Штамм бактерий Bacillus subtilis Б-94 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при вегетации и хранении, повышения урожайности и улучшения качества клубней Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической защите растений и сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой штамм, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, обладающих фунгицидным и бактерицидным действием, может использоваться для получения биопрепарата для защиты от грибных и бактериальных болезней картофеля в период вегетации и хранения урожая, а также повышения урожайности и улучшения качества клубней.

В настоящее время ведущее место в защите картофеля от фитопатогенов при выращивании и хранении занимает химический метод. Однако широкое использование химических средств защиты часто приводит к отрицательным последствиям - нарушению структуры биоценозов, снижению их способности к саморегуляции, накоплению токсичных остатков пестицидов в почве, воде и продуктах питания. Кроме того, возрастает устойчивость популяций фитопатогенных грибов и бактерий к химическим фунгицидам, что снижает эффективность их применения.

Анализ отечественной и зарубежной научно-технической литературы показал, что микробиологический контроль может успешно конкурировать с химическими средствами защиты, не обладая в то же время их недостатками. Микробиометод обладает значительными экономическими преимуществами и не использует невозобновляемые природные ресурсы. Сравнительно новое направление в развитии биоконтроля - применение биопрепаратов на основе активных штаммов антагонистов при хранении продукции растениеводства и улучшения ее качества.

Известны штаммы Bacillus subtilis - продуценты ряда биологических фунгицидов - Витаплана, Фитоспорина, Алирина-Б, Гамаира, Бактофита, Альбита и т.д. («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2019). Используемые в них штаммы обладают низкой биологической эффективностью в условиях овощехранилищ и не обеспечивают комплексную эффективную защиту растениеводческой продукции от болезней в период вегетации и при хранении урожая. В «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» отсутствуют биопрепараты, рекомендованные для защиты картофеля от болезней в условиях хранилища.

Известно применение Bacillus subtilis штамм 413 для снижения потерь моркови от инфекционных заболеваний и улучшения показателей качества продукции при длительном холодильном хранении (Самусенко, 2001).

Известны штаммы В. subtilis штамм В-10 ВИЗР (патент РФ №2081167, 1997) - продуцент препарата Алирин-Б и В. subtilis штамм М-22 ВИЗР (патент РФ №2084152, 1997) - продуцент препарата Гамаир для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2019). Но эти штаммы имеют более узкий спектр действия и недостаточную биологическую эффективность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий в условиях низкой температуры при длительном хранении растениеводческой продукции. Алирин-Б и Гамаир рекомедованы к применению на картофеле только в период вегетации против «черной ножки», ризоктониоза, фитофтороза и альтернариоза.

Наиболее близкий аналог, принятый за прототип - штамм Bacillus subtilis - Б 93 ВИЗР (патент РФ №2538157, 2015) обладающий высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий и перспективный в качестве продуцента биопрепарата для защиты картофеля от болезней при хранении. Недостатком известного изобретения является низкая биологическая эффективность штамма в защите растений картофеля в период вегетации, а также отсутствие положительного влияния на качество клубней.

Задача изобретения - создание штамма, обладающего широким спектром действия и высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля и обеспечивающего комплексную защиту от болезней растений картофеля в период вегетации и при хранении клубней, увеличивающего урожайность картофеля и улучшающего качество клубней.

Задача была выполнена путем ступенчатого отбора активных изолятов из моноклоновых рассевов штамма Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР, продуцирующего комплекс биологически активных веществ, обладающих высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей ФГБНУ ВИЗР. Исходный штамм выделен из почв Индии (Дели) по признакам антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Идентификация штамма проведена по определителю бактерий Берджи (Хоулт Д., Криг И. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.9-е издание. Издательство Мир. 1997).

ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ

1. Морфология: Прямые палочки, с закругленными концами, часто образуют цепочки.

2. Размер: 0,8-0,9x2,5-3,5 мкм.

3. Клеточная стенка и окраска по Граму: грамположительные, клеточная стенка толстая грамположительного типа (метод анализа окраска генциановым красителем и йодистым раствором по Граму). Капсулы не образует.

