КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/09 A61K31/7125 A61K31/713 A61K39/02 A61K39/12 A61K39/39 A61P31/12 A61P33/00 A61P35/00 A61P43/00 C07H21/04 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотид-содержащему комплексу, обладающему иммуностимулирующей активностью, и его применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к комплексу, включающему CpG-олигонуклеотид (ODN), обладающий иммуностимулирующей активностью, и β-глюкан, и его фармацевтическому применению.

Предшествующий уровень техники

[0002]

CpG-олигонуклеотид (CpG-ODN) представляет собой короткий (около 20 пар оснований) фрагмент одноцепочечной синтетической ДНК, содержащий иммуностимулирующий мотив CpG, эффективный агонист Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), который активирует дендритные клетки (DC) и B-клетки для продуцирования интерферонов типа I (IFN) и воспалительных цитокинов (не-патентные документы 1, 2), и действует как адьювант в отношении как гуморального Th1-типа, так и клеточного иммунного ответа, включая ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (не-патентные документы 3, 4). Поэтому CpG-ODN постулируется в качестве возможного иммунотерапевтического средства против инфекционных заболеваний, злокачественного новообразования, астмы и поллиноза (не-патентные документы 2, 5).

[0003]

Существует, по меньшей мере, четыре типа CpG ODN, каждый из которых имеет различный каркас, последовательность и иммуностимулирующие свойства (не-патентный документ 6). CpG-ODN типа D (также называется A), как правило, содержит один палиндромный CpG-мотив с фосфодиэфирным (PO) каркасом и фосфоротиоатным (PS) полиG-хвостом, который активирует плазмоцитоидные DC (pDC) для получения большого количества IFN-α, но не индуцируют созревание pDC и не активирует B-клетки (не-патентные документы 7, 8). Три других типа ODN состоят из PS-каркаса. CpG-ODN Типа K (также называется B) содержит непалиндромные множественные CpG-мотивы и сильно активирует B-клетки, чтобы секретировать IL-6, и созревание pDC, однако лишь едва продуцирование IFN-α (не-патентные документы 8, 9). Недавно, были разработаны CpG-ODN C- и Р-типов; они содержат одну и две CpG-палиндромные последовательности(ть), соответственно, каждая из которых может активировать В-клетки подобно типу K и pDC подобно типу D, хотя CpG-ODN типа C слабее индуцирует продуцирование IFN-α по сравнению с CpG-ODN Р-типа (не-патентный документ 10-12). Много превосходных CpG-ODN Типа K описаны в патентном документе 1.

[0004]

Было показано, что CpG-ODN D- и Р-типов образуют структуры высокого порядка, хугстиновское спаривание оснований с образованием параллельных квадруплексных структур, называемых G-тетрадами, и уотсон-криковское спаривание оснований между cis- и trans-палиндромными участками, соответственно, которые необходимы для устойчивого продуцирования IFN-α при помощи рDC (не-патентные документы, 12-14). Несмотря на то, что такие структуры высших порядков, как представляется, необходимым для локализации в ранних эндосомах и сигнализации через TLR9, они страдают от полиморфизма продуктов, агрегации и преципитации, что препятствует их клиническому применению (не-патентный документ 15). Поэтому CpG-ODN только K и C типа, как правило, доступны в качестве иммунотерапевтических средств и вакцинных адъювантов для применения у человека (не-патентный документ 16 и 17). Несмотря на то, что CpG-ODN K типа усиливает иммуногенность вакцин, предназначенных для защиты от инфекционных заболеваний и злокачественных новообразований в клинических испытаниях на людях (не-патентные документы 6, 16), химическая или физическая коньюгация между антигеном и CpG-ODN K типа необходима для оптимальных адъювантных эффектов. Данные результаты указывают на то, что CpG-ODN этих четырех типов (K, D, P и C) имеют свои преимущества и недостатки, однако разработку CpG-ODN «все в одном», активирующего как B-клетки, так и рDC без агрегации еще только предстоит выполнить.

[0005]

Шизофилан (SPG), растворимый β-1,3-глюкан, полученный из Schizophyllum commune, представляет собой препарат, одобренный в Японии в качестве усилителя лучевой терапии для пациентов с раком шейки матки, в течение последних трех десятилетий (не-патентный документ 18). Аналогичным образом, лентинан (LNT), растворимый β-1,3-глюкан, полученный из гриба шиитаке, представляет собой лекарственное средство, одобренное в 1985 году, и используется в сочетании с лекарственным средством фторпиримидином для пациентов с неоперабельным и рецидивным раком желудка (не-патентные документы 19, 20). Было показано, что β-1,3-глюкан образует комплекс с полидезоксиаденилатом (dA) в виде структуры тройной спирали (не-патентный документ 21).

[0006]

Патентные документы 2-4 раскрывают использование водорастворимого комплекса β-1,3-глюкана, включающего шизофиллан и нуклеиновую кислоту (ген) в качестве генного носителя. Эти документы описывают, что образование комплекса усиливает антисмысловое действие гена и его резистентное действие против нуклеаз.

[0007]

Патентный документ 5 раскрывает использование полисахаридов, имеющих β-1,3-связь, в качестве носителя (трансфекционного средства), усиливающего действие иммуностимулирующего олигонуклеотида, имеющего последовательность CpG, причем фосфодиэфирная связь заменена фосфоротиоатной связью или фосфородитиоатной связью.

[0008]

Патентный документ 6 раскрывает иммуностимулирующий комплекс, состоящий из иммуностимулирующего олигонуклеотида и β-1,3-глюкана, имеющего длинную β-1,6-гликозидсвязанную боковую цепь.

[0009]

Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что мышиный и гуманизированный CpG ODN, связанный с поли-dA, имеющий фосфодиэфирную связь на 5' конце, образовавал комплекс с SPG, усиливал продуцирование цитокинов и выступал в качестве гриппозного вакцинного адъюванта и профилактического или терапевтического средства при заболеваниях, связанных с Th2-клетками (не-патентные документы 22, 23, патентный документ 7). При добавлении поли(dA) к 5'-концу CpG каждого из K-типа и D-типа с образованием комплекса с SPG, оба показали улучшенную активность при сохранении свойства K-типа и D-типа. При этом было трудно добиться высоких выходов комплекса CpG-SPG с целью его более эффективной и рентабельной доклинической, а также клинической разработки. Недавно, при соединении поли(dA) с CpG-ODN при помощи фосфоротиоатной связи эффективность комплексообразования была увеличена почти на 100% (не-патентный документ 24). Однако тщательное исследование пока не проводилось, чтобы выявить лучшую гуманизированную CpG-последовательность и оптимизировать факторы для получения активностей «все-в-одном» CpG ODN четырех типов.

[0010]

Патентный документ 8 раскрывает способ продуцирования тройного комплекса типа антиген/CPG-олигонуклеотид/β-1,3-глюкан.

Список документов

Патентные документы

[0011]

патентный документ 1: US 8,030,285 B2

патентный документ 2: WO 01/034207 A1

патентный документ 3: WO 02/072152 A1

патентный документ 4: JP-A-2004-107272

патентный документ 5: WO 2004/100965 A1

патентный документ 6: JP-A-2007-70307

патентный документ 7: JP-A-2008-100919

патентный документ 8: JP-A-2010-174107

Непатентные документы

[0012]

Непатентный документ 1: Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000).

Непатентный документ 2: Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006).

Непатентный документ 3: Brazolot Millan, C.L., Weeratna, R., Krieg, A.M., Siegrist, C.A. & Davis, H.L. CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 15553-15558 (1998).

Непатентный документ 4: Chu, R.S., Targoni, O.S., Krieg, A.M., Lehmann, P.V. & Harding, C.V. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. The Journal of experimental medicine 186, 1623-1631 (1997).

Непатентный документ 5: Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004).

Непатентный документ 6: Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009).

Непатентный документ 7: Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).

Непатентный документ 8: Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).

Непатентный документ 9: Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).

Непатентный документ 10: Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003).

Непатентный документ 11: Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).

Непатентный документ 12: Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatory CpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).

Непатентный документ 13: Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005).

Непатентный документ 14: Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).

Непатентный документ 15: Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN D type: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488-6495 (2006).

Непатентный документ 16: Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).

Непатентный документ 17: McHutchison, J.G., et al. Phase 1B, randomized, double-blind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).

Непатентный документ 18: Okamura, K., et al. Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986).

Непатентный документ 19: Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J. Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.

Непатентный документ 20: Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect on prolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668.

Непатентный документ 21: Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide-polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the natural polysaccharide шизофиллан in the macromolecular complex with single-stranded RNA and DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).

Непатентный документ 22: Shimada, N., et al. A polysaccharide carrier to effectively deliver native phosphodiester CpG DNA to antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007).

Непатентный документ 23: Koyama, S., et al. Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).

Непатентный документ 24: Minari, J., et al. Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin-1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Задачи, на решение которых направлено изобретение

[0013]

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание иммуностимулирующего средства, обладающего большей активностью, чем обычные комплексы CpG-SPG.

Средства решения задач

[0014]

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования и идентифицировали новый комплекс, содержащий CpG ODN (K3) K-типа (SEQ ID NO: 2), имеющий поли(da)-хвост на 3'-конце и SPG, а именно К3-SPG. Он образует нано-частицу высокого порядка, которая может быть полностью растворимой. Подобным образом, авторы настоящего изобретения также добились успеха в продуцировании нового комплекса K3-LNT, содержащего вышеупомянутый CpG ODN (K3) K-типа и лентинан (LNT). Несмотря на то, что K3-SPG и K3-LNT не имеет последовательности CpG-ODN типа D, он одновременно обладает иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K (например, активностью активирования В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) для секреции IL-6) и иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D (например, активностью активирования дендритных клеток, подобных плазматическим клеткам, для продуцирования IFN-α). Кроме того, K3-LNT и K3-SPG обладают эффективной активностью вакцинного адъюванта, и при инокулировании вместе с антигеном для иммунизации они индуцируют как антиген-специфический гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет, и действительно демонстрировали очень мощный инфекцие-защитный эффект против вируса РСВ и вируса гриппа. Основываясь на этих выводах, авторы провели дополнительные исследования и завершили настоящее изобретение.

[0015]

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет следующее.

[1] Олигонуклеотид, включающий гуманизированный CpG-олигонуклеотид Типа K и полидезоксиаденилат, причем полидезоксиаденилат размещен с 3'-стороны гуманизированного CpG-олигонуклеотида типа K.

[2] Олигонуклеотид по п. [1], в котором гуманизированный CpG-олигонуклеотид типа K имеет длину не менее 10 нуклеотидов и содержит нуклеотидную последовательность, представленную формулой:

[0016]

[0017]

в которой CpG-мотив в центре не метилирован, W представляет собой А или Т, а N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ и N₆ могут представлять собой любые нуклеотиды.

[3] Олигонуклеотид по п. [1] или [2], в котором гуманизированный CpG-олигонуклеотид типа K состоит из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.

[4] Олигонуклеотид по любому из по пп. [1]-[3], в котором фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде частично или полностью замещены фосфоротиоатными связями.

[5] Олигонуклеотид по п. [4], в котором фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде полностью замещены фосфоротиоатными связями.

[6] Олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[5], в котором полидезоксиаденилат имеет длину 20-60 нуклеотидов.

[7] Комплекс, содержащий олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6] и β-1,3-глюкан.

[8] Комплекс по п. [7], в котором β-1,3-глюкан представляет собой лентинан, биополимера шизофиллан, склероглюкан, кулдлан, пакиман, грифолан или ламинаран.

[9] Комплекс по п. [8], в котором β-1,3-глюкан представляет собой лентинан, шизофиллан или склероглюкан.

[10] Комплекс, состоящий из олигонуклеотида, описанного в следующем подпункте (I), и β-1,3-глюкана, описанного в подпункте (II):

(I) Олигонуклеотид, в котором полидезоксиаденилат длиной 20-60 нуклеотидов связан с 3'-концом олигонуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и все фосфодиэфирные связи заменены фосфоротиоатными связями

(II) лентинан или шизофиллан.

[11] Комплекс любого из пп. [7]-[10], имеющий структуру тройной спирали.

[12] Комплекс любого из пп. [7]-[11], обладающий активностью для активации В-клеток секретировать IL-6 и активностью для активации дендритных клеток продуцировать IFN-α.

[13] Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6], или комплекс по любому из пп. [7]-[12].

[14] Фармацевтическая композиция по п. [13], которая предназначена для профилактики или лечения вирусной инфекции, злокачественного новообразования, аллергического заболевания или внутриклеточного паразитического простейшего или бактериальной инфекции.

[15] Фармацевтическая композиция по п. [14], которая предназначена для профилактики или лечения вирусной инфекции.

[16] Фармацевтическая композиция по п. [15], в котором вирусная инфекция является инфекцией РС-вируса или инфекцией вируса гриппа.

[17] Средство для индуцирования продуцирования интерферона I типа и/или II типа, включающее комплекс по любому из пп. [7]-[12].

[18] Иммуностимулирующее средство, включающее олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6] или комплекс по любому из пп. [7]-[12].

[19] Иммуностимулирующее средство [18], которое представляет собой вакцинный адъювант.

[20] Профилактическое или терапевтическое средство от вирусной инфекции, злокачественного новообразования, аллергического заболевания, или внутриклеточного паразитического простейшего или бактериальной инфекции, включающее олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6] или комплекс по любому из пп. [7]-[12].

[21] Профилактическое или терапевтическое средство по п. [20], в котором вирусная инфекция представляет собой РС-вирус или гриппозную вирусную инфекцию.

[22] Применение олигонуклеотида по любому из пп. [1]-[6] или комплекса по любому из пп. [7]-[12] для изготовления фармацевтической композиции.

[23] Применение по п. [22], в котором фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию для профилактики или лечения вирусной инфекции, злокачественного новообразования, аллергического заболевания или внутриклеточного паразитического простейшего или бактериальной инфекции.

[24] Применение по п. [23], где вирусная инфекция представляет собой РС-вирус или гриппозную вирусную инфекцию.

[25] Способ лечения или профилактики заболевания у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества олигонуклеотида по любому из пп. [1]-[6] или комплекса по любому из пп. [7]-[12] теплокровному животному.

[26] Способ по п. [25], в котором заболевание представляет собой вирусную инфекцию, злокачественное новообразование, аллергическое заболевание или внутриклеточное паразитическое простейшее или бактериальную инфекцию.

[27] Способ по п. [26], в котором вирусная инфекция представляет собой РС-вирус или гриппозную вирусную инфекцию.

[28] Способ по любому из пп. [25]-[27], в котором теплокровным животным является человек.

[29] Способ индукции защитной иммунной реакции у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества олигонуклеотида по любому из пп. [1]-[6] или комплекса по любому из пп. [7]-[12] теплокровному животному.

