вышеуказанной линкерной области (Lx) такова, что, например, два или более из вышеуказанных ненуклеотидных остатков, имеющих структуру вышеуказанной формулы (I), связаны друг с другом. Количество структур вышеуказанной формулы (I) может составлять, например, 1, 2, 3 или 4. Когда вышеуказанная линкерная область (Lx) включает несколько вышеуказанных структур, то структуры вышеуказанной формулы (I) могут быть связаны, например, либо непосредственно, либо посредством вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов). С другой стороны, когда R¹ и R² отсутствуют, то вышеуказанная линкерная область (Lx) образована, например, только вышеуказанным ненуклеотидным остатком, имеющим структуру вышеуказанной формулы (I).

[0068]

Комбинация вышеуказанных областей (Xc) и (X) с -OR¹- и -OR²- особым образом не ограничивается и может представлять, например, любое из следующих условий.

Условие (1):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно.

Условие (2):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR¹- и -OR²-, соответственно.

[0069]

Примеры структуры вышеуказанной формулы (I) включают структуры следующих формул (II-1)-(II-9). В следующих формулах n и m являются такими же, как в вышеуказанной формуле (I). В следующих формулах q равно целому числу от 0 до 10.

[0070]

[0071]

В вышеприведенных формулах (I-1)-(I-9) значения n, m и q особым образом не ограничиваются и являются такими, как определено выше. Конкретным примером этого является вышеуказанная формула (I-1), где n=8, n=3 в вышеуказанной формуле (I-2), n=4 или 8 в вышеуказанной формуле (I-3), n=7 или 8 в вышеуказанной формуле (I-4), n=3 и m=4 в вышеуказанной формуле (I-5), n=8 и m=4 в вышеуказанной формуле (I-6), n=8 и m=4 в вышеуказанной формуле (I-7), n=5 и m=4 в вышеуказанной формуле (I-8), и q=1 и m=4 в вышеуказанной формуле (I-9). Один вариант осуществления (n=8) вышеуказанной формулы (II-4) показан в следующей формуле (I-4a), и один вариант осуществления (n=5, m=4) вышеуказанной формулы (I-8) показан в следующей формуле (I-8а).

[0072]

(1-4а)

(1-8а)

[0073]

В вышеуказанной молекуле ssPN вышеуказанная область (Xc) является комплементарной вышеуказанной области (X). Таким образом, в вышеуказанной молекуле ssPN двойная цепь может образоваться обратным фолдингом вышеуказанной области (Xc) к области (X) и самоотжигом вышеуказанных областей (Xc) и (X).

[0074]

В вышеуказанной молекуле ssPN, например, только вышеуказанная область (Xc) может подвергаться обратному фолдингу с образованием двойной цепи с вышеуказанной областью (X), или другая двойная цепь может образоваться в другой области. Ниже первая молекула ssPN, то есть молекула ssPN, в которой происходит образование двойной цепи в одном месте, упоминается как «первая молекула ssPN», и последняя молекула ssPN, т. е. молекула ssPN, в которой происходит образование двойной цепи в двух положениях, называется «второй молекулой ssPN». Примеры вышеуказанной первой и второй молекул ssPN приведены ниже. Следует, однако, отметить, что настоящее изобретение не ограничивается этими иллюстративными примерами.

[0075]

(1-1) Первая молекула ssPN

Вышеуказанная первая молекула ssPN представляет собой, например, молекулу, включающую вышеуказанную область (X), вышеуказанную область (Xc) и вышеуказанную линкерную область (Lx).

[0076]

Вышеуказанная первая молекула ssPN может включать вышеуказанную область (Xc), вышеуказанную линкерную область (Lx) и вышеуказанную область (X) в таком порядке, например, от 5'-конца к 3'-концу, или может включать вышеуказанную область (Xc), вышеуказанную линкерную область (Lx) и вышеуказанную область (X) в таком порядке от 3'-конца к 5'-концу.

[0077]

В вышеуказанной первой молекуле ssPN вышеуказанная область (Xc) является комплементарной вышеуказанной области (X). Необходимо только, чтобы вышеуказанная область (Xc) имела последовательность, комплементарную всей области или участку вышеуказанной области (X). Предпочтительно вышеуказанная область (Xc) включает или состоит из последовательности, комплементарной всей области или участку области (X). Вышеуказанная область (Xc) может быть, например, полностью комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (X), или одно или более оснований в области (Xc) могут быть не комплементарными им. Предпочтительно область (Xc) является полностью комплементарной ей. Вышеуказанное выражение «одно или несколько оснований» означает, например, 1-3 основания, предпочтительно 1 основание или 2 основания.

[0078]

В вышеуказанной первой молекуле ssPN вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии вставлена, по меньшей мере, в одну из вышеуказанных областей (Xc) и (X), как описано выше. Вышеуказанная первая молекула ssPN может включать, например, одну контрольную последовательность экспрессии или две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше.

[0079]

В последнем случае вышеуказанная первая молекула ssPN может включать, например: две или более одинаковых контрольных последовательностей экспрессии для одного и того же гена-мишени; две или более различных контрольных последовательностей экспрессии для одного и того же гена-мишени; или две или более различных контрольных последовательностей экспрессии для разных генов-мишеней. Когда вышеуказанная первая молекула ssPN включает две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше, то положения соответствующих контрольных последовательностей экспрессии особым образом не ограничиваются, и они могут находиться в одной области или в разных областях, выбранных из вышеуказанных областей (X) и (Xc). Когда вышеуказанная первая молекула ssPN включает две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше, для разных генов-мишеней, то, например, вышеуказанная первая молекула ssPN может контролировать экспрессию двух или более видов различных генов-мишеней.

[0080]

Один вариант осуществления вышеуказанной первой молекулы ssPN описан в WO 2012/017919, фиг. 1, и может быть отнесен к этому.

[0081]

В вышеуказанной первой молекуле ssPN число оснований в каждой из вышеуказанных областей (Xc) и (X) особым образом не ограничивается. Примеры длин соответствующих областей приведены ниже. Однако следует отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается этим. В настоящем изобретении «число оснований» означает, например, «длину», и его также можно назвать «длиной оснований». В настоящем изобретении цифровой диапазон числа оснований раскрывает все положительные целые числа, которые попадают в этот диапазон. Например, описание «1-4 основания» означает все «1, 2, 3, 4 основания» (ниже то же самое).

[0082]

Вышеуказанная область (Xc) может представлять, например, полностью комплементарную всей области вышеуказанной области (X). В этом случае это означает, например, что вышеуказанная область (Xc) состоит из последовательности оснований, комплементарной всей области, простирающейся от 5'-конца до 3'-конца вышеуказанной области (X). Другими словами, это означает, что вышеуказанная область (Xc) имеет такую же длину оснований, что и вышеуказанная область (X), и все основания в вышеуказанной области (Xc) являются комплементарными всем основаниям в вышеуказанной области (X).

[0083]

Кроме того, вышеуказанная область (Xc) может быть, например, полностью комплементарной участку вышеуказанной области (X). В данном случае это означает, например, что вышеуказанная область (Xc) состоит из последовательности оснований, комплементарной участку вышеуказанной области (X). Другими словами, это означает, что вышеуказанная область (Xc) состоит из последовательности оснований, длина оснований которой меньше длины оснований вышеуказанной области (X) на одно или более оснований, и все основания в вышеуказанной области (Xc) комплементарны всем основаниям в части вышеуказанной области (X). Вышеуказанный участок области (X) предпочтительно представляет область, имеющую последовательность оснований, состоящую, например, из последовательных оснований, начиная с основания на конце (1-ое основание) в вышеуказанной области (Xc) в вышеуказанной области (X).

[0084]

В вышеуказанной первой молекуле ssPN соотношение между числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Xc) в вышеуказанной области (Xc) удовлетворяет, например, следующему условию (3) или (5). Например, в первом случае, в частности, выполняется следующее условие (11):

X > Xc (3)

X - Xc=1-10, предпочтительно 1, 2 или 3,

более предпочтительно 1 или 2 (11)

X=Xc (5)

[0085]

Когда вышеуказанная область (X) и/или вышеуказанная область (Xc) включают(ет) вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная область может представлять, например, область, состоящую только из вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, или область, включающую вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Число оснований в вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии составляет, например, 19-30, предпочтительно 19, 20 или 21. В области(х), включающей вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, например, вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии также может включать дополнительную последовательность на 5'-конце и/или 3'-конце. Число оснований в вышеуказанной дополнительной последовательности составляет, например, от 1 до 31, предпочтительно от 1 до 21 и более предпочтительно от 1 до 11.

[0086]

Число оснований в вышеуказанной области (X) особым образом не ограничивается. Когда вышеуказанная область (X) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то нижний предел числа оснований в вышеуказанной области (X) составляет, например, 19, и его верхний предел составляет, например, 50, предпочтительно 30 и более предпочтительно 25. В частности, число оснований в вышеуказанной области (Х) составляет, например, от 19 до 50, предпочтительно от 19 до 30 и более предпочтительно от 19 до 25.

[0087]

Число оснований в вышеуказанной области (Xc) особым образом не ограничивается. Нижний предел числа оснований в вышеуказанной области (Xc) составляет, например, 19, предпочтительно 20 и более предпочтительно 21, и его верхний предел составляет, например, 50, более предпочтительно 40, и еще более предпочтительно 30.

[0088]

В вышеуказанной молекуле ssPN длина вышеуказанной линкерной области (Lx) особым образом не ограничивается. Длина вышеуказанной линкерной области (Lx) предпочтительно такова, что, например, вышеуказанные области (X) и (Xc) могли образовывать двойную цепь. Когда вышеуказанная линкерная область (Lx) включает вышеуказанный нуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанному ненуклеотидному остатку(ам), то нижний предел числа оснований в вышеуказанной линкерной области (Lx) составляет, например, 1, предпочтительно 2 и более предпочтительно 3, и его верхний предел составляет, например, 100, предпочтительно 80 и более предпочтительно 50.

[0089]

Полная длина вышеуказанной первой молекулы ssPN особым образом не ограничивается. В вышеуказанной первой молекуле ssPN нижний предел общего числа оснований (число оснований в полноразмерной молекуле ssPN) составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51, и, наиболее предпочтительно 52, и его верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80. В вышеуказанной первой молекуле ssPN нижний предел общего числа оснований, исключая число в вышеуказанной линкерной области (Lx), составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51 и наиболее предпочтительно 52, и его верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80.

[0090]

(1-2) Вторая молекула ssPN

Вышеуказанная вторая молекула ssPN представляет молекулу, которая дополнительно включает область (Y) и область (Yc), которая является комплементарной вышеуказанной области (Y), в дополнение, например, к вышеуказанной области (X), вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной области (Xc). В вышеуказанной второй молекуле ssPN внутренняя область (Z) состоит из вышеуказанной области (X) и вышеуказанной области (Y), которые связаны друг с другом. Описание вышеуказанной первой молекулы ssPN также относится к вышеуказанной второй молекуле ssPN, если не указано иное.

[0091]

Вышеуказанная вторая молекула ssPN может включать, например, вышеуказанную область (Xc), вышеуказанную линкерную область (Lx), вышеуказанную область (X), вышеуказанную область (Y) и вышеуказанную область (Yc) в таком порядке от 5'-конца к 3'-концу. В этом случае вышеуказанная область (Xc) также относится к «5'-концевой области (Xc)»; вышеуказанная область (X) в вышеуказанной внутренней области (Z) также относится к «внутренней 5'-концевой области (X)»; вышеуказанная область (Y) в вышеуказанной внутренней области (Z) также относится к «внутренней 3'-концевой области (Y)»; и вышеуказанная область (Yc) также относится к «3'-концевой области (Yc)». Альтернативно, вышеуказанная вторая молекула ssPN может включать, например, вышеуказанную область (Xc), вышеуказанную линкерную область (Lx), вышеуказанную область (X), вышеуказанную область (Y) и вышеуказанную область (Yc) в таком порядке от 3'-конца к 5'-концу. В этом случае вышеуказанная область (Xc) также относится к «3'-концевой области (Xc)»; вышеуказанная область (X) в вышеуказанной внутренней области (Z) также относится к «внутренней 3'-концевой области (X)»; вышеуказанная область (Y) в вышеуказанной внутренней области (Z) также относится к «внутренней 5'-концевой области (Y)»; и вышеуказанная область (Yc) также относится к «5'-концевой области (Yc)».

[0092]

Как описано выше, вышеуказанная внутренняя область (Z) состоит, например, из вышеуказанных областей (X) и (Y), которые связаны друг с другом. Например, вышеуказанные области (X) и (Y) связаны непосредственно друг с другом без промежуточной последовательности между ними. Вышеуказанная внутренняя область (Z) определяется как «состоящая из вышеуказанных областей (X) и (Y), которые связаны друг с другом» просто для обозначения статуса последовательности между вышеуказанными областями (Xc) и (Yc). Данное определение не предназначено для ограничения того, что при использовании вышеуказанной молекулы ssPN вышеуказанные области (X) и (Y) в вышеуказанной внутренней области (Z) являются дискретными независимыми областями. То есть, например, когда вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии включается в вышеуказанную внутреннюю область (Z), то вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии может быть расположена таким образом, чтобы простираться через вышеуказанные области (X) и (Y) в вышеуказанной внутренней области (Z).

[0093]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN вышеуказанная область (Xc) является комплементарной вышеуказанной области (X). Необходимо только, чтобы вышеуказанная область (Xc) имела последовательность, комплементарную всей области или участку вышеуказанной области (X). Предпочтительно вышеуказанная область (Xc) включает или состоит из последовательности, комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (X). Вышеуказанная область (Xc) может быть, например, полностью комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (X), или одно или несколько оснований в вышеуказанной области (Xc) могут не быть комплементарными тому же. Предпочтительно вышеуказанная область (Xc) является полностью комплементарной ей. Вышеуказанное выражение «одно или несколько оснований» означает, например, 1-3 основания, предпочтительно 1 основание или 2 основания.

[0094]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN вышеуказанная область (Yc) является комплементарной вышеуказанной области (Y). Необходимо только, чтобы вышеуказанная область (Yc) имела последовательность, комплементарную всей области или участку вышеуказанной области (Y). Предпочтительно вышеуказанная область (Yc) включает или состоит из последовательности, комплементарной всей области или участку области (Y). Вышеуказанная область (Yc) может быть, например, полностью комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (Y), или одно или несколько оснований в области (Yc) могут быть не комплементарными им. Предпочтительно область (Yc) является полностью комплементарной ей. Вышеуказанное выражение «одно или несколько оснований» означает, например, 1-3 основания, предпочтительно 1 основание или 2 основания.

[0095]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN, по меньшей мере, одна из вышеуказанной внутренней области (Z), которая состоит из вышеуказанных областей (X) и (Y), и вышеуказанной области (Xc) включает, например, вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Кроме того, вышеуказанная область (Yc) также может включать вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то например, любая из вышеуказанных областей (X) и (Y) может включать вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, или вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии может быть включена таким образом, чтобы простираться через вышеуказанные области (X) и (Y). Вышеуказанная вторая молекула ssPN может включать, например, одну вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии или две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше.

[0096]

Когда вышеуказанная вторая молекула ssPN включает две или более контрольных последовательностей экспрессии, то упомянутых выше, то положения соответствующих контрольных последовательностей экспрессии особым образом не ограничиваются. Они могут находиться в одной из вышеуказанной внутренней области (Z) и вышеуказанной области (Xc) или могут находиться в одной из вышеуказанной внутренней области (Z) и вышеуказанной области (Xc), и любой другой области, помимо этих областей.

[0097]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN, например, вышеуказанные области (Yc) и (Y) могут быть связаны друг с другом прямо или опосредованно. В первом случае, например, вышеуказанные области (Yc) и (Y) могут быть связаны непосредственно фосфодиэфирной связью или тому подобное. В последнем случае, например, вышеуказанная вторая молекула ssPN может быть сконфигурирована таким образом, что она имеет линкерную область (Ly) между вышеуказанными областями (Yc) и (Y), и вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны посредством вышеуказанной линкерной области (Ly).

[0098]

Когда вышеуказанная вторая молекула ssPN содержит вышеуказанную линкерную область (Ly), то, например, вышеуказанная линкерная область (Ly) может представлять линкер, состоящий из вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов), или линкер, имеющий ненуклеотидную структуру, включающую, по меньшей мере, одно из пирролидинового скелета и пиперидинового скелета, такого как описан выше. В последнем случае вышеуказанная линкерная область (Ly) может быть представлена, например, вышеуказанной формулой (I), и все описания, относящиеся к вышеуказанной формуле (I), указанные выше для вышеуказанной линкерной области (Lx), также относятся к вышеуказанной линкерной области (Ly).

[0099]

Вышеуказанные области (Yс) и (Y) каждая связана с вышеуказанной линкерной областью (Ly) через -OR¹- или -OR²-. В вышеуказанной линкерной области (Ly) R¹ и R² могут присутствовать или отсутствовать, как в вышеуказанной линкерной области (Lx).

[0100]

Комбинация вышеуказанных областей (Xc) и (X) с вышеуказанными -OR¹- и -OR²- и комбинация вышеуказанных областей (Yc) и (Y) с вышеуказанными -OR¹- и -OR²- особым образом не ограничивается, и может представлять, например, любое из следующих условий:

Условие (1):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно; и

вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно.

Условие (2):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно; и

вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно.

Условие (3):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно; и

вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно.

Условие (4):

вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно; и

вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²- и -OR¹-, соответственно.

[0101]

В отношение вышеуказанной второй молекулы ssPN, то один вариант осуществления молекулы ssPN, содержащий вышеуказанную линкерную область (Ly), описан в WO 2012/017919, фиг. 2, и ее можно отнести к этому.

[0102]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN число оснований в каждой из вышеуказанных областей (Xc), (X), (Y) и (Yc) особым образом не ограничивается. Примеры длин соответствующих областей приведены ниже. Следует, однако, отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается этими значениями.

[0103]

Как описано выше, например, вышеуказанная область (Xc) может быть комплементарной всей области вышеуказанной области (X). В этом случае предпочтительно, чтобы, например, вышеуказанная область (Xc) имела ту же длину оснований, что и вышеуказанная область (X), и состояла из последовательности оснований, комплементарной всей области вышеуказанной области (X). Более предпочтительно, чтобы вышеуказанная область (Xc) имела ту же длину оснований, что и вышеуказанная область (X), и все основания в вышеуказанной области (Xc) были комплементарными всем основаниям в вышеуказанной области (X), т.е., например, область (Xc) является полностью комплементарной области (X). Следует, однако, отметить, что конфигурация области (Xc) не ограничивается этим, и одно или несколько оснований в области (Xc) могут быть не комплементарны соответствующим основаниям в области (X), например, как описано выше.

[0104]

Кроме того, как описано выше, вышеуказанная область (Xc) может быть комплементарной, например, участку вышеуказанной области (X). В этом случае предпочтительно, чтобы, например, вышеуказанная область (Xc) имела ту же длину оснований, что и участок вышеуказанной области (X), т.е. вышеуказанная область (Xc) состояла из последовательности оснований, длина оснований которой меньше длины оснований вышеуказанной области (X) на одно или более оснований. Более предпочтительно, чтобы вышеуказанная область (Xc) имела ту же длину оснований, что и участок вышеуказанной области (X), и все основания в вышеуказанной области (Xc) были комплементарными всем основаниям в участке вышеуказанной области (X), т.е., например, область (Xc) была полностью комплементарной участку области (X). Участок вышеуказанной области (X) предпочтительно представляет область, имеющую последовательность оснований, состоящую, например, из последовательных оснований, начиная от основания на конце (1-ое основание) в вышеуказанной области (Xc) в вышеуказанной области (X).

[0105]

Как описано выше, вышеуказанная область (Yc) может быть комплементарной, например, всей области вышеуказанной области (Y). В этом случае предпочтительно, чтобы, например, вышеуказанная область (Yc) имела ту же длину оснований, что и вышеуказанная область (Y), и состояла из последовательности оснований, комплементарной всей области вышеуказанной области (Y). Более предпочтительно, чтобы вышеуказанная область (Yc) имела ту же длину оснований, что и вышеуказанная область (Y), и все основания в вышеуказанной области (Yc) были комплементарными всем основаниям в вышеуказанной области (Y), т.е., например, область (Yc) была полностью комплементарной области (Y). Следует, однако, отметить, что конфигурация области (Yc) не ограничивается этим, и одно или несколько оснований в области (Yc) могут быть не комплементарны соответствующим основаниям в области (Y), например, как описано выше.

