ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ ФУНГИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ ОТ ГРИБНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ПЕРИОД ХРАНЕНИЯ НА ОСНОВЕ БИОМАССЫ ЭТОГО ШТАММА Российский патент 2004 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/13 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству и применению биологических средств борьбы с возбудителями болезней растений.

Одной из серьезных проблем сельского хозяйства является сохранение урожая овощных культур, картофеля, зерновых и фруктов. Болезни, вызываемые микроскопическими грибами, приводят к серьезным экономическим потерям, в том числе, за счет загрязнения микотоксинами, потери товарного вида. Картофель является одной из основных производственных культур. Фитопатогенные грибы поражают картофель на протяжении всего периода вегетации и во время хранения клубней. При хранении картофеля теряется до 30% собранного урожая. Основной причиной гибели картофеля в период хранения являются гнили грибного происхождения. Болезни, вызываемые фитопатогенными грибами, также снижают качество продовольственного и семенного картофеля. Зараженный посадочный материал становится источником заболевания картофеля в период вегетации. Для защиты от фитопатогенов проводят обеззараживание химическими фунгицидами клубней в процессе закладки урожая картофеля на хранение, что существенно снижает зараженность клубней возбудителями грибных болезней. В качестве химических протравителей клубней применяют ряд препаратов, в том числе Картоцид, Текто, Максим. Однако химические фунгициды обладают рядом недостатков. К основным негативным факторам относятся неспецифичность действия, загрязнение окружающей среды, накопление в окружающей среде, возникновение устойчивости у возбудителей болезней. Особую опасность представляют химические фунгициды, применяемые для обработки готовой сельскохозяйственной продукции, поскольку известно отрицательное влияние химических препаратов на человека и животных. В качестве альтернативных средств защиты растений могут быть использованы биологические фунгицидные препараты, основу которых составляют штаммы микроорганизмов, проявляющих антагонистическую активность по отношению к различным фитопатогенным грибам. Так, описаны бактериальные фунгициды пептидной природы - сурфактины, итурины, плипастатин, бацилломицин (1-5). Механизм фунгицидного действия пептидов обусловлен либо лизисом клеток, либо подавлением синтеза компонентов клеточных стенок. Ряд штаммов В. cereus продуцируют антибиотик звиттермицин, оказывающий ингибирующий эффект на фитопатогенные грибы (6).

Биологические препараты на основе микроорганизмов, продуцирующие антагонистические факторы, также могут быть использованы для борьбы с фитопатогенньми грибами, поражающими клубни картофеля при хранении. Учитывая, что в России на хранение закладывается свыше 3 млн. тонн клубней картофеля, проблема защиты картофеля от грибных болезней является весьма важной. Известен биологический препарат “Бактофит”, созданный на основе штамма В. subtilis ИПМ 215 (7). Препарат рекомендован для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение для защиты от фузариозного увядания, фитофтороза и ризоктониоза (8). Препарат “Бактофит” и составляющий его активное начало штамм В. subtilis ИПМ 215 рассмотрены в качестве ближайших аналогов заявляемых объектов.

Задачи заявляемой группы изобретений:

- получить штамм бактерий, обладающий фунгицидным действием против широкого спектра грибных фитопатогенов, в том числе вызывающих заболевания клубней картофеля;

- разработать на его основе эффективный препарат для защиты клубней картофеля от грибных заболеваний в период хранения.

Задача решена путем:

- получения фунгицидного штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767;

- разработки биологического препарата для защиты клубней картофеля от грибных заболеваний в период хранения, включающего биомассу фунгицидного штамма бактерий и целевые добавки, отличающегося тем, что он дополнительно содержит воду, в качестве биомассы фунгицидного штамма бактерий включает биомассу штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, а в качестве целевых добавок - твин-80, глицерин, тридекан, 10%-ный поливиниловый спирт и хинозол при следующем соотношении компонентов, мас.%:

биомасса штамма бактерий

Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 48-57

твин-80 2,5-5,0

глицерин 10-15

тридекан 15-25

поливиниловый спирт 10% 11-15

хинозол 0,01-0,03

вода остальное

Заявляемый штамм выделен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-7767.

Заявляемый штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 имеет следующие характеристики:

1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×2,5-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует на жидких и твердых питательных средах.

В качестве твердых питательных сред использовали агаризованные среды NBY, LB и ДПС.

