Штамм бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus K 1903, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903, выделенный из Якутского кумыса, обладающий высокой ростовой активностью и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.

Обеспечение продуктами питания, имеющими высокую биологическую ценность и способными оказывать лечебно-профилактическое действие, выполняющими роль продуктов функционального питания, является важным аспектом пищевой промышленности. Особое место среди продуктов функционального питания занимают кисломолочные продукты, в том числе диетические продукты, обеспечивающие возможность их употребления лицами, страдающими непереносимостью молочных продуктов из-за дефицита в организме лактатдегидрогеназы.

Производство ферментированных продуктов питания основано на использовании стартовых культур; например, для производства продуктов молочнокислого брожения применяют стартовые культуры молочнокислых бактерий. Именно состав и свойства штаммов микроорганизмов, включаемых в стартовые культуры, позволяют получать широкий ассортимент продуктов с заданными биологическими показателями и характерными особенностями: обеспечивающие микробиологическую безопасность и обладающие органолептическими, технологическими, питательными и/или медицинскими преимуществами. Примерами являются молочнокислые бактерии, которые продуцируют противомикробные вещества, полисахариды, ароматические соединения, витамины, полезные ферменты и обладающие пробиотическими свойствами.

Культуры должны обеспечивать воспроизводимость технологического процесса, стабильное качество готовой продукции; кроме того, культуры должны быть устойчивы к бактериофагам, иметь высокую выживаемость, обеспечивать ферментируемый молочный продукт необходимыми свойствами, а также позволять проявлять больше гибкости на производстве (использовать разные штаммы с разными свойствами и возможность комбинировать их в зависимости от качества сырья).

Для удовлетворения данных требований применяют закваски прямого внесения (Direct Vat Set (DVS) / Direct Vat Inoculation (DVI)), которые производятся в виде замороженных гранул или в лиофилизированной форме. Для обеспечения высокого качества заквасок прямого внесения, штаммы культур должны обладать высокой выживаемостью в процессе изготовления заквасок прямого внесения.

Основными компаниями-правообладателями в исследуемой области являются CHR HANSEN (Дания), BRIGHT DAIRY & FOOD (Китай), MEIJI (Япония), DUPONT NUTRITION BIOSCIENCES (Дания), GERVAIS DANONE (Франция), NESTEC (Швейцария).

За рубежом в составе заквасок прямого внесения часто используют мутированные штаммы болгарской палочки с целью устранения эффекта «вторичного скисания» в результате ферментации лактозы (патент РФ №2232816, патент РФ №2446209).

Использование мутированных штаммов, как компонентов заквасок прямого внесения имеет некоторые недостатки: так неспецифический мутагенез ведет, как к приобретению штаммом необходимого свойства, так и к появлению неспецифических мутаций, что ведет в нестабильности генома и постепенному вырождению данного штамма, что, в свою очередь, сильно ограничивает продолжительность его применения.

Задачей изобретения является получение нового штамма, не являющегося генетически модифицированной культурой, обеспечивающего получение кисломолочных продуктов питания, а также обладающего высокой эффективностью в процессе получения сухой лиофилизированной микробной массы для изготовления заквасок прямого внесения.

Задача изобретения решается посредством селекции нового штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 (регистрационный номер ГКНМ №1277), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных продуктов, и обладающего высокой биохимической активностью.

Настоящее изобретение относится к штамму молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903, который по ряду полезных качеств может быть использован в качестве компонента комплексной закваски прямого внесения для производства кисломолочных лечебно-профилактических продуктов питания.

Технический результат заключается в том, что предлагаемый к использованию штамм обладает быстрым набором биомассы при культивировании, высокой антагонистической активностью и укороченной лагфазой при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида, а кисломолочные продукты на его основе обладают низкой кислотностью (100-104°Т), которая сохраняется на протяжении 3 суток хранения, а также плотным сгустком. При хранении кисломолочных продуктов с использованием данного штамма не образуется сыворотка.

Предлагаемый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 новый, в научной и патентной литературе не описан.

Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 выделен из Якутского кумыса. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus К 1903 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1277.

1. Изучение анатомо-морфологических свойств штамма.