[0106]

Кроме того, как описано выше, вышеуказанная область (Yc) может быть комплементарной, например, участку вышеуказанной области (Y). В этом случае предпочтительно, чтобы, например, вышеуказанная область (Yc) имела ту же длину оснований, что и участок вышеуказанной области (Y), т.е. вышеуказанная область (Yc) состояла из последовательности оснований, длина которой короче длины оснований вышеуказанной области (Y) на одно или более оснований. Более предпочтительно, чтобы вышеуказанная область (Yc) имела ту же длину оснований, что и участок вышеуказанной области (Y), и все основания в вышеуказанной области (Yc) были комплементарными всем основаниям в участке вышеуказанной области (Y), т.е., например, область (Yc) является полностью комплементарной участку области (Y). Участок вышеуказанной области (Y) предпочтительно представляет область, имеющую последовательность оснований, состоящую, например, из последовательных оснований, начиная от основания на конце (1-е основание) в вышеуказанной области (Yc) в вышеуказанной области (Y).

[0107]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN соотношение между числом оснований (Z) в вышеуказанной внутренней области (Z) и числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Y) в вышеуказанной области (Y), и соотношение между числом оснований (Z) в вышеуказанной внутренней области (Z) и числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Xc) в вышеуказанной области (Xc) удовлетворяет, например, условиям следующих уравнений (1) и (2).

Z=X+Y (1)

Z≥Xc+Yc (2)

[0108]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN соотношение между числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Y) в вышеуказанной области (Y) особым образом не ограничивается и удовлетворяет, например, любому условию следующих уравнений:

X=Y (19)

X < Y (20)

X > Y (21).

[0109]

Во второй молекуле ssPN соотношение между числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Xc) в вышеуказанной области (Xc) и соотношение между числом оснований (Y) в вышеуказанной области (Y) и числом оснований (Yc) в вышеуказанной области (Yc) удовлетворяют, например, любому из следующих условий уравнений (a)-(d):

(а) Условия следующих уравнений (3) и (4) удовлетворяются.

X > Xc (3)

Y=Yc (4)

(b) Условия следующих уравнений (5) и (6) удовлетворяются.

X=Xc (5)

Y > Yc (6)

(с) Условия следующих уравнений (7) и (8) удовлетворяются.

X > Xc (7)

Y > Yc (8)

(d) Условия следующих уравнений (9) и (10) выполняются.

X=Xc (9)

Y=Yc (10)

[0110]

В вышеописанных условиях уравнений (а)-(d), например, разница между числом оснований (X) в вышеуказанной области (X) и числом оснований (Xc) в вышеуказанной области (Xc), и разница между числом оснований (Y) в вышеуказанной области (Y) и числом оснований (Yc) в вышеуказанной области (Yc) предпочтительно удовлетворяет следующим условиям.

(а) Условия следующих уравнений (11) и (12) удовлетворяются.

X - Xc=1-10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4,

более предпочтительно 1, 2 или 3 (11)

Y - Yc=0 (12)

(b) Условия следующих уравнений (13) и (14) удовлетворяются.

X - Xc=0 (13)

Y - Yc=1-10, предпочтительно 1, 2, 3 или 4,

более предпочтительно 1, 2 или 3 (14)

(с) Условия следующих уравнений (15) и (16) удовлетворяются.

X - Xc=1-10, предпочтительно 1, 2 или 3,

более предпочтительно 1 или 2 (15)

Y - Yc=1-10, предпочтительно 1, 2 или 3,

более предпочтительно 1 или 2 (16)

(d) Условия следующих уравнений (17) и (18) удовлетворяются.

X - Xc=0 (17)

Y - Yc=0 (18)

[0111]

В отношении вторых молекул ssPN вышеуказанных (а)-(d), то один вариант осуществления каждой структуры описан в WO 2012/017919, фиг. 3, и их можно отнести к этому.

[0112]

Молекулы ssPN вышеуказанных (а)-(с) представляют конфигурации, имеющие основание, не выравненное с обеими вышеупомянутыми областями (Xc) и (Yc) в вышеуказанной внутренней области (Z), поскольку, например, вышеуказанные области (Xc) и (X), и области (Yc) и (Y) образуют двойную цепь. Также они могут иметь указанные конфигурации, содержащими основание, не образующее двойную цепь. В вышеуказанной внутренней области (Z) вышеуказанное основание, которое не выравнивается (также относится к основанию, которое не образует двойную цепь), в дальнейшем упоминается как «непарное основание». На фиг. 3 в WO 2012/017919, область вышеуказанного непарного основания показана «F». Число оснований в вышеуказанной области (F) особым образом не ограничивается. Число оснований (F) в вышеуказанной области (F) представляет, например, число оснований «X-Xc» для молекулы ssPN согласно вышеуказанному (a); число оснований «Y-Yc» для молекулы ssPN согласно вышеуказанному (b); и общее число оснований «X-Xc» и число оснований «Y-Yc» для молекулы ssPN согласно вышеуказанному (c).

[0113]

С другой стороны, молекула ssPN, удовлетворяющая вышеуказанному условию (d), сконфигурирована таким образом, что, например, вся область вышеуказанной внутренней области (Z) выравнивается с вышеуказанными областями (Xc) и (Yc), другими словами, вся область вышеуказанной внутренней области (Z) образует двойную цепь. В молекуле ssPN, удовлетворяющей вышеуказанному условию (d), 5'-конец вышеуказанной области (Xc) и 3'-конец вышеуказанной области (Yc) не связаны друг с другом.

[0114]

Общее число оснований в вышеуказанной области (Xc), оснований в вышеуказанной области (Yc), и вышеуказанных неспаренных оснований (F) в вышеуказанной внутренней области (Z) равно числу оснований в вышеуказанной внутренней области (Z). Таким образом, длина вышеуказанной области (Xc) и длина вышеуказанной области (Yc) могут быть определены как соответствующие, в зависимости, например, от длины вышеуказанной внутренней области (Z), числа вышеуказанных неспаренных оснований и положений непарных оснований.

[0115]

Число оснований в вышеуказанной внутренней области (Z) составляет, например, 19 или более. Нижний предел числа оснований составляет, например, 19, предпочтительно 20 и более предпочтительно 21. Верхний предел числа вышеуказанных оснований составляет, например, 50, предпочтительно 40 и более предпочтительно 30. Конкретный пример числа оснований в вышеуказанной внутренней области (Z) равен 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30. Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то, например, такие условия являются предпочтительными.

[0116]

Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная внутренняя область (Z) может представлять, например, область, состоящую только из вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, или область, включающую вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Число оснований вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии составляет, например, 19-30, предпочтительно 19, 20 или 21. Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии также может иметь дополнительную последовательность на ее 5'-конце и/или 3'-конце. Число оснований в вышеуказанной дополнительной последовательности составляет, например, от 1 до 31, предпочтительно от 1 до 21, более предпочтительно от 1 до 11 и еще более предпочтительно от 1 до 7.

[0117]

Число оснований в вышеуказанной области (Xc) составляет, например, от 1 до 29, предпочтительно от 1 до 11, более предпочтительно от 1 до 7, еще более предпочтительно от 1 до 4 и наиболее предпочтительно 1, 2 или 3. Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) или вышеуказанная область (Yc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то, например, число оснований, как описано выше, является предпочтительным. Конкретным примером является следующее: когда число оснований в вышеуказанной внутренней области (Z) составляет от 19 до 30 (например, 19), то число оснований в вышеуказанной области (Xc) составляет, например, от 1 до 11, предпочтительно от 1 до 7, более предпочтительно от 1 до 4 и еще более предпочтительно 1, 2 или 3.

[0118]

Когда вышеуказанная область (Xc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная область (Xc) может представлять, например, область, состоящую только из вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, или область, включающую вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Например, длина вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии является такой, как описано выше. Когда вышеуказанная область (Xc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии также может иметь дополнительную последовательность на ее 5'-конце и/или 3'-конце. Число оснований в вышеуказанной дополнительной последовательности составляет, например, от 1 до 11, предпочтительно от 1 до 7.

[0119]

Число оснований в вышеуказанной области (Yc) составляет, например, от 1 до 29, предпочтительно от 1 до 11, более предпочтительно от 1 до 7, еще более предпочтительно от 1 до 4 и особенно предпочтительно 1, 2 или 3. Когда вышеуказанная внутренняя область (Z) или вышеуказанная область (Xc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то, например, число оснований, как описано выше, является предпочтительным. Конкретным примером является следующее: когда число оснований в вышеуказанной внутренней области (Z) составляет от 19 до 30 (например, 19), то число оснований в вышеуказанной области (Yc) составляет, например, от 1 до 11, предпочтительно от 1 до 7, более предпочтительно 1, 2, 3 или 4 и еще более предпочтительно 1, 2 или 3.

[0120]

Когда вышеуказанная область (Yc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная область (Yc) может представлять, например, область, состоящую только из вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, или область, включающую вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии. Длина вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии представляет, например, описанную выше. Когда вышеуказанная область (Yc) включает вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии, то вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии также может иметь дополнительную последовательность на ее 5'-конце и/или 3'-конце. Число оснований в вышеуказанной дополнительной последовательности составляет, например, от 1 до 11, предпочтительно от 1 до 7.

[0121]

Как описано выше, соотношение между числом оснований в вышеуказанной внутренней области (Z), числом оснований в вышеуказанной области (Xc) и числом оснований в вышеуказанной области (Yc) может быть выражено, например, вышеуказанным уравнением (2): «Z≥Xc+Yc». В частности, число оснований, представленных «Xc+Yc», например, равно числу оснований в вышеуказанной внутренней области (Z) или меньше числа оснований в вышеуказанной внутренней области (Z). В последнем случае «Z - (Xc+Yc)» составляет, например, от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 4 и более предпочтительно 1, 2 или 3. Вышеуказанное «Z - (Xc+Yc)» соответствует, например, числу оснований (F) в области непарных оснований (F) в вышеуказанной внутренней области (Z).

[0122]

В вышеуказанной второй молекуле ssPN длины вышеуказанных линкерных областей (Lx) и (Ly) особым образом не ограничиваются. Вышеуказанная линкерная область (Lx) является такой, как описано выше. Когда составляющее звено вышеуказанной линкерной области (Ly) включает основание(я), то нижний предел числа оснований в вышеуказанной линкерной области (Ly) составляет, например, 1, предпочтительно 2 и более предпочтительно 3, и его верхний предел составляет, например, 100, предпочтительно 80 и более предпочтительно 50. Число оснований в каждой из вышеуказанных линкерных областей составляет, в частности, от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 7 или от 1 до 4, например, но оно не ограничивается данными примерами.

[0123]

Вышеуказанная линкерная область (Ly) может быть, например, такой же или отличной от вышеуказанной линкерной области (Lx).

[0124]

Полная длина вышеуказанной второй молекулы ssPN особым образом не ограничивается. В вышеуказанной второй молекуле ssPN нижний предел общего числа оснований (число оснований в молекуле ssPN полноразмерной длины) составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51, и наиболее предпочтительно 52, и его верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80. В вышеуказанной второй молекуле ssPN нижний предел общего числа оснований (Lx) и (Ly) составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51 и наиболее предпочтительно 52, и его верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80.

[0125]

В вышеуказанной молекуле ssPN необходимо только, чтобы вышеуказанная линкерная область (Lx) имела вышеуказанную ненуклеотидную структуру, как описано выше, и другие составляющие звенья особым образом не ограничиваются. Примеры вышеуказанных нуклеотидных остатков включают рибонуклеотидный остаток и дезоксирибонуклеотидный остаток. Вышеуказанной нуклеотидный остаток может представлять, например, остаток, который не является модифицированным (немодифицированный нуклеотидный остаток), или остаток, который был модифицирован (модифицированный нуклеотидный остаток). Можно сконструировать вышеуказанную молекулу ssPN с включением вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка, например, для повышения устойчивости миРНК природного типа к нуклеазе, что позволит повысить стабильность молекулы ssPN. Кроме того, молекула ssPN дополнительно может включать, например, ненуклеотидный остаток в дополнение к вышеуказанному нуклеотидному остатку.

[0126]

Вышеуказанный нуклеотидный остаток является предпочтительным в качестве составляющего звена каждой из вышеуказанной области (Xc), вышеуказанной области (X), вышеуказанной (Y) и вышеуказанной области (Yc). Каждая из вышеуказанных областей состоит, например, из любого из следующих остатков (1)-(3):

(1) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(2) модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(3) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов).

[0127]

Вышеуказанная линкерная область (Lx) может состоять, например, только из вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов) или может состоять из вышеуказанного ненуклеотидного и вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов). Вышеуказанная линкерная область (Lx) состоит, например, из любого из следующих остатков (4)-(7):

(4) ненуклеотидного остатка(ов)

(5) ненуклеотидного остатка(ов) и немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(6) ненуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка (ов)

(7) ненуклеотидного остатка(ов), немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов).

[0128]

Конкретные составляющие звенья вышеуказанной линкерной области (Ly) особым образом не ограничиваются, и их примеры включают вышеуказанные нуклеотидные остатки и вышеуказанные ненуклеотидные остатки, как описано выше. Каждая из вышеуказанных линкерных областей (Ly) может состоять, например, только из вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов), только из вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов) или обоих вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов) и вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов). Каждая из вышеуказанных линкерных областей (Ly) состоит, например, из любого из следующих остатков (1)-(7):

(1) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(2) модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(3) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(4) ненуклеотидного остатка(ов)

(5) ненуклеотидного остатка(ов) и немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(6) ненуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка (ов)

(7) ненуклеотидного остатка(ов), немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов).

[0129]

Примеры вышеуказанной молекулы ssPN, исключая вышеуказанную линкерную область (Lx), включают молекулы, состоящие только из вышеуказанных нуклеотидных остатков; и молекулы, включающие вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанным нуклеотидным остаткам. В вышеуказанной молекуле ssPN, например, вышеуказанные нуклеотидные остатки могут представлять только вышеуказанные немодифицированные нуклеотидные остатки; только вышеуказанные модифицированные нуклеотидные остатки; или оба вышеуказанный немодифицированный нуклеотидный остаток(и) и вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток(и), как описано выше. Когда вышеуказанная молекула ssPN включает как вышеуказанный немодифицированный нуклеотидный остаток(и), так и вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток(и), то число вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается и, например, в частности, равно, «от одного до нескольких», в частности, например, 1-5, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1-3 и наиболее предпочтительно 1-2. Когда вышеуказанная молекула ssPN включает вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и), то число вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается и, например, составляет «от одного до нескольких», в частности, например, 1 или 2.

[0130]

В вышеуказанной молекуле ssPN, например, вышеуказанный нуклеотидный остаток предпочтительно представляет рибонуклеотидный остаток. В этом случае, например, вышеуказанная молекула ssPN также относится к «молекуле ssRNA» или «молекуле P-ssRNA». Примеры вышеуказанной молекулы ssRNA, исключая вышеуказанную линкерную область (Lx), включают молекулы, состоящие только из вышеуказанных рибонуклеотидных остатков; и молекулу, включающую вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанным рибонуклеотидным остаткам. Как описано выше, в качестве вышеуказанных рибонуклеотидных остатков, например, вышеуказанная молекула ssRNA может включать: только вышеуказанные немодифицированные рибонуклеотидные остатки; только вышеуказанные модифицированные рибонуклеотидные остатки; или оба вышеуказанный немодифицированный рибонуклеотидный остаток(и) и вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток(и).

[0131]

Когда вышеуказанная молекула ssRNA включает, например, вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток в дополнение к вышеуказанным немодифицированным рибонуклеотидным остаткам, то число вышеуказанного модифицированного рибонуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается и представляет, например, от «одного до нескольких», в частности, от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно от 1 до 3 и наиболее предпочтительно 1 или 2. Вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток в противоположность немодифицированному рибонуклеотидному остатку может представлять, например, вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток, полученный замещением остатка рибозы на остаток дезоксирибозы. Когда вышеуказанная молекула ssRNA включает, например, вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанному немодифицированному рибонуклеотидному остатку(ам), то число вышеуказанного дезоксирибонуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается, и равно, например, «от одного до нескольких», в частности, например, 1-5, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1-3 и наиболее предпочтительно 1 или 2.

[0132]

Вышеуказанная молекула SSPN может включать, например, вещество для введения метки, и может быть помечена вышеуказанным веществом для мечения. Вышеуказанное вещество для введения метки особым образом не ограничивается и может представлять собой, например, флуоресцентное вещество, краситель, изотоп и тому подобное. Примеры вышеуказанного вещества для введения метки включают: флуорофоры, такие как пирен, TAMRA, флуоресцеин, краситель Cy3 и краситель Cy5. Примеры вышеуказанного красителя включают красители Alexa, такие как Alexa 488, и тому подобное. Примеры вышеуказанного изотопа включают стабильные изотопы и радиоизотопы. Среди них предпочтительными являются стабильные изотопы. Например, вышеуказанные стабильные изотопы имеют низкий риск радиационного облучения и при работе не требуют специальных средств. Таким образом, со стабильными изотопами легко обращаться, и это может способствовать снижению затрат. Кроме того, например, вышеуказанный стабильный изотоп не изменяет физических свойств соединения, помеченного им, и, таким образом, обладает отличным свойством в качестве индикатора. Вышеуказанный стабильный изотоп особым образом не ограничивается, и его примеры включают 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S и 36S.

[0133]

В настоящем изобретении термин «алкил» включает, например, алкильные группы с прямой или разветвленной цепью. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкиле особым образом не ограничивается и составляет, например, от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4. Примеры вышеуказанной алкильной группы включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, н-гептил, н-октил, н-нонил и н-децил. Среди них, например, предпочтительными являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил и тому подобное.

[0134]

В настоящем изобретении термин «алкенил» включает, например, алкенильные группы с прямой и разветвленной цепью. Примеры вышеуказанного алкенила включают вышеуказанные алкильные группы, содержащие одну или несколько двойных связей и тому подобное. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкениле особым образом не ограничивается и равно, например, такому же, как в вышеуказанном алкиле, предпочтительно от 2 до 8. Примеры вышеуказанного алкенила включают винил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1,3-бутадиенил и 3-метил-2-бутенил.

[0135]

В настоящем изобретении термин «алкинил» включает, например, алкинильные с прямой и разветвленной цепью. Примеры вышеуказанного алкинила включают вышеуказанные алкильные группы, содержащие одну или несколько тройных связей и тому подобное. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкиниле особым образом не ограничивается и равно, например, такому же, как в вышеуказанном алкиле, предпочтительно от 2 до 8. Примеры вышеуказанного алкинила включают этинил, пропинил и бутинил. Вышеуказанный алкинил может дополнительно содержать, например, одну или несколько двойных связей.

[0136]

В настоящем изобретении термин «арил» включает, например, моноциклические ароматические углеводородные группы и полициклические ароматические углеводородные группы. Примеры вышеуказанной моноциклической ароматической углеводородной группы включают фенил и тому подобное. Примеры вышеуказанной полициклической ароматической углеводородной группы включают 1-нафтил, 2-нафтил, 1-антрил, 2-антрил, 9-антрил, 1-фенантрил, 2-фенантрил, 3-фенантрил, 4-фенантрил и 9-фенантрил. Среди них, например, предпочтительными являются фенил, нафтилы, такие как 1-нафтил и 2-нафтил, и подобные.