[30] Олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6] или комплекс по любому из пп. [7]-[12] для применения при лечении или профилактики вирусной инфекции, злокачественного новообразования, аллергического заболевания или внутриклеточного паразитического простейшего или бактериальной инфекции.

[31] Олигонуклеотид или комплекс по п. [30], в котором вирусная инфекция представляет собой РС-вирус или гриппозную вирусную инфекцию.

[32] Фармацевтическая композиция, содержащая

(а) олигонуклеотид по любому из пп. [1]-[6] или комплекс по любому из пп. [7]-[12], и

(b) антиген.

[33] Композиция по п. [32], которая предназначена для индуцирования иммунной реакции на антиген.

[34] Композиция по п. [33], в котором антиген получен из патогенного организма.

[35] Композиция по п. [34], которая предназначена для профилактики или лечения инфекции, вызываемой патогенным организмом.

[36] Композиция по п. [35], в котором патогенным организмом является вирус.

[37] Композиция по п. [36], в котором вирус представляет собой вирус гриппа или РС-вирус.

Эффект изобретения

[0018]

Настоящее изобретение предоставляет олигонуклеотид с более высокой иммуностимулирующей активностью и комплекс, его содержащий. В частности, комплекс по настоящему изобретению одновременно обладает иммуностимулирующей активностью, специфической для CpG-ODN типа K, и иммуностимулирующей активностью, специфический для CpG-ODN типа D. Кроме того, поскольку комплекс по настоящему изобретению обладает сильной активностью вакцинного адъюванта, когда иммунизация комплексом по настоящему изобретению осуществляется вместе с антигеном, стимулируется как антиген-специфический гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет для предоставления в высшей степени сильного эффекта защиты от инфекции. Поэтому комплекс по настоящему изобретению является полезным в качестве иммуностимулирующего средства или вакцинного адъюванта.

Краткое описание чертежей

[0019]

Фиг. 1 демонстрирует способ комплексообразования CpG-ODN и LNT или SPG.

Фиг. 2 демонстрирует продуцирование pan-IFN-α PBMC.

Фиг. 3 демонстрирует профиль цитокина, продуцируемого PBMC человека при стимуляции К3, К3-dA40 или К3-SPG.

Фиг. 4 демонстрирует изображение К3-SPG, полученное при помощи сканирующего электронного микроскопа.

Фиг. 5 показывает размеры частиц К3-SPG, SPG и D35, что было проанализировано способом динамического рассеяния света.

Фиг. 6 показывает продуцирование pan-IFN-α, IFN-α2 и IFN-γ клетками PBMC, индуцированное стимуляцией К3, К3-SPG или D35.

Фиг. 7 показывает продуцирование pan-IFN-α и IL-6 клетками PBMC человека, которое индуцируется стимуляцией К3, К3-dA40, К3-SPG, CpG21798 (CpG-ODN Типа P), CpG21889(Р), CpG2395(C) или M362(С) (0,74, 2,2, 6,6 или 20 мкг/мл).

Фиг. 8 показывает колокализацию K3-SPG с эндосомой, содержащей CpG ODN K Типа. Масштабная линейка соответствует 10 мкм. Представлены результаты, по меньшей мере, двух независимых экспериментов.

Фиг. 9 показывает колокализацию K3-SPG с эндосомой, содержащей CpG ODN D Типа. Масштабная линейка соответствует 10 мкм.

Фиг. 10 показывает титр антиген-специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных OVA самим по себе, OVA⁺K3 или OVA⁺K3-SPG. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 11 показывает продуцирование IFNγ спленоцитами мышей, иммунизированных OVA самим по себе, OVA⁺K3 или OVA⁺K3-SPG, которые были индуцированы повторной стимуляцией антигеном.

Фиг. 12 показывает соотношение OVA-специфические CD8 Т-клеток, индуцированных путем иммунизации OVA самим по себе, OVA⁺K3 или OVA⁺K3-SPG. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 13 показывает in vivo OVA-специфическую ЦТЛ-активность, индуцированную путем иммунизации OVA самим по себе, OVA⁺K3, OVA⁺К3-dA40 или OVA⁺К3-SPG. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 14 показывает эффект пептидного вакцинного адъюванта К3-SPG.

Фиг. 15 показывает дозозависимый адъювантный эффект К3-SPG.

Фиг. 16 показывает титры антиген-специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных OVA самим по себе, OVA⁺K3 или OVA⁺K3-SPG. Доза OVA при иммунизации показана на каждом графике. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 17 показывает продуцирование IFN γ спленоцитами мышей, иммунизированных OVA только, OVA⁺K3 или OVA⁺K3-SPG, которое было индуцировано рестимуляцией антигеном. Доза OVA при иммунизации показана на каждом графике.

Фиг. 18 показывает связывание SPG с контрольным (вектор), Dectin-1 или Dectin-2 трансфектантом.

Фиг. 19 показывает связывание К3 или К3-SPG с контрольным (вектор), Dectin-1 или Dectin-2 трансфектантом.

Фиг. 20 показывает продуцирование TNF-α спленоцитами мыши C57BL/6J или мыши, дефектной по Dectin-1, которое было индуцировано стимуляцией зимосаном-обедненным.

Фиг. 21 показывает продуцирование TNF-α спленоцитами мыши C57BL/6J или мыши, дефектной по Dectin-1, которое было индуцировано стимуляцией SPG.

Фиг. 22 показывает влияние зимосана-обедненного на продуцирование IFN-α спленоцитами мыши C57BL/6J или мыши, дефектной по Dectin-1, которое было индуцировано стимуляцией CpG-ODN. *р<0,05 (τ-тест).

Фиг. 23 показывает влияние SPG на продуцирование IFN-α спленоцитами мыши C57BL/6J, которое было индуцировано стимуляцией CpG-ODN.

Фиг. 24 показывает, что продуцирование цитокинов, индуцированное К3-SPG, зависит от TLR9. а) продуцирование IFN-α FL-DC, b) продуцирование IL-6 и IL-12 р40 спленоцитами, с) продуцирование IFN-α FL-DC, d) продуцирование IL-6 и IL-12 р40 спленоцитами.

Фиг. 25 показывает титры антиген-специфических антител в сыворотке крови мышей Tlr9⁺/⁺ или Tlr9-/-, иммунизированных OVA⁺K3-SPG. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 26 показывает продуцирование IFN-γ спленоцитами Tlr9⁺/⁺ или Tlr9-/- мыши, иммунизированной OVA⁺K3-SPG, которое индуцируется рестимуляцией антигеном. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 27 показывает соотношение OVA-специфических CD8 T-клеток, индуцированных путем иммунизации мышей Tlr9⁺/⁺ или Tlr9-/- OVA⁺К3-SPG. *р<0,05 (U критерий Манна-Уитни).

Фиг. 28 показывает, что адъювантный эффект К3-SPG не зависит от Dectin-1. а) титр антиген-специфического антитела в сыворотке крови. b) продуцирование IFN-γ спленоцитами вследствие рестимуляции антигеном. c) соотношение антиген-специфических CD8 T-клеток, индуцированных in vivo.

Фиг. 29 показывает титры антиген-специфических антител в сыворотке крови мышей Dectin-1⁺/- или Dectin-1-/-, иммунизированных OVA⁺К3-SPG.

Фиг. 30 показывает продуцирование IFNγ спленоцитами мышей Dectin-1⁺/- или Dectin-1-/- мышей, иммунизированных OVA⁺К3-SPG, которое было индуцировано рестимуляцией антигеном.

Фиг. 31 показывает соотношение OVA-специфических CD8 Т-клеток, индуцированных путем иммунизации мышей Dectin-1⁺/- или Dectin-1-/- OVA⁺К3-SPG. *р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни).

Фиг. 32 показывает локализацию К3-SPG на поверхности iLN через 1 ч после введения Alexa 488-К3-SPG.

Фиг. 33 показывает локализацию OVA, клеток MARCO⁺ и клеток Siglec-1⁺ в iLN через 1 ч после введения DQ-OVA.

Фиг. 34 показывает результаты анализа, по Volocity, колокализации OVA с клетками MARCO⁺ или клетками Siglec-1⁺ на фиг. 33. *р<0,05 (τ-тест).

Фиг. 35 показывает локализацию К3, К3-SPG и клеток MARCO⁺ в iLN через 1 ч после введения Alexa 488-K3 или Alexa К3-К3-SPG.

Фиг. 36 показывает результаты анализа, по Volocity, колокализации К3 или К3-SPG с клетками MARCO⁺ на фиг. 35. *р<0,05 (τ-тест).

Фиг. 37 показывает протокол эксперимента по истощению с клодронат-содержащей липосомой (верхняя панель), титр антиген-специфического антитела в сыворотке крови (ниже слева) и продуцирование цитокинов при антигенной стимуляции. *р<0,05 (τ-тест).

Фиг. 38 показывает экспрессию СD40 в различных DC мышей С57BL/6J или Tlr9-/- с введенным К3 или К3-SPG.

Фиг. 39 показывает титр антиген-специфического антитела в сыворотке крови мышей, иммунизированных SV, WIV или SV⁺К3-SPG.

Фиг. 40 показывает временную кривую изменения массы тела (слева) и кривую выживаемости (справа) при иммунизации SV, WIV или SV⁺К3-SPG после заражения вирусом гриппа A/P/R8(H1N1).

Фиг. 41 показывает временную кривую изменения титра антиген-специфического антитела в сыворотке крови Macaca fascicularis, иммунизированных SV⁺ К3 или SV⁺К3-SPG. *р<0,05 (τ-тест).

Фиг. 42 показывает временную кривую изменения титра антиген-специфического антитела в сыворотке крови Macaca fascicularis, иммунизированных SV⁺ К3 или SV⁺К3-SPG (в неделю 110).

Фиг. 43 показывает сравнение действия К3 и К3-SPG в качестве вакцинного адъюванта.

Фиг. 44 показывает продуцирование pan-IFN-a и продуцирование IL-6 при помощи К3, К3-LNT или К3-SPG.

Фиг. 45 показывает титры антиген RSV F-специфических IgG-антитела в сыворотке крови мышей, привитых с использованием RSV F субъединичной вакцины с добавлением К3, К3-LNT или К3-SPG.

Фиг. 46 показывает продукцию цитокинов, специфически индуцированную RSV F-антигенной стимуляцией у мышей, привитых с использованием RSV F субъединичной вакцины с добавлением К3, К3-LNT или К3-SPG.

Фиг. 47 показывает эффект защиты от РСВ-инфекции у хлопковых хомяков, привитых с использованием RSV F субъединичной вакцины с добавлением К3, К3-LNT или К3-SPG.

Описание вариантов осуществления

[0020]

1. Олигонуклеотид

Настоящее изобретение предоставляет олигонуклеотид, содержащий CpG-олигонуклеотид K Типа и полидезоксиаденилат (dA) (далее по тексту называется олигонуклеотид по настоящему изобретению).

Олигонуклеотид по настоящему изобретению включает олигонуклеотид, в котором фосфодиэфирные связи модифицированы (например, часть или все фосфодиэфирные связи заменены/заменена фосфоротиоатными связями).

Олигонуклеотид по настоящему изобретению включает фармацевтически приемлемую соль.

В настоящей спецификации, олигонуклеотид и ODN означают одно и то же. Кроме того, “гуманизированный CpG-олигонуклеотид (CPG-ODN) Типа K” и “гуманизированный CpG-олигонуклеотидный (CPG-ODN) остаток Типа K” означают одно и то же независимо от присутствия или отсутствия термина “остаток” в конце, и используются взаимозаменяемо. Кроме того, полидезоксиаденилат и (остаток) полидезоксиадениловой кислоты означают одно и то же. Термин “остаток” означает частичную структуру соединения, обладающего большей молекулярной массой. Специалисты в данной области техники могут легко понять из контекста, означает ли “гуманизированный CpG-олигонуклеотид (CPG-ODN) Типа K” отдельную молекулу или частичную структуру соединения, обладающего большей молекулярной массой в настоящем описании. То же самое касается терминов, относящихся к другим частичным структурам, содержащимся в олигонуклеотиде по настоящему изобретению, таких как “полидезоксиаденилат” и тому подобное.

[0021]

CpG-олигонуклеотид (CPG-ODN) представляет собой однонитевую ДНК, содержащую иммуностимулирующий неметилированный CpG-мотив, и представляет собой агонист TLR9. CpG-ODN включает в себя 4 типа: Тип K (называемый также Тип B), Тип D (также называемый Тип А), Тип C и Тип P, которые отличаются по каркасу, последовательности и иммуностимулирующим характеристикам (Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)). Из этого, олигонуклеотид по настоящему изобретению включает в себя CpG ODN K Типа.

[0022]

CpG ODN Типа K представляет собой CpG-ODN, имеющий такие структурные и функциональные свойства, что он обычно содержит непалиндромные, множественные неметилированные CpG-мотивы, активирует В-клетки для секретирования IL-6, но почти не индуцирует продуцирование IFN-α дендритными клетками, подобными клеткам плазмы (pDC). Неметилированный CpG-мотив представляет собой короткую нуклеотидную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну цитозин(С)-гуаниновую(G) последовательность, причем цитозин в 5-ом положении в цитозин-гуаниновой последовательности не метилирован. В следующем объяснении, CpG означает неметилированный CpG, если не указано особенно. Поэтому олигонуклеотид по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K (например, активностью по активации В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) секретировать IL-6), содержанием CpG-ODN K Типа. Многие гуманизированные CpG-ODN Типа K известны в соответствующей области техники (Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Journal of immunology 164, 944-953 (2000); US 8, 030, 285 B2).

[0023]

CpG-ODN Типа K, входящий в олигонуклеотид по настоящему изобретению, является предпочтительно гуманизированным. То, что он является “гуманизированным” означает, что он обладает активностью агониста в отношении TLR9 человека. Поэтому олигонуклеотид по настоящему изобретению, содержащий гуманизированный CpG-ODN Типа K, обладает иммуностимулирующей активностью для человека, которая является уникальной для CpG-ODN типа K (например, активность активировать человеческие В-клетки для секретирования IL-6).

[0024]

CpG-ODN Типа K, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, имеет длину не менее 10 нуклеотидов и содержит нуклеотидную последовательность, представленную формулой:

[0025]

[0026]

в которой CpG-мотив в центре не метилированы, W представляет собой А или Т, а N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ и N₆ могут представлять собой любой нуклеотид.