Изучение колоний в полужидкой среде проводили на протяжении 12 пересевов суточных культур. В полужидкой среде для культивирования и выделения бифидобактерий (БС) форма единичных колоний - рыхлая комета-елочка, длиной 3-5 мм, растет по всему объему среды без зоны аэробиоза, на поверхности плотной питательной среды вырастают прозрачные апигментированные круглые колонии (S-форма), сметаноподобной консистенции. В микропрепарате Грам +, неподвижные, неспорообразующие, прямые длинные тонкие палочки с закругленными концами, образующие цепочки из 4-8 клеток.

2. Идентификация изучаемого штамма.

Для идентификации изучаемого штамма по белкам клеточной стенки использован Bruker Daltonik MALDI Biotyper. Для этого использовали единичные колонии 24 часовой культуры третьей генерации, выращенной на поверхности МРС-4 в анаэробных условиях.

По данным MALDI штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 определен как Lactobacillus delbrueckii с высокой долей достоверности (Score 2,433).

Генетическая идентификация штамма также подтверждена с помощью анализа 16SрРНК.

3. Изучение технологических свойств штамма.

Для определения особенностей штамма проводили культивирование при максимальной температуре - 50°С. (Оптимальная температура развития для штамма 37-40°С, минимальная - 25°С, максимальная 45-50°С).

Наблюдался выраженный рост по всей толще среды без зоны аэробиоза - в полужидкой БС среде при высоких температурах. Данная культура растет в толще полужидких питательных сред и на поверхности плотных сред в присутствии кислорода, т.е. штамм относится к аэротолерантным микроорганизмам (микроаэрофилам).

4. Изучение протеолитической активности культуры.

Изучение протеолитических свойств, накопление титруемой кислотности в молоке проводили на стерильном 12% сухом обезжиренном молоке (СОМ), приготовленном в лаборатории питательных сред ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. (СОМ по ГОСТ 33629-2015 "КОНСЕРВЫ МОЛОЧНЫЕ. МОЛОКО СУХОЕ. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ", поставщик «Агропромышленный Союз «Алев»).

Кислотность кисломолочных продуктов определяли в условных единицах - градусах Тернера (Т) (ГОСТ 3624-67).

Ход определения: В колбу или стакан на 100-150 мл отмеряют пипеткой 10 мл исследуемого продукта. Остатки продукта на стенках пипетки смывают 20 мл дистиллированной воды, добавляют 3 капли 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 Н раствором NaOH до появления бледно-розового цвета, не исчезающего в течение 1 минуты. Количество щелочи, израсходованное на титрование, умножают на 10 в пересчете на 100 мл продукта.

Штамм к 16 часам сквашивает молоко с образованием равномерного сметанообразного сгустка приятного вкуса без синерезиса. В 1 мл сквашенного стерильного молока к 12 часам культивирования накапливается 10⁸ микробных клеток. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Данные накопления титруемой кислотности представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемый штамм лактобацилл проявляет стабильные протеолитические свойства.

5. Изучение антибиотикочувствительности штамма.

Чувствительность к антибиотикам штамма изучали на модели 15 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско - диффузионным методом в интерпретации Назыровой Н.Р. с соавт., 2008 г., рекомендованной МУ 2.3.2.2789-10. В работе использованы диски производства HiMedia для определения чувствительности к антимикробным препаратам. Полученные данные представлены в таблице 2.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 чувствителен к стрептомицину, линкомицину, хлорамфениколу, тетрациклину, эритромицину, ванкомицину, имипенему, устойчив к ампициллину, ципрофлоксацину, полимиксину, налидиксовой кислоте, промежуточно-устойчив к пенициллину, канамицину, гентамицину, цефалотину.

6. Изучение ферментативной активности штамма При изучении ферментативных свойств штамма сравнивали данные двух тест-систем API-50 CHL и АНАЭРОТЕСТ - 23. По результатам изучения ферментативных свойств штамма лактобацилл с применением двух тест-систем было обнаружено, что заявляемый штамм ферментирует глюкозу, галактозу, сахарозу, салицин, трегалозу, мальтозу, целобиозу, лактозу, мочевину, замедленно ферментирует рамнозу, ксилозу, D-арабинозу.