[0137]

В настоящем изобретении термин «гетероарил» включает, например, моноциклические ароматические гетероциклические группы и конденсированные ароматические гетероциклические группы. Примеры вышеуказанного гетероарила включают фурилы (например, 2-фурил, 3-фурил), тиенилы (например, 2-тиенил, 3-тиенил), пирролилы (например, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил), имидазолилы (например, 1-имидазолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил), пиразолилы (например, 1-пиразолил, 3-пиразолил, 4-пиразолил), триазолилы (например, 1,2,4-триазол-1-ил, 1,2,4-триазол-3-ил, 1,2,4-триазол-4-ил), тетразолилы (например, 1-тетразолил, 2-тетразолил, 5-тетразолил), оксазолилы (например, 2-оксазолил, 4 -оксазолил, 5-оксазолил), изоксазолилы (например, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил), тиазолилы (например, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил), тиадиазолилы, изотиазолилы (например, 3-изотиазолил, 4-изотиазолил, 5-изотиазолил), пиридилы (например, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил), пиридазинилы (например, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил), пиримидинилы (например, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил), фуразанилы (например, 3-фуразанил), пиразинилы (например, 2-пиразинил), оксадиазолилы (например, 1,3,4-оксадиазол-2-ил), бензофурилы (например, 2-бензо[b]фурил, 3-бензо[b]фурил, 4-бензо[b]фурил, 5-бензо[b]фурил, 6-бензо[b]фурил, 7-бензо[b]фурил), бензотиенилы (например, 2-бензо[b]тиенил, 3-бензо[b]тиенил, 4-бензо[b]тиенил, 5-бензо[b]тиенил, 6-бензо[b]тиенил, 7-бензо[b]тиенил), бензимидазолилы (например, 1-бензимидазолил, 2-бензимидазолил, 4-бензимидазолил, 5-бензимидазолил), дибензофурилы, бензоксазолилы, бензотиазолилы, хиноксалинилилы (например, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 6-хиноксалинил), циннолинилы (например, 3-циннолинил, 4-циннолинил, 5-циннолинил, 6-циннолинил, 7-циннолинил, 8-циннолинил), хиназолинилы (например, 2-хиназолинил, 4-хиназолинил, 5-хиназолинил, 6-хиназолинил, 7-хиназолинил, 8-хиназолинил), хинолилы (например, 2-хинолил, 3-хинолил, 4-хинолил, 5-хинолил, 6-хинолил, 7-хинолил, 8-хинолил), фталазинилы (например, 1-фталазинил, 5-фталазинил, 6-фталазинил), изохинолилы (например, 1-изохинолил, 3-изохинолил, 4-изохинолил, 5-изохинолил, 6-изохинолил, 7-изохинолил, 8-изохинолил), пурилы, птеридинилы (например, 2-птеридинил, 4-птеридинил, 6-птеридинил, 7-птеридинил), карбазолилы, фенантридинилы, акридинилы (например, 1-акридинил, 2-акридинил, 3-акридинил, 4-акридинил, 9-акридинил), индолилы (например, 1-индолил, 2-индолил, 3-индолил, 4-индолил, 5-индолил, 6-индолил, 7-индолил), изоиндолилы, феназинилы (например, 1-феназинил, 2-феназинил) и фенотиазинилы (например, 1-фенотиазинил, 2-фенотиазинил, 3-фенотиазинил, 4-фенотиазинил).

[0138]

В настоящем изобретении, например, термин «циклоалкил» относится к циклическим насыщенным углеводородным группам, и число атомов углерода в циклоалкиле равно, например, от 3 до 15. Примеры вышеуказанного циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, мостиковые циклические углеводородные группы, спирановые углеводородные группы и тому подобное. Среди них предпочтительными являются циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, мостиковые циклические углеводородные группы и тому подобное.

[0139]

В настоящем изобретении примеры «мостиковых циклических углеводородных групп» включают бицикло[2.1.0]пентил, бицикло[2.2.1]гептил, бицикло[2.2.2]октил и бицикло[3.2.1]октил, трицикло[2.2.1.0]гептил, бицикло[3.3.1]нонан, 1-адамантил, 2-адамантил.

[0140]

В настоящем изобретении примеры «спирановых углеводородных групп» включают спиро[3,4]октил.

[0141]

В настоящем изобретении термин «циклоалкенил» включает, например, ненасыщенные циклические алифатические углеводородные группы, и число атомов углерода в циклоалкениле равно, например, от 3 до 7. Примеры вышеуказанного циклоалкенила включают циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил и циклогептенил. Среди них предпочтительными являются циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил и циклогексенил. Вышеуказанный термин «циклоалкенил» также включает, например, мостиковые циклические углеводородные группы и спирановые углеводородные группы, имеющие ненасыщенную связь в их кольцах.

[0142]

В настоящем изобретении примеры «арилалкила» включают бензил, 2-фенэтил и нафталинилметил. Примеры «циклоалкилалкила» и «циклилалкила» включают циклогексилметил и адамантилметил. Примеры «гидроксиалкила» включают гидроксиметил и 2-гидроксиэтил.

[0143]

В настоящем изобретении «алкокси» включает, например, группы, состоящие из любой вышеуказанной алкильной группы и кислорода (алкил-О-группы), и их примеры включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси и н-бутокси. Примеры «алкоксиалкила» включают метоксиметил и тому подобное. Примеры «аминоалкила» включают 2-аминоэтил.

[0144]

В настоящем изобретении примеры «гетероциклила» включают 1-пирролинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, 1-пирролидинил, 2-пирролидинил, 3-пирролидинил, пирролидинон, 1-имидазолинил, 2-имидазолинил, 4-имидазолинил, 1-имидазолидинил, 2-имидазолидинил, 4-имидазолидинил, имидазолидинон, 1-пиразолинил, 3-пиразолинил, 4-пиразолинил, 1-пиразолидинил, 3-пиразолидинил, 4-пиразолидинил, пиперидинон, пиперидино, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-пиперидинил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил, пиперазинон, 2-морфолинил, 3-морфолинил, морфолино, тетрагидропиранил и тетрагидрофуранил.

[0145]

В настоящем изобретении примеры «гетероциклилалкила» включают пиперидинилметил и пиперазинилметил. Примеры «гетероциклилалкенила» включают 2-пиперидинилэтенил. Примеры «гетероарилалкила» включают пиридилметил и хинолин-3-илметил.

[0146]

В настоящем изобретении термин «силил» включает группы, представленные химической формулой R3Si-, где R независимо может быть выбран из вышеуказанных алкилов, арилов и циклоалкилов. Примеры силила включают триметилсилильную группу и трет-бутилдиметилсилильную группу. Примеры «силилокси» включают триметилсилилоксигруппу. Примерами «силилоксиалкила» являются триметилсилилоксиметил.

[0147]

В настоящем изобретении примеры «алкилена» включают метилен, этилен и пропилен.

[0148]

В настоящем изобретении вышеописанные различные группы могут быть замещены. Примеры вышеуказанного заместителя включают гидрокси, карбокси, сульфо, атом галогена, алкилгалогенид (галогеналкил, например, CF3, CH2CF3, CH2CCl3), нитро, нитрозо, циано, алкил (например, метил, этил, изопропил, трет-бутил), алкенил (например, винил), алкинил (например, этинил), циклоалкил (например, циклопропил, адамантил), циклоалкилалкил (например, циклогексилметил, адамантилметил), циклоалкенил (например, циклопропенил), циклолалкил, гидроксиалкил (например, гидроксиметил, гидроксиэтил), алкоксиалкил (например, метоксиметил, этоксиметил, этоксиэтил), арил (например, фенил, нафтил), арилалкил (например, бензил, фенэтил), алкиларил (например, п-метилфенил), гетероарил (например, пиридил, фурил), гетероарилалкил (например, пиридилметил), гетероциклил (например, пиперидил), гетероциклилалкенил, гетероциклилалкил (например, морфолилметил), алкокси (например, метокси, этокси, пропокси, бутокси), галогенированный алкокси (например, OCF3), алкенилокси (например, винилокси, аллилокси), арилокси (например, фенилокси), алкилоксикарбонил (например, метоксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил), арилалкилокси (например, бензилокси), амино [алкиламино (например, метиламино, этиламино, диметиламино), ациламино (например, ацетиламино, бензоиламино), арилалкиламино (например, бензиламино, тритиламино), гидроксиамино], аминометил), алкиламиноалкил (например, диэтиламинометил), карбамоил, сульфамоил, оксо и тому подобное.

[0149]

(2) Нуклеотидный остаток

Нуклеотидный остаток, составляющий вышеуказанную молекулу нуклеиновую кислоту, содержащуюся в композиции по настоящему изобретению, включает, например, сахар, основание и фосфат в качестве его компонентов. Вышеуказанный нуклеотидный остаток может представлять, например, рибонуклеотидный остаток или дезоксирибонуклеотидный остаток, как описано выше. Вышеуказанный рибонуклеотидный остаток содержит, например, остаток рибозы в качестве сахара; и аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) или урацил (U) в качестве основания. Вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток содержит, например, остаток дезоксирибозы в качестве сахара; и аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) или тимин (T) в качестве основания.

[0150]

Вышеуказанный нуклеотидный остаток может представлять, например, немодифицированный нуклеотидный остаток или модифицированный нуклеотидный остаток. Вышеуказанные компоненты вышеуказанного немодифицированного нуклеотидного остатка являются такими же или, по существу, такими же, как, например, компоненты встречающегося в природе нуклеотидного остатка. Предпочтительно компоненты являются такими же или по существу такими же, как компоненты нуклеотидного остатка, встречающегося в природе в организме человека.

[0151]

Вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток представляет, например, нуклеотидный остаток, полученный модификацией вышеуказанного немодифицированного нуклеотидного остатка. Например, вышеуказанный модифицированный нуклеотид может быть таким, в котором модифицирован любой из компонентов вышеуказанного немодифицированного нуклеотидного остатка. В настоящем изобретении «модификация» означает, например, замещение, добавление и/или делецию любого из вышеуказанных компонентов; и замещение, добавление и/или делецию атома(ов) и/или функциональной группы(групп) в вышеуказанном компоненте (ах). Его также можно назвать «изменением». Примеры вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка включают встречающиеся в природе нуклеотидные остатки и искусственно модифицированные нуклеотидные остатки. В отношение вышеуказанных модифицированных нуклеотидных остатков, полученных из природы, то, например, они описаны в публикации Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: pp. 2183 to 2196, Nucleic Acids Res. 22: pp. 2183-2196). Вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток может представлять, например, остаток альтернативы вышеуказанного нуклеотида.

[0152]

Примеры модификации вышеуказанного нуклеотидного остатка включают модификацию рибозо-фосфатного остова (далее именуемого «рибофосфатным остовом»).

[0153]

В вышеуказанном рибофосфатном остове, например, может быть модифицирован остаток рибозы. В вышеуказанном остатке рибозы, например, может быть модифицирован атом углерода в 2'-положении. В частности, гидроксильная группа, связанная, например, с атомом углерода в 2'-положении, может быть замещена водородом или фтором. Путем замещения гидроксильной группы, связанной с вышеуказанным атомом углерода в 2'-положении, водородом, можно заменить остаток рибозы дезоксирибозой. Вышеуказанный остаток рибозы может быть замещен, например, его стереоизомером, и может быть замещен, например, остатком арабинозы.

[0154]

Вышеуказанный рибофосфатный остов может быть замещен, например, нерибофосфатным остовом, содержащим нерибозный остаток и/или нефосфат. Вышеуказанный нерибофосфатный остов может представлять, например, вышеуказанный рибофосфатный остов, модифицированный таким образом, чтобы он был незаряженным. Примеры альтернативы, полученной замещением нерибофосфатного остова в вышеуказанном нуклеотиде, включают морфолино, циклобутил и пирролидин. Другие примеры вышеуказанной альтернативы включают мономерные остатки искусственной нуклеиновой кислоты. Конкретные примеры включают PNA (пептидную нуклеиновую кислоту), LNA (замкнутую нуклеиновую кислоту) и ENA (нуклеиновые кислоты с 2'-O,4'-этиленовыми мостиками). Среди них PNA является предпочтительной.

[0155]

В вышеуказанном рибофосфатном остове, например, может быть модифицирована фосфатная группа. В вышеуказанном рибофосфатном остове фосфатная группа, находящаяся в ближайшей близости к остатку сахара, называется «α-фосфатной группой». Вышеуказанная α-фосфатная группа заряжена отрицательно, и электрические заряды распределяются равномерно по двум атомам кислорода, которые не связаны с остатком сахара. Среди четырех атомов кислорода в вышеуказанной α-фосфатной группе два атома кислорода, не связанные с остатком сахара в фосфодиэфирной связи между нуклеотидными остатками в дальнейшем, называются «несвязывающими атомами кислорода». С другой стороны, два атома кислорода, которые связаны с остатком сахара в фосфодиэфирной связи между вышеуказанными нуклеотидными остатками в дальнейшем, называются «связывающими атомами кислорода». Например, вышеуказанная α-фосфатная группа предпочтительно модифицируется, чтобы стать незаряженной, или чтобы распределение заряда между вышеуказанными несвязывающими атомами было асимметричным.

[0156]

В вышеуказанной фосфатной группе, например, вышеуказанный несвязывающий атом(ы) кислорода может быть замещен. Вышеуказанный атом(ы) кислорода может быть замещен, например, любым атомом, выбранным из S (серы), Se (селена), B (бора), C (углерода), H (водорода), N (азота) и OR (R представляет, например, алкильную группу или арильную группу), и замещение атомом S является предпочтительным. Предпочтительно, чтобы оба вышеуказанных несвязывающих атома кислорода были замещены, например, и более предпочтительно, чтобы оба несвязывающих атома кислорода были замещены атомом S. Примеры вышеуказанной модифицированной фосфатной группы включают фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные эфиры, гидрофосфонаты, фосфороамидаты, алкилфосфонаты или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В частности, предпочтительным является фосфородитиоат, в котором два вышеуказанных несвязывающих атома кислорода замещены S.

[0157]

В вышеуказанной фосфатной группе, например, вышеуказанный связывающий атом(ы) кислорода может быть замещен. Вышеуказанный атом(ы) кислорода может быть замещен, например, любым атомом, выбранным из S (серы), C (углерода) и N (азота). Примеры вышеуказанной модифицированной фосфатной группы включают: мостиковые фосфорамидаты, полученные в результате замещения N; мостиковые фосфоротиоаты, образующиеся в результате замещения S; и мостиковые метиленфосфонаты, образующиеся в результате замещения С. Предпочтительно замещение вышеуказанного связывающего атома(в) кислорода осуществляют, например, по меньшей мере, в одном из 5'-концевого нуклеотидного остатка и 3'-концевого нуклеотидного остатка вышеуказанной молекулы ssPN. Когда замещение выполняется на 5'-конце, то предпочтительным является замещение на атом С. Когда замещение выполняется на 3'-конце, то предпочтительной является замещение на атом N.

[0158]

Вышеуказанная фосфатная группа может быть замещена, например, вышеуказанным линкером, не содержащим фосфат. Вышеуказанный линкер может включать силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо, метиленоксиметилимино или тому подобное. Предпочтительно линкер может содержать метиленкарбониламино и метиленметилимино.

[0159]

В вышеуказанной молекуле ssPN, например, может быть модифицирован, по меньшей мере, один нуклеотидный остаток на 3'-конце и нуклеотидный остаток на 5'-конце. Например, нуклеотидный остаток может быть модифицирован на любом из 3'-конца и 5'-конца, или нуклеотидные остатки могут быть модифицированы как на 3'-конце, так и на 5'-конце. Вышеуказанная модификация может представлять, например, как описано выше, и предпочтительно модифицируется фосфатная группа(ы) на конце(ах). Например, может быть модифицирована вся вышеуказанная фосфатная группа, или модификации подвергается один или более атомов в вышеуказанной фосфатной группе. В первом случае, например, вся фосфатная группа может быть замещена или делетирована.

[0160]

Модификация вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов) на конце(ах) может представлять, например, добавление любой другой молекулы. Примеры вышеуказанной другой молекулы включают функциональные молекулы, такие как вещества для введения метки, описанные выше, и защитные группы. Примеры вышеуказанных защитных групп включают S (серу), Si (кремний), B (бор) и сложноэфирные группы. Функциональные молекулы, такие как вышеуказанные вещества для введения метки, могут быть использованы, например, в детектировании и т.п. вышеуказанной молекулы ssPN.

[0161]

Вышеуказанная другая молекула может быть, например, добавлена к фосфатной группе вышеуказанного нуклеотидного остатка или может быть добавлена к вышеуказанной фосфатной группе, или к вышеуказанному остатку сахара через спейсер. Например, концевой атом вышеуказанного спейсера может быть добавлен или замещен одним из вышеуказанных связывающих атомов кислорода вышеуказанной фосфатной группы или O, N, S или C остатка сахара. Связывающий сайт в вышеуказанном сахарном остатке предпочтительно представляет, например, С в 3'-положении, С в 5'-положении или любой связанный с ним атом. Например, вышеуказанный спейсер также может быть добавлен или замещен концевым атомом вышеуказанной альтернативы нуклеотида, такой как PNA.

[0162]

Вышеуказанный спейсер особым образом не ограничивается, и его примеры включают: (CH₂)n-, -(CH₂)_nN-, -(CH₂)_nO-, -(CH₂)_nS-, O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH, сахара без основания, амид, карбокси, амин, оксиамин, оксимимин, тиоэфир, дисульфид, тиомочевину, сульфонамид и морфолино, и также биотиновые реагенты и флуоресцеиновые реагенты. В вышеуказанных формулах n является положительным целым числом, и n=3 или 6 является предпочтительным.

[0163]

Другие примеры вышеуказанной молекулы, добавляемой к концу, включают красители, интеркалирующие агенты (например, акридины), сшивающие агенты (например, псорален, митомицин С), порфирины (TPPC4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные носители (например, холестерин, холевая кислота, адамантан-1-уксусная кислота, 1-пиренмасляная кислота, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил) глицерин, геранилоксигексил, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецил, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холевую кислоту, диметокситритил или феноксатиин), пептидные комплексы (например, пептид Antennapedia, пептид Tat), алкилирующие агенты, фосфат, амино, меркапто, ПЭГ (например, ПЭГ-40К), MPEG, [MPEG]₂, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченые радиоактивным изотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), усилители транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевая кислота) и синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, комплексы акридин-имидазол, комплексы Eu³⁺ и тетраазамакроциклов).

[0164]

В вышеуказанной молекуле ssPN, например, вышеуказанный 5'-конец может быть модифицирован фосфатной группой или аналогом фосфатной группы. Примеры вышеуказанного фосфорилирования включают:

5'-монофосфат((HO)₂(O)P-O-5'); 5'-дифосфат((HO)₂(O)P-O-P(HO) (O)-O-5'); 5'-трифосфат ((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-гуанозин кэп-группа (7-метилированный или неметилированный, 7 м-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-аденозин кэп-группу (Appp); любая модифицированная или немодифицированная нуклеотидная кэп-структура (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-монотиофосфат (фосфоротиоат: (HO)₂(S)P-O-5'); 5'-монодитиофосфат (фосфородитиоат: (HO)(HS)(S)P-O-5'); 5'-фосфоротиолат ((HO)₂(O)P-S-5'); замещенный серой монофосфат, дифосфат и трифосфат (например, 5'-α-тиотрифосфат, 5'-γ-тиотрифосфат и тому подобное); 5'-фосфорамидаты ((HO)₂(O)P-NH-5', (HO)(NH₂)(O) P-O-5'); 5'-алкилфосфонаты (например, RP(OH)(O)-O-5', (OH)₂(O)P-5'-CH₂, где R представляет алкил (например, метил, этил, изопропил, пропил или тому подобное)); и 5'-алкилэфирные фосфонаты (например, RP(OH)(O)-O-5', где R представляет алкиловый эфир (например, метоксиметил, этоксиметил или тому подобное)).

[0165]

В вышеуказанном нуклеотидном остатке вышеуказанное основание особым образом не ограничивается. Вышеуказанное основание может быть, например, природным основанием или неприродным основанием. Вышеуказанное основание может быть, например, основанием, полученным из природы, или синтетическим основанием. В качестве вышеуказанного основания, например, может использоваться обычное основание, его модифицированный аналог и тому подобное.

