Штамм бактерий Lactobacillus helveticus T-5068, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K35/744 

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм Lactobacillus helveticus Т-5068, обладающий высокой ростовой активностью и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.

Производство ферментированных продуктов питания основано на использовании стартовых культур, например, для производства продуктов молочнокислого брожения применяют стартовые культуры молочнокислых бактерий. Разрабатываются новые стартовые культуры молочнокислых бактерий с промышленно важными свойствами -обладающие органолептическими, технологическими, питательными и/или медицинскими преимуществами. Примерами являются молочнокислые бактерии, которые продуцируют полисахариды, ароматические соединения, витамины и противомикробные вещества.

Качество и биологическая ценность кисломолочных продуктов напрямую зависят от применяемых стартовых культур. Культуры должны обеспечивать воспроизводилось технологического процесса, стабильное качество готовой продукции, кроме того, культуры должны быть устойчивы к бактериофагам, иметь высокую выживаемость при хранении, обеспечивать ферментируемый молочный продукт необходимыми свойствами, а также позволять проявлять больше гибкости на производстве (использовать разные штаммы с разными свойствами и возможность комбинировать их в зависимости от качества сырья).

Для обеспечения высокого качества заквасок прямого внесения, штаммы культур должны обладать высокой выживаемостью в процессе изготовления и хранения заквасок прямого внесения.

Основными компаниями-правообладателями в исследуемой области являются CHR HANSEN (Дания), BRIGHT DAIRY & FOOD (Китай), MEIJI (Япония), DUPONT NUTRITION BIOSCIENCES (Дания), GERVAIS DANONE (Франция), NESTEC (Швейцария).

Данные компании в составе заквасок прямого внесения в большинстве случаев используют мутированные штаммы болгарской палочки с целью устранения эффекта «вторичного скисания», например, патент US 20020081712. В патенте WO 2017194650 описан штамм с увеличенным сроком годности и температуры хранения кисломолочного продукта до 20-25°С. В патенте RU 2446209 описан штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который был подвегнут химическому мутагенезу.

Использование мутированных штаммов, как компонентов заквасок прямого внесения имеет определенные недостатки, так неспецифический мутагенез ведет, как к приобретению штаммом необходимого свойства, так и к появлению неспецифических мутаций, что ведет в нестабильности генома и быстрому вырождению данного штамма, что сильно ограничивает, число генераций (пересевов) штамма при которых он сохраняет свои технологические свойства.

Задачей изобретения является получение нового штамма, не являющегося генетически модифицированной культурой, обеспечивающего стабильное получение кисломолочных продуктов питания, а также обладающего высокой эффективностью в процессе получения сухой лиофилизированной микробной массы для изготовления заквасок прямого внесения.

Задачей изобретения решается посредством селекции нового штамма Lactobacillus helveticus Т-5068 (регистрационный номер ГКНМ №1262), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных, а также к лечебно-диетических продуктам, и обладающего высокой ферментативной активностью.

Настоящее изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus helveticus Т-5068, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве закваски прямого внесения.

Технический результат заключается в том, что предлагаемый к использованию штамм обладает быстрым набором биомассы при культивировании и укороченной лагфазойе при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида, а кисломолочные продукты на его основе обладают высокой кислотностью (110-150°Т), которая сохраняется на протяжении 14 суток хранения, а также плотным сгустком. При хранении кисломолочных продуктов с использованием данного штамма не образуется сыворотка. Предлагаемый штамм Lactobacillus helveticus Т-5068 новый, в научной и патентной литературе не описан. Штамм выделен из домашнего кисломолочного продукта. Штамм Lactobacillus helveticus Т-5068 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1263.

1. Анатомо-морфологические свойства штамма.

Изучение колоний в полужидкой среде (среда «Бифидум сухая» производства ГНЦ ПМ п. Оболенск) проводили на протяжении 12 пересевов суточных культур. В полужидкой питательной среде форма единичных колоний - рыхлая комета, длиной 7-6 мм, растет по всему объему среды, кроме зоны аэробиоза (0,5 см от верхнего края среды), на поверхности плотной питательной среды МРС-4 в анаэробных условиях вырастают полупрозрачные непигментированные шероховатые колонии (R-форма). Грам +, неподвижные, неспорообразующие, прямые крупные прямые или слегка изогнутые палочки с закругленными концами, иногда образующие цепочки из 2-4 клеток.

2. Ферментативная активность культуры.

