КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭМБРИОНОВ КОПЫТНЫХ Российский патент 2020 года по МПК A61D19/04 C12N5/73 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США под серийным номером 62/192544, поданной 14 июля 2015 года, описание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень техники

[0002] Получение эмбрионов in vitro является одним из основных компонентов животноводства. Часто получают больше эмбрионов, чем имплантируют. Хотя недавно достигнута более чем 30% частота зачатия при переносе (ЕТ) витрифицированных полученных in vitro (IVP) эмбрионов, сложный процесс восстановления этих эмбрионов после витрификации остается препятствием для коммерческого использования данной методики. Существует потребность в новых эффективных протоколах криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота.

Раскрытие изобретения

[0003] В настоящем изобретении предложены технологии криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота и/или достижения оплодотворения с использованием криоконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота. В настоящем изобретении также предложены криоконсервированные эмбрионы, популяции таких криоконсерваированных эмбрионов, системы для их получения и/или хранения и т.д.

[0004] В числе прочего, настоящее изобретение охватывает определение источника проблем с некоторыми имеющимися технологиями переноса криоконсервированных эмбрионов, особенно с процессами восстановления (например, размораживания, имплантации и т.д.) криоконсервированных эмбрионов. Например, настоящее изобретение принимает во внимание, что численность персонала и время, необходимые для восстановления жизнеспособных криоконсревированных эмбрионов согласно многим стандартным технологиям, вызывают опасения относительно их коммерческой целесообразности.

[0005] Кроме того, в настоящем изобретении раскрыто наличие потребности в технологиях переноса криоконсервированных эмбрионов, позволяющей достичь улучшенной частоты зачатия по сравнению с большинством стандартных технологий, использующих криоконсервированные эмбрионы; при этом предполагается, что частота зачатия, которой обычно позволяют добиться такие стандартные технологии, намного ниже достигаемой при использовании свежих эмбрионов. В числе прочего, в настоящем изобретении предложены технологии, позволяющие добиться желательной (например, приблизительно 10% или более) частоты зачатия для криоконсервированных эмбрионов.

[0006] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, включающие этапы, например: получения эмбрионов копытных in vitro (IVP); криоконсервации эмбрионов; и переноса эмбрионов для имплантации в организмы реципиентов-копытных, причем криоконсервация и перенос выполняются таким образом, который позволяет достичь частоты беременности, равной по меньшей мере приблизительно 10%.

[0007] В некоторых вариантах реализации получение одного или нескольких эмбрионов in vitro включает этапы, например: получения одной или более яйцеклеток у самок; созревания одной или более яйцеклеток in vitro; оплодотворения одной или более зрелых яйцеклеток спермой или одним или более выделенными сперматозоидами с получением одной или более зигот; и удаления оболочки и культивирования одной или более зигот. В некоторых вариантах реализации использованную сперму разделяют по полу. В некоторых вариантах реализации сперму не разделяют по полу.

[0008] В некоторых вариантах реализации созревание яйцеклетки in vitro включает, например: инкубирование яйцеклеток в пределах физиологически релевантного диапазона по меньшей мере одного из параметров, выбранных из группы, состоящей из: температуры, наличия или количества газа, влажности, рН, осмолярности и их комбинации. В некоторых вариантах реализации наличие или количество газа выбирают из группы, состоящей из О₂ и СО₂. В некоторых вариантах реализации этап созревания яйцеклеток in vitro включает: инкубирование яйцеклеток при 35-40°С в присутствии 3-9% СО₂ и влажности насыщения. В некоторых вариантах реализации этап удаления оболочек и культивирования зигот включает инкубирование зигот при 35-40°С в присутствии 5% СО₂ в воздухе и влажности насыщения. В некоторых вариантах реализации этап удаления оболочек и культивирования зигот дополнительно включает инкубирование зигот в присутствии 5% О₂.