[0166]

Примеры вышеуказанного основания включают: пуриновые основания, такие как аденин и гуанин; и пиримидиновые основания, такие как цитозин, урацил и тимин. Другие примеры вышеуказанного основания включают инозин, тимин, ксантин, гипоксантин, нубуларин, изогуанинин и туберцидин. Примеры вышеуказанного основания также включают: 2-аминонаденин, алкильные производные, такие как 6-метилированный пурин; алкильные производные, такие как 2-пропилированный пурин; 5-галогенаурацил и 5-галогенцитозин; 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин; 6-азоурацил, 6-азоцитозин и 6-азотимин; 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 5-галогенурацил, 5-(2-аминопропил)урацил, 5-аминоаллилурацил; 8-галогенированные, аминированные, тиолированные, тиоалкилированные, гидроксилированные и другие 8-замещенные пурины; 5-трифторметилированный и другие 5-замещенные пиримидины; 7-метилгуанин; 5-замещенные пиримидины; 6-азапиримидины; N-2-, N-6- и O-6-замещенные пурины (включая 2-аминопропиладенин); 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин; дигидроурацил; 3-деаза-5-азацитозин; 2-аминопурин; 5-алкилурацил; 7-алкилгуанин; 5-алкилцитозин; 7-деазааденин; N6, N6-диметиладенин; 2,6-диаминопурин; 5-аминоаллилурацил; N3-метилурацил; замещенные 1,2,4-триазолы; 2-пиридинон; 5-нитроиндолы; 3-нитропиррол; 5-метоксиурацил; урацил-5-оксиуксусную кислоту; 5-метоксикарбонилметилурацил; 5-метил-2-тиоурацил; 5-метоксикарбонилметил-2-тиоурацил; 5-метиламино-2-тиоурацил; 3-(3-амино-3-карбоксипропил)урацил; 3-метилцитозин; 5-метилцитозин; N4-ацетилцитозин; 2-тиоцитозин; N6-метиладенин; N6-изопентиладенин; 2-метилтио-N6-изопентениладенин; N-метилгуанин; и O-алкилированные основания. Примеры пуринов и пиримидинов включают производные, которые описаны в патенте США № 3687808, «Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering», pp. 858-585, edited by Kroschwitz J. I, John Wiley & Sons, 1990, and Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, vol. 30, p. 613.

[0167]

Конкретные примеры вышеуказанной молекулы ssPN, которые будут использоваться в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь этим, молекулы ssPN, показанные молекулами PH-0009, PK-7006, PK-7015, PH-7069 и PH-7081, приведенными ниже.

[0168]

II. Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, контролирующую экспрессию гена-мишени, которая содержит линкер, состоящий из нуклеотидного остатка и/или ненуклеотидного остатка

(1) молекула ssNc

В качестве вышеуказанной молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты можно упомянуть молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащую линкер, состоящий из нуклеотидного остатка(ов) и/или нуклеотидного остатка(ов). Один из вариантов осуществления представляет, например, молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, описанную в WO 2012/005368, которая содержит от 5'-конца к 3'-концу 5'-концевую область (Xc), внутреннюю область (Z) и 3'-концевую область (Yc) в этом порядке, где:

вышеуказанная внутренняя область (Z) образована соединением внутренней 5'-концевой области (X) и внутренней 3'-концевой области (Y),

вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X),

вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y), и

по меньшей мере, одно из вышеуказанной внутренней области (Z), вышеуказанной 5'-концевой области (Xc) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc) содержит вышеуказанную контрольную последовательность экспрессии (далее также называемую «молекулой ssNc»). Нет необходимости говорить, что это только пример, и специалисты в данной области, очевидно, понимают, что может быть использована любая молекула нуклеиновой кислоты. Следовательно, специалисты в данной области техники могут соответствующим образом получить требуемую молекулу нуклеиновой кислоты на основе известного метода и общих технических знаний в этой области.

[0169]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии представляет последовательность, которая проявляет активность подавления экспрессии вышеуказанного гена-мишени, когда молекулу ssNc по настоящему изобретению вводят в клетку in vivo или in vitro. Вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии особым образом не ограничивается и может быть установлена в зависимости от типа гена-мишени. В качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, например, может быть использована последовательность, связанная с РНК-интерференцией, вызванной siРНК. То есть последовательность РНК цепи из вышеуказанной siРНК, которая связывается с мРНК-мишенью, может быть использована в качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии.

[0170]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X), и вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y). Таким образом, на 5'-конце двойная цепь может образоваться путем обратного фолдига вышеуказанной области (Xc) к области (X) и самоотжига вышеуказанных областей (Xc) и (X), и на 3'-конце двойная цепь может образоваться путем обратного фолдинга вышеуказанной области (Yc) к области (Y) и самоотжига вышеуказанных областей (Yc) и (Y). Таким образом, вышеуказанная молекула ssNc может образовывать двойную цепь в молекуле и представляет собой структуру, четко отличающуюся от структуры, в которой две отдельные одноцепочечные РНК образуют двухцепочечную РНК путем отжига, например, siРНК, используемую для обычной РНК-интерференции.

[0171]

Вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии представляет собой, например, предпочтительно, комплементарную, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно комплементарную, на 95%, еще более предпочтительно комплементарную на 98% и наиболее предпочтительно комплементарную на 100% заранее определенной области вышеуказанного гена-мишени. Когда такая комплементарность выполняется, то, например, немишеневый эффект может быть в достаточной степени снижен.

[0172]

В качестве конкретного примера, когда геном-мишенью является ген люциферазы, то, например, последовательность, показанная в SEQ ID NO: 5, может быть использована в качестве вышеуказанной контрольной последовательности экспрессии, и когда геном-мишенью является ген GAPDH мыши, то последовательность, показанная в SEQ ID NO: 6 может использоваться как вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии.

5'-UCGAAGUACUCGGCGUAGG-3' (SEQ ID NO: 5)

5'-GUUGUCAUAUUUCUCGUGG-3' (SEQ ID NO: 6)

[0173]

В вышеуказанной молекуле ssNC вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии включается, по меньшей мере, в одну из вышеуказанной внутренней области (Z), вышеуказанной 5'-концевой области (Xc) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc), как описано выше. Вышеуказанная молекула ssNc может включать, например, одну контрольную последовательность экспрессии или две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше.

[0174]

В последнем случае вышеуказанная молекула ssNc может включать, например: две или более идентичные контрольные последовательности экспрессии для одного и того же гена-мишени; две или более различных контрольных последовательностей экспрессии для одного и того же гена-мишени; или две или более различных контрольных последовательностей экспрессии для разных генов-мишеней. Когда вышеуказанная молекула ssNc включает две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше, то положения соответствующих контрольных последовательностей экспрессии особым образом не ограничиваются, и они могут находиться в одной области или разных областях, выбранных из вышеуказанной внутренней области (Z), вышеуказанной 5'-концевой области (Xc) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc). Когда вышеуказанная молекула ssNc включает две или более контрольных последовательностей экспрессии, упомянутых выше для разных генов-мишеней, то, например, вышеуказанная молекула ssNc может контролировать экспрессию двух или более видов различных генов-мишеней.

[0175]

Как описано выше, вышеуказанная внутренняя область (Z) состоит из вышеуказанной внутренней 5'-области (X) и вышеуказанной внутренней 3'-области (Y), которые связаны друг с другом. Например, вышеуказанные области (X) и (Y) связаны непосредственно друг с другом без промежуточной последовательности между ними. Вышеуказанная внутренняя область (Z) представляется как «состоящая из вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y), которые связаны друг с другом» просто для указания статуса последовательности между вышеуказанной 5'-концевой областью (Xc) и вышеуказанной 3'-концевой областью (Yc). Это определение не предназначено для ограничения того, например, что при использовании вышеуказанной молекулы ssNc, вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) и вышеуказанная 3'-концевая область (Xc) в вышеуказанной внутренней области (Z) являются дискретными независимыми областями. То есть, например, когда вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии включена в вышеуказанную внутреннюю область (Z), то вышеуказанная контрольная последовательность экспрессии может быть расположена таким образом, чтобы простираться через вышеуказанные области (X) и (Y) в вышеуказанной внутренней области (Z).

[0176]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X). Необходимо только, чтобы вышеуказанная область (Xc) имела последовательность, комплементарную всей области или участку вышеуказанной области (X). В частности, например, вышеуказанная область (Xc) включает или предпочтительно состоит из последовательности, комплементарной всей области или участку области (X). Вышеуказанная область (Xc) может быть, например, полностью комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (X), или одно или несколько оснований в области (Xc) могут быть не комплементарными тому же. Предпочтительно область (Xc) является полностью комплементарной тому же. В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) является комплементарной вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y). Необходимо только, чтобы вышеуказанная область (Yc) имела последовательность, комплементарную всей области или участку вышеуказанной области (Y). Конкретно, например, вышеуказанная область (Yc) включает или предпочтительно состоит из последовательности, комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (Y). Вышеуказанная область (Yc) может быть, например, полностью комплементарной всей области или участку вышеуказанной области (Y), или одно или несколько оснований в вышеуказанной области (Yc) могут быть не комплементарными тому же. Предпочтительно, вышеуказанная область (Yc) является полностью комплементарной тому же. Вышеуказанное выражение «одно или несколько оснований» означает, например, 1-3 основания, предпочтительно 1 основание или 2 основания.

[0177]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) и вышеуказанная внутренняя 5'-концевая область (X) могут быть связаны друг с другом, например, прямо или опосредованно. В первом случае, например, вышеуказанные области (Xc) и (X) могут быть связаны непосредственно посредством фосфодиэфирной связи или тому подобное. В последнем случае, например, можно упомянуть вариант осуществления, в котором линкерная область (Lx) сконфигурирована между вышеуказанной областью (Xc) и вышеуказанной областью (X), и вышеуказанные области (Xc) и (X) связаны посредством вышеуказанной линкерной области (Lx).

[0178]

В вышеуказанной молекуле ssNc, например, вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) и вышеуказанная внутренняя 3'-концевая область (Y) могут быть связаны друг с другом прямо или опосредованно. В первом случае, например, вышеуказанные области (Yc) и (Y) могут быть связаны непосредственно фосфодиэфирной связью или тому подобное. В последнем случае, например, линкерная область (Ly) находится между вышеуказанными областями (Yc) и (Y), и вышеуказанные области (Yc) и (Y) связаны посредством вышеуказанной линкерной области (Ly).

[0179]

Вышеуказанная молекула ssNc может иметь, например, обе или любую одну из вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (Ly). В последнем случае можно упомянуть, например, конфигурацию, имеющую вышеуказанную линкерную область (Lx) между вышеуказанной 5'-концевой областью (Xc) и вышеуказанной внутренней 5'-концевой областью (X), не содержащую вышеуказанную линкерную область (Ly) между вышеуказанной 3'-концевой областью (Yc) и вышеуказанной внутренней 3'-концевой областью (Y), где вышеуказанная область (Yc) и вышеуказанная область (Y) связаны непосредственно. В последнем случае можно упомянуть, например, конфигурацию, имеющую вышеуказанную линкерную область (Ly) между вышеуказанной 3'-концевой областью (Yc) и вышеуказанной внутренней 3'-концевой областью (Y), не содержащую вышеуказанную линкерную область (Lx) между вышеуказанной 5'-концевой областью (Xc) и вышеуказанной внутренней 5'-концевой областью (X), где вышеуказанная область (Xc) и вышеуказанная область (X) связаны непосредственно.

[0180]

Вышеуказанная линкерная область (Lx) и вышеуказанная линкерная область (Ly) каждая предпочтительно имеет структуру, не содержащую самоотжиг внутри самой области.

[0181]

В отношении вышеуказанной молекулы ssNc, то можно упомянуть один вариант осуществления молекулы ssNc, не содержащей вышеуказанной линкерной области, описанный в WO 2012/005368, фиг. 1.

[0182]

В отношении вышеуказанной молекулы ssNc, то один вариант осуществления молекулы ssNc, имеющей вышеуказанную линкерную область, описан в WO 2012/005368, фиг. 2, и ее можно отнести к этому.

[0183]

В вышеуказанной молекуле ssNc число оснований в вышеуказанной 5'-концевой области (Xc), вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X), вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc) особым образом не ограничивается, и оно составляет число, например, описанное ниже. В настоящем изобретении «число оснований» означает, например, «длину», и его также можно назвать «длиной оснований».

[0184]

Как описано выше, например, вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) может быть комплементарной всей области вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X). В этом случае вышеуказанная область (Xc) является такой же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0185]

Кроме того, как описано выше, вышеуказанная 5'-концевая область (Xc) может быть комплементарной, например, участку вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X). В этом случае вышеуказанная область (Xc) является такой же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0186]

Как описано выше, вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) может быть комплементарной, например, всей области вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y). В этом случае вышеуказанная область (Yc) является такой же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0187]

Кроме того, как описано выше, вышеуказанная 3'-концевая область (Yc) может быть комплементарной, например, участку вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y). В этом случае вышеуказанная область (Yc) является такой же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0188]

В вышеуказанной молекуле ssNc соотношение числа оснований (Z) в вышеуказанной внутренней области (Z) к числу оснований (X) в вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и числу оснований (Y) в вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y) и соотношение числа оснований (Z) в вышеуказанной внутренней области (Z) к числу оснований (X) в вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и числу оснований (Xc) в вышеуказанной 5'-концевой области (Xc), является таким же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0189]

В вышеуказанной молекуле ssNc соотношение между числом оснований (X) в вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и числом оснований (Y) в вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y) является таким же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0190]

В вышеуказанной молекуле ssNc соотношение между числом оснований (X) в вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и числом оснований (Xc) в вышеуказанной 5'-концевой области (Xc), числом оснований (Y) в вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y) и числом оснований (Yc) в вышеуказанной 3'-концевой области (Yc) является таким же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0191]

В вышеуказанной молекуле ssNc, несмотря на то, что длина каждой области является такой же, как определено для вышеупомянутой второй молекулы ssPN, настоящее изобретение не ограничивается этим. В настоящем изобретении, например, цифровой диапазон числа оснований раскрывает все положительные целые числа, которые попадают в диапазон, и, например, «1-4 основания» означает все «1, 2, 3, 4 основания» (ниже то же самое).

[0192]

В вышеуказанной молекуле ssNc длины вышеуказанных линкерных областей (Lx) и (Ly) особым образом не ограничиваются. Вышеуказанная линкерная область (Lx) предпочтительно имеет, например, длину, позволяющую вышеуказанной внутренней 5'-концевой области (X) и вышеуказанной 5'-концевой области (Xc) образовать двойную цепь, и вышеуказанная линкерная область (Ly) предпочтительно имеет, например, длину, позволяющую вышеуказанной внутренней 3'-концевой области (Y) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc) образовать двойную цепь. Когда составляющие звенья вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (Ly) включают основание(я), то число оснований вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (Ly) может быть одинаковым или различным, и также их последовательности оснований могут быть одинаковыми или разными. Нижний предел числа оснований в вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (Ly) составляет, например, 1, предпочтительно 2 и более предпочтительно 3, и верхний предел составляет, например, 100, предпочтительно 80 и более предпочтительно 50. Число оснований в каждой из вышеуказанных линкерных областей составляет, например, от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 7 или от 1 до 4, не ограничиваясь этим.

[0193]

Полная длина вышеуказанной молекулы ssNc особым образом не ограничиваются. В вышеуказанной молекуле ssNc нижний предел общего числа оснований (числа оснований в полноразмерной молекуле ssPN) составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51 и наиболее предпочтительно 52, и их верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80. В вышеуказанной молекуле ssNc нижний предел общего числа оснований, исключая основания в вышеуказанных линкерных областях (Lx) и (Ly), составляет, например, 38, предпочтительно 42, более предпочтительно 50, еще более предпочтительно 51 и наиболее предпочтительно 52, и их верхний предел составляет, например, 300, предпочтительно 200, более предпочтительно 150, еще более предпочтительно 100 и наиболее предпочтительно 80.

[0194]

Примеры составляющих звеньев в вышеуказанной молекуле ssNc особым образом не ограничиваются и включают, например, нуклеотидные остатки. Вышеуказанный нуклеотидный остаток может представлять собой, например, рибонуклеотидный остаток или дезоксирибонуклеотидный остаток. Вышеуказанный нуклеотидный остаток может быть, например, нуклеотидным остатком, который не является модифицированным (немодифицированный нуклеотидный остаток), или нуклеотидным остатком, который был модифицирован (модифицированный нуклеотидный остаток). Можно сконструировать вышеуказанную молекулу ssNc с включением вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка, например, для повышения устойчивости молекулы ssNc к нуклеазе, что позволит повысить стабильность молекулы ssNc. Кроме того, молекула ssNc дополнительно может включать, например, ненуклеотидный остаток в дополнение к вышеуказанному нуклеотидному остатку.

[0195]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанный нуклеотидный остаток является предпочтительным в качестве составляющего звена каждой из вышеуказанной внутренней области (Z), вышеуказанной 5'-концевой области (Xc) и вышеуказанной 3'-концевой области (Yc). Каждая из вышеуказанных областей состоит, например, из любого из следующих остатков (1)-(3):

(1) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(2) модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(3) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов).

[0196]

В вышеуказанной молекуле ssNc составляющие звенья вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (L) особоым образом не ограничиваются, и примеры включают вышеуказанные нуклеотидные остатки и вышеуказанные ненуклеотидные остатки. Каждая из вышеуказанных линкерных оластей может состоять, например, только из вышеуказанного нуклеотидного остатка(в), только из вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов), или обоих вышеуказанного нуклеотидного остатка(в) и вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов). Каждая из вышеуказанных линкерных областей состоит, например, из любого из следующих остатков (1)-(7):

(1) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(2) модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(3) немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(4) ненуклеотидного остатка(ов)

(5) ненуклеотидного остатка(ов) и немодифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(6) ненуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов)

(7) ненуклеотидного остатка(ов), немодифицированного нуклеотидного остатка(ов) и модифицированного нуклеотидного остатка(ов).

[0197]

Когда вышеуказанная молекула ssNc содержит как вышеуказанную линкерную область (Lx), так и вышеуказанную линкерную область (Ly), то, например, оба составляющих звена могут быть одинаковыми или различными. Конкретные примеры этого включают форму, в которой составляющее звено обеих линкерных областей представляет вышеуказанные нуклеотидные остатки, форму, в которой составляющее звено обеих линкерных областей представляет вышеуказанные ненуклеотидные остатки, форму, в которой составляющее звено одной области представляет вышеуказанные нуклеотидные остатки, и составляющее звено другой линкерной области представляет ненуклеотидные остатки и тому подобное.

[0198]

Примеры вышеуказанной молекулы ssNc включают молекулы, состоящие только из вышеуказанных нуклеотидных остатков; и молекулы, включающие вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанным нуклеотидным остаткам. В вышеуказанной молекуле ssNc, например, вышеуказанные нуклеотидные остатки могут представлять только вышеуказанные немодифицированные нуклеотидные остатки; только вышеуказанные модифицированные нуклеотидные остатки; или оба вышеуказанный немодифицированный нуклеотидный остаток(и) и вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток(ов), как описано выше. Когда вышеуказанная молекула ssNc включает как вышеуказанный немодифицированный нуклеотидный остаток(и), так и вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток(и), то число вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается и составляет, например, «от одного до нескольких», в частности, например, от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, более предпочтительно от 1 до 3 и наиболее предпочтительно 1 или 2. Когда вышеуказанная молекула ssNc включает вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и), то число вышеуказанного ненуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается и составляет, например, «от одного до нескольких», в частности, например, 1-8, 1-6, 1-4, 1, 2 или 3.

[0199]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанный нуклеотидный остаток предпочтительно представляет, например, рибонуклеотидный остаток. В этом случае вышеуказанная молекула ssNc также относится к «молекуле RNA» или «молекуле ssRNA». Примеры вышеуказанной молекулы ssRNA включают молекулы, состоящие только из вышеуказанных рибонуклеотидных остатков; и молекулы, включающие вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанным рибонуклеотидным остаткам. Как описано выше, в качестве вышеуказанных рибонуклеотидных остатков, например, вышеуказанная молекула ssRNA может включать: вышеуказанные немодифицированные рибонуклеотидные остатки; вышеуказанные модифицированные рибонуклеотидные остатки; или оба вышеуказанный немодифицированный рибонуклеотидный остаток(и) и вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток (и).

[0200]

Когда вышеуказанная молекула ssRNA включает, например, вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток в дополнение к вышеуказанным немодифицированным рибонуклеотидным остаткам, то число вышеуказанного модифицированного рибонуклеотидного остатка(ов) является таким же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0201]

Вышеуказанная молекула ssNc может включать, например, вещество для введения метки и может быть помечена вышеуказанным веществом для введения метки. Вышеуказанное вещество для введения метки является таким же, как определено для вышеуказанной второй молекулы ssPN.

[0202]

(2) Нуклеотидный остаток

Вышеуказанный нуклеотидный остаток является таким же, как определено для вышеуказанной молекулы ssPN.

[0203]

(3) Ненуклеотидный остаток

Вышеуказанный ненуклеотидный остаток особым образом не ограничивается. Вышеуказанная молекула ssNc может содержать, как вышеуказанный ненуклеотидный остаток, например, ненуклеотидную структуру, содержащую пирролидиновый скелет или пиперидиновый скелет. Вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) предпочтительно присутствует, например, по меньшей мере, в одной из вышеуказанной линкерной области (Lx) и вышеуказанной линкерной области (Ly). Вышеуказанный ненуклеотидный остаток(и) может присутствовать, например, в вышеуказанной линкерной области (Lx) или вышеуказанной линкерной области (Ly) или в обеих вышеуказанных линкерных областях. Вышеуказанная линкерная область (Lx) и вышеуказанная линкерная область (Ly) могут быть, например, одинаковыми или различными.

