ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS MOJAVENSIS PS17 ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ И ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/07 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к производству биологических препаратов для защиты растений от фитопатогенных грибов, и может быть использовано для создания биологических фунгицидов для стимуляции роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур и представляет собой штамм бактерии Bacillus mojavensis PS 17.

Многие фитопатогенные грибы наносят существенный ущерб урожаю и качественным характеристикам сельскохозяйственных культур [1]. Для защиты растений от болезней, вызываемых грибами, используются химические и биологические препарата - фунгициды [2]. Применение химических фунгицидов имеет ряд негативных моментов, связанных с экологическими проблемами и развитием у фитопатогенов устойчивости (резистентности) к ним [3]. В связи с этим, важное значение приобретает эффективная биологическая защита растений [4]. Для решения данной задачи наиболее часто используются биологические препараты на основе различных микроорганизмов. В качестве микроорганизмов биологических агентов биопрепаратов для защиты от болезней широко используются бактерии родов Bacillus и Pseudomonas [5], многие из которых являются частью природной микрофлоры растений, взаимовыгодно взаимодействуя с ними. Не смотря на то, что многие микроорганизмы способны стимулировать рост растения и защищать его от воздействия фитопатогеных организмов, с точки зрения удобства применения спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют преимущество, поскольку их споры могут длительно храниться, что позволяет биопрепаратам на их основе длительно сохранять свою активность и разрабатывать эффективные промышленные технологии их производства [6]. Установлено положительное влияние штаммов бактерий рода Bacillus на рост и развитие растений, снижение развития болезней и повышение урожайности [7]. В связи с этим, поиску эффективных штаммов бактерий рода Bacillus уделяется пристальное внимание.

Известна штаммы бактерий рода Bacillus обладающих способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и стимулировать формирование урожая сельскохозяйственных культур. В частности, это Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 и биопрепарат Фитоспорин, созданный на основе этого штамма [8]; В. subtilis Б 93 ВИЗР [9], В. subtilis BZR 517 [10] и др.

Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является недостаточная биологическая активность в отношении подавления фитопатогенов и недостаточное изученное влияние на урожайность сельскохозяйственных культур.

Одним из ценных источников для поиска биологических агентов для создания биопрепаратов для защиты от болезней являются эндофитные бактерии [11].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Bacillus mojavensis Lhv-97, обладающий фунгицидной и бактерицидной активностью и выделенный из ризосферной почвы [12].

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для получения биологического препарата с высокой активностью в подавлении фитопатогенных грибов и повышающего урожайность сельскохозяйственных культур, позволяющего расширить набор средств биологической защиты растений от болезней.

Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus mojavensis PS 17, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Новый штамм выделен из семян пшеницы сорта Садокат (Республика Таджикистан) и депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМВ-13415.

Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов, положительное влияние на продуктивность растений, отсутствие патогенности к теплокровным животным и совместимость с другими микроорганизмами. Видовая принадлежность определялась с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК, а также амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для бактерий вида Bacillus mojavensis в НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами размером 1,5-2,5×0,5-0,7 мкм; располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже. При спорообразовании клетки не раздуваются, споры эллипсовидные, расположены центрально.

На мясо-пептонном агаре (МПА) через 2 суток образует округлые колонии с фестончатым краем, 5-6 мм в диаметре; с преимущественно зернистой поверхностью, матовые, непрозрачные, цвет - белый с зеленоватыми оттенками. Колонии имеют выпуклое основание, рельефные складки и значительно приподнятый центральный кратер; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.

Bacillus mojavensis PS 17 является аэробной, хемоорганогетеротрофной бактерией, не нуждающейся в факторах роста. Растет в диапазоне температур от 10 до 47°С с оптимальным диапазоном 28-32°С, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5, при концентрации хлорида натрия до 5%.

Проявляет активность триптофандеаминазы и желатиназы. Активность β-галактозидазы (ортонитрофенил-βD-галактопиранозидазы), аргининдигид-ролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы не выявлена. Не продуцирует индол и сероводород и восстанавливает нитраты. Реакция Фогес-Проскауэра (продукция ацетоина) положительная.

В качестве источника углерода и энергии утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-ксилозу, D-рибозу, L-арабинозу, D-маннозу, D-маннит, инозит, D-сорбит, метил-αD-маннопиранозид, метил-αD-глюкопиранозид, D-мальтозу, D-целлобиозу, D-лактозу, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-мелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-раффинозу, гентибиозу, глицерин, цитрат.