[0009] В некоторых вариантах реализации криоконсервация эмбрионов включает этапы, например: инкубирования эмбрионов в растворе, содержащем криопротектор, и погружение эмбрионов в жидкий азот. В некоторых вариантах реализации этап криоконсервации эмбриона включает этапы: инкубирования эмбрионов в растворе для замораживания, содержащем 1,0-4 М этиленгликоля, в течение 5-30 минут при первой температуре в диапазоне от приблизительно 10°С до приблизительно 38°С; загрузки эмбрионов в сосуд, где пузырьки воздуха отделяют эмбрионы от размораживающего раствора, содержащего этиленгликоль в изотоническом разбавителе; воздействия температуры в диапазоне от приблизительно минус 2 до приблизительно минус 10°С на эмбрионы в течение времени в диапазоне от приблизительно 1 мин до приблизительно 60 минут; снижение температуры со скоростью в диапазоне от приблизительно минус 0,2 до приблизительно минус 0,8°С в минуту до достижения второй температуры в диапазоне от приблизительно минус 30 до приблизительно минус 36°С; и погружение эмбрионов в жидкий азот для хранения. В некоторых вариантах реализации этиленгликоль присутствует в диапазоне конечных концентраций от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,3 моль.

[0010] В некоторых вариантах эмбрионы криоконсервируют для прямого переноса в организмы реципиентов-самок.

[0011] В некоторых вариантах реализации перенос эмбрионов включает этапы: культивирования эмбрионов в среде с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) под минеральным маслом в течение времени в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней; и перенос эмбрионов в организмы реципиентов-копытных. В некоторых вариантах реализации среду выбирают из группы, состоящей из среды С4, среды SOF, среды SOFaa и их комбинаций. В некоторых вариантах реализации в среду добавляют один или более из следующих компонентов: сыворотки, сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, эмбриональной телячьей сыворотки, бычьего сывороточного альбумина и/или одной или более аминокислот.

[0012] В некоторых вариантах реализации перенесенные эмбрионы находятся в стадии развития, выбранной из группы, состоящей из морулы, ранней бластоцисты, бластоцисты и поздней бластоцисты.

[0013] В некоторых вариантах реализации реципиентов-копытных синхронизируют. В некоторых вариантах реализации реципиенты-копытные находятся в фазе естественного эструса. В некоторых вариантах реализации эмбрионы являются свежими, витрифицированными или замороженными. В некоторых вариантах реализации копытные являются крупным рогатым скотом. В некоторых вариантах реализации эмбрионов определенного вида животных выбирают из Bos taurus и Bos indicus и пород-гибридов Bos indicus-taurus.

[0014] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен криоконсервированный эмбрион, полученный с помощью способа, включающего этапы, например: получения эмбрионов копытных in vitro (IVP); криоконсервации эмбрионов в условиях, после переноса криоконсервированных эмбрионов реципиентам-копытным позволяющих достичь частоты беременности, равной по меньшей мере приблизительно 10%. В некоторых вариантах реализации получение эмбрионов in vitro включает этапы, например: получения яйцеклеток у самок; созревания яйцеклеток in vitro; оплодотворения зрелых яйцеклеток спермой; и удаления оболочки и культивирования зигот. В некоторых вариантах реализации созревание яйцеклеток in vitro включает инкубирование яйцеклеток в пределах физиологически релевантного диапазона по меньшей мере одного из параметров, выбранных из группы, состоящей из: температуры, наличия или количества газа, влажности, рН, осмолярности и их комбинации. В некоторых вариантах реализации перенос эмбрионов включает этапы: культивирования эмбрионов в среде с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) под минеральным маслом в течение времени в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней; и перенос эмбрионов в организмы реципиентов-копытных.

[0015] В некоторых вариантах реализации среда, используемая в соответствии с настоящим изобретением, является или содержит среду, выбранную из группы, состоящей из среды С4, среды SOF, среды SOFaa и их комбинаций. В некоторых вариантах реализации в среду добавляют один или более из следующих компонентов: сыворотки, сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, эмбриональной телячьей сыворотки, бычьего сывороточного альбумина и/или одной или более аминокислот.

[0016] В некоторых вариантах реализации эмбрионы, криоконсервированные и/или перенесенные в соответствии с настоящим изобретением, находятся в стадии развития, выбранной из группы, состоящей из морулы, ранней бластоцисты, бластоцисты и поздней бластоцисты.

[0017] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено устройство, содержащее: контейнер; криоконсервированный эмбрион в растворе для криоконсервации, расположенный в первой области контейнера, причем по сторонам от указанной первой области находятся: вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся: четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор; по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся: шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся: восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор. В некоторых вариантах реализации одна или более из областей является камерой в том смысле, что камера по определению является физическим отсеком, между которым и по меньшей мере одной из других смежных областей находится барьер. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено множество устройств.