[0204]

Вышеуказанный пирролидиновый скелет является таким же, как определено для пирролидинового скелета в вышеуказанной молекуле ssPN.

[0205]

Вышеуказанный пиперидиновый скелет является таким же, как определено для пиперидинового скелета в вышеуказанной молекуле ssPN.

[0206]

Вышеуказанные линкерные области могут состоять, например, только из ненуклеотидного остатка(ов), имеющего вышеуказанную ненуклеотидную структуру, или могут содержать ненуклеотидный остаток(и), имеющий вышеуказанную ненуклеотидную структуру, и нуклеотидный остаток(и).

[0207]

Вышеуказанная линкерная область представлена, например, следующей формулой (I). Вышеуказанная линкерная область является такой же, как определено для линкерной области в вышеуказанной молекуле ssPN.

[208]

(I)

[0209]

Когда вышеуказанная линкерная область (Ly) представлена вышеуказанной формулой (I), то, например, вышеуказанная линкерная область (Ly) является такой же, как определено для вышеуказанной линкерной области (Lx).

[0210]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанная линкерная область (Lx) может содержать, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из аминокислотного остатка, остатка полиамина и остатка поликарбоновой кислоты. Вышеуказанная линкерная область может содержать или не содержать остаток, отличный от аминокислотного остатка, остатка полиамина и остатка поликарбоновой кислоты. Например, вышеуказанная линкерная область может содержать любой остаток поликарбоновой кислоты, остаток терефталевой кислоты и аминокислотный остаток.

[0211]

В настоящем изобретении «полиамин» означает любое соединение, содержащее несколько (две, три или более) аминогрупп. Вышеуказанная «аминогруппа» не ограничивается группой -NH₂ и также включает иминогруппу (-NH-). В настоящем изобретении вышеуказанный полиамин особым образом не ограничивается, и его примеры включают 1,4-диаминобензол, 1,3-диаминобензол, 1,2-диаминобензол и тому подобное. Кроме того, в настоящем изобретении «поликарбоновая кислота» означает любое соединение, содержащее несколько (две, три или более) карбоксильных групп. В настоящем изобретении вышеуказанная поликарбоновая кислота особым образом не ограничивается, и ее примеры включают 1,4-бензолдикарбоновую кислоту (терефталевая кислота), 1,3-бензолдикарбоновую кислоту (изофталевая кислота), 1,2-бензолдикарбоновую кислоту (фталевая кислота) и тому подобное. Кроме того, в настоящем изобретении «аминокислота» означает любое органическое соединение, содержащее одну или более аминогрупп и одну или более карбоксильных групп в молекуле, как указано ниже. Вышеуказанная «аминогруппа» не ограничивается группой -NH₂ и также включает иминогруппу (-NH-).

[0212]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанный аминокислотный остаток может состоять из множества связанных между собой аминокислотных остатков. В настоящем изобретении аминокислотный остаток, который представляет собой множество связанных между собой аминокислотных остатков, представляет, например, остаток, содержащий пептидную структуру. Более конкретно, вышеуказанный аминокислотный остаток, который представляет собой множество связанных между собой аминокислотных остатков, представляет, например, аминокислотный остаток приведенной ниже химической формулы (I), где приведенная ниже химическая формула (Ia) представляет пептид (например, димер на основе глицина или тример на основе глицина и т.д.).

[0213]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанный аминокислотный остаток может представлять остаток глицина, остаток амида терефталевой кислоты, остаток пролина или остаток лизина. Вышеуказанный аминокислотный остаток может представлять модифицированный аминокислотный остаток или производное аминокислоты.

[0214]

В вышеуказанной молекуле ssNc вышеуказанный остаток линкерной области представлен, например, следующей химической формулой (I-0):

[0215]

[0216]

в вышеуказанной химической формуле (I-0),

Q¹¹ и Q¹² каждый независимо представляет простую связь, CH₂ (метиленовую группу), NH (иминогруппу), C=O (карбонильную группу), C=S (тиокарбонильную группу), C=NH (иминометиленовую группу), O или S;

Q¹ и Q² каждый независимо представляет простую связь, CH₂ (метиленовую группу), NH (иминогруппу), C=O (карбонильную группу), C=S (тиокарбонильную группу), C=NH (иминометиленовую группу), O или S;

Y¹ и Y² каждый независимо представляет простую связь, CH₂, NH, O или S;

L¹ представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов углерода, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или может быть не замещен ОН, OR^a, NH₂, NHR^a, NR^aRb, SH или SR^a; или

L¹ представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;

при условии, что: когда Y¹ представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y¹ в L¹, представляет углерод, атом, связанный с OR¹ в L¹, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;

L² представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов углерода, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен OH, OR^c, NH₂, NHR^c, NR^cR^d, SH или SR^c; или

L² представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;

при условии, что: когда Y² представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y² в L², представляет атом углерода, атом, связанный с OR² в L², является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;

R^a, R^b, R^c и R^d каждый независимо является заместителем или защитной группой;

m равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;

n равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;

вышеуказанная область X и вышеуказанная область Y связаны посредством вышеуказанного линкерного остатка через -OR¹- или -OR²-,

где R¹ и R² могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R¹ и R² каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (I-0);

А представляет любую атомную группу.

[0217]

Комбинация вышеуказанной области (X) и вышеуказанной области (Y) с -OR¹- и -OR²- особым образом не ограничивается и может представлять, например, любое из следующих условий.

Условие (1):

вышеуказанная область X связана со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²-, и вышеуказанная область Y связана с ней через -OR¹-.

Условие (2):

вышеуказанная область X связана со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR²-, и вышеуказанная область Y связана с ней через -OR¹-.

[0218]

В вышеуказанной химической формуле (I-0), например, Q¹¹ может представлять C=O (карбонильную группу), и Q¹ может представлять NH (иминогруппу). Кроме того, например, Q¹¹ может представлять NH (иминогруппу), и Q¹ может представлять C=O (карбонильную группу). Кроме того, например, Q¹² может представлять C=O (карбонильную группу), и Q² может представлять NH (иминогруппу). Кроме того, например, Q¹² может представлять NH (иминогруппу), и Q² может представлять C=O (карбонильную группу).

[0219]

В вышеуказанной химической формуле (I-0) каждый из Q11 и Q12 может представлять, например, карбонильную группу. В этом случае каждый из Q1 и Q2 предпочтительно является иминогруппой. Кроме того, в этом случае структура следующей химической формулы (Iα) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iα2).

[0220]

[0221]

В вышеуказанной химической формуле (Iα2), R100 представляет любой заместитель, который может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то может присутствовать один или несколько. Когда присутствует несколько, то они могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Примеры вышеуказанного любого заместителя для R100 включают указанные ниже заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных Ra, Rb, Rc и Rd. Более конкретные примеры включают атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклоалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Структура вышеуказанной химической формулы (Iα2) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iα3).

[0222]

[0223]

Когда Q¹¹ и Q¹² являются карбонильными группами, и Q¹ и Q² представляют иминогруппы, то линкерный остаток вышеуказанной химической формулы (I-0) может представлять остаток амида карбоновой кислоты или остаток карбоновой кислоты. Например, структура «ТРА» в приведенном ниже примере может представлять остаток терефталамида или остаток терефталевой кислоты, представленный вышеуказанной химической формулой (Iα3).

[0224]

В вышеуказанной химической формуле (I-0) каждый из Q¹¹ и Q¹² может быть иминогруппой. В этом случае каждый из Q¹ и Q² предпочтительно представляет карбонильную группу. В этом случае структура следующей химической формулы (Iβ) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iβ2).

[0225]

[0226]

В вышеуказанной химической формуле (Iβ2), R¹⁰⁰ представляет любой заместитель, который может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то может присутствовать один или несколько заместителей. Когда присутствует несколько, то они могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. В частности, например, он является таким же как R¹⁰⁰ в вышеуказанной химической формуле (Iα2). Кроме того, структура вышеуказанной химической формулы (Iβ2) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iβ3).

[0227]

[0228]

В вышеуказанной молекуле ssNc, когда вышеуказанный линкерный остаток представляет аминокислотный остаток, то вышеуказанный аминокислотный остаток представлен, например, следующей химической формулой (I). Структура следующей химической формулы (I) является одним из примеров структуры, представленной вышеуказанной химической формулой (I-0).

[0229]

[0230]

В вышеуказанной формуле (I), например, X1, X2, Y1, Y2, L1 и L2 имеют значения, определенные выше.

Последовательность, комплементарная контрольной последовательности экспрессии, каждая связана с вышеуказанным аминокислотным остатком через -OR1- или -OR2-,

где R1 и R2 могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R1 и R2 каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (I); и

А представляет любую атомную группу, при условии, что следующая химическая формула (Ia) представляет аминокислоту или пептид.

[0231]

[0232]

Атомная группа А в вышеуказанной химической формуле (I), (Iα) или (Ia) может содержать или не содержать, например, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из атомной группы с цепью, алициклической атомной группы, ароматической атомной группы, гетероароматической атомной группы и гетероалициклической атомной группы. Несмотря на то, что вышеуказанная атомная группа с цепью особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил и тому подобное. Несмотря на то, что вышеуказанная алициклическая атомная группа особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил и тому подобное. Несмотря на то, что вышеуказанная ароматическая атомная группа особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, арил, арилалкил, алкиларил, арил, конденсированный с кольцом арил, конденсированный с кольцом арилалкил, конденсированный с кольцом алкиларил и тому подобное. Несмотря на то, что вышеуказанная гетероароматическая атомная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают гетероарил, гетероарилалкил, алкилгетероарил, конденсированный с кольцом гетероарил, конденсированный с кольцом гетероарилалкил, конденсированный с кольцом арил, конденсированный с кольцом алкилгетероарил и тому подобное. В атомной группе А в вышеуказанной химической формуле (I), (Iα) или (Ia) каждая из вышеуказанных атомных групп может или может дополнительно не содержать заместитель или защитную группу. Когда имеется несколько вышеуказанных заместителей или защитных групп, то они могут быть одинаковыми или различными. Вышеуказанные заместители представляют, например, заместители, которые были приведены для вышеуказанных R^a, R^b, R^c и R^d, более конкретно, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Вышеуказанные защитные группы являются, например, такими же, как те, которые были приведены в качестве примера для вышеуказанных R^a, R^b, R^c и R^d.

[0233]

В настоящем изобретении «аминокислота» относится, как было упомянуто выше, к любому органическому соединению, содержащему, по меньшей мере, одну аминогруппу и, по меньшей мере, одну карбоксильную группу в молекуле. Вышеуказанная «аминогруппа» особым образом не ограничивается группой -NH₂, и также включает иминогруппу (-NH-). Например, пролин, гидроксипролин и тому подобное, не содержащие -NH₂-группу в молекуле, но содержащие иминогруппу (-NH-), включаются в определение «аминокислоты» в настоящем изобретении. В настоящем изобретении вышеуказанная «аминокислота» может быть, как упомянуто ниже, природной аминокислотой или искусственной аминокислотой. Например, поскольку соединение, представленное приведенной ниже химической формулой (Ia2) или (Ia3), содержит аминогруппу и карбоксильную группу в молекуле, то оно включается в определение «аминокислоты» в настоящем изобретении. Следовательно, например, вышеуказанная химическая формула (I), в которой атомная группа А представляет собой структуру, показанную приведенной ниже химической формулой (А2) или химической формулой (А2а), включается в определение «аминокислотного остатка» в настоящем изобретении. Например, структура «ТРА» в приведенном ниже примере также включается в определение «аминокислотного остатка» в настоящем изобретении. «Пептид» в настоящем изобретении относится к органическому соединению, имеющему структуру, в которой не менее 2 молекул аминокислоты связаны пептидной связью. Вышеуказанная пептидная связь может представлять структуру амида кислоты или структуру имида кислоты. Когда присутствуют многочисленные аминогруппы в молекуле аминокислоты или пептида, представленной вышеуказанной химической формулой (Ia), то аминогруппа, четко показанная в вышеуказанной химической формуле (Ia), может представлять любую аминогруппу. Кроме того, когда в молекуле аминокислоты или пептида, представленной вышеуказанной химической формулой (Ia), присутствуют многочисленные карбоксильные группы, то карбоксильная группа, четко показанная в вышеуказанной химической формуле (Ia), может представлять любую карбоксильную группу.

[0234]

В вышеуказанном аминокислотном остатке миРНК природного типа по настоящему изобретению, то вышеуказанная аминокислота может быть, как упомянуто выше, природной аминокислотой или искусственной аминокислотой. В настоящем изобретении «природная аминокислота» относится к аминокислоте, имеющей встречающуюся в природе структуру или ее оптическому изомеру. Способ получения вышеуказанной природной аминокислоты особым образом не ограничивается и, например, она может быть получена из природы или может быть синтезирована. В настоящем изобретении, кроме того, «искусственная аминокислота» относится к аминокислоте, имеющей структуру, не встречающуюся в природе. То есть вышеуказанная искусственная аминокислота представляет аминокислоту, то есть производное карбоновой кислоты, содержащее аминогруппу (органическое соединение, содержащее, по меньшей мере, одну аминогруппу и, по меньшей мере, одну карбоксильную группу в молекуле) и имеющую структуру, не встречающуюся в природе. Вышеуказанная искусственная аминокислота предпочтительно не содержит, например, гетероцикл. Вышеуказанная аминокислота может быть аминокислотой, составляющей, например, белок. Вышеуказанная аминокислота может представлять, например, по меньшей мере, один вид, выбранный из группы, состоящей из глицина, α-аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, цистина, глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, гидроксилизина, метионина, фенилаланина, серина, треонина, тирозина, валина, пролина, 4-гидроксипролина, триптофана, β-аланина, 1-амино-2-карбоксициклопентана, аминобензойной кислоты, аминопиридинкарбоновой кислоты и аминокислоты, представленной следующей химической формулой (Ia2) и может или может дополнительно не содержать заместитель или защитную группу. Примеры вышеуказанного заместителя включают заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных R^a, R^b, R^c и R^d. Более конкретно, можно упомянуть, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Вышеуказанная защитная группа является такой же, как, например, защитные группы, примеры которых приведены для вышеуказанных R^a, R^b, R^c и R^d. Когда аминокислота вышеуказанной химической формулы (Ia), которая не является пептидом, содержит изомеры, такие как оптический изомер, геометрический изомер, стереоизомер и тому подобное, то может быть использован любой изомер.

[0235]

[0236]

В вышеуказанной химической формуле (Ia2) R¹⁰⁰ является необязательным заместителем и может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то его число может составлять один или более, и, когда присутствует несколько заместителей, то они могут быть одинаковыми или различными. Примеры вышеуказанного необязательного заместителя для R¹⁰⁰ включают заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных R^a, R^b, R^c и R^d, более конкретно, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Структура вышеуказанной химической формулы (Ia2) может представлять, например, следующую химическую формулу (Ia3).

[0237]

[0238]

Когда структура вышеуказанной химической формулы (Ia) представляет вышеуказанную химическую формулу (Ia2), то структура атомной группы A в вышеуказанной химической формуле (I) представлена следующей химической формулой (A2). R¹⁰⁰ в следующей химической формуле (А2) является таким же, как в вышеуказанной химической формуле (Ia2). Когда структура вышеуказанной химической формулы (Ia) представляет вышеуказанную химическую формулу (Ia3), то структура атомной группы A в вышеуказанной химической формуле (I) представлена следующей химической формулой (A2a).

[0239]

[0240]

Примеры структуры вышеуказанной химической формулы (I) включают следующие химические формулы (I-1)-(I-7). В следующих химических формулах (I-1)-(I-7) n и m являются такими же, как определено для вышеуказанной химической формулы (I).

[0241]

[0242]

В вышеуказанных химических формулах (I-1)-(I-7) n и m особым образом не ограничиваются, и имеют значения, определенные выше. Конкретные примеры включают n=11 и m=12 или n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-1), n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-4), n=4 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-6), и n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (1-7). Их структуры показаны в следующих химических формулах (I-1a), (I-1b), (I-4a), (I-6a) и (I-7a).

[0243]

[0244]

Примеры вышеуказанной молекулы ssNc, которая предназначена для применения в настоящем изобретении, включают молекулы ssNc, показанные NK-7006 и NK-7007, которые приводятся ниже.

[0245]

Молекула нуклеиновой кислоты, которая должна содержаться в композиции по настоящему изобретению, может быть получена известным способом. Например, она может быть получена согласно способу, описанному в WO 2012/017919, WO 2013/103146, WO 2012/005368 или WO 2013/077446.

[0246]

Несмотря на то, что содержание молекулы нуклеиновой кислоты в композиции по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, когда композиция представляет фармацевтическую композицию, то обычно оно составляет 0,0001-60 мас.%, предпочтительно 0,001-15 мас.%, более предпочтительно 0,01-1 мас.% в расчете на массу всей фармацевтической композиции.

[0247]

2. Буфер

Композиция по настоящему изобретению содержит буфер. В настоящем изобретении буфер относится к раствору (в частности, водному раствору), обладающему буферным действием, и обеспечивается содержащимся буферным агентом. Буферный агент в настоящем изобретении означает стабилизатор рН водного раствора, и может быть выбран из обычно используемого в области производства лекарственных средств.

В настоящем изобретении разрушение молекулы нуклеиновой кислоты в композиции может быть предотвращено с использованием буфера.

В качестве буфера, предназначенного для применения в настоящем изобретении, можно упомянуть буфер, который доводит рН композиции не ниже 4,0 и не выше 9,0. Предпочтительным является буфер, который доводит рН композиции не ниже 5,5 и не выше 7,5, и более предпочтительным является буфер, который доводит рН композиции не ниже 6,0 и не выше 7,0. Кроме того, предпочтительным является буфер, который доводит рН композиции не ниже 6,1 и не выше 6,9, предпочтительным является буфер, который доводит рН композиции не ниже 6,2 и не выше 6,8, буфер, который доводит рН композиции не ниже 6,3 и не выше 6,7 является более предпочтительным, буфер, который доводит рН композиции не ниже 6,4 и не выше 6,6 является еще более предпочтительным, и буфер, который устанавливает рН композиции на значении 6,5, является особенно предпочтительным.

[0248]

В качестве буферного агента, который предназначен для применения в настоящем изобретении, можно упомянуть, в частности, один или более буферных агентов, выбранных из аскорбиновой кислоты, L-аспартата магния, сульфита натрия, L-аргинина, L-аргинина гидрохлорида, бензойной кислоты, бензоата натрия, эпсилон-аминокапроновой кислоты, хлорида аммония, хлорида калия, хлорида натрия, глюкозамина гидрохлорида, соляной кислоты, триэтаноламина, разбавленной соляной кислоты, лимонной кислоты, безводной лимонной кислоты, безводного цитрата натрия, лимонной кислоты, цитрата натрия гидрата, гидроцитрата натрия, динатрия цитрата, тринатрия цитрата, тринатрия цитрата дигидрата, цитрата калия, глицилглицина, глицина, глюконо-σ-лактона, глюконовой кислоты, глюконата кальция гидрата, L-глутаминовой кислоты, L-глутамата мононатрия, креатинина, хлорбутанола, динатрия гидрофосфата, дигидрофосфата натрия, янтарной кислоты, динатрия сукцината гексагидрата, уксусной кислоты, ацетата аммония, ацетата калия, ацетата натрия гидрата, диизопропаноламина, диэтаноламина, винной кислоты, L-тартрата натрия, гидроксида калия, гидроксида натрия, таурина, карбоната натрия, карбоната натрия гидрата, гидрокарбоната натрия, триизопропаноламина, триэтаноламина, трометамола, диоксида углерода, молочной кислоты, лактата кальция гидрата, раствора лактата натрия, L-гистидина, 4-(2-гидроксиэтила), ледяной уксусной кислоты, глюкозы, фумарата мононатрия, пропионата натрия, бензалкония хлорида, смешанного растворителя группы ароматических углеводородов, бората аммония, малеиновой кислоты, безводного ацетата натрия, безводного карбоната натрия, динатрия гидрофосфата ангидрата, тринатрия фосфата ангидрата, дигидрофосфата натрия ангидрата, метафосфата натрия, метансульфоновой кислоты, серной кислоты, калийалюминия сульфата гидрата, фосфорной кислоты, моногидрофосфата натрия гептагидрата, тринатрия фосфата, двухосновного фосфата натрия гидрата, динатрия гидрофосфата натрия гидрата, дигидрофосфата натрия гидрата, дигидрофосфата калия, дигидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия моногидрата. Из них предпочтительной является лимонная кислота.