[0027]

В одном варианте осуществления CpG ODN K Типа по настоящему изобретению имеет длину не менее 10 нуклеотидов и содержит нуклеотидную последовательность, представленную вышеуказанной формулой. В вышеуказанной формуле, необходимо только, чтобы CpG-мотив из 4 оснований (TCpGW) в центре содержался в 10 нуклеотидах, и не является необходимым, чтобы он был расположен между N₃ и N₄ в вышеприведенной формуле. Кроме того, N₁, N₂, N₃, N₄, N₅ и N₆ в вышеприведенной формуле могут представлять собой любые нуклеотиды, и комбинация, по меньшей мере, одного из (предпочтительно одного) N₁ и N₂, N₂ и N₃, N₃ и N₄, N₄ и N₅, и N₅ и N₆ может формировать 2-основный CpG-мотив. Когда вышеупомянутый CpG-мотив из 4 оснований не находится между N₃ and N₄, 2 любых соседних основания в 4 основаниях в центре (основания с 4-го по 7-й) вышеуказанной формулы представляет собой CpG-мотив, а другие 2 основания могут представлять собой любые нуклеотиды.

[0028]

CpG-ODN Типа K, более предпочтительно используемый в настоящем изобретении, содержит непалиндромные структуры, содержащие один или множество CpG-мотивов. CpG-ODN Типа K, далее предпочтительно используемый в настоящем изобретении, состоит из непалиндромной структуры, содержащей один или множество CpG-мотивов.

[0029]

Гуманизированный CpG-ODN Типа K, как правило, характеризуется CpG-мотивом, состоящим из 4 оснований TCGA или TCGT. Во многих случаях, 2 или 3 таких 4-основных CpG-мотива содержится в одном гуманизированном CpG-ODN Типа K. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления CpG-ODN типа K, содержащийся в олигонуклеотиде по настоящему изобретению, содержит, по меньшей мере, один, более предпочтительно, два или больше, еще более предпочтительно 2 или 3 из 4-основных CpG-мотивов, состоящих из TCGA или TCGT. В случае, когда CpG-ODN K Типа имеет 2 или 3 из 4-основных CpG-мотивов, эти 4-основные CpG-мотивы могут быть одинаковыми или разными, и мотив не является особенно ограниченным при условии, что он обладает активностью агониста TLR9 человека.

[0030]

CpG-ODN Типа K, содержащийся в олигонуклеотиде по настоящему изобретению, более предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.

[0031]

Несмотря на то, что длина CpG-ODN Типа K не особенно ограничена при условии, что олигонуклеотид по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью (например, активность, которая активирует В-клетки (предпочтительно, В-клетки человека) для секретирования IL-6), предпочтительно, чтобы он составлял не более чем 100 нуклеотидов в длину (например, длиной 10-75 нуклеотидов). Длина CpG-ODN Типа K составляет, более предпочтительно, не более чем 50 нуклеотидов в длину (например, 10-40 нуклеотидов в длину). Длина CpG-ODN Типа K составляет, более предпочтительно, не более чем 30 нуклеотидов в длину (например, 10-25 нуклеотидов в длину). Длина CpG-ODN Типа K, наиболее предпочтительно, составляет 12-25 нуклеотида в длину.

[0032]

Несмотря на то, что длина полидезоксиаденилата (dA) не особенно ограничена, пока она достаточна для формирования структуры тройной спирали с цепью β-1,3-глюкана (предпочтительно, лентинана или шизофиллана), с точки зрения формирования стабильной структуры тройной спирали она составляет, как правило, не менее 20 нуклеотидов в длину, предпочтительно, не менее чем 40 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, не менее чем 60 нуклеотидов в длину. Теоретически, поли dA не имеет верхнего предела длины, поскольку более длинный поли dA образует более стабильную структуру тройной спирали с β-1,3-глюканом. Однако, когда он слишком длинный, длина олигонуклеотида варьирует при синтезе. Поэтому, как правило, он содержит не более 100, предпочтительно, не более чем 80 нуклеотидов в длину. С другой стороны, с точки зрения формирования вышеупомянутой стабильной структуры тройной спирали, а также увеличения количества олигонуклеотида по настоящему изобретению, которое связывается в расчете на единицу количества β-1,3-глюкана, предотвращения варьирования длина при синтезе олигонуклеотида и эффективности комплексообразования, длина поли dA составляет предпочтительно 20-60 нуклеотидов в длину (в частности,, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 нуклеотидов в длину), более предпочтительно, 30-50 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 нуклеотидов в длину), наиболее предпочтительно, 30-45 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 нуклеотидов в длину). В частности, хорошая эффективность комплексообразования достигается в случае, когда олигонуклеотид составляет не менее чем 30 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотид по настоящему изобретению, содержащий поли dA, обладает активностью формирования тройной спирали с двумя цепями шизофиллана. Следует отметить, что полидезоксиаденилат иногда обозначается как “поли(dA)” или “поли(dA)”.

[0033]

Несмотря на то, что одна молекула олигонуклеотида по настоящему изобретению может содержать множество CpG ODN K-Типа и/или поли-dA, она предпочтительно содержит по одному из каждого из CpG-ODN типа K и поли-dA, наиболее предпочтительно, состоит из одной из каждого из CpG-ODN типа K и поли-dA.

[0034]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению характеризуется тем, что поли-dA размещен на 3'-стороне CpG-ODN типа K. Благодаря такому расположению комплекс по настоящему изобретению (подробно описано ниже) обладает иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K, а также иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D.

[0035]

CpG-ODN Типа K и поли-dA могут быть напрямую связаны ковалентной связью или связаны через спейсерную последовательность. Под спейсерными последовательностями подразумевают нуклеотидные последовательности, имеющие один или более нуклеотидов, встроенных между двумя смежными составными элементами. Длина спейсерной последовательности не особенно ограничена, при условии, что комплекс по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью (предпочтительно активность по активации В-клеток секретировать IL-6 и активности по активации дендритных клеток вырабатывать IFN-α), обычно 1-10 нуклеотидов в длину, предпочтительно 1-5 нуклеотидов в длину, более предпочтительно 1-3 нуклеотидов в длину. Наиболее предпочтительно, CpG-ODN Тип K и поли-dA непосредственно связаны ковалентной связью.

[0036]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению необязательно имеет дополнительную нуклеотидную последовательность на своем 5'-конце и/или 3'-конец, в дополнение к CpG-ODN Типа K, поли-dA и необязательной спейсерной последовательности. Несмотря на то, что длина дополнительной нуклеотидной последовательности не является особенно ограниченной при условии, что комплекс по настоящему изобретению обладает иммуностимулирующей активностью (предпочтительно активностью по активации В-клеток секретировать IL-6 и активностью по активации дендритных клеток вырабатывать IFN-α), она обычно составляет 1-10 нуклеотидов в длину, предпочтительно 1-5 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, 1-3 нуклеотида в длину.

[0037]

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по настоящему изобретению не содержит такие дополнительные нуклеотидные последовательности на 5'-конце и/или 3'-конце. То есть олигонуклеотид по настоящему изобретению, предпочтительно, состоит из CpG-ODN Типа K, поли-dA а и необязательной спейсерной последовательности, более предпочтительно, состоит из CpG-ODN Типа K и поли-dA.

[0038]

В наиболее предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по настоящему изобретению состоит из CpG-ODN Типа K (в частности, например, олигонуклеотид, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1) и поли-dA, причем CpG-ODN Типа K присутствует на 5'-конце и олигонуклеотид поли-dA присутствует на его 3'-конец. В частности, это олигонуклеотид, в котором поли-dA составляет 20-60 нуклеотидов в длину (более предпочтительно, 30-50 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 нуклеотидов в длину), наиболее предпочтительно, 30-45 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 нуклеотидов в длину)) присоединен к 3'-концу олигонуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, например, олигонуклеотид, состоящей из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:2, или 9-12.

[0039]

Полная длина олигонуклеотида по настоящему изобретению составляет, как правило, 30-200 нуклеотидов в длину, предпочтительно 35-100 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, 40-80 нуклеотидов в длину (в частности, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов в длину), еще более предпочтительно, 50-70 нуклеотидов в длину (в частности,, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 нуклеотидов в длину), наиболее предпочтительно 50-65 нуклеотидов в длину (в частности,, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 нуклеотидов в длину).

[0040]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть соответствующим образом модифицирована, чтобы быть устойчивым к деградации in vivo (например, деградация под воздействием экзо-или эндонуклеазы). Предпочтительно, модификация включает фосфоротиоатную модификацию и фосфородитиоатную модификацию. То есть часть из или все фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде по настоящему изобретению заменены/заменена фосфоротиоатной связью или фосфородитиоатной связью.

[0041]

Предпочтительно, олигонуклеотид по настоящему изобретению включает модификацию фосфодиэфирной связи, более предпочтительно, модификация фосфодиэфирной связи является фосфоротиоатная связь (то есть, как описано в документе WO 95/26204, один из неперекрестносшитых атомов кислорода замещен на атом серы). То есть часть из или все фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде по настоящему изобретению заменены/заменена фосфоротиоатной связью.

[0042]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно содержит модификацию, фосфоротиоатную связь или фосфородитиоатную связь в CpG-ODN Типа K, более предпочтительно, все фосфодиэфирные связи в CpG-ODN Типа K заменены на фосфоротиоатные связи. Кроме того, олигонуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно содержит фосфоротиоатную связь или фосфородитиоатную связь в поли-dA, более предпочтительно, все фосфодиэфирные связи в поли-dA заменены на фосфоротиоатные связи. Еще более предпочтительно, все фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде по настоящему изобретению, содержащем гуманизированный CpG-олигонуклеотид типа K и полидезоксиаденилат, заменены фосфоротиоатной связью. Наиболее предпочтительно, чтобы олигонуклеотид по настоящему изобретению являлся олигонуклеотидом, в котором поли-dA с 20-60 нуклеотидов в длину (более предпочтительно, 30-50 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 нуклеотидов в длину), наиболее предпочтительно, 30-45 нуклеотидов в длину (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 нуклеотидов в длину)) связан с 3'-концом гуманизированного CpG-олигонуклеотида типа K (например, SEQ ID NO:1), и все фосфодиэфирные связи, содержащиеся в олигонуклеотиде, заменены фосфоротиоатными связями. Благодаря фосфоротиоатной связи олигонуклеотид по настоящему изобретению, как ожидается, будет демонстрировать не только устойчивость к деградации, но и усиление иммуностимулирующей активности (например, активности по активации В-клеток секретировать IL-6) и высокий выход комплекса CpG-β-1,3-глюкан. В настоящей спецификации фосфоротиоатная связь означает то же, что и фосфоротиоатный каркас, и фосфодиэфирная связь означает то же, что и фосфатный каркас.

[0043]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению включает любые фармацевтически приемлемые соли, сложный эфир и соли такого сложного эфира вышеупомянутого олигонуклеотида.

[0044]

Предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей олигонуклеотида по настоящему изобретению включают соли металлов, такие как соли щелочных металлов (например, натриевая соль, калиевая соль и литиевая соль), соли щелочноземельных металлов (например, соль кальция и соль магния), соль алюминия, соль железа, соль цинка, соль меди, соль никеля, соль кобальта и тому подобное; аминовые соли, такие как неорганические соли (например, соли аммония) и органические соли (например, τ-октиламинная соль, дибензиламинная соль, морфолиновая соль, глюкозаминовая соль, соль фенилглициналкилового эфира, этилендиаминовая соль, N-метилглюкаминовая соль, гуанидиновую соль, диэтиламиновую соль, триэтиламиновую соль, дициклогексиламиновая соль, N,N'-дибензилэтилендиаминовая соль, хлоропрокаиновая соль, прокаиновая соль, диэтаноламиновая соль, N-бензилфенилэтиламиновая соль, пиперазиновая соль, соль тетраметиламмония, трис(гидроксиметил)аминометановая соль) и тому подобное; соли неорганических кислот, такие как галогенированные соли водородной кислоты (например, фторгидрат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид), нитратную соль, перхлорат, сульфат, фосфат и тому подобное; соли органических кислот, такие как низшие алкансульфонаты (например, метансульфонат, трифторметансульфонат, этансульфонат), арилсульфонаты (например, бензолсульфонат, ρ-толуолсульфонат), ацетат, малат, фумарат, сукцинат, цитрат, тартрат, оксалат, малеат и тому подобное; и соли аминокислот, такие как соль глицина, соль лизина, соль аргинина, соль орнитина, глутамат и аспартат.

0045]

Несмотря на то, что олигонуклеотид по настоящему изобретению может принимать любую форму из одноцепочечной, двуцепочечной и трехцепочечной, предпочтительной является одноцепочечная.

[0046]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно является выделенным. “Выделенный” означает, что была выполнена процедура по удалению факторов, отличных от рассматриваемых компонентов, и олигонуклеотид не находится в состоянии естественного присутствия. Чистота “выделенного олигонуклеотида” (процентное содержание массы рассматриваемого олигонуклеотида в общей массе оцениваемого целевого продукта), как правило, составляет не менее 70%, предпочтительно, не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90%, еще более предпочтительно, не менее чем 99%.

[0047]

Поскольку олигонуклеотид по настоящему изобретению обладает превосходной иммуностимулирующей активностью (например, активностью по активации В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) секретировать IL-6), он полезен в качестве иммуностимулирующего средства и тому подобное. Кроме того, поскольку олигонуклеотид по настоящему изобретению обладает свойством образовывать структуру тройной спирали с двумя β-1,3-глюканами (предпочтительно, лентинаном, шизофилланом или склероглюканом), он полезен для подготовки комплекса по настоящему изобретению, упомянутого ниже.

[0048]

2. Комплекс

Настоящее изобретение предоставляет комплекс, содержащий вышеуказанных олигонуклеотид по настоящему изобретению и β-1,3-глюкан (далее по тексту называемый комплекс по настоящему изобретению).

[0049]

Поскольку вышеупомянутый олигонуклеотид по настоящему изобретению содержит CpG-ODN Типа K, он сам по себе демонстрирует иммуностимулирующую активность, уникальную для CpG-ODN типа K (например, активность по активации В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) секретировать IL-6), и обладает иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D (например, активностью по активации дендритных клеток, подобных плазматическим клеткам, продуцировать IFN-α). Удивительно, однако, что он приобретает иммуностимулирующую активность, уникальную для CpG-ODN типа D (например, активностью по активации дендритных клеток, подобных плазматическим клеткам, продуцировать IFN-α) в результате образования комплекса с β-1,3-глюканом (предпочтительно, лентинаном или шизофилланом), не требуя последовательности CpG-ODN типа D. То есть в комплекс по настоящему изобретению обладает как иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K (например, активностью по активации В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) секретировать IL-6), так и иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D (например, активностью по активации дендритных клеток, подобных плазматическим клеткам, (предпочтительно, дендритные клетки, подобные клеткам плазмы человека), продуцировать IFN-α.