Оптимальная температура культивирования - 37-40°С. В качестве сред для культивирования штамма используют обезжиренное молоко, среду Блаурокка, ГМ - среду, МРС, МРС-2, МРС-4 и другие. Выделенный антагонистически активный штамм фенотипически апатогенный, т.е. не обладает гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью. Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев. Штамм не является генетически модифицированным, имеет статус GRAS (generally recognized as safe), относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах СП 1.3.2322-08 и СП 1.3.2518-09. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

7. Изучение антагонистической активности штамма.

Изучение антагонистической активности штамма проводили согласно МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. В качестве штамма - прототипа использовался штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В 3141, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 3.

Из представленной таблицы видно, что заявляемый штамм проявляет более высокую антагонистическую активность в отношении основных патогенных микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления.

Для подтверждения высокой активности сквашивания заявляемого штамма по сравнению со штаммом-прототипом, в качестве которого использовался штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ВКПМ В 3141, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, лиофилизаты каждого штамма в объеме 0,1% вносили в восстановленное сухое молоко. При этом наблюдаемый период лаг-фазы у заявляемого штамма был значительно короче (2,5 часа), чем у штамма-прототипа (4,5-5 часов), что является важным условием для промышленного производства кисломолочной продукции.

Аналогичным образом изучалась скорость накопления биомассы у заявляемого штамма и штамма-прототипа, которая также показала, что оптическая плотность роста культуры заявляемого штамма через 12 часов культивирования в питательной среде на основе гидролизата сухого обезжиренного молока (СОМ) достигала 18 ОД, в то время как у штамма-прототипа она составляла 9 ОД., т.е. была выше в два раза. Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления производственной закваски прямого внесения на первом этапе получали посевной материал для засева в заквасочник, для этого ресуспендировали ампулу лиофилизированной культуры штамма, а полученную суспензию вносили в кобылье, козье или коровье цельное или восстановленное обезжиренное сухое молоко и инкубировали при температуре 37°С 24 часа.

Полученную культуру использовали в качестве посевного материала в ферментер. Посевной материал вносили в количестве 5-7% от объема молока. Время инкубации: 5-7 ч.

Пример 2. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления йогурта.

Для приготовления йогурта использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 в количестве 0,1% вместе с лиофилизатом штамма Streptococcus thermophillus Т-5367 (депонирован в ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под коллекционным номером 1266) также в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,5. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.

Пример 3. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления сметаны.

Для приготовления сметаны использовали сливки с массовой долей жира 10, 15, 20, 25%, полученные путем сепарирования натурального или сухого восстановленного молока добавлением цельного обезжиренного молока или пахты. Далее проводили пастеризацию при температуре 86°С в течение 5 мин. Гомогенезировали и охлаждали до температуры 38°С и вносили закваску в количестве 5-10% от массы сливок. В качестве закваски использовали неслизеобразующие молочнокислые бактерии вида Streptococcus cremoris (штамм приобретен во ВНИМИ) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 в соотношении 1:9. Заквашенные сливки перемешивали в течение 15 мин и оставляли в покое для сквашивания. Сливки сквашивали до образования сгустка и достижения кислотности 60°Т, затем охлаждали до 17°С. Фасовку в тару осуществляют перед сквашиванием продукта или после его сквашивания.

Пример 4. Получение сухой лиофилизированной микробной массы. Для получения сухой лиофилизированной микробной массы жидкую биомассу, выращенную на гидролизатно-молочной среде, концентрировали методом центрифугирования, добавляли 10-12% об. концентрированной защитной среды на основе сахарозы и желатины и 12-15% об. восстановленного 12% сухого молока и проводили лиофильное высушивание.

Полученный лиофилизат может быть использован в качестве компонента комплексной закваски прямого внесения для производства кисломолочной продукции.

Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в качестве компонента закваски прямого внесения.

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 выделен из Якутского кумыса и используется в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов. Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1277. Предлагаемый к использованию штамм обладает быстрым набором биомассы при культивировании, высокой антагонистической активностью и укороченной лаг-фазой при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида. 3 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus К 1903, депонированный в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером №1277 и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.