Следовательно, в качестве буфера, который предназначен для применения для композиции по настоящему изобретению, предпочтительно можно упомянуть буфер, содержащий лимонную кислоту.

В настоящем изобретении буфер предпочтительно содержит кислоту, приведенную в качестве примера вышеуказанного буферного агента и ее соль, или соли двух или более видов кислот, приведенных в качестве примера вышеуказанного буферного агента. Более предпочтительно можно упомянуть буфер, содержащий лимонную кислоту и ее соль (например, лимонную кислоту и цитрат натрия, лимонную кислоту, тринатрия цитрат и тому подобное), буфер, содержащий фосфорную кислоту и ее соль (например, фосфорную кислоту, дигидрофосфат натрия и тому подобное), и буфер, содержащий два вида фосфатов (например, динатрия гидрофосфат и дигидрофосфат натрия). Особенно предпочтительным является буфер, содержащий лимонную кислоту и ее соль.

[0249]

Количество буфера, используемого для композиции по настоящему изобретению, может быть любым при условии, что оно может довести значение рН до требуемого диапазона. Например, его можно соответствующим образом определить, чтобы содержание буферного агента в композиции находилось в следующем диапазоне. То есть, содержание буферного агента в композиции по настоящему изобретению обычно составляет 0,0001-040 мас.%, предпочтительно 0,0005-20 мас.%, еще более предпочтительно 0,001-10 мас.% в рачете на массу всей композиции.

[0250]

3. Другие добавки

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать растворитель. Примеры растворителя включают фармацевтически приемлемые органические растворители (например, этанол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и т. д.), воду, воду для инъекций, физиологический раствор, раствор глюкозы и тому подобное. Один или более видов растворителей могут использоваться в комбинации.

В настоящем изобретении молекулу нуклеиновой кислоты предпочтительно растворяют в растворителе и смешивают с буфером, поскольку молекулу нуклеиновой кислоты можно растворить за короткое время. В качестве растворителя вода является предпочтительной. В настоящем описании, если не указано иначе, что «молекула нуклеиновой кислоты растворяется в буфере» означает не только то, что молекула нуклеиновой кислоты в виде твердого вещества непосредственно растворяется в буфере, но, как упоминалось выше, молекулу нуклеиновой кислоты иногда растворяют в растворителе, таком как вода, и тому подобное, и полученный раствор смешивают с буфером.

В настоящем изобретении содержание растворителя обычно составляет не ниже 0,0001 мас.% и ниже 100 мас.%, предпочтительно не ниже 0,001 мас.% и ниже 100 мас.%, еще более предпочтительно не ниже 0,005 мас.% и ниже 100 мас.%, в виде общего количества в расчете на массу всей композиции.

[0251]

Когда композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, композицию можно формулировать в виде, например, ингаляционного жидкого препарата, раствора для инъекций, жидкости и т.п. известным способом, и вводить парентеральным введением (например, трансназальным введением, внутривенным введением, инстилляцией, внутримышечным введением, подкожным введением и т.д.). Кроме того, ее можно вводить перорально в подходящей лекарственной форме (например, в капсуле и т.д.).

[0252]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может также содержать, помимо вышеуказанных компонентов, фармацевтически приемлемую добавку при необходимости. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекционный раствор, то примеры добавки включают агент, обеспечивающий изотоничность (например, глюкозу, D-сорбит, хлорид натрия, глицерин, D-маннит и т.д.), смячающее средство (например, бензиловый спирт и т.д.), консервант (например, метилбензоат, параоксибензоаты, хлорбутанол, бензиловый спирт и т.д.) и тому подобное. Предпочтительной добавкой является метилбензоат.

Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой инъекционный раствор, то ее можно также приготовить в виде липосомального препарата, инкапсулирующего молекулу нуклеиновой кислоты, путем растворения молекулы нуклеиновой кислоты в буфере и контактирования полученного раствора с составляющей молекулой липидной мембраны. Липосомальный препарат может предпочтительно использоваться в качестве инъекционного препарата для системного введения, такого как внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция и тому подобное.

[0253]

Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению формулируется в виде ингаляционного препарата, например, раствора, полученного путем растворения молекулы нуклеиновой кислоты в растворителе, таком как вода и тому подобное, то ее смешивают с водным раствором, с добавлением буферного агента (например, лимонной кислоты и ее соли, фосфорной кислоты и ее соли), смесь фильтруют для удаления бактерий, и полученный лекарственный раствор разливают в плотно закрывающиеся контейнеры, такие как флакон, ампула и тому подобное, с получением ингаляционного препарата. Например, молекулу нуклеиновой кислоты смешивают с водным раствором, содержащим воду и буферный агент (например, лимонную кислоту и ее соль, фосфорную кислоту и ее соль), растворяют при обработке ультразвуком и т.п., фильтруют для удаления бактерий и полученный лекарственный раствор разливают в плотно закрывающиеся контейнеры, такие как флакон, ампула и тому подобное, с получением ингаляционного препарата. Несмотря на то, что плотно закрывающийся контейнер, который предназначен для применения, обычно представляет собой бесцветный и прозрачный контейнер из боросиликатного стекла, также можно использовать контейнер, в котором часть, контактирующая с жидкостью на внутренней части стекла, имеет свойство кварцеподобной поверхности.

[0254]

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению молекула нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента пригодна для лечения или профилактики различных заболеваний.

Например, введение пациенту с заболеванием, вызванным геном, может обеспечить контролирование экспрессии вышеуказанного гена, тем самым обеспечивая лечение вышеуказанного заболевания. В настоящем изобретении термин «лечение» включает профилактику вышеуказанных заболеваний; ослабление заболеваний; и улучшение прогноза, как указывалось выше, и этот термин может означать любое из них.

[0255]

Конкретным примером является следующее. Установив ген TGF-β1 в качестве вышеуказанного гена-мишени и включив ингибирующую экспрессию последовательность (например, нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4) для вышеуказанного гена в вышеуказанную молекулу ssPN, она может быть использована для лечения заболеваний или патологии, для которых ожидается лечебный эффект путем подавления TGF-β1.

[0256]

Способ применения фармацевтической композиции по настоящему изобретению особым образом не ограничивается. Например, вышеуказанную фармацевтическую композицию можно вводить субъекту, имеющему вышеуказанный ген-мишень.

[0257]

Примерами вышеуказанного субъекта, которым вводится фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, являются клетки, ткани, органы и тому подобное. Примеры вышеуказанного субъекта также включают людей, животных, отличных от человека, и т.п., таких как млекопитающие, отличные от человека, то есть млекопитающие, исключая людей. Вышеуказанное введение может быть осуществлено, например, in vivo или in vitro. Вышеуказанные клетки особым образом не ограничиваются, и их примеры включают: различные культивируемые клетки, такие как клетки HeLa, клетки 293, клетки NIH3T3, клетки COS и тому подобное; стволовые клетки, такие как клетки ES, гемопоэтические стволовые клетки и тому подобное; и клетки, выделенные из живых организмов, такие как первичные культивируемые клетки.

[0258]

Поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению является низкотоксичной, то ее можно безопасно вводить млекопитающим (например, человеку, мыши, крысы, кролику, собаке, кошке, корове, лошади, свиньям, обезьянам), особенно человеку.

[0259]

Доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению также варьируется в зависимости от субъекта введения, пути введения, заболевания и тому подобного. Например, когда она вводится в качестве терапевтического агента для идиопатического фиброза легких в виде ингаляционной жидкости для взрослого человека, то доза молекулы нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента составляет примерно от 0,001 до примерно 20 мг/кг массы тела, предпочтительно примерно от 0,005 до примерно 5 мг/кг массы тела, более предпочтительно примерно от 0,01 до примерно 1 мг/кг массы тела, которую можно вводить в одной или нескольких порциях в день.

[0260]

Настоящее изобретение также относится к способу стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции, который включает добавление буфера к молекуле нуклеиновой кислоты, или способу получения стабильной композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты. В качестве буфера, используемого для данного способа, можно упомянуть буферы, которые аналогичны вышеуказанным примерам композиции по настоящему изобретению, и аналогичный вариант является предпочтительным.

Количество буфера, добавляемого в способе стабилизации/получения по настоящему изобретению, может быть любым, при условии, что рН можно довести до требуемого диапазона. Например, количество буферного агента можно соответствующим образом определить для попадания в следующий диапазон. То есть, количество буферного агента, добавляемое в способе стабилизации/получения по настоящему изобретению, обычно составляет 0,0001-040 мас.%, предпочтительно 0,0005-20 мас.%, более предпочтительно 0,001-10 мас.% в расчете на массу всей композиции, полученной способом.

[0261]

В дальнейшем настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры и тому подобное. Следует, однако, отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается этим.

Примеры

[0262]

Пример получения 1 (синтез молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты)

Молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, приведенную ниже, синтезировали с использованием синтезатора нуклеиновых кислот (торговое название: ABI Expedite (зарегистрированная торговая марка) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems) на основе фосфорамидитного метода. Для вышеуказанного синтеза использовали РНК фосфорамидиты (2'-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.) в качестве РНК амидита. С вышеуказанного амидита снимали защиту обычным способом и синтезированную РНК очищали с помощью ВЭЖХ. Каждую РНК после очистки лиофилизовали.

[0263]

В качестве молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты для примеров 1-4, синтезировали PH-0009 (PshRNA), как описано выше. В PshRNA Lx обозначает линкерную область Lx, и следующая структурная формула образуется с использованием амидита диамида L-пролина. Подчеркнутый участок показывает ингибирующую последовательность экспрессии человеческого гена TGF-β1.

PshRNA (PH-0009)

5'-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Lx-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3' (SEQ ID NO: 7)

[0264]

[0265]

Пример 1 (оценка влияния рН на температуру хранения)

Пример 1-1 (получение испытуемой композиции)

Оценивали термостабильность композиции, содержащей PH-0009, прототипа ингаляционного препарата на основе нуклеиновой кислоты. Следующие испытуемые композиции 1-12 готовили способом, обычно используемым в данной области.

Испытуемая композиция 1: состав 19, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (рН 2,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 2: состав 20, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (рН 3,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 3: состав 21, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 4: состав 22, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 5: состав 23, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 6: состав 24, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 7: состав 25, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 8: состав 26, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 9,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 9: состав 27, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 10,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 10: состав 28, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (рН 11,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 11: состав 29, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер Бриттона-Робинсона (pH 12,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 12: состав 30, содержащий PH-0009 (0,04 М буфер на основе соляной кислоты-хлорида калия (рН 1,5)), (0,1 мг/мл)

[0266]

Пример 1-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Испытуемые композиции 1-12 каждую закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 25°С/60% относительной влажности, 40°С/75% относительной влажности и 60°С. Образец каждого продукта, заложенного на хранение, отбирали каждую неделю, содержание определяли с использованием ионообменной ВЭЖХ и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение. Период хранения и номер заложенных на хранение продуктов показаны в таблицах 2-5.

Изменения в отношении содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение подтверждали до 4 недель при каждом условии хранения, и оценку продолжали для композиций, которые, как полагали, превосходили другие по стабильности.

В качестве образцов, заложенных на хранение, использовали испытуемые композиции 1-12, которые хранили в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель при 25°С/60% относительной влажности, 40°С/75% относительной влажности и 60°С.

Отдельно готовили раствор PH-0009 в концентрации 0,1 мг/мл с использованием воды для инъекций и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%). Отбирали 90 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (10 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (90%). Отбирали 80 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (20 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (80%). Отбирали 70 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (30 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (70%). Отбирали 60 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (40 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (60%).

Каждый образец для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый образец, заложенный на хранения (каждый 10 мкл) анализировали ВЭЖХ. В отношение площадей пиков, полученных с образцами для построения калибровочной кривой (60%-100%), определяли линейную регрессию (Y=aX+b) и коэффициент корреляции (r) методом наименьших квадратов с теоретическим содержанием (%) на горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), и рассчитывали отношение содержания (%) каждого образца к содержанию на время начала закладки на хранение (excel 2013).

[0267]

Таблица 2
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 19 состав 20 состав 21 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 2,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 3,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 4,0) нуклеиновая кислота PH-0009 PH-0009 BPH-0009 мг/мл 0,1 0,1 0,1 испытуемая композиция № 1 2 3 Найдено 0 1 1 1 40°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1 60°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1

[0268]

Таблица 3
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 22 состав 23 состав 24 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 2,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 3,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 4,0) нуклеиновая кислота PH-0009 PH-0009 PH-0009 мг/мл 0,1 0,1 0,1 испытуемая композиция № 4 5 6 Найдено 0 1 1 1 40°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1 60°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1

[0269]

Таблица 4
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 25 состав 26 состав 27 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 8,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 9,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 10,0) нуклеиновая кислота B B B PH-0009 PH-0009 PH-0009 мг/мл 0,1 0,1 0,1 испытуемая композиция № 7 8 9 Найдено 0 1 1 1 40°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1 60°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1

[0270]

Таблица 5
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 28 состав 29 состав 30 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 11,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 12,0) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 1,5) нуклеиновая кислота PH-0009 PH-0009 PH-0009 мг/мл 0,1 0,1 0,1 испытуемая композиция № 10 11 12 Найдено 0 1 1 1 40°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1 60°C 1 неделя 1 1 1 2 недели 1 1 1 3 недели 1 1 1 4 недели 1 1 1

[0271]

Метод анализа

Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и соответствующие опытные образцы анализировали в следующих условиях анализа.

Детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрил

Подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

Подача подвижной фазы: соотношение смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (таблица 6).

[0272]

Таблица 6 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

скорость потока: 1,0 мл/мин

[0273]

Пример 1-3 (результаты)

Результаты показаны на фиг. 1-3. Поскольку четкого снижения отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение не наблюдали в диапазоне значений рН 5-7 в самых жестких условиях хранения при 60°С, в течение 4 недели, то диапазон значений рН был установлен равным 5-7 для композиций, содержащих PH-0009.

В общем, на нуклеиновую кислоту прямое влияние оказывает температура, и ее хранение при температуре окружающей среды или выше в течение длительного времени считается невозможным. Результаты показали, что одноцепочечную нуклеиновую кислоту можно хранить в течение длительного периода времени даже при температуре окружающей среды или выше, контролируя pH раствора.

[0274]

Пример 2 (цитратный буфер и оценка стабильности в зависимости от его концентрации)

Пример 2-1 (испытуемая композиция)

Была оценена термостабильность композиции, содержащей PH-0009, прототипа ингаляционного препарата на основе нуклеиновой кислоты.

Используя 0,05 М цитратный буфер (рН 6,8) и 0,005 М цитратный буфер (рН 6,8) в качестве базовых композиций, оценивали термостабильность следующих испытуемых композиций 13 и 14 в каждом растворе.

Испытуемую композицию 13 готовили следующим образом.

Гидрат лимонной кислоты (21,0 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора лимонной кислоты. Аналогичным образом тринатрия цитрат дигидрат (29,4 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора цитрата натрия. 0,1 М раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 М раствору цитрата натрия для доведения рН до 6,8 и смесь использовали в качестве 0,1 М цитратного буфера (рН 6,8).

Отдельно нуклеиновую кислоту (PH-0009) (10 мг) растворяли в воде для инъекций (0,5 мл). Этот раствор (0,2 мл) смешивали с водой для инъекций (20 мл). К нему добавляли 0,1 М цитратный буфер (рН 6,8) (20 мл), смесь перемешивали и пропускали через фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) с диаметром пор 0,22 мкм, с получением 4 мг/40 мл (0,1 мг/мл) композиции, содержащей PH-0009.

Испытуемую композицию 14 готовили следующим образом.

Гидрат лимонной кислоты (21,0 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора лимонной кислоты. Аналогичным образом тринатрия цитрат дигидрат (29,4 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора цитрата натрия. 0,1 М раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 М раствору цитрата натрия для доведения рН до 6,8 и смесь использовали в качестве 0,1 М цитратного буфера (рН 6,8). 0,1 М раствор лимонной кислоты (18 мл), 0,1 М раствор цитрата натрия (82 мл) и воду для инъекций (900 мл) смешивали и доводили до рН 6,8 1Н раствором NaOH с получением 0,01 М цитратного буфера (рН 6,8).

Отдельно нуклеиновую кислоту (PH-0009) (10 мг) растворяли в воде для инъекций (0,5 мл). Данный раствор (0,0719 мл) смешивали с водой для инъекций (4,9281 мл). К нему добавляли 0,01 М цитратный буфер (рН 6,8) (5 мл), смесь перемешивали и пропускали через фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) с диаметром пор 0,22 мкм, с получением 1 мг/10 мл (0,1 мг/мл) композиции, содержащей PH-0009.

Испытуемая композиция 13: состав 3, содержащий PH-0009, (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 14: состав 7, содержащий PH-0009, (0,005 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

[0275]

Пример 2-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Испытуемые композиции 13 и 14 каждую закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 40°С/75% относительной влажности и 60°С. Образец каждого продукта, заложенного на хранение, отбирали каждую неделю, содержание определяли с использованием ионообменной ВЭЖХ и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение. Период хранения и номер заложенных на хранение продуктов показаны в таблице 7.

Изменения в отношении содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение подтверждали до 4 недель при каждом условии хранения, и оценку продолжали для композиций, которые, как полагали, превосходили другие по стабильности.

В качестве образцов, заложенных на хранение, использовали испытуемые композиции 13 и 14, которые хранили в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель при 40°С/75% относительной влажности и 60°С.

Отдельно готовили раствор PH-0009 в концентрации 0,1 мг/мл с использованием воды для инъекций и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%). Отбирали 90 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (10 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (90%). Отбирали 80 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (20 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (80%). Отбирали 70 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (30 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (70%). Отбирали 60 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (40 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (60%).

Каждый образец для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый опытный образец, заложенный на хранение (каждый 10 мкл) анализировали ВЭЖХ. В отношение площадей пиков, полученных с образцами для построения калибровочной кривой (60%-100%), определяли линейную регрессию (Y=aX+b) и коэффициент корреляции (r) методом наименьших квадратов с теоретическим содержанием (%) на горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), и рассчитывали отношение содержания (%) каждого образца к содержанию на время начала закладки на хранение (excel 2013).

[0276]

Таблица 7
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 3 состав 7 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 6,8) 0,04 M буфер Бриттона-Робинсона (pH 6,8) нуклеиновая кислота PH-0009 PH-0009 мг/мл 0,1 0,1 испытуемая композиция № 13 14 найдено 0 1 1 40°C 1 неделя 1 1 2 недели 1 1 3 недели 1 1 4 недели 1 1 60°C 1 неделя 1 1 2 недели 1 1 3 недели 1 1 4 недели 1 1

[0277]

Метод анализа

Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и соответствующие опытные образцы анализировали в следующих условиях анализа.

Детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрил

Подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

Подача подвижной фазы: соотношение смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (таблица 6).

[0278]

Таблица 8 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

скорость потока: 1,0 мл/мин

[0279]

Пример 2-3 (результаты)

Результаты показаны на фиг. 4 и фиг. 5. Результаты показывают, что четкое изменение отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение отсутствовало даже в диапазоне концентраций цитратного буфера от 0,005 М до 0,05 М при 60°С в течение 4 недель, когда одноцепочечную нуклеиновую кислоту готовили с концентрацией 0,1 мг/мл. На основании этого можно предположить, что эффект обеспечения стабильности нуклеиновой кислоты можно сохранять, контролируя концентрацию цитратного буфера, даже когда концентрация одноцепочечной нуклеиновой кислоты повышается.

[0280]

Пример 3 (получение композиции, содержащей PH-0009 (10 мг/мл))

Проводили способ получения композиции, содержащей 10 мг/мл PH-0009. Композицию, содержащую 1 мг/мл PH-0009, можно получить изменением стандартного количества нуклеиновой кислоты, подлежащей загрузке, до 1,0 г. В случае концентрации 0,1 мг/мл количество уменьшают до 0,10 г.