4. Спорообразование: эндоспоры овальные, с центральным положением, термоустойчивые, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным условиям окружающей среды. В клетке образуется не более одной споры. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено. Спорообразование не подавляется на воздухе.

5. Тип деления: поперечное бинарное.

6. Простеки: отсутствуют.

7. Подвижность: подвижные.

8. Жгутикование: перитрихиальные жгутики.

9. Пигментация колоний: колонии кремовые, матовые, плоские, с неровным краем, быстро распространяющиеся по поверхности питательной среды, в дальнейшем колонии уплотняются, становятся блестящими и приобретают коричневато-бежевый оттенок.

10. Пигмент в среду не выделяется.

11. Селективных сред нет.

12. Оксидаза: положителен.

13. Каталаза: положителен.

14. Отношение к кислороду: аэроб. В анаэробном агаре не растет.

15. Хемоорганотроф, метаболизм дыхательного типа. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, сахароза, маннит, мальтоза и лактоза. При использовании глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита образует кислоту и ацетоин, газа не образует. Образует гидролазы. Гидролизует крахмал и казеин. Восстанавливает нитрат до нитритов.

16. В аэробных условиях на сорбите и инозите не растет.

17. Неорганические субстраты не окисляет.

18-20. В анаэробных условиях не растет.

21. Отношение к рН: штамм растет в диапазоне рН от 4,5 до 8,5. Оптимальный рН=6,5-7,5.

23. Отношение к NaCl: культура не растет при 10% NaCl.

24. Отношение к температуре: максимальная температура роста 45-50°С, минимальная 2-4°С, оптимальная - 22-26°С.

25. Отношение к антибиотикам: образует полипептидные и полиеновые антибиотики.

26. Цитохромы: не определяли.

27. Менахиноны: не определяли.

28. % ГЦ: не определяли.

29. Потребность в факторах роста или специальных добавках: не требуются.

30. Дополнительные сведения: штамм-продуцент биопрепарата для защиты вегетирующих растений и клубней картофеля от фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей болезней, повышения урожайности и улучшения качества клубней. Способ определения активности продукта: биологический по подавлению роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий.

31. Способ хранения штамма:

а) косяки со средой СПА или МПА.

б) в лиофилизированном состоянии.

32. Сроки хранения: пересевы через 6 месяцев.

33. Отношение к фагам: фаг не выделяли.

34. Генетические особенности: проведено генотипирование штамма методом ДРИМ (двойное расщепление, избирательное мечение).

Антимикробный спектр: Подавляет рост фитопатогенных грибов и бактерий.

Зоны задержки роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий (радиус в мм):

Fusarium sambucinum - 35.0

F. solani var. coeruleum - 22.0

F. avenaceum - 24.5

Fusarium oxysporum - 35.0

Rhizoctonia solani - 28.0

Alternaria brassicicola - 25.0

Colletotrichum lagenarium - 25.0

Verticillium dahliae - 25.5

Sclerotinia sclerotiorum - 25.0

Phoma exigua - 24.0

Bipolaris sorokiniana - 25.0

Helmintosporium solani - 30.0

Pythium debarianum - 17.0

Ascochytafabae - 22.0

Septoria nodorum - 25.0

Rhizoctonia solani - 28.0

Phytophthora infestans - 34.0

Pectobacterium carotovorum var. sepedonicum - 25.0

Clavibacter. michiganensis var. sepedonicum - 30.0.

По сравнению с прототипом предложенный штамм обладает более широким спектром действия в отношении возбудителей грибных заболеваний и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий (табл.1).

Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.

Пример 1. Культивирование штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера в течение 72 часов на круговой качалке при 28°С до завершения фазы споруляции.

Состав жидкой питательной среды (г/л) (практикум по микробиологии под ред. Егорова Н.С., 1976):

Панкреатический гидролизат кильки 10,05; натрия хлорид 4,95; глюкоза 10,0; вода - до 1 литра; рН 7,1±0,2 стерилизация 0,5атм/30 мин.