Состав агаризованной среды NBY, мас.%:

питательный бульон 0,8

дрожжевой экстракт 0,3

агар 2,0

вода остальное

Состав агаризованной среды LB, мас.%:

бакто-триптон 1,0

бакто-дрожжевой экстракт 0,5

NaCl 1,0

агар 2,0

вода остальное

Состав агаризованной среды ДПС, мас.%:

дрожжи 3,0

кукурузная мука 1,5

агар 2,0

вода остальное

При культивировании на агаризованных средах NBY, LB, ДПС через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-4 мм бежевого цвета с шероховатой поверхностью и неровным краем. Через 72 часа роста на указанных питательных средах штамм образует споры. В процессе споруляции образуется каноэвидная структура, примыкающая к споре. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,9-1,2×1,5-1,7 мкм.

2. Физиолого-биохимические свойства.

Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетоина. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизоцима.

3. Фунгицидные свойства штамма.

Штамм характеризуется широким спектром фунгицидной активности и подавляет развитие следующих фитопатогенных грибов: Alternaria tenuis, Fusarium solani, Fusarium nivale, Phomopsis helianthi, Phoma solanicola, Phytophora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum и не подавляет рост грибов-возбудителей болезней зерновых культур (Aspergillus niger, Fusarium graminearum). Аналог заявляемого нами штамма В-7767 штамм В. subtilis ИПМ 215 и разработанный на его основе препарат “Бактофит” обладают значительно более узким спектром фунгицидното действия. “Бактофит” рекомендован для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение для защиты только от фузариозного увядания, фитофтороза и ризоктониоза. Предлагаемый штамм В-7767, кроме возбудителей перечисленных заболеваний, подавляет также развитие грибов-возбудителей фомоза (Phoma solanicola) и альтернариоза (Alternaria tenuis). Оба заболевания клубней картофеля наносят существенный ущерб в процессе хранения.

4. Состав препарата и способ его получения.

На основе заявляемого штамма был разработан препарат для защиты клубней картофеля от грибных заболеваний в период хранения. Биологический фунгицид с содержанием жизнеспособных спор в 1 г препарата 2,5-3,0×10¹⁰, помимо биомассы штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, он дополнительно включает воду и ряд целевых компонентов, придающих препарату необходимые потребительские свойства, как то: эмульсионную структуру, прилипаемость, стабильность. Препарат с эмульсионной структурой включает масло (тридекан), ПАВ (твин-80), прилипатель (поливиниловый спирт) и стабилизатор (глицерин). В качестве консерванта использован хинозол.

Заявляемый препарат имеет форму водосодержащей эмульсии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с сухими формами: экономия энергетических затрат, отсутствие необходимости в сложном технологическом оборудовании и возможность сохранения биологической активности действующего начала в процессе приготовления препарата, а также удобство и простота в процессе его применения.

Способ получения препарата осуществляют путем постепенного добавления ингредиентов в следующем порядке: биомасса, глицерин, твин-80, 10% водный раствор поливинилового спирта, хинозол, при перемешивании системы в течение 10 мин при 900-1000 об/мин после добавления каждого из ингредиентов, затем при непрерывном перемешивании осуществляют введение в систему тридекана капельным методом со скоростью 3 мл/мин. Для получения конечного продукта систему продолжают перемешивать при 900-1000 об/мин в течение еще 30 мин.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus B-7767.

Для культивирования штамма B-7767 используют стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы объемом 750 см³, которые заполняют 50 мл стерильной среды ДПС.

Состав среды ДПС, мас.%:

дрожжи 3,0

кукурузная мука 1,5

вода остальное

рН 6,8-7,0.

В 50 мл стерильной среды ДПС вносят 2 мл посевного материала, который имеет концентрацию 6×10⁸ кл/мл и получен путем выращивания со встряхиванием (250 об/мин) на среде ДПС при температуре 28-30°С в течение 72 часов. Культуру для получения биомассы выращивают в тех же условиях, что и посевной материал. К 96 часам культивирования спорообразование достигает 90%. Титр культуры после 96 часов культивирования составляет 4,0-6,0×10⁸ клеток в мл.

Пример 2.

Оценка фунгицидной активности штамма В-7767 в лабораторных условиях.