Гидрат лимонной кислоты (21,0 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора лимонной кислоты. Аналогичным образом тринатрия цитрат дигидрат (29,4 г) растворяли в воде для инъекций (1 л), с получением 0,1 М раствора цитрата натрия. 0,1 М раствор лимонной кислоты добавляли к 0,1 М раствору цитрата натрия для доведения рН до 6,5 с получением 0,1 М цитратного буфера (рН 6,5).

Отдельно нуклеиновую кислоту (PH-0009) (10 г) растворяли в воде для инъекций (500 мл). К раствору добавляли 0,1 М цитратный буфер (рН 6,8) (500 мл), смесь перемешивали, и пропускали через фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) с диаметром пор 0,22 мкм, с получением 10 г/л (10 мг/мл) композиции, содержащей PH-0009. Композицию можно использовать в качестве ингаляционного препарата для IPF и тому подобное.

Таблица 9 Название компонента
(торговое название или категория) Стандартное количество загрузки PH-0009 (одноцепочечная нуклеиновая кислота) Гидрат лимонной кислоты (the Japanese Pharmacopoeia) Тринатрий цитрат дигидрат (JIS standard) Вода для инъекций (the Japanese Pharmacopoeia)

[0282]

Пример 4 (оценка термостабильности композиции, содержащей PH-0009)

Пример 4-1 (испытуемая композиция)

При разработке препарата одноцепочечной нуклеиновой кислоты оценивали различные составыв отношении стабильности композиции, содержащей PH-0009. В результате испытуемые композиции 15 и 16 оценивали, как наилучшие препараты, которые можно использовать в качестве фармацевтических продуктов на основе нуклеиновой кислоты, и оценивали их термостабильность.

Испытуемые композиции 15 и 16 получали аналогично тому, как описано в примере 3, для испытуемых композиций 13, 14.

Испытуемая композиция 15: состав 44, содержащий PH-0009 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5), (1 мг/мл)

Испытуемая композиция 16: состав 44, содержащий PH-0009 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5), (10 мг/мл)

[0283]

Пример 4-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Испытуемые композиции 15 и 16 каждую закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 25°С/60% относительной влажности, 40°С/75% относительной влажности и 60°С. Образец каждого продукта, заложенного на хранение, отбирали каждую неделю, содержание определяли с использованием ионообменной ВЭЖХ и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение. Период хранения и номер заложенных на хранение продуктов показаны в таблице 10.

Изменения в отношении содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение подтверждали до 4 недель при каждом условии хранения, и оценку продолжали для композиций, которые, как полагали, превосходили другие по стабильности.

В качестве образцов, заложенных на хранение, использовали испытуемые композиции 15 и 16, которые хранили в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель при 40°С/75% относительной влажности и 60°С.

Отдельно готовили раствор PH-0009 в концентрации 0,1 мг/мл с использованием воды для инъекций и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%). Отбирали 90 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (10 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (90%). Отбирали 80 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (20 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (80%). Отбирали 70 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (30 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (70%). Отбирали 60 мкл образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (40 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (60%).

Каждый образец для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый образец, заложенный на хранения (каждый 10 мкл) анализировали ВЭЖХ. В отношение площадей пиков, полученных с образцами для построения калибровочной кривой (60%-100%), определяли линейную регрессию (Y=aX+b) и коэффициент корреляции (r) методом наименьших квадратов с теоретическим содержанием (%) на горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), и рассчитывали отношение содержания (%) каждого образца к содержанию на время начала закладки на хранение (excel 2013).

[0284]

Таблица 10
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение образец состав состав 44 0,05 M цитратный буфер
(pH 6,5) нуклеиновая кислота PH-0009 мг/мл 1 10 испытуемая композиция № 15 16 найдено 0 1 1 40°C 1 неделя 1 1 2 недели 1 1 3 недели 1 1 4 недели 1 1 60°C 1 неделя 1 1 2 недели 1 1 3 недели 1 1 4 недели 1 1

[0285]

Метод анализа

Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и соответствующие опытные образцы анализировали в следующих условиях анализа.

Детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрил

Подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

Подача подвижной фазы: соотношение смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (таблица 11).

[0286]

Таблица 11 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

скорость потока: 1,0 мл/мин

[0287]

Пример 4-3 (результаты)

Результаты по испытуемой композиции 16 показаны на фиг. 6. Результаты свидетельствуют о том, что четкое изменение отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение отсутствовало для 10 мг/мл композиции, содержащей PH-0009, даже при 60°С в течение 4 недель. Аналогичные результаты были получены с испытуемой композицией 15 (1 мг/мл композиция, содержащая PH-0009). Таким образом, было показано, что композиция, содержащая PH-0009 (жидкой ингаляционный препарат на основе одноцепочечной нуклеиновой кислоты и т.п.), полученный согласно этомусоставу, имеет высокую стабильность при хранении.

[0280]

Пример получения 2

В качестве молекулы нуклеиновой кислоты для примера 5 синтезировали молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты с использованием синтезатора нуклеиновых кислот (торговое название: ABI Expedite (зарегистрированная торговая марка) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems) на основе фосфорамидитного метода. Для вышеуказанного синтеза использовали РНК фосфорамидиты (2'-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.) в качестве РНК амидита. С вышеуказанного амидита снимали защиту обычным способом и синтезированную РНК очищали с помощью ВЭЖХ. Каждую РНК после очистки лиофилизовали.

[0289]

Синтезировали молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты (siРНК) для примера 5, как описано выше. В NK-7006 и NK-7007 участки, заключенные в скобки, представляют линкерные области. В NK-7006, NK-7007, PK-7006, PK-7015, PK-7069 и PH-7081 подчеркнутые участки показывают ингибирующие последовательности экспрессии соответствующих генов-мишеней, и Lx обозначает линкерную область. Линкерную область Lx, имеющую следующую структурную формулу, получали с использованием амидита диамида L-пролина.

NKRNA (NK-7006) (ген-мишень: люцифераза)

5'-ACCUACGCCGAGUACUUCGAUUCC(CCACACC)GGAAUCGAAGUACUCGGCGUAGGUUC(UUCG)G-3' (SEQ ID NO: 8)

NKRNA (NK-7007) (ген-мишень: мышиная GAPDH)

5'-ACCACGAGAAAUAUGACAACUCCC(CCACACC)GGGAGUUGUCAUAUUUCUCGUGGUUC(UUCG)G-3' (SEQ ID NO: 9)

PnkRNA (PK-7006) (ген-мишень: мышиный TGF-β1)

5'-GGAACUCUACCAGAAAUAUAGCCC-Lx-GGGCUAUAUUUCUGGUAGAGUUCCAC-Lx-G-3' (SEQ ID NO: 10)

PnkRNA (PK-7015) (ген-мишень: мышиный CCR3)

5'-AGCCUUGUACAGCGAGAUCUUUCC-Lx-GGAAAGAUCUCGCUGUACAAGGCUUC-Lx-G-3' (SEQ ID NO: 11)

PshRNA (PH-7069) (ген-мишень: мышиный Smad3)

5'-GGUGCUCCAUCUCCUACUACGACC-Lx-GGUCGUAGUAGGAGAUGGAGCACCA-3'

(SEQ ID NO: 12)

антисмысловая нуклеиновая кислота (Kynamro-7001) (антисмысловая ДНК против мРНК ApoB100)

5'-GCCUCagtctgcttcGCACC-3' (SEQ ID NO: 1)

(строчными буквами показана ДНК)

PshRNA (PH-7081) (ген-мишень: люцифераза светлячков)

5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAAACC-Lx-GGUUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUG-3' (SEQ ID NO: 13)

siРНК (NI-7001) (мышиный CTGF)

5'-GUGUGACCAAAAGUUACAUGU-3' (SEQ ID NO: 14)

5'-AUGUAACUUUUGGUCACACUC-3' (SEQ ID NO: 15)

миРНК (NM-7001) (предшественник let7a-1 человека)

5'- UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3' (SEQ ID NO: 2)

аптамер (Macugen-7001) (аптамер к белку VEGF)

5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3' (SEQ ID NO: 3)

(t представляет 3'3'-dT)

[0290]

[0291]

Пример 5 (оценка стабильности различных нуклеиновых кислот с цитратным буфером)

Пример 5-1 (получение испытуемой композиции)

Следующие испытуемые композиции 17-36 готовили аналогично тому, как описано в примере 3 для испытуемых композиций 13, 14.

Испытуемая композиция 17: состав 44, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 18: NK-7006 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 19: состав 44, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 20: NK-7007 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 21: состав 44, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 22: PK-7006 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 23: состав 44, содержащий PK-7015 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 24: PK-7015 в воде для инъекций, (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 25: состав 44, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 26: PH-7069 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 27: состав 44, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 28: Kynamro-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 29: состав 44, содержащий PH-7081 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 30: PH-7081 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 31: состав 44, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 32: NI-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 33: состав 44, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 34: NM-7001 в воде для инъекций, (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 35: состав 44, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 36: Macugen-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

[0292]

Пример 5-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Испытуемые композиции 17-36 каждую закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 60°С. Образец каждого заложенного на хранение продукта отбирали каждую неделю, содержание определяли с использованием ионообменной ВЭЖХ и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время закладки на хранение. Период хранения и номер заложенных на хранение продуктов показаны в таблице 12.

В качестве образцов, заложенных на хранение, использовали испытуемые композиции 17-36, которые хранили в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель при 60°С.

Отдельно продукты испытуемых композиций 17-36, которые подвергались хранению при 4°С, использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%). Отбирали 90 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (10 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (90%). Отбирали 80 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (20 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (80%). Отбирали 70 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (30 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (70%). Отбирали 60 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (40 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (60%). Приготовление образцов для построения калибровочной кривой смотри в таблице 13.

Каждый образец для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый опытный образец, заложенный на хранения (каждый 10 мкл) анализировали ВЭЖХ. В отношение площадей пиков, полученных с образцами для построения калибровочной кривой (60%-100%), определяли линейную регрессию (Y=aX+b) и коэффициент корреляции (r) методом наименьших квадратов с теоретическим содержанием (%) на горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), и рассчитывали отношение содержания (%) каждого образца к содержанию на время начала закладки на хранение (excel 2013).

Таблица 12
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение заложенный на хранение образец 4°C 60°C время начала 1-4 недели испытуемое соединение № название 1 4 17 состав 44 с NK-7006 1 4 18 NK-7006 в воде для инъекций 1 4 19 состав 44 с NK-7007 1 4 20 NK-7007 в воде для инъекций 1 4 21 состав 44 с PK-7006 1 4 22 PK-7006 в воде для инъекций 1 4 23 состав 44 с PK-7015 1 4 24 PK-7015 в воде для инъекций 1 4 25 состав 44 с PH-7069 1 4 26 PH-7069 в воде для инъекций 1 4 27 состав 44 с Kynamro-7001 1 4 28 Kynamro-7001 в воде для инъекций 1 4 29 состав 44 с PH-7081 1 4 30 PH-7081 в воде для инъекций 1 4 31 состав 44 с NI-7001 1 4 32 NI-7001в воде для инъекций 1 4 33 состав 44 с NM-0001 1 4 34 NM-0001 в воде для инъекций 1 4 35 состав 44 с Macugen-7001 1 4 36 Macugen-7001 в воде для инъекций 1 4

[0294]

Таблица 13
Приготовление образцов для аналитической кривой каждый образец для аналитической кривой (60%-100%) 100% 90% 80% 70% 60% способ
получения испытуемое соединение испытуемое соединение 90 мкл +
вода для инъекций
10 мкл испытуемое соединение 80 мкл +
вода для инъекций
20 мкл испытуемое соединение 70 мкл +
вода для инъекций
30 мкл испытуемое соединение 60 мкл +
вода для инъекций
40 мкл

[0295]

Метод анализа

Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и соответствующие опытные образцы анализировали в следующих условиях анализа.

Детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрил

Подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

Подача подвижной фазы: соотношение смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (таблица 11).

[0296]

Таблица 14 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

скорость потока: 1,0 мл/мин

[0297]

Пример 5-3 (результаты)

Результаты показаны на фиг. 7-16.

Результаты свидетельствуют о том, что состав (pH 6,5) 0,05 М цитратного буфера обеспечивает термостабильность независимо от типа нуклеиновой кислоты по сравнению с водой для инъекций (WFI).

[0298]

Пример получения 3

В качестве молекулы нуклеиновой кислоты для примера 6 синтезировали молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты с использованием синтезатора нуклеиновых кислот (торговое название: ABI Expedite (зарегистрированная торговая марка) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems) на основе фосфорамидитного метода. Для вышеуказанного синтеза использовали РНК фосфорамидиты (2'-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.) в качестве РНК амидита. С вышеуказанного амидита снимали защиту обычным способом и синтезированную РНК очищали с помощью ВЭЖХ. Каждую РНК после очистки лиофилизовали.

[0299]

Синтезировали молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты (siРНК) для примера 6, как описано выше. В NK-7006 и NK-7007 участки, заключенные в скобки, представляют линкерные области. В NK-7006, NK-7007, PK-7006, PH-7069 и PH-7081 подчеркнутые участки показывает ингибирующие последовательности экспрессии соответствующих генов-мишеней, и Lx обозначает линкерную область. Линкерную область Lx, имеющую следующую структурную формулу, получали с использованием амидита диамида L-пролина.

NkRNA (NK-7006) (ген-мишень: люцифераза)

5'-ACCUACGCCGAGUACUUCGAUUCC(CCACACC)GGAAUCGAAGUACUCGGCGUAGGUUC(UUCG)G-3' (SEQ ID NO: 8)

NkRNA (NK-7007) (ген-мишень: мышиная GAPDH)

5'-ACCACGAGAAAUAUGACAACUCCC(CCACACC)GGGAGUUGUCAUAUUUCUCGUGGUUC(UUCG)G-3' (SEQ ID NO: 9)

PnkRNA (PK-7006) (ген-мишень: мышиный TGF-β1)

5'-GGAACUCUACCAGAAAUAUAGCCC-Lx-GGGCUAUAUUUCUGGUAGAGUUCCAC-Lx-G-3'(SEQ ID NO: 10)

PnkRNA (PK-7015) (ген-мишень: мышиный CCR3)

5'-AGCCUUGUACAGCGAGAUCUUUCC-Lx-GGAAAGAUCUCGCUGUACAAGGCUUC-Lx-G-3'(SEQ ID NO: 11)

PshRNA (PH-7069) (ген-мишень: мышиный Smad3)

5'-GGUGCUCCAUCUCCUACUACGACC-Lx-GGUCGUAGUAGGAGAUGGAGCACCA-3'

(SEQ ID NO: 12)

антисмысловая нуклеиновая кислота (Kynamro-7001) (антисмысловая ДНК против мРНК ApoB100)

5'-GCCUCagtctgcttcGCACC-3' (SEQ ID NO: 1)

(строчные буквы показывают ДНК)

PshRNA (PH-7081) (ген-мишень: люцифераза светлячков)

5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAAACC-Lx-GGUUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUG-3' (SEQ ID NO: 13)

siРНК (NI-7001) (мышиный CTGF)

5'-GUGUGACCAAAAGUUACAUGU-3' (SEQ ID NO: 14)

5'-AUGUAACUUUUGGUCACACUC-3' (SEQ ID NO: 15)

миРНК (NM-7001) (предшественник let7a-1 человека)

5'- UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3' (SEQ ID NO: 2)

аптамер (Macugen-7001) (аптамер к белку VEGF)

5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3' (SEQ ID NO: 3)

(t представляет 3'3'-dT)

[0300]

[0301]

Пример 6 (оценка стабильности различных нуклеиновых кислот с фосфатным буфером)

Пример 6-1 (получение испытуемой композиции)

Следующие испытуемые композиции 37-56 получали следующим образом.

0,1 М фосфатный буфер (рН 6,5) готовили смешиванием дигидрофосфата натрия дигидрата (13,006 г) и динатрия гидрофосфата додекагидрата (6,017 г) и его разведением до 1 л.

Нуклеиновую кислоту (0,1 г) растворяли в воде для инъекций (500 мл). К раствору добавляли 0,1 М фосфатный буфер (рН 6,5) (500 мл), смесь перемешивали, и пропускали через фильтр из поливинилидендифторида (PVDF) с диаметром пор 0,22 мкм с получением 0,1 г/л (0,1 мг/мл) композиции, содержащей нуклеиновую кислоту.

Испытуемая композиция 37: композиция 44, содержащая NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 38: NK-7006 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 39: композиция 44, содержащая NK-7007 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 40: NK-7007 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 41: композиция 44, содержащая PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 42: PK-7006 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 43: композиция 44, содержащая PK-7015 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 44: PK-7015 в воде для инъекций, (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 45: композиция 44, содержащая PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 46: PH-7069 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 47: композиция 44, содержащая Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 48: Kynamro-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 49: композиция 44, содержащая PH-7081 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 50: PH-7081 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 51: композиция 44, содержащая NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 52: NI-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 53: композиция 44, содержащая NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 54: NM-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 55: композиция 44, содержащая Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,5)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 56: Macugen-7001 в воде для инъекций (0,1 мг/мл)

[0302]

Пример 6-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Испытуемые композиции 37-56 закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 60°С. Образец каждого заложенного на хранение продукта отбирали каждую неделю, содержание определяли с использованием ионообменной ВЭЖХ и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время закладки на хранение. Период хранения и номер заложенных на хранение продуктов показаны в таблице 12.

В качестве образцов, заложенных на хранение, использовали испытуемые композиции 37-56, которые хранили в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель при 60°С.

Отдельно продукты испытуемых композиций 17-36, которые подвергались хранению при 4°С, использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%). Отбирали 90 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (10 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (90%). Отбирали 80 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (20 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (80%). Отбирали 70 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (30 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (70%). Отбирали 60 мкл каждого образца для построения калибровочной кривой (100%), добавляли воду для инъекций (40 мкл) до 100 мкл и использовали в качестве образца для построения калибровочной кривой (60%).

Каждый образец для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый опытный образец, заложенный на хранения (каждый 10 мкл) анализировали ВЭЖХ. В отношение площадей пиков, полученных с образцами для построения калибровочной кривой (60%-100%), определяли линейную регрессию (Y=aX+b) и коэффициент корреляции (r) методом наименьших квадратов с теоретическим содержанием (%) на горизонтальной оси (X) и площадью пика на вертикальной оси (Y), и рассчитывали отношение содержания (%) каждого образца к содержанию на время начала закладки на хранение (excel 2013).

[303]

Таблица 15
Период хранения и номер продуктов, заложенных на хранение заложенный на хранение образец 4°C 60°C время начала 1-4 недели испытуемое соединение № название 1 4 37 состав 44 с NK-7006 1 4 38 NK-7006 в воде для инъекций 1 4 39 состав 44 с NK-7007 1 4 40 NK-7007 в воде для инъекций 1 4 41 состав 44 с PK-7006 1 4 42 PK-7006 в воде для инъекций 1 4 43 состав 44 с PK-7015 1 4 44 PK-7015 в воде для инъекций 1 4 45 состав 44 с PH-7069 1 4 46 PH-7069 в воде для инъекций 1 4 47 состав 44 с Kynamro-7001 1 4 48 Kynamro-7001 в воде для инъекций 1 4 49 состав 44 с PH-7081 1 4 50 PH-7081 в воде для инъекций 1 4 51 состав 44 с NI-7001 1 4 52 NI-7001 в воде для инъекций 1 4 53 состав 44 с NM-0001 1 4 54 NM-0001 в воде для инъекций 1 4 55 состав 44 с Macugen-7001 1 4 56 Macugen-7001 в воде для инъекций 1 4

[0304]

Метод анализа

Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и соответствующие опытные образцы анализировали в следующих условиях анализа.

Детектор: ультрафиолетовый абсорбциометр (длина волны анализа: 254 нм)

Колонка: X-Bridge OST C18 (2,5 мкм, 4,6×50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 50 мМ TEAA (pH 7,0), 0,5% ацетонитрил

Подвижная фаза B: 100% ацетонитрил

Подача подвижной фазы: соотношение смешивания подвижной фазы А и подвижной фазы В изменяли следующим образом для контроля градиента концентрации (таблица 16).

[0305]

Таблица 16 Время после инжектирования (мин) подвижная фаза A (об.%) подвижная фаза B (об.%) 0→12 100→60 0→40

скорость потока: 1,0 мл/мин

[0306]

Пример получения 4

В качестве молекул нуклеиновой кислоты для примера 7 синтезировали PK-7006, NK-7006, PH-7069, NI-7001, NM-7001, Kynamro-7001 и Macugen-7001 способом, аналогичным способу, описанному в примере получения 2.