[0050]

Примеры β-1,3-глюкана, используемого в настоящем изобретении, включают лентинан, шизофиллан, склероглюкан, кулдлан, пакиман, грифолан, ламинарана и тому подобное. β-1,3-глюкан, предпочтительно, содержит множество 1,6-глюкопиранозидных ветвей (содержание боковых цепей 33-40%), таких как лентинан, шизофиллан и склероглюкан, более предпочтительно, лентинан или шизофиллан, наиболее предпочтительно, лентинан.

[0051]

Лентинан (LNT) представляет собой известный β-1,3-1,6-глюкан, получаемый из гриба шиитаке и имеющий молекулярную формулу (C₆H₁₀O₅)n и молекулярную массу около 300,000-700,000. Несмотря на то, что он плохо растворим в воде, метаноле, этаноле(95) и ацетоне, он растворим в полярных органических растворителях (ДМСО) и водном растворе гидроксида натрия.

Действие лентинана состоит в усилении активированных макрофагов, киллерных Т-клеток, натуральных киллеров и антителозависимой макрофаг-опосредованной цитотоксической активности (ADMC) (Hamuro, J., et al.: Immunology, 39, 551-559, 1980, Hamuro, J., et al.: Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980, Herlyn, D., et al.: Gann, 76, 37-42, 1985). В экспериментах на животных, совместное с химиотерапевтическим средством введение показало подавляющее действие на рост опухоли и эффект продления жизни при сингенной опухоли и аутогенный опухоли. Кроме того, введение лентинана самого по себе оказывало подавляющее действие на рост опухоли и эффект продления жизни. В ходе клинических исследований комбинированное применение с тегафуром при пероральном введении пролонгировало период выживания пациентов с неоперабельным или рецидивирующим раком желудка (опросная форма фармацевтического продукта “1 мг лентинана для внутривенного введения” Ajinomoto Co., Инк.), и оно было официально утверждено в Японии. Эффект введения отдельно лентинана не подтвержден на сегодняшний день.

[0052]

Шизофиллан (SPG) представляет собой известный растворимый β-глюкан, получаемый из Schizophyllum commune. SPG состоит из основной цепи β-(1→3)-D-глюкана и одной боковой цепи β-(1→6)-D-гликозила на 3 глюкозы (Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A., “Carbohydr. Res.”, 1981, 89, 1, p.121-135). SPG фактически применяли в течение 20 лет или больше в качестве препарата клинического лекарственного средства для внутримышечных инъекций при иммуноадъювантной терапии гинекологического рака (Shimizu, Chin, Hasumi, Masubuchi, “Biotherapy”, 1990, 4, p.1390 Hasegawa, “Oncology and Chemotherapy”, 1992, 8, p.225), и безопасность была подтверждена in vivo (Theresa, M. McIntire and David, A. Brant, “J. Am. Chem. Soc.”, 1998, 120, p.6909).

[0053]

В настоящем описании “комплекс” означает продукт, полученный путем объединения множества молекул посредством нековалентной связи или ковалентной связи, таких как ионная связь, ван-дер-ваальсова связь, водородная связь, гидрофобное взаимодействие и тому подобное.

[0054]

Комплекс по настоящему изобретению предпочтительно демонстрирует структуру тройной спирали. В предпочтительном варианте осуществления из трех цепей, образующих структуру тройной спирали, две представляют собой цепи β-1,3-глюкана и одна представляет собой цепь полидезоксиаденилата в вышеупомянутом олигонуклеотиде по настоящему изобретению. Комплекс может содержать часть, не образующую структуру тройной спирали.

[0055]

Композиционное соотношение олигонуклеотида и β-1,3-глюкана в комплексе по настоящему изобретению может различаться в зависимости от длины цепи полидезоксиаденилата в олигонуклеотиде, длины β-1,3-глюкана и тому подобное. Например, если длина цепи β-1,3-глюкана и цепи полидезоксиаденилата эквивалентны, две цепи β-1,3-глюкана и одна олигонуклеотида по настоящему изобретению могут быть связаны, чтобы сформировать структуру тройной спирали. Как правило, поскольку длина цепи полидезоксиаденилата короче, чем у цепи β-1,3-глюкана, несколько олигодезоксирибонуклеотидов пол настоящему изобретению могут быть связаны с двумя цепями β-1,3-глюкана через полидезоксиаденилат, с образованием структуры тройной спирали (см. фиг. 1).

[0056]

Комплекс по настоящему изобретению представляет собой комплекс, содержащий гуманизированный CpG-ODN Типа K и β-1,3-глюкан (например, лентинан, шизофиллан, склероглюкан, кулдлан, пакиман, грифолан, ламинарана), предпочтительно комплекс, состоящий из гуманизированного CpG-ODN типа K и β-1,3-глюкана (например, лентинана, шизофиллана, склероглюкана). Более предпочтительно, он представляет собой комплекс, состоящий из олигонуклеотида, в котором полидезоксиаденилат из 20-60 нуклеотидов в длину (в частности,, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 нуклеотидов длиной) связывается с 3'-стороной олигонуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и все фосфодиэфирные связи заменены фосфоротиоатными связями, и β-1,3-глюкан (например, лентинан, шизофиллан) (например, К3-dA20-60-LNT, К3-dA20-60-SPG), наиболее предпочтительно, представляет собой комплекс, состоящий из олигонуклеотида, в котором полидезоксиаденилат из 30-50 нуклеотидов в длину (в частности, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 нуклеотидов длиной) связан с 3'-стороны с олигонуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и все фосфодиэфирные связи заменены фосфоротиоатными связями, и β-1,3-глюкана (например, лентинана, шизофиллана) (например, К3-dA30-50-LNT, K3-dA30-50-SPG), наиболее предпочтительно, представляет собой комплекс, состоящий из олигонуклеотида, в котором полидезоксиаденилат из 30-45 нуклеотидов в длину (в частности, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 нуклеотидов длиной) связан с 3'-стороны с олигонуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и все фосфодиэфирные связи заменены фосфоротиоатными связями, и β-1,3-глюкана (например, лентинана, шизофиллана) (К3-dA30-45-LNT, К3-dA30-45-SPG).

[0057]

Способ подготовки комплекса по настоящему изобретению можно выполнять при условиях, аналогичных описанным в непатентных документах 21-24, и JP-A-2008-100919. То есть, β-1,3-глюкан, который по своей природе естественным образом присутствует в виде структуры тройной спирали, растворяют в органическом апротонном полярном растворителе (диметилсульфоксиде (ДМСО), ацетонитриле, ацетоне и т.д.) или водным растворе щелочи (гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, гидроксид кальция и т. д.) для распускания до отдельной цепи. Раствор полученного таким образом одноцепочечного β-1,3-глюкана и раствор (водный раствор, буферизованный водный раствор при близком к нейтральному рН, или кислый забуференный водный раствор, предпочтительно, водный раствор или буферизованный водный раствор при близком к нейтральному рН) олигонуклеотида по настоящему изобретению смешивают, доводят рН до почти нейтрального рН по мере необходимости, и смесь выдерживают в течение подходящего времени, например, ночь при 5°С. В результате две цепи β-1,3-глюкана и цепь поли-dA в олигонуклеотиде образуют структуру тройной спирали, тем самым комплекс по настоящему изобретению может быть сформирован. Полученный комплекс может быть подвергнут очистке при помощи эксклюзионной хроматографии, ультрафильтрации, диализа и для удаления олигонуклеотида, не образующего комплекс. Кроме того, полученный комплекс может быть подвергнут очистке путем анионообменной хроматография для удаления β-1,3-глюкана, не образующего комплекс. Комплекс можно соответствующим образом очищать с помощью вышеупомянутых способов.

[0058]

Формирование комплекса по настоящему изобретению может быть подтверждено, например, путем определения изменения конформации по спектру КД (кругового дихроизма), сдвига УФ-поглощения при эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, электрофореза на микрочипах, капиллярного электрофореза, хотя способ не ограничивается этими.

[0059]

Несмотря на то, что соотношение при смешивании олигонуклеотида по настоящему изобретению и β-1,3-глюкана может быть надлежащим образом определено с учетом длины цепи поли-dA и подобного, мольное соотношение (SPG/ODN), как правило, составляет 0,02-2,0, предпочтительно 0,1-0,5. В дополнительном варианте осуществления мольное соотношение (β-1,3-глюкан (LNT и т. д.)/ ODN) составляет, например, 0,005-1,0, предпочтительно 0,020-025.

[0060]

Способ подготовки комплекса по настоящему изобретению объясняется, принимая комплекс CpG-ODN и LNT в качестве примера. LNT растворяют в 0,05-2N, предпочтительно 0,1-1,5N, водном растворе щелочи (например, 0,25N водный раствор гидроксида натрия) и смесь оставляют стоять при 1°С-40°С в течение 10 ч-4 суток (например, простояла ночь при комнатной температуре) для подготовки водного раствора одноцепочечного LNT (например, водный раствор 50 мг/мл LNT). Вышеупомянутый водный раствор LNT и водный раствор CpG (например, 100 мкМ водный раствор CpG) готовят отдельно, смешивают в мольном соотношении (LNT/ODN) 0,005-1,0, затем вышеупомянутый водный раствор LNT нейтрализуют кислым буферизованным водным раствором (например, NaH₂PO₄) и выдерживают при 1-40°С в течение 6 ч-4 суток (например, ночь при 4°C) для полного комплексообразования. Водный раствор LNT можно добавлять в конце и перемешивать для образования вышеупомянутого комплекса. Образование комплекса может быть подтверждено, например, путем сдвига CpG-ODN в сторону высоких молекулярных масс при помощи размер-эксклюзионной хроматографии, при контроле поглощения в области 240-280 нм (например, 260 нм).

[0061]

В одном варианте осуществления, комплекс по настоящему изобретению демонстрирует форму палочковидных частиц. Размер частиц эквивалентен таковому частиц, естественно образующихся при помощи β-1,3-глюкана (например, шизофиллана), используемого в качестве материала, путем появления структуры тройной спирали. Средний размер частиц обычно составляет 10-100 нм, предпочтительно 20-50 нм. Размер частиц можно определить путем растворения комплекса в воде и подвергая раствор способу динамического рассеяния света при 80°C, используя прибор Malvern Instruments Zeta Sizer.

[0062]

Комплекс по настоящему изобретению предпочтительно очищают. Чистота “выделенного комплекса” (процентное содержание рассматриваемого комплекса к общей массе оцениваемых целевых продуктов), как правило, составляет не менее 70%, предпочтительно, не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90%, еще более предпочтительно, не менее чем 99%.

[0063]

Поскольку комплекс по настоящему изобретению обладает превосходной иммуностимулирующей активностью и обладает как иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K (например, активностью по активации В-клеток (предпочтительно, В-клеток человека) секретировать IL-6), так и иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D (например, активностью по активации дендритных клеток, подобных плазматическим клеткам (предпочтительно, дендритных клеток, подобных клеткам плазмы человека), продуцировать IFN-α, он полезен в качестве иммуностимулирующего средства и тому подобного. Например, комплекс, содержащий CpG-ODN Типа K (например, SEQ ID NO: 2, 11, 12) и LNT (К3-LNT), и комплекс, содержащий CpG-ODN Типа K (например, как SEQ ID NO: 2) и SPG (К3-SPG), обладают способностью индуцировать воспалительную реакцию (pan-IFN-а, IL-6 и др.), действие для увеличения титра антиген-специфического IgG-антитела (общий IgG, IgG2c и т. д.) в сыворотке крови индивидуума с привитым вирусом, способность антиген-специфически продуцировать цитокин (IFN-γ, IL-2 и т. д.) у индивидуума с привитым вирусом и защитный эффект против вирусной инфекции. К3- LNT также обладает способностью усиливать продуцирование Th2 цитокинов (IL-13 и т.д.) у индивидуума с привитым вирусом. Поэтому они являются полезными в качестве кандидатов на новый вакцинный адъювант.

[0064]

3. Фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую вышеупомянутый олигонуклеотид по настоящему изобретению или вышеупомянутый комплекс по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена путем формулирования вышеуказанного олигонуклеотида по настоящему изобретения или вышеупомянутого комплекса по настоящему изобретению в соответствии с общепризнанными способами. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит олигонуклеотид или комплекс по настоящему изобретению и фармакологически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать антиген. Такие фармацевтические композиции предоставляются в лекарственной форме, пригодной для перорального или парентерального введения.

[0065]

В качестве композиции для парентерального введения, например, применяют инъекцию, суппозиторий и тому подобное, и инъекция может охватывать лекарственные формы, такие как внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрикожная инъекция, мышечная инъекция, капельное введение и тому подобное. Такая инъекция может быть приготовлена при помощи известного способа. Способ подготовки инъекции включает растворение или суспендирование вышеуказанного олигонуклеотида или комплекса по настоящему изобретению в стерильном водном растворителе, обычно используемом для инъекции. В качестве водного растворителя для инъекций можно использовать, например, дистиллированную воду; физиологический раствор; буферы, такие как фосфатный буфер, карбонатный буфер, трис-буфер, ацетатный буфер и тому подобное; и тому подобное. РН такого водного растворителя составляет, например, 5-10, предпочтительно 6-8. Подготовленной инъекцией предпочтительно заполняют подходящую ампулу.

[0066]

Также можно подготовить порошковый препарат олигонуклеотида или комплекса по настоящему изобретению, подвергая суспензию олигонуклеотида или комплекса по настоящему изобретению обработке, такой как вакуумная сушка, сублимационная сушка и тому подобное. Олигонуклеотид или комплекс по настоящему изобретению можно применять, сохраняя его в порошковом состоянии и диспергируя порошок в водном растворителе для инъекций при использовании.

[0067]

Содержание олигонуклеотида или комплекса по настоящему изобретению в фармацевтической композиции составляет обычно примерно 0,1-100 мас.%, предпочтительно, примерно 1-99 мас.%, более предпочтительно, примерно 10-90 мас.% от всей фармацевтической композиции.

[0068]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в качестве активного ингредиента, отдельно олигонуклеотид или комплекс по настоящему изобретению, или комбинацию олигонуклеотида или комплекса по настоящему изобретению и другого активного ингредиента.