Определение антагонистической активности 3-суточной культуральной жидкости, полученной при глубинном выращивании штамма, проводили стандартным микробиологическим методом лунок (Практикум по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1976; Руководство к практическим занятиям по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1995). Диаметр зоны задержки роста измеряли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-культуры. Эффективность в отношении фитопатогенных грибов и спектр действия по сравнению с прототипом представлены в табл. 1.

Как видно из таблицы 1, штамм В. subtilis Б-94 ВИЗР ВИЗР, в отличие от прототипа, обладает более высокой антигрибной и антибактериальной активностью. Существенно выше у предлагаемого штамма антагонистическая активность в отношении фитопатогенных бактерий Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Clavibacter michiganensis var. sepedonicum, Pseudomonas corrugata и грибов Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Phoma exigua. Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Ascochyta fabae.

Пример 2.

Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР ВИЗР получали так же, как в примере 1. Изучение биологической эффективности в модельных опытах и в картофелехранилище осуществляли в соответствии со стандартными методиками, изложенными в следующих пособиях: «Методика исследований по культуре картофеля», М., 1967; «Методика полевого опыта», М, 1985; «Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур» /М., 1965/; «Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету», М., 1995; «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.

Закладка образцов клубней картофеля на длительное хранение с целью оценки биологической эффективности штамма в отношении комплекса болезней была проведена в картофелехранилище ГНУ ВНИИКХ (Московская область, Люберецкий район, п. Красково, микрорайон Коренево).

В опыте использовали клубни сорта Сантэ (среднеранний, универсального использования). Урожайность высокая. Сорт устойчив к раку картофеля (возбудитель Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis), вирусным болезням, восприимчив по ботве к фитофторозу. Среднеустойчив к обыкновенной парше, восприимчив к ризоктониозу и фомозу. Набор материала для проведения опытов был произведен через 3 дня после уборки урожая. Перед обработкой и закладкой на хранение проводили клубневой анализ с целью определения фитопатологического состояния картофеля. Перед закладкой на хранение клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости штамма с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. Расход рабочей жидкости - 3 л/т. Масса образца клубней картофеля составляла 5 кг. Повторность опыта - 10-кратная. Общая масса клубней каждого варианта 50 кг. Место размещения образцов: в насыпи картофеля на глубине 20-30 от поверхности.

По окончании периода хранения в марте 2019 года был проведен клубневой анализ, и определены пораженность болезнями и потери массы картофеля при хранении (таблицы 2-3).

Отмечено существенное снижение развития болезней на клубнях семенного картофеля после обработки штаммом В. subtilis Б-94 ВИЗР ВИЗР, и стандартом Максим, КС по сравнению с контролем. Количество здоровых клубней после применения штамма достигало 35.4-40.5%, в то время как в прототипе этот показатель составлял 25,4%, в контроле не превышал 13.5%. Таким образом, по сравнению с контролем выход здоровой продукции увеличился в 3.0 раза. Обработка штаммом эффективно снижала пораженность клубней всеми проявившимися заболеваниями, за исключением парши обыкновенной. Наибольший эффект штамм проявил в отношении возбудителей кольцевой и сухой гнилей картофеля. В варианте с применением штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР распространенность кольцевой гнили составила 3.6-3.9%, сухой гнили - 0.1-7.0%, что значительно ниже этих показателей у штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР (прототип) - 5.0% и 13.1% и стандарта фунгицида Максим, КС - 9.5 и 12.2%, соответственно.

Таким образом, анализ результатов опыта показал, что обработка клубней штаммом В. subtilis Б-94 ВИЗР перед закладкой на хранение в картофелехранилище уменьшало количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышало выход здорового картофеля в 3-3.5 раза. Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза была существенно выше эффективности прототипа и стандартного фунгицида Максим, КС.