По результатам изучения ферментативных свойств штамма лактобацилл с применением двух тест-систем было обнаружено, что заявляемый штамм ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, D-арабинозу, эскулин, салицин, целлобиозу, маннозу, трегалозу, мелецитозу, раффинозу, мочевину, замедленно утилизирует сахарозу, гентиобиозу, N-ацетилглюкозамин, галактозу, фруктозу, рамнозу. Каталазу не образует, желатин не разжижает. Оптимальная температура культивирования - 42±1°С. В качестве сред для культивирования штамма используют обезжиренное молоко, среду Блаурокка, ГМ -среду, МРС-2, МРС-4 и другие.

3. Протеолитическая активность культуры.

Изучение протеолитических свойств, изменение величины титруемой кислотности при росте в молоке проводили на стерильном 12% сухом восстановленном обезжиренном молоке. Кислотность кисломолочных продуктов определяли в условных единицах-градусах Тернера (°Т) (ГОСТ 3624-67).

Ход определения: В колбу или стакан на 100-150 мл отмеряют пипеткой 10 г исследуемого продукта. В стакан вносят 20 мл дистиллированной воды, добавляют 3 капли 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 Н раствором NaOH до достижения величиной рН значения 8,5±0,05 ед. и появления бледно-розового цвета, не исчезающего в течение 1 минуты. Количество щелочи, израсходованное на титрование, умножают на 10. Штамм к 16 часам сквашивает молоко с образованием равномерного сметанообразного сгустка приятного вкуса без синерезиса. В 1 мл сквашенного стерильного молока к 12 часам культивирования накапливается до 10⁸ микробных клеток. Каталазу не образует. Данные накопления титруемой кислотности представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемый штамм лактобацилл проявляет стабильные протеолитические свойства.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев. Генетическая идентификация штамма подтверждена с помощью анализа 16SpPHK.

Для подтверждения высокой активности сквашивания заявляемый штамм сравнивали со штаммом-аналогом в качестве которого использовался штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ВКПМ В-3141, депонированный во Всеросийской коллекекции промышленных микроорганизмов. Лиофилизаты каждого штамма в объеме 0,1% вносили в восстановленное сухое молоко. При этом наблюдаемый период лаг-фазы у заявляемого штамма был значительно короче (1,5 часа), чем у штамма-аналога (4,5-5 часов), что является важным условием для промышленного производства кисломолочной продукции.

Аналогичным образом изучалась скорость накопления биомассы у заявляемого штамма и штамма-аналога, которая также показала, что изменение оптической плотности жидкой культуры заявляемого штамма через 12 часов культивирования в питательной среде на основе СОМ достигала 14,3 ед., в то время как у штамма-аналога она составляла 9 ед., т.е. была примерно на 50% выше.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления производственной закваски прямого внесения на первом этапе получали посевной материал для засева в ферментер, для этого ресуспендировали флакон лиофилизированной культуры штамма, а полученную суспензию вносили в среду Блаурокка и инкубировали при температуре 37°С 18-24 часа. Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для получения культуры 2-ой генерации. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации: 12-18 ч. Для получения жидкой биомассы посевной материал 2-ой генерации вносили в биореактор в количестве 5% от объема среды культивирования. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации до 12 ч.

Для получения сухой лиофилизированной микробной массы жидкую биомассу концентрировали методом центрифугирования, смешивали со средой высушивания на основе сахарозы и желатины и проводили лиофильное высушивание. Полученный лиофилизат может быть использован в качестве закваски, как в виде монокультуры или как компонент комплексной закваски для производства кисломолочной продукции.

Пример 2. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления простокваши. Для приготовления простокваши использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат штамма Lactobacillus helveticus Т-5068 в количестве 0,1% вместе с лиофилизатом штамма Streptococcus thermophillus Т-5367 (штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1266.) также в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,7±0,1. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охладили до температуры 2-8°С. Образующийся сгусток - белый, не тянущийся, без признаков синерезиса. Вкус - кисломолочный, кислый. рН простокваши на 7 день хранения составила 4,0, на 14 день хранения 3,9.

Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.

Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе поликомпонентной закваски прямого внесения.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus helveticus Т-5068, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1263. Штамм Lactobacillus helveticus ГНКМ 1263 может быть использован для приготовления кисломолочных продуктов. 1 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Lactobacillus helveticus Т-5068, депонированный в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером №1263 и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.