[0069]

4. Фармацевтическое применение

Поскольку олигонуклеотид и комплекс по настоящему изобретению обладает превосходной иммуностимулирующей активностью, олигонуклеотид, комплекс и фармацевтическая композиция по настоящему изобретению можно применять в качестве иммуностимулирующих средств. Введение олигонуклеотида, комплекса или фармацевтической композиции по настоящему изобретению млекопитающему (приматам, таким как человек и тому подобное, грызунам, таким как мышь и тому подобное, и т. д.) может вызвать иммунную реакцию у млекопитающего. В частности, поскольку комплекс по настоящему изобретению обладает свойством CpG-ODN Типа D активации и стимулирует мононуклеарные клетки периферической крови продуцировать большие количества интерферона I типа (pan-IFN-α, IFN-α2 и т.д.) и интерферона II типа (IFN-γ), он полезен в качестве индуцирующего средства продуцирования интерферона I типа, индуцирующего средства продуцирования интерферона II типа или индуцирующего средства продуцирования интерферона I типа и II типа. Поскольку комплекс по настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, его содержащая, стимулируют выработку интерферонов как типа I, так и типа II, они полезны для профилактики или лечения заболевания, для которого является/являются эффективными интерферон одного из типов или интерферон как типа I, так и типа II. Примеры заболеваний, для которых эффективен интерферон типа I, включают вирусные инфекции (например, вирус гепатита С (ВГС), вирус герпеса, вирус папилломы, РС-вирус, вирус гриппа и т.д.), злокачественное новообразование и тому подобное. Примеры заболеваний, для которых является эффективным интерферон типа II, включают аллергическое заболевание, инфицирования внутриклеточными паразитическими простейшими (Лейшмания и т.д.), бактериями (Листерия, Mycobacterium tuberculosis и т.д.) и тому подобное, и тому подобное. Как для острых вирусных инфекций РС-вируса, вируса гриппа и тому подобное, поскольку интерферон как типа I, так и типа II усиливают иммунные ответы, связанные с элиминацией вируса, комплекс и содержащая его фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, как ожидается, будут эффективными при острых вирусных инфекциях.

[0070]

Кроме того, олигонуклеотид и комплекс по настоящему изобретению, в частности, комплекс по настоящему изобретению, обладают сильной активностью вакцинного адьюванта, и введение олигонуклеотида и комплекса по настоящему изобретению вместе с антигеном млекопитающему может индуцировать сильный иммунный ответ на антиген. Следовательно, настоящее изобретение также предоставляет композицию для индуцирования иммунной реакции на антиген, которая содержит (а) олигонуклеотид по настоящему изобретению или комплекс по настоящему изобретению, и (b) антиген. В частности, комплекс по настоящему изобретению сильно индуцирует как гуморальный иммунный ответ на антиген (продуцирование антиген-специфического антитела), так и клеточный иммунный ответ (антиген-специфическая индукция ЦТЛ). Поэтому олигонуклеотид, комплекс и фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, в частности, комплекс по настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, его содержащая, полезны в качестве вакцинных адъювантов.

В настоящей спецификации, адъювант относится к фармацевтической добавке, способствующей развитию иммунной реакции, которая является субстанцией, неспецифически усиливающей иммунные ответы на антиген при введении антигена в живой организм.

[0071]

Антиген не является особенно ограниченным, при условии, что он обладает антигенностью для млекопитающего (приматов, таких как человек и т.п., грызунов, таких как мыши и тому подобное, и т.д.), которому он вводится, и может быть распознан как антиген с помощью антител или цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ, CD8⁺ Т-клетки). Можно использовать любое вещество, которое становится антигеном (белок, пептид, нуклеиновая кислота, липид, углевод и модификация вышеупомянутого вещества (например, модификация, введенная делетированием, заменой и/или добавлением одной или более аминокислот (далее мутация и т.д.) и тому подобное). В качестве антигена также может быть использован антиген, полученный из патогенного микроорганизма, такого как простейшее, грибок, бактерия, вирус и тому подобное, и антиген, относящийся к злокачественному новообразованию или иному заболеванию.

[0072]

В настоящем описании, “антиген А, полученный из патогенного микроорганизма Х” означает, что антиген А содержится в качестве составляющего фактора патогенного микроорганизма X. Например, если антиген А является полипептидом, это означает, что аминокислотная последовательность полипептида присутствует в аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном патогенного микроорганизма Х.

[0073]

Примеры антигена, полученного из патогенного микроорганизма, включают патогенный микроорганизм как таковой или его части, инактивированный или аттенуированный патогенный микроорганизм как таковой или его части, или модификация, привнесенная с мутацией этого и тому подобное, и тому подобное.

[0074]

Если антиген, полученный из патогенного микроорганизма, используется в качестве антигена, то индуцируется иммунная реакция на антиген и создается механизм иммунологической элиминации из организма возбудителя, содержащего антиген. Таким образом, композиция, содержащая (а) олигонуклеотид по настоящему изобретению, или комплекс по настоящему изобретению, и (b) антиген, полученного из патогенного микроорганизма, для индуцирования иммунной реакции на антиген, является полезным для профилактики или лечения от патогенного микроорганизма.

[0075]

Комплекс по настоящему изобретению сильно индуцирует как гуморальную иммунную реакцию (продуцирование антиген-специфического антитела), так и клеточную иммунную реакцию (антиген-специфическая индукция ЦТЛ) на антиген. Поэтому, в качестве антигена предпочтительно используется антиген, полученный из внутриклеточного инфекционного патогенного микроорганизма (вируса, простейшего, грибка, бактерии и т.д.), для которого известно, что он узнается цитотоксическими Т-лимфоцитами, антиген, относящийся к злокачественным клеткам (например, опухолевый антиген) и подобные предпочтительно используются в качестве антигена.

[0076]

Несмотря на то, что внутриклеточный инфекционный вирус не является особенно ограниченным, примеры этого включают РС-вирус, вирус гриппа, вирус парагриппа, вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита А (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус Эбола, цитомегаловирус, аденовирус, вирус полиомиелита, вирус японского энцефалита, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус бешенства, вирус желтой лихорадки, вирус ветряной оспы, хантавирус, вирус денге, норовирус, ротавирус, парвовирус, коронавирус, вирус чумки, вирус Т-клеточного лейкоза взрослых (HTLV-1), вирус иммунодифицита человека (ВИЧ), вирус герпеса, вирус папилломы и тому подобное. Примеры внутриклеточных инфекционных бактерий включают микоплазму и тому подобное. Примеры внутриклеточных инфекционных простейших включают плазмодии, шистосомы и тому подобное. Внутриклеточным инфекционным патогенным микроорганизмом предпочтительно является вирус (в частности, РС-вирус, или вирус гриппа и т.д.).

[0077]

Примеры антигена, связанного с раковыми клетками, включают белок, сахарную цепь, пептид, которые специфически экспрессируется на раковых клетках, вариант вышеупомянутых веществ (делетированный, замененный и/или добавленный) или модификацию этого, и тому подобное.

[0078]

Поскольку комплекс по настоящему изобретению сильно индуцирует интерфероны как типа I, так и типа II, в одном варианте осуществления, вирус (например, RS-вирус, вирус гриппа), который приводит к острой вирусной инфекции, для которой являются эффективными интерфероны как типа I, так и типа II, выбран в качестве вируса.

[0079]

Например, композиция, содержащая (а) олигонуклеотид по настоящему изобретению или комплекс по настоящему изобретению, и (b) антиген, полученный из патогенного микроорганизма или злокачественной опухоли, для индуцирования иммунной реакции на антиген, вводят пациенту с инфекцией патогенного микроорганизма заражение или злокачественной опухолью или человеку с потенциально предрасположенный к инфекции патогенного микроорганизма или злокачественной опухоли, чтобы антиген-специфически активировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) у индивидуума, который получил введение, индуцировать продуцирование антиген-специфического антитела, т.е. индуцировать защитную иммунную реакцию у теплокровного животного (предпочтительно, человека), в результате чего инфекцию и рак можно предотвратить или лечить. Соответственно, композиция полезна в качестве вакцины для профилактики или лечения вышеупомянутых заболеваний, таких как инфекции, рак и тому подобное.

[0080]

Кроме того, поскольку комплекс по настоящему изобретению может сильно индуцировать как гуморальную иммунную реакцию (продуцирование антиген-специфического антитела), так и клеточную иммунную реакцию (антиген-специфическая индукция ЦТЛ) на антиген, любой из поверхностного антигена и внутреннего антигена патогенного микроорганизма и злокачественной клетки может быть использован в качестве антигена, и также желательно использование смеси из поверхностного антигена и внутреннего антигена.

[0081]

Композицию, содержащую (а) олигонуклеотид по настоящему изобретению или комплекс по настоящему изобретению, и (b) антиген, для индуцирования иммунной реакции на антиген, можно подготовить в соответствии с вышеупомянутой фармацевтической композицией по настоящему изобретению.

[0082]

Содержания, раскрытые в любой публикации, цитируемой в настоящем описании, включая патенты и патентные заявки, включены в этот документ в своей полноте путем ссылки, в той мере, в какой они были раскрыты в данном документе.

Примеры

[0083]

Настоящее изобретение объясняется более подробно следующей ссылкой на примеры, которые не следует истолковывать в качестве ограничивающих.

[0084]

[Способ]

Животные и реагенты

Создание Tlr9-дефектных и Dectin-1-дефектных мышей было описанл (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)). Мыши C57BL/6J были приобретены у NIHON CLEA. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными директивами для Национального института биомедицинских инноваций и для вивария университета Осака. Следующие CpG-ODN были синтезированы GeneDesign, Инк.

(подчеркивание показывает фосфоротиоатные связи).

[0085]

Таблица 1

K3 (5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3') (SEQ ID NO: 1);

K3-dA₄₀ (5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-40мер A-3') (SEQ ID NO:2);

dA₄₀-K3 (5'-40мер A-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3') (SEQ ID NO:3);

D35 (5'-GGT GCA TCG ATG CAG GGG GG-3') (SEQ ID NO:4);

CpG21798 (5'-TCG TCG ACG ATC GGC GCG CGC CG-3') (SEQ ID NO:5);

CpG21889 (5'-TCG TCG ACG ATC GGC GCG CGC CG-3') (SEQ ID NO:6);

CpG2395 (5'-TCG TCG TTT TCG GCG CGC GCC G-3') (SEQ ID NO:7);

M362 (5'-TCG TCG TCG TTC GAA CGA CGT TGA T-3') (SEQ ID NO:8);

Alexa 488-меченый K3; Alexa 488-меченый K3-dA40;

Alexa 647-меченый K3;

Alexa 647-меченый K3-dA40

[0086]

В частности, описан синтез K3-dA35 (SEQ ID NO:12), K3-dA30 (SEQ ID NO:11), K3-dA25 (SEQ ID NO:10) и K3-dA20 (SEQ ID NO:9), в дополнение к вышеупомянутому K3-dA40 (SEQ ID NO:2) (Таблица 2).

[0087]

Таблица 2

K3-dA40: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Список последовательностей, SEQ ID NO:2)

K3-dA35: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Список последовательностей, SEQ ID NO:12)

K3-dA30: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Список последовательностей, SEQ ID NO:11)

K3-dA25: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Список последовательностей, SEQ ID NO:10)

K3-dA20: AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA (Список последовательностей, SEQ ID NO:9)

[0088]

(В вышеупомянутых последовательностяй s показывает, что фосфодиэфирные связи между нуклеозидами заменены фосфоротиоатной связью.)

[0089]

Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали по традиционной методике, твердофазным фосфороамидитным способом (Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press).

[0090]

В таблице 3 приведены молекулярные массы CpG-ODN, описанных в таблице 2, и время удерживания, анализируемое обращенно-фазовой ВЭЖХ при следующих условиях (колонка: Waters, X-Bridge C18 2,5 мкм, 4,6×75 мм, раствор А: 100 мМ гексафторизопропиловый спирт, 8 мМ триэтиламин, раствор В: метанол, В%:5%→30% (20 мин, линейный градиент); 60°С; 1 мл/мин; 260 нм).

[0091]

Таблица 3 соединение Рассчитанное
значение измеренное
значение Время выхода (мин) К3-dA40 19520,3 19519,0 14,9 К3-dA35 17873,9 17872,8 15,0 К3-dA30 16227,5 16225,7 14,9 К3-dA25 14581,1 14580,5 14,7 К3-dA20 12934,8 12933,3 14,6

[0092]

Овальбумин (OVA) был приобретен у Seikagaku Kogyo. DQ-OVA, Alexa488-OVA, CFSE и липофектамин 2000 были приобретены у Invitrogen. Hoechst33258, зимосан и кулдлан были приобретены у Sigma. Зимосан-обедненный был приобретен у Invivogen. Клодронат-содержащая липосома была приобретена у FormuMax. Гриппозная субъединичная вакцина, формалин-инактивированный цельный вирус (WIV) и очищенные вирусы гриппа (H1N1) были подготовлены, как описано ранее (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)).

[0093]

Комплексообразование CpG-ODN и SPG (Фиг. 1)

7,22 мг К3-dA40 растворяли в воде (3,7 мл). SPG (15 мг, Mitsui Sugar Co., Ltd.) растворяли в 0,25 Н растворе NaOH (1 мл). 330 мМ NaH₂PO₄ объемом 1 мл добавляли к раствору ДНК, затем раствор SPG добавляли к раствору ДНК/NaH₂PO₄ и выдерживали при 4°С в течение ночи для завершения комплексообразования. Мольное соотношение (MSPG/MДНК) было зафиксировано на уровне 0,27. Образование комплекса было подтверждено при помощи прибора для электрофореза в микрочипе (SHIMADZU: MultiNA).

[0094]

Комплексообразование CpG-ODN и LNT (Фиг. 1)

Лентинан (LNT: Ajinomoto Co., Inc., lot No.: 2D8X1) растворяли в 0,25 Н растворе NaOH до 50 мг/мл, и смесь оставили стоять при комнатной температуре в течение ночи. Различные CpG-ODN (таблицы 2, 3) растворяли в воде для инъекций до 100 мМ. водный раствор LNT и различные CpG-водные растворы (K3-dA20 (SEQ ID NO:9), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA35 (SEQ ID NO:12), K3-dA40 (SEQ ID NO:2)) смешивали в соотношениях, показанных в Таблице 4, затем добавляли тот же объем 330 мМ NaH₂PO₄, что и LNT, и смесь выдерживали при 4°С в течение ночи для полноты комплексообразования. Образование комплекса подтверждали сдвигом CpG ODN в сторону более высокой молекулярной массы при помощи размер-эксклюзионной хроматографии, контролируя поглощение при 260 нм. (Система: Agilent серии 1100, колонка: Asahipak GF7 M-HQ (Shodex), две колонки соединены, скорость потока: 0,8 мл/мин, буфер: 10 мМ ЭДТА в PBS, рН 7,4, температура: 40°С).