Пример 3. В полевых опытах была изучена эффективность штамма Bacillus subtilis Б-94 ВИЗР против ризоктониоза (Rhizoctonia spp.), альтернариоза (Alternaria spp.) и фитофтороза (Phytophthora infestans) на картофеле сорта Светлячок 1. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР получали так же, как в примере 1 и 2. В течение периода вегетации растения обрабатывали разведениями культуральной жидкости штамма с титром жизнеспособных клеток 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл (табл. 4). Норма высева семян: 3,0 т/га. Дата посадки: 25.04, дата появления всходов 15.05. Фаза развития растений в момент обработки: 0 (клубни), опрыскивания: смыкание рядков, окончание цветения. Обработка почвы: дискование, вспашка, боронование, сплошная культивация, ручная посадка, двукратное рыхление междурядий. Удобрения: аммиачная селитра - 100 кг/га при поливе. Мероприятия по уходу за опытными делянками: один полив в период вегетации путем дождевания, окучивание кустов, двукратное рыхление в рядках, обработка против вредителей.

Размер делянок и их размещение: 25 м², рендомизированное. Количество повторений: 4, срок обработки: 20.04; 20.05; 5.06. Кратность обработки: клубни 1 - кратно, опрыскивание суспензией препарата в период вегетации - 2-кратно. Используемая аппаратура: ранцевый опрыскиватель типа ОРИ. Расход рабочей жидкости: 10 л/т (протравливание), 300 л/га (опрыскивание).

Даты учетов: 6.06; 18.07. Дата появления болезней: 20.05 (ризоктониоз); 5.06 (альтернариоз); 25.06 (фитофтороз). Способ уборки и учет урожая: вручную с каждого варианта. Дата уборки урожая: 20 июля.

Результаты испытаний показали, что против фитофтороза картофеля эффективность штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР при 2-х концентрациях суспензии и химического стандарта была примерно одинаковой (таблица 5). При титре 10⁹ КОЕ/мл она составила 62,5%, при титре 10⁸ КОЕ/мл - 57,5%; в стандарте Максим, КС - 42,9% при развитии болезни в контроле 28,0%. При нарастании развития болезни в контроле до 38,5% эффективность штамма при титре 10⁸ КОЕ/мл снизилась и составила 42,9%, при титре 10⁹ КОЕ/мл немного повысилась (68,8%), эффективность стандарта снизилась до 31,2%. Эффективность прототипа существенно уступала эффективности штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР и не превышала 15,6-26,8%.

Против альтернариоза лучшие результаты получены при титре суспензии 10⁹ КОЕ/мл (54,5-66,7%), превышающие эффективность стандарта (43,2-45,4%). Эффективность штамма при титре 10⁸ КОЕ/мл составила 29,5-40,6%. Развитие болезни в контроле в течение периода наблюдений увеличилась от 22,0 до 42,1%. В отношении альтернариоза эффективность прототипа была ниже (18,2-38,2%)

Результаты испытаний показали, что 2-кратное опрыскивание растений картофеля суспензией штамма в обеих концентрациях на фоне обработки клубней была эффективна против ризоктониоза стеблей. Максимальная эффективность против данного заболевания была получена в варианте с титром 10⁹ КОЕ/мл (70,9%) при развитии болезни в контроле 31,6%. Эффективность при титре 10⁸ КОЕ/мл была ниже 47,8%. Эффективность стандарта Максим, КС составляла 77,8%. Эффективность прототипа уступала предлагаемому штамму и составляла 39,2%.

Эффективность прототипа (штамм В. subtilis Б 93 ВИЗР) в отношении фитофтороза, альтернариоза и ризоктониоза уступала эффективности предлагаемого штамма в течение всего периода вегетации (табл. 5). Прибавка урожая также была ниже, чем в вариантах опыта с использованием штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР и не превышала 38%. Максимальная прибавка урожая была получена в опытном варианте (42-45%) она значительно превышала прибавку урожая в стандарте - 24%.

По результатам проведенного осеннего клубневого анализа полученного урожая биологическая эффективность культуральной жидкости штамма, В.subtilis Б-94 ВИЗР против возбудителей сухих гнилей, кольцевой гнили и ризоктониоза достигала 82-100% и находилась на уровне химического стандарта (таблица 5). Эффективность прототипа была ниже на 10%.

Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность отобранного штамма В. subtilis В. subtilis Б-94 ВИЗР и перспективность его использования в качестве продуцента биопрепарата для защиты клубней картофеля от комплекса болезней в период вегетации и при хранении урожая путем предпосадочной обработки клубней суспензией с титром 10⁸-10⁹ КОЕ/мл и опрыскивании в период вегетации при норме расхода рабочей жидкости 300 л/га, 2-кратно.

Пример 4. Урожай клубней, полученных в полевом опыте, описанном в Примере 3, был проанализированы по показателям качества. Анализы проведены по следующим методикам: Определение сухого вещества в свежем материале.

Для определения содержания сухих веществ в клубнях используется термостатно-весовой метод. Исследуемую пробу листьев или клубней хорошо измельчают, тщательно перемешивают и разравнивают тонким слоем. Из разных мест подготовленного слоя берут 2 навески по 25-50 г в высушенные до постоянного веса стаканчики.

Предварительную сушку материала проводят в сушильном шкафу при температуре 50-60°С в течение 4 часов, после этого навеску продолжают сушить при температуре 100-105°С еще 3-4 часа. Затем стаканчики с навесками охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Повторное высушивание продолжается 2 часа. Затем стаканчики снова взвешивают. Высушивание продолжается до постоянного веса. Количество сухого вещества определяют по формуле:

где

В - вес навески свежего материала,

Д - вес абсолютно сухого материала.

Определение содержания крахмала по удельному весу.

Удельный вес клубней определяют взвешиванием их в воздухе и в воде и рассчитывают по формуле:

где

А - вес клубней картофеля в воздухе (г),

В - вес клубней картофеля в воде (г)

Перед отбором и взвешиванием образца клубни тщательно моют и высушивают на воздухе. Используют только визуально здоровый не поврежденный картофель. Для взвешивания пользуются специально оборудованными лабораторными весами с сеточкой (или корзинкой) для погружения клубней в воду. При взвешивании в воде обращают внимание на ее температуру и образующиеся на поверхности клубней пузырьки воздуха, которые следует удалить, что достигается движением корзины вверх и вниз. Вода, в которую погружают клубни, должна быть чистой и иметь температуру 17-18°С. После расчета формулы по специальной таблице определяют процент крахмала в клубнях картофеля.

Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях (по Мурри).

Метод основан на переведении аскорбиновой кислоты в раствор и на способности ее восстанавливать в кислой среде индикатор синего цвета 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия до лейкоформы, при этом аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту. Реакция идет за счет фермента аскорбатоксидазы: чем выше содержание аскорбиновой кислоты, тем выше активность фермента аскорбатоксидазы.

Навеску растительного материала (клубни картофеля) 5 г растирают в ступке с 20 мл 1%-го раствора соляной кислоты не более 10 минут. Полученную массу переносят по воронке в мерную колбу на 100 мл с 1%-м раствором щавелевой кислоты. Доводят раствор в колбе до метки щавелевой кислотой. Колбу несколько раз сильно встряхивают и оставляют стоять на 15 минут для осаждения белков. Содержимое колбы отфильтровывают, из фильтрата берут по 10 мл раствора в три стакана, содержимое в стаканах оттитровывают из микробюретки 0,001 Н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия (краска Тильманса) до розовой окраски, которая не исчезает в течение 1 минуты. Расчет содержания аскорбиновой кислоты производят по формуле:

где

X - содержание аскорбиновой кислоты в мг на 100 г вещества;

а - число краски, ушедшей на титрование, мл;

Т - титр краски Тильманса (0,14);

V - объем мерной колбы с экстрактом;

в - число экстракта, взятого для титрования, мл;

с - навеска исследуемого материала, г.

Определение содержания редуцирующих сахаров проводят по методу Самнера.

Метод основан на способности редуцирующих сахаров давать окрашенные соединения с 3,5-динитросалициловой кислотой.

Для анализа из средней пробы берут 10-15 клубней картофеля. Клубни, отмытые и просушенные на воздухе, разрезают вдоль осевой линии на две или более частей. Из каждой части отбирают сегменты для анализа так, чтобы они отображали все зоны анализируемого клубня. Затем отобранные части измельчают на терке или гомогенизаторе и перемешивают.