Оценку фунгицидной активности заявляемого штамма В-7767 проводили в лабораторных условиях следующим образом. Штамм выращивали как в примере 1. Для анализа фунгицидной активности использовали культуральную жидкость, содержащую 4×10⁸ кл/мл. Тестирование фунгицидной активности проводили методом лунок. Для этого фитопатогенные грибы (табл. 1) высевали на чашки Петри с агаризованной картофельно-сахарозной средой. Картофельно-сахарозный агар получали, добавляя к отвару картофеля сахарозу и агар.

Картофельно-сахарозный агар, мас.%:

сахароза 2,0

агар 2,0

картофельный отвар остальное

В вырезанные в агаре лунки диаметром 8 мм вносили по 1 мл культуральной жидкости штамма ВКПМ В-7767. Эффективность фунгицидного действия заявляемого штамма определяли по диаметру зоны отсутствия роста тест-микроорганизмов. В качестве стандарта считали диаметр зоны отсутствия роста, равный 4-6 мм. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 3.

Определение эффективной концентрации биомассы штамма ВКПМ В-7767 в заявляемом препарате.

Для определения эффективной концентрации биомассы штамма ВКПМ В-7767 в составе заявляемого препарата использовали метод распыления. Для этого фитопатогенные грибы, вызывающие заболевания картофеля в условиях хранения, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Alternaria tenuis, Phoma solanicola высевали на чашки Петри с агаризованной картофельно-сахарозной средой. После начала роста грибов на питательной среде чашки Петри опрыскивали водными суспензиями, содержащими различные концентрации биомассы штамма ВКПМ В-7767 из расчета 1 мл на чашку. В контроле чашки Петри с засеянными грибами опрыскивали водой. Фунгицидный эффект рассчитывали по снижению роста грибов, обработанных суспензией биомассы, по отношении к контролю, который принимали за 100%. В качестве оптимальной принимали концентрацию биомассы, вызывающую подавление роста фитопатогена на 70-80%. Подавление роста фитопатогенных грибов Alternaria tenuis, Phoma solanicola, Fusarium solani и Rhizoctonia solani достигалось при концентрации биомассы штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, равной 20 г/л.

Пример 4.

Определение рабочей дозы заявляемого препарата по его фунгицидной активности.

Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 культивировали как в примере 1, а затем полученную биомассу осаждали центрифугированием при 12000 об/мин и использовали с учетом результатов из примера 3 для приготовления препарата при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биомасса штамма бактерий Brevibacillus

laterosporus ВКПМ В-7767 48

твин-80 2,5

глицерин 10

тридекан 15

10% поливиниловый спирт 11

хинозол 0,01

вода остальное

Приготовление препарата осуществляют следующим образом:

- навеску концентрированной биомассы помещают в химический стакан и перемешивают на мешалке при 900-1000 об/ мин в течение 10 мин;

- затем в биомассу вводят глицерин и перемешивают на мешалке в течение 10 мин при 900-1000 об/мин;

- к полученной системе добавляют твин-80 и опять перемешивают в течение 10 мин при 900-1000 об/мин;

- затем в систему вводят 10% водный раствор поливинилового спирта и осуществляют последующее перемешивание в течение 10 мин при 900-1000 об/мин;

- к полученной системе добавляют хинозол с последующим перемешиванием полученной системы в течение 10 мин при 900-1000 об/мин;

- при непрерывном перемешивании осуществляют введение в систему тридекана капельным методом со скоростью 3 мл/мин;

- для получения конечного продукта систему продолжают перемешивать при 900-1000 об/мин в течение еще 30 мин.

Фунгицидную активность полученного препарата определяли методом опрыскивания, как и при оценке фунгицидных свойств биомассы (пример 3). Внесенные целевые компоненты препаративной формы не изменяли эффективность и спектр фунгицидного действия биомассы штамма. Полученные результаты соответствовали результатам в примере 3.

Результаты лабораторных опытов были экстраполированы на площадь массы картофеля, подвергаемой обработке, что позволило рассчитать дозу препарата, необходимую для защиты 1 т картофеля. Расчетным путем было установлено, что в условиях хранилища для обработки 1 т клубней картофеля необходимо использовать 80-100 г заявляемого препарата в 3 л рабочей жидкости.

Пример 5.

Оценка эффективности защиты заявляемым препаратом клубней картофеля от грибных заболеваний в период хранения в полевых условиях (хранилище).