[0307]

Пример 7 (оценка стабильности различных нуклеиновых кислот с цитратным буфером и/или фосфатным буфером)

Пример 7-1 (получение испытуемой композиции)

Испытуемые композиции 57-74, 105-122, 153-170 готовили следующим образом.

0,1 М водный раствор лимонной кислоты и 0,1 М раствор тринатрия цитрата дигидрата смешивали и доводили до рН 4,0-8,0 с получением 0,1 М цитратного буфера при каждом значении рН.

25 мг/мл испытуемой композиции (0,02 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,48 мл) и 0,1 М цитратный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 201-218 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М цитратный буфер. 10 мг/мл испытуемой композиции (0,05 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,45 мл) и 0,1 М цитратный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 249-266, 297-314, 345-362 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М цитратный буфер. 20 мг/мл испытуемой композиции (0,025 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,475 мл) и 0,1 М цитратный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 75-95, 123-143, 171-191 готовили следующим образом.

0,1 М водный раствор дигидрофосфата натрия и 0,1 М раствор динатрия гидрофосфата смешивали и доводили до рН 4,0-8,0 с получением 0,1 М фосфатного буфера при каждом рН.

25 мг/мл испытуемой композиции (0,02 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,48 мл) и 0,1 М фосфатный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 219-239 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М фосфатный буфер. 10 мг/мл испытуемой композиции (0,05 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,45 мл) и 0,1 М фосфатный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 267-287, 315-335, 363-383 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М фосфатный буфер. 20 мг/мл испытуемой композиции (0,025 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,475 мл) и 0,1 М фосфатный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 96-104, 144-152, 192-200 готовили следующим образом.

0,1 М водный раствор цитрата натрия и 0,1 М водный раствор лимонной кислоты смешивали и доводили до рН 4,2-7,6 с получением 0,1 М цитратного буфера при каждом рН. Аналогично, 0,1 М водный раствор дигидрофосфата натрия и 0,1 М раствор динатрия гидрофосфата смешивали и доводили до рН 4,2-7,6 с получением 0,1 М фосфатного буфера при каждом рН. 0,1 М цитратный буфер и 0,1 М фосфатный буфер при одинаковом значении рН смешивали в соотношении 5:5 (3 мл:3 мл) с получением 0,1 М цитратно-фосфатного буфера (5:5) при каждом рН.

25 мг/мл испытуемой композиции (0,02 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,48 мл) и 0,1 М цитратно-фосфатный буфер (5:5) (2,50 мл) при каждом рН смешивали с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 240-248 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М цитратно-фосфатный буфер (5:5). 10 мг/мл испытуемой композиции (0,05 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,45 мл) и 0,1 М цитратно-фосфатный буфер (5:5) (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

Испытуемые композиции 288-296, 336-344, 384-392 готовили следующим образом.

Способом, аналогичным описанному выше, приготовили 0,1 М цитратно-фосфатный буфер (5:5). 20 мг/мл испытуемой композиции (0,025 мл), приготовленной на воде для инъекций, воду для инъекций (2,475 мл) и 0,1 М цитратно-фосфатный буфер (2,50 мл) смешивали при каждом значении рН с получением 5 мл каждой 0,1 мг/мл испытуемой композиции.

[0308]

Молекула нуклеиновой кислоты: PK-7006

Испытуемая композиция 57: состав 199, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 58: состав 200, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 59: состав 201, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 60: состав 202, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 61: состав 203, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 62: состав 204, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 63: состав 205, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 64: состав 206, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 65: состав я 207, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 66: состав 208, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 67: состав 209, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 68: состав 210, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 69: состав 211, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 70: состав 212, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 71: состав 213, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 72: состав 214, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 73: состав 215, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 74: состав 216, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 75: состав 217, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 76: состав 218, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 77: состав 219, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 78: состав 220, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 79: состав 221, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 80: состав 222, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 81: состав 223, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 82: состав 224, содержащий (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 83: состав 225, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 84: состав 226, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 85: состав 227, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 86: состав 228, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 87: состав 229, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 88: состав 230, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 89: состав 231, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 90: состав 232, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 91: состав 233, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 92: состав 234, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 93: состав 235, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 94: состав 236, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 95: состав 237, содержащий PK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 96: состав 238, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 97: состав 239, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 98: состав 240, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 99: состав 241, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 100: состав 242, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 101: состав 243, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 102: состав 244, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 103: состав 245, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 104: состав 246, содержащий PK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0309]

Молекула нуклеиновой кислоты: NK-7006

Испытуемая композиция 105: состав 247, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 106: состав 248, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 107: состав 249, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 108: состав 250, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 109: состав 251, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 110: состав 252, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 111: состав 253, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 112: состав я 254, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 113: состав 255, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 114: состав 256, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 115: состав 257, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 116: состав 258, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 117: состав 259, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 118: состав 260, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 119: состав 261, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 120: состав 262, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 121: состав 263, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 122: состав 264, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 123: состав 265, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 124: состав 266, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 125: состав 267, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 126: состав 267, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 127: состав 268, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 128: состав 270, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 129: состав 271, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 130: состав 272, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 131: состав 273, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 132: состав 274, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 133: состав 275, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 134: состав 276, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 135: состав 277, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 136: состав 278, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 137: состав 279, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 138: состав 280, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 139: состав 281, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 140: состав 282, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 141: состав 283, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 142: состав 284, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 143: состав 285, содержащий NK-7006 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 144: состав 286, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 145: состав 287, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 146: состав 288, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 147: состав 289, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 148: состав 290, содержащий NK-7006 (0,05 М) буферный раствор цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 149: состав 291, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 150: состав 292, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 151: состав 293, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 152: состав 294, содержащий NK-7006 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0310]

Молекула нуклеиновой кислоты: PH-7069

Испытуемая композиция 153: состав 295, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 154: состав 296, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 155: состав 297, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 156: состав 298, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 157: состав 299, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 158: состав 300, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 159: состав 301, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 160: состав 302, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 161: состав 303, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 162: состав 304, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 163: состав 305, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (pH 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 164: состав 306, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 165: состав 307, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 166: состав 308, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 167: состав 309, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 168: состав 310, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 169: состав 311, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 170: состав 312, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 171: состав 313, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 172: состав 314, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 173: состав 315, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 174: состав 316, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 175: состав 317, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 176: состав 318, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 177: состав 319, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 178: состав 320, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 179: состав 321, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 180: состав 322, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 181: состав 323, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 182: состав 324, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 183: состав 325, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 184: состав 326, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 185: состав 327, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 186: состав 328, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 187: состав 329, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 188: состав 330, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 189: состав 331, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 190: состав 332, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 191: состав 333, содержащий PH-7069 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 192: состав 334, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 193: состав 335, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 194: состав 336, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 195: состав 337, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 196: состав 338, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 197: состав 339, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 198: состав 340, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 199: состав 341, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 200: состав 342, содержащий PH-7069 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0311]

Молекула нуклеиновой кислоты: NI-7001

Испытуемая композиция 201: состав 343, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 202: состав 344, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 203: состав 345, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 204: состав 346, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 205: состав 347, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 206: состав 348, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 207: состав 349, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 208: состав 350, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 209: состав 351, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 210: состав 352, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 211: состав 353, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 212: состав 354, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 213: состав 355, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 214: состав 356, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 215: состав 357, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 216: состав 358, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 217: состав 359, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 218: состав 360, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 219: состав 361, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 220: состав 362, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 221: состав 363, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 222: состав 364, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 2223: состав 365, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 224: состав 366, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 225: состав 367, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 226: состав 368, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 227: состав 369, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 228: состав 370, содержащаий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 229: состав 371, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 230: состав 372, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 231: состав 373, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 232: состав 374, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 233: состав 375, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 234: состав 376, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 235: состав 377, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 236: состав 378, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 237: состав 379, содержащаий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 238: состав 380, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 239: состав 381, содержащий NI-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 240: состав 382, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 241: состав 383, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 242: состав 384, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный буфер (5:5) (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 243: состав 385, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 244: состав 386, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный буфер (5:5) (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 245: состав 387, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 246: состав 388, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 247: состав 389, содержащий NI-7001 (0,05 М) цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 248: состав 390, содержащий NI-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0312]

Молекула нуклеиновой кислоты: NM-7001

Испытуемая композиция 249: состав 391, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 250: состав 392, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 251: состав 393, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 252: состав 394, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 253: состав 395, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 254: состав 396, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 255: состав 397, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 256: состав 398, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 257: состав 399, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 258: состав 400, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 259: состав 401, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 260: состав 402, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 261: состав 403, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 262: состав 404, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 263: состав 405, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 264: состав 406, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 265: состав 407, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 266: состав 408, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 267: состав 409, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 268: состав 410, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 269: состав 411, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 270: состав 412, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 271: состав 413, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 272: состав 414, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 273: состав 415, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 274: состав 416, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 275: состав 417, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 276: состав 418, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 277: состав 419, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 278: состав 420, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 279: состав 421, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 280: состав 422, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 281: состав 423, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 282: состав 424, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 283: состав 425, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 284: состав 426, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 285: состав 427, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 286: состав 428, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 287: состав 429, содержащий NM-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 288: состав 430, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный буфер (5:5) (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 289: состав 431, содержащий NM-7001 (0,05 М) цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 290: состав 432, содержащий NM-7001 (0,05 М) цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 291: состав 433, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 292: состав 434, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 293: состав 435, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 294: состав 436, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 295: состав 437, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 296: состав 438, содержащий NM-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0313]

Молекула нуклеиновой кислоты: Kynamro-7001

Испытуемая композиция 297: состав 439, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 298: состав 440, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 299: состав 441, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 300: состав 442, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 301: состав 443, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 302: состав 444, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 303: состав 445, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 304: состав 446, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 305: состав 447, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 306: состав 448, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 307: состав 449, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 308: состав 450, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 309: состав 451, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 310: состав 452, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 311: состав 453, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 312: состав 454, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 313: состав 455, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 314: состав 456, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 315: состав 457, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 316: состав 458, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 317: состав 459, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 318: состав 460, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 319: состав 461, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 320: состав 462, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 321: состав 463, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 322: состав 464, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 323: состав 465, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 324: состав 466, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 325: состав 467, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 326: состав 468, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 327: состав 469, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 328: состав 470, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 329: состав 471, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 330: состав 472, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 331: состав 473, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 332: состав 474, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 333: состав 475, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 334: состав 476, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (pH 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 335: состав 477, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 336: состав я 478, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 337: состав 479, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М) буферный раствор цитратно-фосфат (5:5) (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 338: состав 480, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 339: состав 481, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 340: состав 482, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 341: состав 483, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 342: состав 484, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (pH 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 343: состав 485, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 344: состав 486, содержащий Kynamro-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0314]

Молекула нуклеиновой кислоты: Macugen-700

Испытуемая композиция 345: состав 487, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 346: состав 488, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 347: состав 489, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 348: состав 490, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 349: состав 491, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 350: состав 492, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 351: состав я 493, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 352: состав 494, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 353: состав 495, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 354: состав 496, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 355: состав 497, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 356: состав я 498, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 357: состав 499, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 358: состав 500, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 359: состав 501, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 360: состав 502, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 361: состав 503, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 362: состав 504, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 363: состав 505, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 364: состав 506, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 365: состав 507, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 366: состав 508, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 367: состав 509, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 4,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 368: состав 510, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 369: состав 511, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 370: состав 512, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 371: состав 513, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 372: состав 514, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 5,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 373: состав 515, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 374: состав 516, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 375: состав 517, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 376: состав 518, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 377: состав 519, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 6,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 378: состав 520, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 379: состав 521, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 380: состав 522, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 381: состав 523, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 382: состав 524, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 7,8)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 383: состав 525, содержащий Macugen-7001 (0,05 М фосфатный буфер (рН 8,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 384: состав 526, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,2)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 385: состав 527, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 386: состав 528, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 4,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 387: состав 529, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 5,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 388: состав 530, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 389: состав 531, содержащий Macugen-7001 (0,05 М) цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 6,6)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 390: состав 532, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,0)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 391: состав 533, содержащий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5)) буфер (рН 7,4)), (0,1 мг/мл)

Испытуемая композиция 392: состав 534, содержащаий Macugen-7001 (0,05 М цитратно-фосфатный (5:5) буфер (рН 7,6)), (0,1 мг/мл)

[0315]

Пример 7-2 (метод испытаний и оценочные критерии)

Каждую из испытуемых композиций 57-392 закладывали на хранение при 4°С и каждую четвертую закладывали на хранение в испытательной камере для оценки стабильности при 60°С. Образец каждого заложенного на хранение продукта при 4°С отбирали на время начала закладки и образец каждого заложенного на хранение продукта при 60°С отбирали каждую неделю, содержание определяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, и стабильность оценивали на основе снижения отношения содержания (%) к содержанию на время начала закладки на хранение.

Используя каждую испытуемую композицию на время начала закладки в качестве образца для построения калибровочной кривой (100%), готовили образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) способом, аналогичным, описанному в примере 1-2. Образцы для построения калибровочной кривой (60%-100%) и каждый подвергшийся хранению опытный образец (каждый 30 мкл) анализировали с помощью ВЭЖХ способом, аналогичным описанному в примере 1-2.

[0316]

Пример 7-3 (результаты)

Результаты показаны на фиг. 17-23. Результаты показывают, что PK-7006, NK-7006 и PH-7069 имеют высокую стабильность при хранении даже при 60°C, в течение 4 недель.

Промышленная применимость

[0317]

Согласно настоящему изобретению может быть обеспечена новая жидкая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, в частности фармацевтическая композиция, обеспечивающая улучшенную стабильность молекулы нуклеиновой кислоты. Следовательно, становится возможным хранение, транспортировка и т.п. при температуре окружающей среды, и композиция очень полезна, поскольку может быть обеспечена композиция, содержащая нуклеиновые кислоты с превосходной способностью к манипулированию с ними.

Данная заявка основана на заявке на патент № 2014-267087, поданной в Японии (дата подачи заявки: 29 декабря 2014 года) и 2015-081298, поданной в Японии (дата подачи заявки: 10 апреля 2015 года), содержание которых полностью включено в данное описание.

--->

Список последовательностей

<110> BONAC CORPORATION

<120> Композиция, стабильно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты

<130> 092374

<150> JP 2014-267087

<151> 2014-12-29

<150> JP 2015-081298

<151> 2015-04-10

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антисмысловая, нуклеотид в положениях 1-5 и 16-20 представляет РНК.

<400> 1

gccucagtct gcttcgcacc 20

<210> 2

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> миРНК

<400> 2

ugggaugagg uaguagguug uauaguuuua gggucacacc caccacuggg agauaacuau 60

acaaucuacu gucuuuccua 80

<210> 3

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аптамер, T в положении 28 представляет 3'-3'-связанный дезокситимидин.

<400> 3

cggaaucagu gaaugcuuau acauccgt 28

<210> 4

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> контролирующая экспрессию область

<400> 4

uaugcugugu guacucug 18

<210> 5

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> контролирующая экспрессию область

<400> 5

ucgaaguacu cggcguagg 19

<210> 6

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> контролирующая экспрессию область

<400> 6

guugucauau uucucgugg 19

<210> 7

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 7

gcagaguaca cacagcauau accgguauau gcugugugua cucugcuu 48

<210> 8

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 8

accuacgccg aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucggcg uagguucuuc 60

gg 62

<210> 9

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 9

accacgagaa auaugacaac ucccccacac cgggaguugu cauauuucuc gugguucuuc 60

gg 62

<210> 10

<211> 51

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 10

ggaacucuac cagaaauaua gcccgggcua uauuucuggu agaguuccac g 51

<210> 11

<211> 51

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 11

agccuuguac agcgagaucu uuccggaaag aucucgcugu acaaggcuuc g 51

<210> 12

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 12

ggugcuccau cuccuacuac gaccggucgu aguaggagau ggagcacca 49

<210> 13

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекула нуклеиновой кислоты

<400> 13

cuuacgcuga guacuucgaa accgguuucg aaguacucag cguaagug 48

<210> 14

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siРНК

<400> 14

gugugaccaa aaguuacaug u 21

<210> 15

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> siРНК

<400> 15

auguaacuuu uggucacacu c 21

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к стабильной композиции нуклеиновой кислоты. Изобретение позволяет стабильно сохранять нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента в форме раствора в интервале pH от 4 до 11 при температуре окружающей среды в течение длительного срока. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 16 табл., 7 пр. , 23 ил.

1. Композиция для стабильного хранения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты и буфер, и которая обладает следующими признаками:

(а) находится в форме раствора при температуре окружающей среды,

(b) молекула нуклеиновой кислоты присутствует в композиции в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл и

(с) содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 25°С и относительной влажности 60% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания на момент начала хранения,

где молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты

(1) с областью (X), линкерной областью (Lx) и областью (Xc), где линкерная область (Lx) соединяет область (X) и область (Xc), где область (Xc) комплементарна области (X), по меньшей мере одна область (X) и область (Xc) содержит последовательность контроля экспрессии, и где линкерная область (Lx) содержит аминокислотный остаток, полиаминовый остаток, остаток поликарбоновой кислоты или ненуклеотидную структуру, содержащую по меньшей мере пирролидиновый скелет или пиперидиновый скелет, или

(2) содержащую в направлении от 5’-конца к 3’-концу: 5’-концевую область (Xc), линкерную область (Lx), внутреннюю область (Z), линкерную область (Ly) и 3’-концевую область (Yc) в приведенном порядке, где внутренняя область (Z) образована соединением внутренней 5’-концевой области (X) и внутренней 3’-концевой области (Y), 5’-концевая область (Xc) комплементарна внутренней 5’-концевой области (X), 3’-концевая область (Yc) комплементарна внутренней 3’-концевой области (Y), по меньшей мере одна внутренняя область (Z), 5’-концевая область (Xc) и 3’-концевая область (Yc) содержит последовательность контроля экспрессии, и внутренняя область (Lx) и внутренняя область (Ly), соответственно, содержат нуклеотидный остаток, аминокислотных остаток, полиаминовый остаток и остаток поликарбоновой кислоты или ненуклеотидную структуру, содержащую пирролидиновый скелет или пиперидиновый скелет,

где буфер устанавливает значение рН композиции не менее 4,0 и не более 11,0.

2. Композиция по п.1, где содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 40°С и относительной влажности 75% в течение 4 недель составляет не менее 80% относительно содержания на момент начала хранения,

где буфер устанавливает значение рН композиции не менее 4,0 и не более 10,0.

3. Композиция по п.1 или 2, где содержание молекулы нуклеиновой кислоты после хранения при 60°С в течение 4 недель составляет не менее 60% относительно содержания на момент начала хранения,

где буфер устанавливает значение рН композиции не менее 5,0 и не более 8,0.

4. Композиция по п.1, где буфер устанавливает значение рН композиции до значения не ниже 4,0 и не выше 9,0.

5. Композиция по п.1, где буфер устанавливает значение рН композиции до значения не ниже 5,5 и не выше 7,5.

6. Композиция по п.1, где буфер устанавливает значение рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0.

7. Композиция по п.1, где буфер содержит один или более буферных агентов, выбранных из гидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия, динатрия гидрофосфата, хлорида натрия, аргинина гидрохлорида, цитрата натрия, тринатрия цитрата дигидрата, L-глутамата мононатрия, ацетата натрия, карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, лактата натрия, фосфата монокалия, гидроксида натрия, меглюмина, глицина, лимонной кислоты и уксусной кислоты.

8. Композиция по п.1, где буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.

9. Композиция по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет молекулу ДНК, молекулу РНК или молекулу химерной нуклеиновой кислоты ДНК и РНК.

10. Композиция по п.1, где число нуклеотидов в указанной молекуле нуклеиновой кислоты составляет 10-300.

11. Композиция по п.1, где одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический агент.

12. Способ получения композиции по любому из пп.1-11, включающий растворение указанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, доведение рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.

13. Способ стабилизации молекулы нуклеиновой кислоты в композиции по любому из пп.1-11, включающий растворение указанной молекулы нуклеиновой кислоты в буфере, доведение рН композиции до значения не ниже 6,0 и не выше 7,0, и хранение раствора при температуре окружающей среды.

14. Способ по любому из пп.12 или 13, где буфер содержит лимонную кислоту и/или фосфорную кислоту.

15. Способ по любому из пп.12-14, где одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический агент.