Навеску картофельной мезги в количестве 5 г помещаем в баночку (или колбочку), приливаем 50 мл дистиллированной воды нагретой до температуры 60-70°С и ставим для встряхивания на 10 мин. на качалку. Затем раствор фильтруем через обычный фильтр (или центрифугируем). 1 мл отфильтрованного раствора переносим в пробирку, добавляем 1 мл реактива Самнера и кипятим на водяной бане 5 мин. Одновременно с опытными образцами на штатив ставим контрольный - пробирка с 1 мл Самнера и 1 мл дистиллированной воды. После 5 мин кипячения штатив с пробирками охлаждаем в холодной воде. Затем в каждую пробирку приливаем 15 мл дистиллированной воды, хорошо перемешиваем и смотрим на ФЭКе при длине волны 540 нм.

Количество Сахаров определяют по формуле:

редуцирующие сахара, % = а×V×100/Н×1000, где

а - количество сахаров, найденное по калибровочной кривой, мг;

V - общий объем фильтрата (50 мл);

Н - навеска (5 г);

1000 - коэффициент для перевода мг в г.

Построение графика на сахара. 2,5 г глюкозы растворяем в воде (мерная колба на 50 мл). 1 мл полученного раствора содержит 50 мг глюкозы. В мерные колбы на 100 мл помещаем следующее количество исходного раствора: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл. Доводим до метки дистилированной водой. Перемешиваем. Далее из колбочек набираем в пробирки по 1 мл рабочего раствора, добавляем по 1 мл реактива Самнера. Кипятим на водяной бане 5 мин. Охлаждаем в холодной воде. Добавляем 15 мл дистиллированной воды, перемешиваем и смотрим на ФЭКе при длине волны 540 нм.

Приготовление реактива Самнера. Для приготовления 100 мл реактива Самнера необходимо 1,6 г NaOH, 30 г K-Na-виннокислого, 1 г 3,5 динитросалициловой кислоты растворить в дистиллированной воде и довести до метки (для лучшего растворения приготовляемый раствор подогревают на водяной бане).

Ионометрический метод определения нитратов в растительных образцах.

Метод основан на извлечении нитратов раствором алюмокалиевых квасцов с последующим измерением концентрации нитратов с помощью ионоселективного нитратного электрода и является экспрессным.

Проводят подготовку электродов к работе. Для этого мембранный нитратный ионоселективный электрод и хлорсеребряный электрод готовят к работе в соответствии с инструкцией, прилагаемой к электродам.

Перед началом работы мембрану ионоселективного электрода вымачивают в течение 24 ч в растворе азотнокислого калия или азотнокислого натрия C_NO3- = 0,1 моль/дм³ при температуре (20±5)°С.

Между измерениями электрод хранят в растворе сравнения C_NO3- = 0,0001 моль/дм³. При длительных перерывах в работе электрод хранят сухим; перед измерением электрод вымачивают в течение 1-2 ч в растворе сравнения C_NO3- = 0,1 моль/дм³. Вспомогательный хлорсеребряный электрод хранят в воде.

Градуировочный график строят следующим образом: основной раствор азотнокислого калия или азотнокислого натрия готовится в день проведения испытания. Для приготовления основного раствора азотнокислого калия или азотнокислого натрия с(NO₃) = 0,1 моль/дм³ (pC_NO3= - LgC = 1) берут 10,110 г азотнокислого калия или 8,500 г азотнокислого натрия растворяют в растворе алюмокалиевых квасцов и доводят объем до 1000 см³ этим раствором. Раствор хранят не более одного года. При появлении мути или осадка раствор заменяют свежеприготовленным.

Раствор сравнения с(NO₃)=0,01 моль/дм³ (pC_NO3= - LgC = 2): готовится из основного раствора с(NO₃) = 0,1 моль/дм³ разведением в 10 раз. Для этого отбирают пипеткой 10 см³ основного раствора, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до 100 см³ раствором алюмокалиевых квасцов, перемешивают. Раствор алюмокалиевых квасцов используют для всех последующих разведений.

Раствор сравнения с(NO₃^-) = 0,001 молъ/дм³ (pC_NO3= - LgC = 3): готовят в день проведения испытания разведением в 10 раз раствора с(NO₃) = 0,01 моль/дм³.