[0095]

Таблица 4 CpG-LNT CpG ODN LNT тип (мкг) (мкг) K3-dA20-LNT K3-dA20 69 113 K3-dA20-LNT K3-dA20 138 136 K3-dA25-LNT K3-dA25 78 85 K3-dA30-LNT #1 K3-dA30 433 425 результаты 9) K3-dA30-LNT #2 K3-dA30 433 510 результаты 9), 10), 11) K3-dA35-LNT #1 K3-dA35 477 496 результаты 9) K3-dA35-LNT #2 K3-dA35 477 595 результаты 9), 10), 11) K3-dA40-LNT #1 K3-dA40 521 567 результаты 9) K3-dA40-LNT #2 K3-dA40 521 680 результаты 9), 10), 11) K3-dA35-LNT K3-dA35 1527 1524 результаты 12) K3-dA40-LNT K3-dA40 1667 1741 результаты 12)

[0096]

Подготовка и стимуляция PBMC человека (фиг. 2, 3, 6 и 7)

PBMC были получены от трех здоровых взрослых мужчин-добровольцев (30-40 лет). Все эксперименты с использованием PBMC человека были одобрены экспертным Советом Национального института биомедицинских инноваций. После подготовки PBMC с помощью фиколла их высевали в концентрации 1×10⁷ клеток/мл. PBMC поддерживали в полной среде RPMI (RPMI 1640 с добавлением 10% ФТС, пенициллина и стрептомицина). PBMC стимулировали при помощи К3 (0,24, 0,74, 2,2, 6,6, 20 мкг/мл), К3-dA40, К3-SPG (комплекс К3-dA40), dA40-К3, SPG-К3 (комплекс dA40-К3), D35, CpG21798, CpG21889, CpG2395 или M362 в течение 24 ч. Надосадочную жидкость подвергали ELISA на pan-IFN-α (Mabtech), IL-6 (R&D) и Milliplex (Millipore).

[0097]

Электронно-микроскопический анализ (Фиг. 4)

Перед окрашиванием, образцы наносили на сетки с формвар-углеродным покрытием. Для негативного окрашивания каплю 2% уранилацетата (рН 4,0) помещали на сетку и оставляли высыхать на воздухе. Сетки исследовали при ×40000 увеличении на электронном микроскопе (фирмы Hitachi Н-7650).

[0098]

Динамическое рассеяние света (Фиг. 5)

Средние размеры нано-частиц в водном растворе при 80°C определяли способом динамического рассеяния света на приборе Malvern Instruments Zeta Sizer.

[0099] Культуры спленоцитов и дендритных клеток (фиг. 8 и 9)

Селезенки мышей собирали от 6-недельных мышей C57BL/6J, Tlr9-дефектных и Dectin-1-дефектных мышей. После суспендирования спленоцитов, красные кровяные клетки (эритроциты) лизировали при помощи лизис-буфера ACK, и клетки поддерживали в полной среде RPMI. Клетки разводили до 1×10⁷ клеток/мл. Полученные из костного мозга DC были образованы при культивировании в течение 7 дней с Flt3L человека (Peprotech) (100 нг/мл). Клетки разводили в концентрации 1×10⁷ клеток/мл. BMDM получали при культивировании в течение 7 дней с M-CSF мыши (Peprotech) (20 нг/мл). Эти клетки поддерживали в полной среде RPMI.

[0100]

Внутриклеточное распределение (фиг. 8 и 9)

BMDM разводили до 5×10⁷ клеток/мл и стимулировали с Alexa 488-К3 (1 мкМ) плюс версии Alexa 647-К3-SPG (1 мкМ), или Alexa 488-D35 (1 мкМ) плюс Alexa 647-К3-SPG (1 мкМ) в течение 3 сек. Клетки окрашивали при помощи Hoechst33258 в течение 30 мин для визуализации ядер, затем клетки фиксировали и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.

[0101]

Иммунизация

Шести-недельным мышам C57BL/6J, Tlr9-дефектным и Dectin-1- дефектным мышам вводили

OVA (0,1, 1, 10 или 100 мкг);

OVA (0,37, 1,1, 3,3 или 10 мкг) и K3(538 пмоль);

OVA (0,37, 1,1, 3,3 или 10 мкг) и K3-dA40 (538 пмоль); или

OVA (0,37, 1,1, 3,3 или 10 мкг) и K3-SPG (538 пмоль)

в основание хвоста в дни 0 и 10. Для других экспериментов, 6-недельным мышам C57BL/6J вводили

сплит-вакцину (0,1 мкг) отдельно;

сплит-вакцину плюс К3 (538 пмоль); или

сплит-вакцину плюс К3-SPG (538 пмоль)

в дни 0 и 10 у основания хвоста. Кровь брали в день 17, и титры антиген-специфических антител в сыворотке крови определяли способом ELISA (фиг. 10, 15а, 16, 25, 28а, 29 и 43а). Мышиные селезенки собирали в день 17, и спленоциты подготавливали упомянутый выше способом. Клетки повторно стимулировали при помощи

OVA257-264 (OVA257):SIINFEKL (10 мкг/мл);

OVA323-339 (OVA323):ISQAVHAAHAEINEAGR (10 мкг/мл);

Целым белком OVA (OVA) (10 мкг/мл);

NP260-283 (NP260):ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 мкг/мл); или

сплит-вакцины (10 мкг/мл)

в течение 24 или 48 ч. Супернатанты подвергали ELISA на мышиный IFN-γ (фиг. 11, 15b, 17, 26, 28b, 30 и 43b). Для тетрамерного анализа, спленоциты окрашивали H-2Kb OVA тетрамером (MBL), антителами анти-CD8α (KT15), анти-TCRβ (H57-597), анти-CD62L (MEL-14) и анти-CD44 (IM7), и 7-ААД. Число клеток OVA-тетрамер⁺ CD44⁺ CD8α⁺ TCRβ⁺ определяли с помощью FACS (фиг. 12, 15с, 27, 28с и 31).

[0102]

ЦТЛ-анализ in vitro (фиг. 13)

Шести-недельным мышам C57BL/6J вводили

OVA (100 мкг);

OVA плюс К3 (3,3 мкг);

OVA плюс К3-dA40 (3,3 мкг); или

OVA с К3-SPG (3,3 мкг)

в основание хвоста в день 0. Через 7 дней после иммунизации, наивные спленоциты С57BL/6J метили CFSE в различной концентрации (5 или 0,5 мкМ) в течение 10 мин при 37°С. Окрашенные клетки при высоких концентрациях подвергали импульсному воздействию OVA257 (10 мкг/мл) в течение 90 мин при 37°С. После промывки средой дважды меченые клетки перемешивали и передавали иммунизированным мышам путем внутривенного введения. Через двадцать четыре часа после передачи спленоциты собирали, и процент CFSE-меченных клеток определяли с помощью FACS.

[0103]

Иммунизация пептидами

Мышей C57BL/6J иммунизировали при помощи

OVA257 (10 мкг);

OVA257 плюс К3 (10 мкг);

OVA257 плюс К3-dA40 (10 мкг); или

OVA257 плюс К3-SPG (10 мкг).

Через семь дней после иммунизации спленоциты подготавливали и окрашивали H-2Kb OVA тетрамером, антителами анти-CD8α, анти-TCRβ, анти-CD62L и анти-CD44. Число клеток OVA-тетрамер⁺ CD44⁺ CD8α⁺ TCRβ⁺ определяли с помощью FACS (фиг. 14 слева). Подготовленные спленоциты повторно стимулировали in vitro при помощи OVA257 (10 мкг/мл) плюс Golgi Plug в течение 4 сек. Клетки окрашивали антителами анти-IFN-γ, анти-CD8α и анти-CD3e, а число клеток IFN-γ⁺ CD8α⁺ CD3e⁺ определяли с помощью FACS (фиг. 14 справа).

[0104]

Трансфекция и анализ связывания Dectin-1 (фиг. 18 и 19)

Клетки HEK293 трансфицировали контрольной, Dectin-1 или Dectin-2 экспрессионными плазмидами с использованием липофектамина 2000. Через 48 ч после трансфекции клетки обрабатывали FITC-SPG (0,5 мкМ), Alexa 488-меченым К3-dA40 (0,5 мкМ) или Alexa 488-меченым К3-SPG (0,5 мкм) в течение 60 мин при 37°С. После обработки клетки собирали, и SPG или CpG-ODN-позитивные клетки анализировали с помощью FASC.

[0105]

Стимуляция иммунокомпетентных клеток (фиг. 20, 21, 22, 23 и 24)

Спленоциты и FL-DC от мыши C57BL/6J, Tlr9-дефектных или Dectin-1-дефектных мышей стимулировали при помощи К3-SPG (0,014, 0,03, 0,04, 0,08, 0,12, 0,25, 0,37, 0,74, 1,1, 2,2, 3,3, 6,7, 10 или 20 мкг/мл), зимосана (3,7, 11,1, 33,3 или 100 мкг/мл), кулдлана, зимосана-обедненного или SPG в течение 24 ч. В других экспериментах, спленоциты от мышей C57BL/6J или Dectin-1-дефектных мышей стимулировали с зимосан-обедненным (100, 33,3 или 11,1 мкг/мл) или SPG (100, 33,3 или 11,1 мкг/мл), с D35(1 мкМ) или без него в течение 24 ч. Надосадочную жидкость подвергали ELISA IFN-α (PBL), IL-6 (R&D), IL-12 p40 (R&D), IL-12 p70 (R&D) и Bioplex (BIO-RAD).

[0106]

Иммуногистохимия (Фиг. 32)

Мышам C57BL/6J вводили

DQ-OVA (10 мкг);

Alexa 488-К3-SPG (10 мкг);

Alexa 647-К3-SPG (10 мкг); или

DQ-OVA плюс Alexa 647-К3-SPG (10 мкг)

в основание хвоста. После сбора iLN замороженные срезы подготавливали в криостате. Замороженные срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин и инкубировали с антителами anti-Siglec-1 (MOMA-1), anti-MARCO (ED31), anti-CD3e (145-2C11) или anti-CD11c (N418). Результаты визуализации анализировали с помощью ImageJ.

[0107]

Двухфотонная микроскопия (фиг. 33 и 35)

Мышам C57BL/6J, Tlr9-дефектным или Dectin-1-дефектным мышам вводили DQ-OVA (10 мкг), Alexa 488-К3 (10 мкг) или Alexa 488-К3-SPG (10 мкг) в основание хвоста. За 30 мин до сбора iLN мышам вводили антитела anti-PE-MARCO или anti-PE-Siglec-1 в основание хвоста. Через 1 ч после введения антигена или адъюванта, iLN собирали и готовили к визуализационному анализу при помощи двух-фотонного микроскопа (Olympus). Коэффициент корреляции Пирсона вычисляли с помощью анализа колокализации Volocity.

[0108] Распределение антигена и адъюванта in vivo (фиг. 34 и 36)

Мышам C57BL/6J мышам вводили

Alexa 647-К3 (538 пмоль);

Alexa 647-К3-SPG (538 пмоль);

Alexa 488-ОВА (10 мкг);

Alexa 488-ОВА плюс К3 (10 мкг);

Alexa 488-ОВА плюс К3-SPG (10 мкг);

DQ-OVA (10 мкг);

DQ-OVA плюс Alexa 647-К3 (538 пмоль); или

DQ-OVA плюс Alexa 647-К3-SPG (538 пмоль)

в основание хвоста. iLN собирали через двадцать четыре часа после введения. Чтобы подготовить суспензии отдельных клеток, iLN инкубировали с коллагеназой D (1 мг/мл) и дезоксирибонуклеазой I (0,1 мг/мл) в течение 30 мин при 37°С. Подготовленные клетки инкубировали с антителами anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD8α (56-6.7) и anti-CD11c для разделения различных DC-популяций. Клеточное поглощение OVA и CpG-ODN анализировали с помощью FACS.

[0109]

Инъекция клодронат-содержащей липосомы (фиг. 37)

Шести-недельным мышам C57BL/6J вводили клодронат-содержащую липосому в основание хвоста, либо за пять, либо за два дня до иммунизации. Мышей иммунизировали в основание хвоста при помощи OVA плюс К3-SPG в день 0. Кровь и селезенку собирали в день 8, а титры антител в сыворотке крови и Т-клеточные ответы определяли способом ELISA.

[0110]

Изучение активация DC in vivo (фиг. 38)

Мышам C57BL/6J или Tlr9-дефектным мышам вводили К3 (10 мкг) или К3-SPG (10 мкг) в основание хвоста. Через 24 ч после введения, iLN подготавливали вышеупомянутыми способами. Клетки инкубировали с антителами anti-CD11c, -mPDCA-1 (JF05-1C2.4.1), -CD8α и -CD40 (3/23), затем анализировали с помощью FASC.

[0111]

Изучение защитной реакции организма против инфекции вирусом гриппа

Шести-недельным мышам C57BL/6J вводили

сплит-вакцину (0,1 мкг);

сплит-вакцину плюс К3-SPG (10 мкг); или

WIV (0,2 мкг)

в дни 0 и 14. Через две недели после иммунизации, титры антител в сыворотке крови исследовали способом ELISA (фиг. 39), и мышам подвергали интраназально 2,3×10³ БОЕ (10 LD₅₀) вируса гриппа А/РR/8/34. Изменения массы тела и смертность подвергнутых введению мышей наблюдали в течение 20 дней (фиг. 40).

[0112]

Вакцинная модель на яванских макаках (фиг. 41 и 42)

Яванским макакам подкожно вводили гриппозную сплит-вакцину (5 мкг) плюс К3(5 нмоль), или

сплит-вакцину и K3-SPG (5 нмоль)

в дни 0 и 14. Образцы крови собирали через -2, 2, 4, 6, 8 и 110 недель, и титры антител в сыворотке крови определяли способом ELISA.

[0113]

Статистический анализ

Статистическую значимость (P<0,05) между группами определяли с помощью T-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни.

[0114]

Результаты

1) Нано-размера частица в форме стержня К3-SPG получает двойные параметры CpG-ODN типа K и D.

Более высокая эффективность комплексообразования между CpG-ODN и SPG требует дополнительных последовательностей PS-каркаса для поли-dA40 на 5' или 3' концах через процедуру денатурации-ренатурации, как показано на Фиг. 1 (Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)). При оптимизации комплексообразования при помощи гуманизированного CpG-ODN, авторы настоящего изобретения исследовали иммуностимулирующие воздействия 5'- и 3'-концов CpG-ODN. 5'-К3-dA40-3', но не 5'-dA40-К3-3' образовывал комплекс с SPG-активированными мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMC), чтобы продуцировать надежное количество IFN-α, хотя эффективности комплексообразования были сопоставимы (фиг. 2 и 3). К3, К3-dA40, и dA40-К3, которые способны активировать PBMC человека для продуцирования других цитокинов, таких как IL-6, оказались неспособным продуцировать IFN-α (фиг. 2 и 3). Эти результаты показывают, что 5'-CpG является более желательным, чем 3'-CpG, в качестве нового агониста TLR9.

[0115]

Качественное и количественное определение К3-SPG проводили способами растровой электронной микроскопии (SEM) и динамического светорассеяния (DLS). К3-SPG имели палочковидные структуры, в соответствии с тем, что наблюдали в предыдущем сообщении (Bae, A.H., et al., Carbohydrate research 339, 251-258 (2004)) (фиг. 4). Оказалось, что она представляет собой растворимую мономерную нано-частицу со средним диаметром 30 нм, сравнимым с SPG самим по себе и меньше, чем CpG-ODN D типа (D35) (Фиг. 5) (Klein, D.C. et al., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, L.T., et al., Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)).