Не утилизирует эритритол, D-арабинозу, D-адонитол, D-галактозу, L-ксилозу, L-сорбозу, L-рамнозу, метил-βD-ксилопиранозид, дульцитол, N-ацетилглюкозамин, инулин, D-мелецитозу, ксилит, D-туранозу, D-ликсозу, D-тагатозу, D-фукозу, D-арабит, L-арабит, глюконат калия, 2-кетоглюконат калия, 5-кетоглюконат калия.

Штамм хранится при 4-6°С в пробирках с полужидким агаром в минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 2 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечению 2-х суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года.

Штамм хорошо растет на МПА, КингБ, среде LB, сусло-агаре (состав: концентрат сусла пивного неохмеленного, разбавленный дистиллированной водой до общей концентрации Сахаров 10% (10° Баллинга), рН 7,0-7,2 с добавлением 2,0% агар-агара), среде Громыко, среде Гаузе №2 (состав: триптон - 2,5 г; пептон - 5,0 г; NaCl - 5,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 20 г; вода водопроводная - 1000 мл; рН - 7,0-7,4) и минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 10 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2). Ферментация осуществляется на смеси равных объемов мясо-пептонного бульона и 6°Б неохмеленного пивного сусла (рН 6,9-7,2) при 30°С до 95% спорообразования. Количество КОЕ составляет не менее 5×10⁹ в 1 мл.

Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Казанском Федеральном университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus mojavensis PS 17 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Пример 1. Исследование антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS 17.

Исследование антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS 17 проводили с использованием конфронтационный метод. В центр чашек Петри со средой КингБ выкладывали блок с мицелием тестируемого гриба, на расстоянии 2-3 см уколом высевали штамм Bacillus mojavensis PS 17, в качестве негативного контроля использовали штамм Pseudomonas putida PCL1760, который высевался также уколом, который не выделяет какие-либо антагонистические вещества, подавляющие развитие микромицетов (фиг. 1-5). Чашки Петри помещали на 48-72 часа в термостаты при температуре 25°С для того, чтобы микромицеты и бактерии могли развиваться. Наблюдения проводили на 2-5 сутки в зависимости от скорости роста фито-патогена.

Этот способ определения антагонистической активности принято считать качественным, где о наличии или отсутствии антагонистических свойств определяется по площади зон подавления роста тест-объектов. Это связано с тем, что при такой постановке опыта антагонизм между микроорганизмами реализуется за счет продукции ими различных антимикробных метаболитов.

В свою очередь, эти метаболиты диффундируют в питательную среду, поэтому накопление их в конкретной точке питательной среды и, соответственно, размер области, где наблюдаются проявления антагонизма, зависит от объема среды, а также от качества и плотности агара.

Результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus mojavensis PS 17 представлены на фиг. 1-5. На котором в качестве вариантов представлены: 1) - штамм Bacillus mojavensis PS 17, 2) Pseudomonas putida PCL1760. В качестве тест культуры микромицетов использованы: фиг. 1 - Trichoderma asperellum RECB-74F, фиг. 2 - Fusarium equisety, фиг. 3 - Penicillum sp., фиг. 4 - Fusarium sporotrichoides, фиг. 5 - Fusarium oxysporum ZUM2407.

Согласно представленной информации, штамм Bacillus mojavensis PS 17 является антагонистом и обладает широким спектром активности; все использованные в исследовании микромицеты проявили, в разной степени, чувствительность к антагонистичному штамму.

Пример 2. Лабораторные испытания фитотоксичности и ростостимулирующей активности штамма Bacillus mojavensis PS 17.

Для испытания фитотоксичности и ростостимулирующих свойств штамма Bacillus mojavensis PS 17 были использованы зерна пшеницы сорта Симбирцит. Для этого зерна замачивали в суспензии клеток, выращенной на богатой среде LB, которая состоит из 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л хлорида натрия. Готовую среду стерилизовали 40 минут при 110°С. после замачивания семена выкладывали в кювету на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. Семена проращивали 7 дней при температуре 23°С при длине светового дня 16 часов. Растения собирали и измеряли длину корней. По результатам экспериментов было показано, что штамм Bacillus mojavensis PS 17 увеличивал длину стеблей и корней пшеницы (Таб. 1).

Пример 3. Совместимость с полезными микроорганизмами.

Проведено исследование совместимости штамма Bacillus mojavensis PS 17 с полезными бактериями Pseudomonas fluorescens RECB-14B, Streptomyces resistomycificus RECB-31B, Pseudomonas fluorescens RECB-44B, Bacillus mojavensis RECB-50B, Trichoderma asperellum RECB-74F на богатой и минимальной средах. В результате конфронтационных тестов было показано, что из указанного списка полезных микроорганизмов штамм Bacillus mojavensis PS 17 подавляет рост штамма Trichoderma asperellum RECB-74B, Streptomyces resistomycificus RECB-31B и Bacillus amyloliquifaciens RECB-95В. Это указывает на возможность применения этого микроорганизма с другими биопрепаратами на основе псевдомонад.