Раствор сравнения c(NO₃^-)=0,0001 молъ/дм³ (pC_NO3^-= - LgC = 4): готовят в день проведения испытания разведением в 10 раз раствора с(NO₃) = 0,001 моль/дм³.

Измерение потенциалов Е(мВ) в растворах сравнения на иономере. Нитратный электрод подключают на задней панели прибора к гнезду «Изм», а хлорсеребряный электрод - к гнезду «Всп». Электроды погружают в испытуемую пробу и проводят определение потенциала электродной пары Е, мВ, при этом клавишу «Род работ» ставят в положение «мВ», после измерения отключают сеть нажатием клавиши «t».

Перед каждым измерением раствора сравнения или испытуемого раствора электроды промывают несколько раз водой, осушают фильтровальной бумагой, промывают раствором сравнения или испытуемым раствором и лишь затем погружают в измеряемый раствор. Показания прибора считывают не ранее чем через 1 мин после прекращения дрейфа показания прибора. Определение испытуемых проб проводят одновременно с калибровкой электродов.

Калибровку электродов проводят путем измерения потенциалов Е, мВ, в растворах сравнения, приготовленных при комнатной температуре. Измерение проводят, начиная с растворов низких концентраций, промывая каждый раз электрод раствором более высокой концентрации. Результаты измерений записывают в таблицу 7.

По полученным результатам строят градуировочный график. По оси абсцисс откладывают значения pC_NO3^-, соответствующие растворам сравнения азотнокислого калия или азотнокислого натрия:

- с(NO₃) = 0,1 моль/дм³ (pC_NO3 = 1);

- c(NO₃) = 0,01 моль/дм³ (pC_NO3 = 2);

- c(NO₃) = 0,001 моль/дм³ (pC_NO3 = 3);

- c(NO₃) = 0,0001 моль/дм³ (pC_NO3 = 4).

По оси ординат соответствующее значение потенциала, Е, мВ.

Калибровку электродов проверяют не менее трех раз в течение рабочего дня, используя каждый раз свежие порции растворов сравнения.

Электрод имеет линейную функцию в диапазоне pC_NO3 от 1 до 4 с наклоном (56±3) мВ на единицу pC_NO3 при температуре 25±5°С. Если характеристика электрода отличается от заданной, электрод не пригоден к работе.

На фиг. 1 приведен График зависимости потенциала Е(мВ) от концентрации NO₃^-(pC_NO3).

Процесс проведения анализа: анализируемый продукт (клубни картофеля) в количестве 10 г измельчают, помещают в плоскодонную или коническую колбу, приливают 50 см³ раствора алюмокалиевых квасцов, закрывают пробкой и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 5 минут, помещают в стеклянный стаканчик, погружают в нее электроды и измеряют потенциал электродной пары Е, мВ. По полученному значению Е по градуировочному графику находят значение pC_NO3.

Обработка результатов: содержание нитратов, мг/кг, или массовую концентрацию, мг/дм³, находят по значению pC_NO3 в специальных таблицах (6). За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми по отношению к среднему арифметическому при

Р = 0,95 не должно превышать:

30 - при содержании нитратов до 200 мг/кг;

25 - при содержании нитратов от 200 мг/кг и выше.

Для оценки вкусовых и пищевых качеств клубней картофеля чистые неочищенные клубни варят без соли. Окончание варки определяют специально приготовленной деревянной палочкой. Сварившиеся клубни выкладывают в тарелки и в горячем виде оценивают на вкус, консистенцию мякоти, разваримость, запах, цвет мякоти, потемнение.

Оценка вкуса производится по 5-балльной схеме: отличный - 5 баллов; очень хороший - 4 балла; хороший - 3 балла; удовлетворительный - 2 балла; плохой - 1 балл.

Потемнение мякоти клубня и цвет мякоти вареных клубней оценивается сразу после варки и в холодном виде примерно через 1,5-2 часа: поверхность и мякоть клубней не потемнели - 3 балла; потемнели слабо - 2 балла; потемнели сильно - 1 балл.