[0116]

Учитывая, что К3-SPG образует нано-частицу, иммуностимулирующую активность К3-SPG сравнивали с CpG-ODN типа C, D и P. PBMC, стимулированные К3-SPG, продуцировали большее количество IFN-α и IFN-γ, и в гораздо меньших концентрациях, чем индуцированные D35 (фиг. 6), CpG-ODN типа C, D и P (фиг. 7). Эти результаты позволяют предположить, что К3-SPG приобретает параметр CpG-ODN Типа D, не теряя таковой Типа K, поскольку об этих IFN известно, что они являются Тип D-специфическими цитокинами (Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. et al., Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002)). Чтобы понять двойственные функции CpG-ODN K и D типа, авторы настоящего изобретения проанализировали внутриклеточную локализацию К3-SPG в макрофагах, полученных из костного мозга. К3-SPG колокализовался не только с эндосомами, содержащими CpG-ODN Типа K, но и с теми, которые содержат CpG-ODN Типа D (фиг. 8 и 9), как и CpG-ODN Типа C (Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999-2008 (2006)), что говорит о том, что К3-SPG может преобразовывать эндосома-опосредованные иммунные сигнальные пути при помощи CpG-ODN типа K и D. Эти результаты убедительно показывают, что К3-SPG формирует наноразмерную высокого порядка и полностью растворяемую частицу и обнаруживают, что этот К3-SPG “все-в-одном” демонстрировал более высокую активность чем, и отличные характеристики от любых других CpG-ODN и ранее известного комплекса CPG-SPG.

[0117]

2) К3-SPG является выдающейся адъювантной вакциной, которая индуцирует сильные ЦТЛ-ответы на белковый антиген без конъюгации.

Авторы настоящего изобретатения сравнивали адъювантные эффекты К3, К3-dA40 и К3-SPG в мышиной модели иммунизации. Когда мышей дикого типа иммунизировали OVA по-отдельности или OVA с каждым К3-производным адъювантом, К3-SPG индуцировал значительно более высокие гуморальные иммунные ответы (Фиг. 10), и более сильные Т-клеточные ответы, чем индуцируемые К3 (фиг. 11). Следует отметить, анализы тетрамеров выявили значительно большее число OVA-специфических CD8 Т-клеток (Фиг. 12). Очень сильная in vivo ЦТЛ-активность против совместного вводимых белковых антигенов без какой-либо ковалентной конъюгации также было отмечено (Фиг. 13). Эта сильная ЦТЛ-индукция путем К3-SPG была воспроизведена посредством пептидной вакцинации (фиг. 14), и было дозозависимой (Фиг. 15). Антиген-сберегающая способность К3-SPG была настолько сильной, что сопоставимые антительные и CD4 Т-клеточные реакции были достигнуты с помощью одной сотой количества OVA-антигена (фиг. 16 и 17). Эти результаты четко указывают на то, что К3-SPG является выдающимся адъювантом, по сравнению с К3 самим по себе.

[0118]

3) SPG представляет собой растворимый лиганд Dectin-1, но не является агонистом Dectin-1.

Проверяли роль Dectin-1 в клеточном поглощении, и последующей активации при помощи SPG и K3-SPG, поскольку Dectin-1, как было показано, является рецептором β-глюканов, таких как зимосан (Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004)). С помощью проточной цитометрии было установлено, что клетки HEK293, экспрессирующие Dectin-1, но не Dectin-2 или контрольный вектор, повышали поглощение SPG или K3-SPG in vitro независимо от присутствия ODN (фиг. 18 и 19). Недавно сообщалось, что водорастворимая форма β-глюкана не активирует Dectin-1 сигнальный путь (Goodridge, H.S., et al., Nature 472, 471-475 (2011)). Кроме того, Dectin-1 сигнальный путь ингибирует сигнальные TLR9-опосредованную продукцию цитокинов через супрессор индукции цитокинового сигнального белка 1 (SOCS1) (Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012)). Поэтому была проверена агонистическая активность SPG. Когда клетки селезенки стимулировали зимосан-обедненным, но не SPG, наблюдалось продуцирование доза- и Dectin-1-зависимого TNF-α и других цитокинов (фиг. 20) (фиг. 21). Продуцирование цитокинов зимосаном и кулдланом было Dectin-1-независимым. Зимосан-обедненный ингибировал CpG-ODN-индуцированный IFN-α, при этом ингибирование ослаблялось нехваткой Dectin-1 (Фиг. 22). В отличие от этого SPG не ингибировал CpG-ODN-индуцированного продуцирования IFN-α (фиг. 23). Эти результаты указывают на то, что SPG является лигандом, но не агонистом Dectin-1; поэтому SPG не служить помехой TLR9-опосредованного продуцирования IFN-α.

[0119]

4) Адъювантные эффекты К3-SPG зависят от TLR9 и частично зависят от Dectin-1.

Поскольку К3-SPG представляет собой комплекс CpG-ODN и β-глюкана, роль TLR9 (Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000)) и Dectin-1 (Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)) была изучена с помощью мышей с нокаутированным рецептором. Когда спленоциты и DC, полученные из Flt3 лиганд-индуцированного костного мозга (FL-DC) от Tlr9-дефектных и Dectin-1-дефектных мышей стимулировали при помощи К3-SPG, продукция цитокинов полностью зависела от TLR9, но не от Dectin-1 (фиг. 24). В соответствии с результатами in vitro, иммунизация Tlr9-дефектных мышей при помощи К3-SPG плюс OVA приводила к снижению гуморального и Т-клеточного ответов (фиг. 25-27). Dectin-1-дефектные мыши показали иммунные ответы, сопоставимые с таковыми у мышей дикого типа, когда мышей иммунизировали при помощи OVA плюс 10 мкг К3-SPG (Фиг. 28). Когда Dectin-1-дефектных мышей иммунизировали при помощи OVA плюс 1 мкг К3-SPG, мыши демонстрировали уменьшенный СД8 Т-клеточный ответ по данным тетрамерного анализов (фиг. 31), без каких-либо существенных изменений в продуцировании антител и цитокинов Т-клетками (фиг. 29 и 30). Эти результаты позволяют предположить, что адъювантный эффект К3-SPG зависит от TLR9 сигнального пути. Несмотря на то, что SPG и К3-SPG не стимулируют Dectin-1 сигнальный путь, эффект К3-SPG по-прежнему частично зависит от Dectin-1 in vivo.

[0120]

5) Макрофаги MARCO⁺, но не Siglec-1⁺ в дренирующих лимфатических узлах преимущественно захватывают К3-SPG с антигеном.

Учитывая, что К3-SPG предоставляет мощные адъювантные эффекты in vivo путем иммунизации простой смесью антигенов, мы предположили, что клетки, которые захватывают как антиген, так и K3-SPG должны играть решающую роль в опосредовании адъювантных эффектов. Для изучения in vivo распределение флуоресцентно-меченых OVA и K3-SPG были использованы люминесцентный микроскоп и двух-фотонный микроскоп. После инъекции в основание хвоста, как антиген, так и адъювант достиг поверхности дренирующих паховых лимфатических узлов (iLN) в течение 1 ч (фиг. 32, 33 и 35). Через 24 ч некоторые К3-SPG переместились к зоне CD3e⁺ Т-клеток и ко-локализовались с DQ-OVA. Те клетки, которые содержали как К3-SPG, так и DQ- OVA в области Т-клеток, представляли собой CD11c⁺ DC.

[0121]

Интересно, что большинство сигналов флуоресценции оставалось на поверхности iLN (Фиг. 32), что побудило авторов изобретатения сосредоточиться на двух типах макрофагов, распределенных, как известно, на LN-поверхности, макрофаги Siglec-1 (также называемые как CD169 или МОМА-1)⁺ (также известные как макрофаги субкапсулярного синуса) и макрофаги MARCO⁺ (Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012)). Гистологический анализ с использованием традиционный флуоресцентной микроскопии не раскрыл должным образом всю iLN-поверхность; более того, эти макрофаги трудно было выделять для анализа проточной цитометрией (Aoshi, T., et al., European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. & Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012)). Поэтому анализ изображений, полученных при помощи двухфотонной микроскопии, был использован для выяснения распределения антигена и K3-SPG ex vivo. После инъекции антител anti-MARCO и anti-Siglec-1 специфические макрофаги были визуализированы. Когда поверхность iLN контролировали с помощью двухфотонной микроскопии через 1 ч после инъекции, OVA и K3-SPG колокализовались с макрофагами MARCO⁺, но не Siglec-1⁺ (фиг. 33 и 35). Предыдущие сообщения свидетельствуют о том, что иммунный комплекс и инактивированный вирус гриппа захватываются макрофагами Siglec-1⁺, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ (Gonzalez, S.F., et al., Nature immunology 11, 427-434 (2010); Suzuki, K. et al., The Journal of experimental medicine 206, 1485-1493 (2009)). Профиль распределения идеально соответствует таковому для макрофагов MARCO⁺ в iLN, и не ко-локализуется с макрофагами Siglec-1⁺, что подтверждается анализом колокализации Volocity (фиг. 34 и 36). В отличие от этого, К3 был более диффузно распределены между областями MARCO⁺ и Siglec-1⁺ по сравнению с К3-SPG (фиг. 35 и 36). Кроме того, как Tlr9-дефектные, так и Dectin-1-дефектные мыши показали сопоставимую локализацию К3-SPG. Для определения вклада этих макрофагов по отношению к адъювантным эффектам К3-SPG, были проверены различные кинетики восстановления макрофагов и DC после инъекции клодронат-содержащей липосомы в основание хвоста. После инъекции макрофаги были полностью истощены за 2 дня. Эти клетки не восстанавливались в течение, по меньшей мере, одной недели, в то время как DC были в основном восстановлены к дню 5, как сообщалось ранее (Aoshi, T., et al., Immunity 29, 476-486 (2008)). Когда были истощены как макрофаги, так и ДК, иммунные реакции были значительно подавлены (Фиг. 37; Clo-d2). Были истощены только макрофаги, но не DC, и иммунные реакции были сопоставимы с таковыми у не проходящих лечение мышей (Фиг. 37; Clo-d5). Это позволяет предположить, что, несмотря на то, что как OVA, так и K3-SPG были в основном захвачены макрофагами MARCO⁺ в LN после инъекции, макрофаги индуцировали адаптивный иммунный ответ. Иными словами, адъювантный эффект К3-SPG в значительной степени зависел от популяции DC.

[0122]

6) К3-SPG нацеливает и сильно активирует популяцию антиген-несущих DC in vivo.

Данные авторов настоящего изобретения свидетельствуют, что хотя большая часть нано-частичного К3-SPG был подхвачена макрофагами MARCO⁺ в iLN после инъекции, адъювантные эффекты, как оказалось, контролируются DC. Поглощение антигена и адъюванта DC в iLN была сфокусировано. Через 24 ч после инъекции, поглощение антигена и адъювантов популяцией DC анализировали способом проточной цитометрии. Частота CpG-позитивов в трех подклассах DC (pDC, CD8α⁺ DC и CD8α⁺ DC) была значительно увеличена после инъекции К3-SPG, чем с К3. В противоположность этому, частота OVA-положительных DC была сопоставимой после инъекций К3 и К3-SPG. При фокусировании как на антиген-, так и на адъювант-позитивных DC наблюдалось существенное возрастание для К3-SPG над К3. Как pDC, так и CD8α⁺ DC в iLN были сильно активированы при помощи К3-SPG, но не при помощи К3 через 24 ч после инъекции, и это полностью зависело от TLR9 (Фиг. 38). Эти результаты указывают на то, что pDC и CD8α⁺ DC предпочтительно захватывают нано-частичные К3-SPG, а не K3, не представляющего частицу, для созревания, и оказывают адъювантное воздействие.

[0123]

7) К3-SPG является эффективным адъювантом для вакцины против гриппа в моделях мышей и приматов, отличных от человека.

Адъювантный эффект К3-SPG проверяли с использованием более клинически соответствующих моделях вакцинации от гриппа как на мышах, так и на приматах, отличных от человека. Когда мышей иммунизировали обработанной эфиром антиген гемагглютинин-обогащенной, не содержащей вирионов субъединичной вакциной (SV) плюс указанный адъювант, К3-SPG продемонстрировал лучшие адъювантные эффекты, чем К3, при сравнении ответов антител и Т-клеточных ответов (Фиг. 43). Что еще более важно, иммунизация SV плюс К3-SPG приводила к большему в 100 раз ответу антител, даже по сравнению с вакцинацией целой (вирион) инактивированной вакциной (WIV) (0,2 мкг/мышь) (Фиг. 39), которая содержит вирусную РНК в качестве составной в адъюванте (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)). Мыши, иммунизированные SV (0,1 мкг/мышь) и K3-SPG, демонстрировали меньшую потерю массы тела, чем WIV-иммунизированные мыши (Фиг. 40). Поразительно, К3-SPG предоставлял 100% защиту от заражения смертоносным вирусом PR8, в дозе, при которой только 10% из WIV-вакцинированных мышей выжили (Фиг. 40). Эти результаты убедительно поддерживают идею о том, что К3-SPG работает как мощный адьювант для белковых или основанных на белках вакцин в мышиной модели, что побудило авторов изобретения распространить этот вывод на модель приматов, отличных от человека, с использованием яванских макак. Каждую группу из трех яванских макак иммунизировали SV плюс К3 или К3-SPG в дни 0 и 14. Титры антител в сыворотке крови затем контролировали в течение 8 недель. SV плюс К3-SPG индуцировал значительно более высокий титр антител через 2 недели после иммунизации, и уровни титров оставались высокой еще в течение, по меньшей мере, 6 недель (Фиг. 41). Через 2 года (110 недель) после начала иммунизации группа К3-SPG имела значительно более высокие титры антител, чем в группе К3 (фиг. 42 и 43). Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что К3-SPG является выдающимся вакцинным адъювантом в модели приматов, отличных от человека.

[0124]

8) Исследование способности комплексов К3-LNT и К3-SPG индуцировать воспалительный ответ с использованием PBMC человека

При помощи PBMC человека (Lonza, Cat# CC-2702, Lot# 0000396517), оценивали способность К3 (К3-dA30, К3-dA35, К3-dA40) самого по себе, комплексов К3-LNT (К3-dA30-LNT, К3-dA35-LNT, К3-dA40-LNT) и комплекса K3-SPG (К3-dA40-LNT) индуцировать продуцирование pan-IFN-а (hIFNa) и IL-6 (hIL-6).