Пример 4. Оценка эффективности обработки растений яровой пшеницы штаммом Bacillus mojavensis PS 17 в полевых условиях.

Исследования проводились на опытных полях Казанского государственного аграрного университета. Объектом исследования выступал сорт яровой пшеницы Экада 66. Изучалась эффективность опрыскивания растений в период вегетации. В качестве экспериментального варианта выступал биопрепарат на основе Bacillus mojavensis PS 17 с нормой 1,0 л/га. Производства биопрепарата проводилось на лабораторной качалке Innova 40R (Eppendorf) при температуре 37°С, время инкубации - 17 часов при ротации 180 об/мин. Среда для получения препаратов - жидкая питательная среда LB, Лурия бульон. Титр не менее 2,5*109 КОЭ/л. В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был зарегистрированный биологический препарат Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens штамм АР-33 с норма расхода - 1 л/га. Агротехнология возделывания яровой пшеницы - общепринятая для зоны Предкамья Республики Татарстан. Расход рабочей жидкости - 200 л/га. Обработку проводили дважды - в фазу колошения и в фазу цветения пшеницы.

Применение различных вариантов обработки оказало влияние на развитие листовых микозов (табл. 2) и пораженность колосьев (табл. 3) болезнями.

С точки зрения контроля листовых болезней, использование Bacillus mojavensis PS 17 оказало более выраженное влияние на снижение развития септориоза листьев и настоящей мучнистой росы в сравнении со стандартным биофунгицидом Ризоплан.

С точки зрения контроля болезней колоса, препарат на основе Bacillus mojavensis PS 17 значительно превосходил по эффективности контроля микозов стандартный биофунгицид Ризоплан.

Обработка растений Bacillus mojavensis PS 17 достоверно увеличила урожайность яровой пшеницы на 0,53 т/га, что значительно превышает результаты, полученные при использовании стандартного биофунгицида Ризоплан (табл. 4).

Таким образом, применение дважды в период вегетации культуры эндофитных бактерий Bacillus mojavensis PS 17 с нормой 1 л/га оказывает выраженное влияние на снижение поражения растений яровой пшеницы основными болезнями, приводит к росту урожайности.

Пример 5. Оценка эффективности предпосадочной обработки клубней картофеля штаммом Bacillus mojavensis PS 17 в полевых условиях.

Объект исследования - картофель сорта Венета, репродукция суперэлита. Изучались варианты обработки клубней перед посадкой. Схема опыта: 1. Контроль - без обработки. 2. Химический препарат стандарт - 290 кс (имидаклоприд + пенцикурон) Престиж (0,7 л/т). 3. Биологический препарат - Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens АР-33 (1 л/т). 4. Биопрепарат на основе эндофитной бактерии Bacillus mojavensis PS 17 (1,0 л/т). Повторность в опытах - четырехкратная. Норма расхода рабочей жидкости - 20 л/т. Клубни обрабатывались непосредственно перед посадкой.

Результаты оценки влияния обработки на пораженность ростков ризоктониозом представлена в таблице 6.

%.

По эффективности контроля ризоктониоза препарат на основе Bacillus mojavensis PS 17 превосходил стандартных биофунгицид Ризоплан и незначительно уступал показателям для химического препарата - Престиж.

Наибольшая урожайность (табл. 7) была получена при применении препарата на основе Bacillus mojavensis PS 17. Если по сравнению с химическим стандартом достоверных различий по урожайности в данном варианте не обнаружилось, то в сравнении со стандартным биофунгицидом Ризопланом прирост общей урожайности составил 3,1 т/га.

Таким образом, штамм бактерий Bacillus mojavensis РS17 является новым, пригоден для получения биологического препарата против фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур, что позволит расширить спектр средств биологической защиты растений от болезней.

Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по соглашению №14.610.21.0017 от 03 октября 2017 г., уникальный идентификатор проекта RFMEFI61017X0017.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии. Изобретение представляет собой штамм Bacillus mojavensis PS17, выделенный из семян яровой пшеницы сорта Садокат, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - Гос-НИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-13415. Штамм имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов и повышает урожайность сельскохозяйственных культур. Штамм нетоксичен для животных, обладает ростостимулирующей активностью для растений и может быть использован для создания на его основе биопрепаратов для защиты растений от болезней, вызываемых грибными патогенами. 7 табл., 5 пр., 5 ил.

Штамм бактерий Bacillus mojavensis PS17, обладающий фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов и повышающий урожайность сельскохозяйственных культур, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-13415.