Эффективность фунгицидного действия препарата в полевых условиях оценивали против гнилей клубней картофеля в период хранения в 2-х точках Центрального района зоны подзолистых и дерново-подзолистых почв таежно-лесной области Российской Федерации. Для оценки использовали свежеубранные партии картофеля. Обработку образцов клубней растворенным в воде препаратом проводили методом опрыскивания не позже, чем через 2 дня после уборки. Была использована норма расхода препарата - 80 г на тонну, рабочей жидкости - 3 л/т. Масса одного опытного образца составляла 10 кг клубней, количество повторностей - 8. Обработанные образцы клубней помещали в сетки и 4 образца (4 повторности) каждого варианта закладывали в массу насыпи картофеля на глубину 1 м для определения эффективности препарата в конце периода хранения. Остальные 4 образца размещали в верхнем слое насыпи для определения эффективности в динамике через 120, 180, 240 дней после обработки. Эффективность препарата устанавливали методом клубневого анализа с учетом всех видов заболеваний, естественной убыли массы, массы абсолютной гнили и технических отходов. Для сравнения использовали химический фунгицид Текто. Сравнительная характеристика эффективности заявляемого препарата и химического препарата Текто (90 мл на тонну) дана в таблице 2.

Проведенные полевые испытания (хранилище) показали, что по эффективности фунгицидного действия предлагаемый биофунгицид практически не уступает химическому препарату Текто, что видно из результатов, приведенных в таблице 2. Таким образом, получен фунгицидный штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, подавляющий развитие более широкого спектра фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания клубней картофеля в период хранения, по сравнению с известными штаммами. На его основе разработан биологический препарат, который по спектру фунгицидной активности не уступает заявляемому штамму, а благодаря своему составу стабилен и технологичен. Выбранная для его применения форма водосодержащей эмульсии делает препарат привлекательным для потребителя благодаря удобству его применения и экономичности.

Список литературы.

1. Akra E., Jacques P., Wathelet В., Paquot M., Fuchs R., Budzikiewicz H., Thonart P. 2001.

1. Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis. Appl. Biochem. Bioctechnol. 91-93: 551-561.

2. Klich M.A., Lax A.R., Bland J.M. 1991. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis. Mycopathology. 116:77-80.

3. Ahimou F., Jacques P., Dejeu M. 2000. Surfactin and iturin A effect on Bacillus subtilis surface hydrophobility. Enzyme Microb. Technol. 27:749-754.

4. Volpon L., Besson F., Lancelin J. 2000. NMR structure plipastatins A and В from Bacillus subtilis inhibitors of phospholipase A2. FEMS Lett. 485: 76-80.

5. Volpon L., Besson F., Lancelin J. 1999. NMR structure of active and forms of the steroldependet antifungal antibiotic bacillomycin L. Eur. J. Biocem. 263:1-12.

6. Milner J. L., Raffel S. J., Lethbridge B. J., Handelsman J. 1995. Culture condition that influence accumulation of zwittermicin A by Bacillus cereus UW85. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 685-691.

7. Патент РФ 2019966.

8. “Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2001 год.”. Приложение к журналу “Защита и карантин растений” №3, стр.106-108.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству и применению биологических средств борьбы с возбудителями болезней растений. Штамм Brevibacillus laterosporus выделен из природных источников, депонирован во ВКПМ, ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7767 и обладает широким спектром фунгицидного действия. На основе штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 разработан фунгицидный препарат, содержащий биомассу штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, воду, тридекан, твин-80, поливиниловый спирт, глицерин и хинозол. Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 и биологический препарат на его основе ингибируют рост фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания клубней картофеля в период хранения. Препарат экономичен и удобен в применении. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, обладающий широким спектром фунгицидного действия.2. Биологический препарат для защиты клубней картофеля от грибных заболеваний в период хранения, включающий биомассу фунгицидного штамма бактерий и целевые добавки, отличающийся тем, что он дополнительно содержит воду, в качестве биомассы фунгицидного штамма бактерий он включает биомассу штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767, а в качестве целевых добавок твин-80, глицерин, тридекан, 10%-й поливиниловый спирт и хинозол при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биомасса штамма бактерий

Brevibacillus laterosporus

ВКПМ В-7767 48-57

Твин-80 2,5-5,0

Глицерин 10-15

Тридекан 15-25

Поливиниловый спирт 10% 11-15

Хинозол 0,01-0,03

Вода Остальное