Результаты показаны на фиг. 44. При стимуляции в низкой дозе, продуцирование pan-IFN-a и IL-6 было выше с К3-SPG, который представляет собой комплекс К3 и SPG, и К3-LNT, который представляет собой комплекс К3 и LNT, по сравнению с К3 самим по себе. Кроме того, возможность продуцирования воспалительных цитокинов, которое индуцируется при помощи К3-LNT, имеющих разные длины dA-хвоста (dA30, dA35, dA40), как полагают, является, возможно, практически эквивалентной. Более того, при сравнении возможности продуцирования воспалительных цитокинов К3-SPG и K3-LNT, индуцибильность продуцирования pan-IFN-a при помощи К3-LNT, как полагают, возможно, была выше, чем для К3-SPG. С другой стороны, оказалось, что К3-SPG и K3-LNT эквивалентны по продуцированию IL-6.

[0125]

9) Титр антиген RSV F-специфического IgG-антитела в сыворотках крови мышей, привитых RSV F субъединичной вакциной с добавлением комплекса К3-LNT и К3-SPG

7-недельных мышей линии C57BL/6J иммунизировали дважды в основание хвоста антигеном RSV F (0,5 мкг) и различными адъювантами (10 мкг) (К3 сам по себе (К3-dA30, К3-dA35, К3-dA40), комплекс К3-LNT (К3-dA30-LNT, К3-dA35-LNT, К3-dA40-LNT) и комплекса K3-SPG (К3-dA40-SPG), фосфат алюминия) на мышь, с 2-недельными интервалами. Через одну неделю после конечной вакцинации получали периферическую кровь и подготавливали сыворотку, которую использовались для оценки образцов. Титр антитела, которое связывается с вакцинным антигеном RSV F в сыворотке крови, измеряли с помощью способа ELISA. Как показано на фиг. 45, индукция RSV F антигена-специфических общих IgG усиливалась за счет добавления адъюванта, по сравнению с группой прививки собственно антигеном RSV F (F), что свидетельствует о том, что адъювантное действие К3 самого по себе (F⁺K3-dA30, F⁺K3-dA35, F⁺K3-dA40), K3-LNT (F⁺K3-dA30-LNT, F⁺K3-dA35-LNT, F⁺K3-dA40-LNT) и комплекса К3-SPG (Ф⁺К3-dA40-SPG) и фосфата алюминия (F⁺Alum) может быть эквивалентным. В группе мышей, привитых фосфатом алюминия (F⁺Alum), который является Th2 адъювантом, было установлено, что способность индукции IgG1-подкласса была выше, чем в группы прививки антигеном RSV F самим по себе. С другой стороны, результаты показали, что группа иммунизации, привитая К3 самим по себе (F⁺K3-dA30, F⁺K3-dA35, F⁺K3-dA40), K3-LNT (F⁺K3-dA30-LNT, F⁺K3-dA35-LNT, F⁺K3-dA40-LNT), K3-SPG (F⁺K3-dA40-SPG), была выше по подклассу антител IgG2c, чем с фосфатом алюминия (F⁺Alum), что говорит о том, что комплекс К3-LNT может представлять собой Th1 адъювант наподобие К3-SPG.

[0126]

10) Способность продуцирования RSV F антиген-специфичных цитокинов у мышей, привитых субъединичной вакциной RSV F с добавлением комплекса К3-LNT и К3-SPG

7-недельных мышей линии C57BL/6J иммунизировали дважды в основание хвоста антигеном RSV F (0,5 мкг) и различными адъювантами (10 мкг) (К3 сам по себе (К3-dA30, К3-dA35, К3-dA40), К3-LNT (К3-dA30-LNT, К3-dA35-LNT, К3-dA40-LNT) и комплекс K3-SPG (К3-dA40-SPG), фосфата алюминия), на мышь, с 2-недельными интервалами. Через одну неделю после конечной вакцинации получали селезенку и подготавливали спленоциты. Спленоциты, засеянные в 96-луночные культуральные планшеты, стимулировали каждым из ГКГС класса I рестрикционным эпитопным пептидом, ГКГС класса II рестрикционным эпитопным пептидом и вакцинным антигенным белком антигена RSV F, и культивировали в течение 24 ч или 48 ч. Способность продуцирования RSV F антиген-специфических цитокинов оценивали способом ELISA на цитокины с использованием надосадочной культуральной жидкости в качестве образца. В этом исследовании, оценивали три вида цитокинов (IFN-g, который является Тh1-цитокином, IL-2, продуцируемый активированными Т-клетками, и IL-13, который является Тh2-цитокином).

В результате, как показано на фиг. 46, было высказано предположение, что усиление эффектов антиген RSV F-специфической индукции продуцирования IFN-g и продуцирования IL-2 может быть эквивалентным для К3-LNT (Ф⁺К3-dA30-LNT, Ф⁺К3-dA35-LNT, Ф⁺К3-dA40-LNT) и K3-SPG (Ф⁺К3-dA40-SPG). В группе прививки (F⁺Alum) адъювантом фосфатом алюминия (Th2-адъювант), продуцирование IFN-g было ниже предельного уровня детектирования любой стимуляцией. С другой стороны, эффект усиления продуцирования IL-13 был высоким в группе прививки фосфатом алюминия (Th2 адъювант) и низким в группе прививки К3-SPG (Тh1 адъювант). Интересно, что в группе прививки К3-LNT (F⁺K3-dA30-LNT, F⁺K3-dA 35-LNT, F⁺K3-dA 40-LNT) усиливающий эффект на продуцирование IL-13 был высоким, по сравнению с группой прививки (F⁺K3-dA40-SPG) аналогичным Тh1 адъювантом (К3-SPG). На основании этого было высказано предположение, что комплекс К3-LNT обладает способностью усиливать Тh2-ответ, в дополнение к сильному эффекту усиления Тh1-ответа, которым обладает К3-SPG.

[0127]

11) Защитный эффект против РСВ-инфекции у хлопковых хомяков, привитых RSV F субъединичной вакциной с добавлением К3-LNT и К3-SPG

6-7-недельных хлопковых хомяков иммунизировали дважды в основание хвоста антигеном RSV F (1 мкг) и различными адъювантами (10 мкг) (К3-LNT (К3-dA35-LNT, К3-dA40-LNT) и комплексом K3-SPG (К3-dA40-SPG), фосфатом алюминия), на крысу, с 2-недельными интервалами. Через две недели после финальной вакцинации хлопковой крысы были заражены RSV серотипа А (штамм Лонг) путем трансназальной прививки, и внутрилегочное количество вирусов определяли через 3 дня. Группе введения синагис (паливизумаб) внутримышечно вводили синагис (2,5 мг/кг) за один день до заражения инфекцией, а защитная способность от инфекции оценивали таким же образом, как выше. Кровь отбирали из яремной вены крыс под наркозом непосредственно перед заражением инфекцией, и титр нейтрализующего антитела исследовали с помощью полученной сыворотки.

Результаты внутрилегочного количества вирусов показаны в левой части фиг. 47, и результаты титра нейтрализующих антител показаны в его правой части. Результаты внутрилегочного количества вирусов показывают, что количество вирусов около 10⁵ БОЕ/легкое наблюдалось в группе введения PBS, в то время как оно было снижено до примерно в 100 раз меньшего количества вируса (среднее) в группе введения RSV F-вакцины с добавлением фосфата алюминия (F⁺Alum). С другой стороны, активностью индуцировать защиту от инфекции наблюдалась также в группе введения К3-SPG-добавленной вакцины (F⁺K3-dA40-SPG). Группа К3-LNT-добавленной вакцины (F⁺K3-dA35-LNT, F⁺K3-dA40-LNT) показала лучший защитный эффект от заражения, тем самым предполагая возможность наличия кандидата на новый вакцинный адъювант, который способствует высокой способности защиты от инфекции, при сравнении с фосфатом алюминия и K3-SPG.

Как для индуцирующей способности нейтрализующего антитела, нейтрализующая активность в крови, эквивалентная Синагис, была обнаружена в группе введения вакцины с добавлением фосфата алюминия (F⁺Alum). С другой стороны, поскольку нейтрализующее антитело едва индуцировалось у 3 хомяков из 4 в группе введения К3-SPG-добавленной вакцины (F⁺К3-dA40-SPG), эффект защиты от инфекции, которому способствует К3-SPG, как считалось, вытекает из нейтрализующего антитело-независимого механизма. Кроме того, поскольку в высокий степени нейтрализующее антитело было обнаружено в группе введения К3-LNT (F⁺K3-dA35-LNT, F⁺K3-dA40-LNT), по сравнению с К3-SPG, было высказано предположение о том, что адъювант К3-LNT может обладать свойством, отличным от такового у К3-SPG, например, увеличенной способностью Th2-ответа.

Промышленная применимость

[0128]

Настоящее изобретение предоставляет олигонуклеотид, обладающий более высокой иммуностимулирующей активностью, и комплекс, его содержащий. В частности, комплекс по настоящему изобретению одновременно обладает иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа K, и иммуностимулирующей активностью, уникальной для CpG-ODN типа D. Кроме того, К3-SPG и K3-LNT обладают сильной вакцинной адъювантной активностью, и иммунизация при помощи К3-SPG или К3-LNT вместе с антигеном стимулирует как антиген-специфический гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет. Поэтому комплекс по настоящему изобретению полезен в качестве иммуностимулирующего средства или вакцинного адъюванта в области медицины.

[0129]

Эта заявка основана на патентной заявке № 2013-196206, поданой в Японии (Дата подачи заявки: 20 сентября 2013 года), содержание которой включено в полном объеме в настоящем документе.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Национальный институт биомедицинских инноваций

Компания Дайичи Санкио, с ограниченной ответственностью

<120> Олигонуклеотид-содержащий комплекс, обладающий иммуностимулирующей

активностью, и его применение

<130> 092215

<150> JP 2013-196206

<151> 2013-09-20

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 1

atcgactctc gagcgttctc 20

<210> 2

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 2

atcgactctc gagcgttctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

<210> 3

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atcgactctc gagcgttctc 60

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 4

ggtgcatcga tgcagggggg 20

<210> 5

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 5

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 6

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 7

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 7

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 8

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 9

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 9

atcgactctc gagcgttctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40

<210> 10

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 10

atcgactctc gagcgttctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 45

<210> 11

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 11

atcgactctc gagcgttctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50

<210> 12

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 12

atcgactctc gagcgttctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуностимулирующему комплексу, и может быть использовано при лечении вызванных вирусами или бактериями инфекционных заболеваний, а также применяться при лечении злокачественных новообразований. Изобретение включает имеющий структуру тройной спирали комплекс, содержащий гуманизированный CpG-олигонуклеотид типа K, полидезоксиаденилат и лентинан, который обладает иммунотерапевтической активностью и способен к стимулированию выработки интерферона (тип I и II) в клетках. 14 н. и 16 з.п. ф-лы. 11 пр., 4 табл., 47 ил.

1. Комплекс для стимулирования выработки интерферона типа I и II, содержащий олигонуклеотид, содержащий гуманизированный CpG-олигонуклеотид типа K, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и полидезоксиаденилат, причем полидезоксиаденилат связан с 3'-стороной гуманизированного CpG-олигонуклеотида типа K, и лентинан,

где указанный полидезоксиаденилат имеет длину 20-60 нуклеотидов,

где фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде частично или полностью заменены фосфоротиоатными связями, и

где указанный комплекс обладает структурой тройной спирали.

2. Комплекс по п. 1, в котором фосфодиэфирные связи в олигонуклеотиде полностью заменены фосфоротиоатными связями.

3. Комплекс по п. 1 или 2, способный к активации В-клеток в отношении продуцирования IL-6 и активации дендритных клеток в отношении продуцирования IFN-α.

4. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из вирусной инфекции и бактериальной инфекции, содержащая фармакологически эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-3.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где указанное заболевание представляет собой вирусную инфекцию.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, где вирусная инфекция представляет собой инфекцию РС-вируса или вируса гриппа.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения злокачественного новообразования, содержащая фармакологически эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-3.

8. Средство для стимулирования выработки интерферона типа I и II, содержащее фармакологически эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-3.

9. Средство по п. 8, которое представляет собой вакцинный адъювант.

10. Средство по п. 9, где указанная вакцина представляет собой вакцину для вирусной инфекции, бактериальной инфекции и злокачественного новообразования.

11. Применение комплекса по любому из пп. 1-3 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из вирусной инфекции и бактериальной инфекции.

12. Применение по п. 11, где указанное заболевание представляет собой вирусную инфекцию.

13. Применение по п. 12, где вирусная инфекция представляет собой инфекцию РС-вируса или вируса гриппа.

14. Применение комплекса по любому из пп. 1-3 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или лечения злокачественного новообразования.

15. Способ лечения или профилактики заболевания у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества комплекса по любому из пп. 1-3 указанному теплокровному животному, где указанное заболевание представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из вирусной инфекции и бактериальной инфекции.

16. Способ по п. 15, где заболевание представляет собой вирусную инфекцию.

17. Способ по п. 16, где вирусная инфекция представляет собой инфекцию РС-вируса или вируса гриппа.

18. Способ по любому из пп. 15-17, где теплокровное животное представляет собой человека.

19. Способ лечения или профилактики злокачественного новообразования у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества комплекса по любому из пп. 1-3 указанному теплокровному животному.

20. Способ по п. 19, где теплокровное животное представляет собой человека.

21. Способ индуцирования защитной иммунной реакции против заболевания, выбранного из вирусной инфекции и бактериальной инфекции, у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества комплекса по любому из пп. 1-3 указанному теплокровному животному.

22. Способ индуцирования защитной иммунной реакции против злокачественного новообразования у теплокровного животного, включающий введение фармакологически эффективного количества комплекса по любому из пп. 1-3 указанному теплокровному животному.

23. Применение комплекса по любому из пп. 1-3 для лечения или профилактики заболевания, выбранного из вирусной инфекции и бактериальной инфекции.

24. Применение по п. 23, где заболевание представляет собой вирусную инфекцию.

25. Применение по п. 24, где вирусная инфекция представляет собой инфекцию РС-вируса или вируса гриппа.

26. Применение комплекса по любому из пп. 1-3 для лечения или профилактики злокачественного новообразования.

27. Фармацевтическая композиция для индуцирования иммунной реакции на антиген, полученный из инфекционного патогена, содержащая

(а) фармакологически эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-3, и

(b) указанный антиген.

28. Композиция по п. 27, где патоген представляет собой вирус.

29. Композиция по п. 28, где вирус представляет собой вирус гриппа или РС-вирус.

30. Фармацевтическая композиция для индуцирования иммунной реакции на антиген, полученный из клетки злокачественного новообразования, содержащая

(а) фармакологически эффективное количество комплекса по любому из пп. 1-3, и

(b) указанный антиген.