Данные проведенных анализов представлены в таблице 8. Как видно из таблицы, применение штамма В. subtilis Б-94 ВИЗР для обработки клубней и опрыскивания растений в период вегетации существенно повлияло на потребительские качества урожая в период хранения. Содержание сухих веществ в клубнях было на 14,6-33,5%, крахмала на 8,2-10,5%, сахаров - на 25,0-90,0% больше по сравнению с контролем. Содержание нитратов в клубнях было на 23,5-69,1% ниже, чем в контроле. Применение штамма улучшило вкусовые качества картофеля. Обработка клубней и растений картофеля культуральной жидкостью штамма-прототипа была менее эффективной: содержание сухих веществ было выше только на 1,9%, а сахаров на 5% по сравнению с контролем. Содержание крахмала осталось на уровне контроля, концентрация нитратов была ниже только на 10,2%. Применение химических фунгицидов в качестве стандарта не улучшило качество клубней.

Потемнения мякоти клубня сразу после варки и в холодном виде через 2 часа не отмечено.

Литература

1. Н.В. Самусенко. Научное обоснование применения бактерий-антагонистов при длительном холодильном хранении корнеплодов моркови. Дис. к.т.н., Санкт-Петербург, 2001.

2. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ, 2014. www.mcx.ru.

3. Методика исследований по культуре картофеля. М., ВАСХНИП, НИИКХ, 1967, 189 с.

4. Б.А. Доспехов. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.

5. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М., 1985. 130 с.

6. Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету. М., ВНИИКХ, 1995. - 105 с.

7. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве. - Санкт-Петербург. - 2009. - 377 с.

8. И.И. Новикова; А.И. Литвиненко А.И., Т.А. Нугманова, Г.В. Калько. Штамм бактерии Bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов. Патент РФ №2081167, дата подачи заявки 08.04.1994, дата публикации 10.06.1997.

9. И.И. Новикова, Г.А. Быкова, М.Е. Сергеева, В.А. Павлюшин. Штамм бактерии Bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий. Патент РФ №2084152, дата подачи заявки 10.10.1994, дата публикации 20.07.1997.

10. И.И. Новикова, И.В. Бойкова, В.А. Павлюшин, В.Н. Зейрук. Штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении. Патент РФ №2538157, дата подачи заявки 27.11.2013 г., дата публикации 10.01.2015.

11. Практикум по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. - М.: МГУ, 1976. - 308 с.

12. М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова, А.И. Нетрусов, Е.В. Семенова, Н.Н. Колотилова, Л.М. Захарчук, В.В. Зинченко, С.И. Мыльникова, М.В. Нефедова, И.В. Ботвинко. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с. Методика исследований по культуре картофеля (под ред. Андрюшиной Н.А., Бацанова Н.С.) - М. - 1967. - 264 с.

13. Методические положения по проведению оценки сортов картофеля на испытательных (тестовых) участках - М., ГНУ ВНИИКХ Россель-хозакадемии - 2013. - 15 с.

14. Методика физиолого-биохимических исследований картофеля (под ред. Кирюхана В.П., Ладыгиной Е.А., Чеголиной М.М., Парфеновой А.В.) - М. - 1989. - 144 с.

15. Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство Мир. 1997.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма как основы для получения биопрепаратов для выращивания сельскохозяйственной продукции. Новый штамм В. subtilis Б-94 ВИЗР, обладающий высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий, перспективен в качестве продуцента биопрепарата для защиты картофеля от болезней в период вегетации и при хранении клубней, повышения урожайности и улучшения качества клубней. Штамм В. subtilis Б-94 ВИЗР депонирован в Коллекции ВИЗР, активен в отношении альтернариоза, фитофтороза и ризоктониоза. Биологическая эффективность штамма в период вегетации в отношении комплекса болезней составляет 60-70%. Применение штамма существенно улучшает потребительские качества клубней при хранении. 9 табл., 4 пр., 1 ил.

Штамм бактерий B. subtilis Б-94 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при вегетации и хранении, повышения урожайности и улучшения потребительских качеств клубней.