[0018] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, включающие этапы: криоконсервации множества эмбрионов копытных; и переноса множества эмбрионов в организмы реципиентов-копытных, причем криоконсервация и перенос выполняются таким образом, который позволяет достичь частоты зачатия, равной по меньшей мере приблизительно 30%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения этап криоконсервации включает размещение каждого эмбриона в растворе для криоконсервации в первой области контейнера, причем по сторонам от указанной первой области находятся: вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся: четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор; по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся: шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся: восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор.

[0019] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы замораживания эмбрионов, например, включающие: помещение эмбрионов копытных в раствор для замораживания (SC), состоящий из от приблизительно 1 до приблизительно 4 М этиленгликоля, в течение 10 минут при температуре 35°С; размещение каждого эмбриона в растворе для замораживания (SC) внутри контейнера, выполненного в размерах трубки, так что эмбрион в растворе для замораживания окружен четырьмя колонками с размораживающим раствором (SD), разделенными колонками с воздухом, причем указанный размораживающий раствор содержит приблизительно 0,75 М этиленгликоля; воздействие температурных условий, стабилизированных при температуре в пределах диапазона от приблизительно 0°С до приблизительно минус 10°С, на контейнер; кристаллизацию колонок над и под эмбрионом через две минуты после помещения в морозильник; поддержание эмбриона в течение 1-60 минут при температуре в диапазоне от приблизительно 0°С до приблизительно минус 10°С; снижение температуры со скоростью в диапазоне от приблизительно минус 0,2°С до приблизительно минус 0,8°С в минуту до достижения второй температуры в диапазоне от приблизительно минус 30°С до приблизительно минус 36°С; и погружение замороженных эмбрионов в жидкий азот. В некоторых вариантах реализации контейнер, содержащий замороженный эмбрион, погружают в жидкий азот после достижения второй температуры в диапазоне от приблизительно минус 30°С до приблизительно минус 36°С.

[0020] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы размораживания эмбрионов, например, включающие: помещение контейнера, содержащего криоконсервированный эмбрион в растворе для криоконсервации, расположенный в первой области контейнера, причем по сторонам от указанной первой области находятся: вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся: четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор; по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся: шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся: восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор, на воздух при комнатной температуре в течение первого периода времени, причем указанный первый период времени является достаточным для начала размораживания замороженных эмбрионов; помещение контейнера в размораживающую среду, характеризующуюся температурой размораживания в диапазоне от приблизительно 10°С до приблизительно 38°С, в течение второго периода времени, причем указанный второй период времени является достаточным для размораживания замораживающего раствора; и смешивание размораживающего раствора, раствора для замораживания и эмбриона в контейнере. В некоторых вариантах реализации первый период времени соответствует диапазону от приблизительно 10°С до приблизительно 38°С. В некоторых вариантах реализации второй период времени соответствует диапазону от приблизительно 20°С до приблизительно 38°С. В некоторых вариантах реализации размораживающая среда является или предусматривает ванну с жидкостью. В некоторых вариантах реализации температура размораживания находится в пределах диапазона от приблизительно 10°С до приблизительно 38°С. В некоторых вариантах реализации этап перемешивания достигается посредством аккуратного встряхивания контейнера. В некоторых вариантах реализации способ размораживания дополнительно включает этап переноса эмбриона в организм реципиента-копытного. В некоторых вариантах реализации перенос выполняют одновременно с или после этапа воздействия или этапа смешивания. В некоторых вариантах реализации этап переноса включает перенос эмбриона в рог матки реципиента-копытного.

Краткое описание чертежей

[0021] На Фигуре 1 изображена схема загрузки для использования эмбрионов, замороженных посредством прямого переноса. Как изображено на этой фигуре, эмбрионы в растворе для замораживания можно разместить в устройствах (например, по одному эмбриону на устройство), в которых области с раствором разделены областями с воздухом. Например, как изображено на фигуре 1, эмбрион 100 в растворе для замораживания 200 расположен в первой области 300 (обозначенной серым цветом на фигуре 1) цилиндрического устройства 400 (например, трубки). Непосредственно по сторонам от первой области расположены две области (вторая 305 и третья 315 области, каждая из которых обозначена точечной заливкой на фиг. 1), содержащие воздух, а затем две области (четвертая 310 и пятая 320 области, каждая из которых обозначена полосатой заливкой на фиг. 1), содержащие размораживающий раствор, за которыми следуют еще две области (шестая 325 и седьмая 335 области, каждая из которых обозначена точечной заливкой на фиг. 1), также содержащие воздух, за которыми следуют еще две области (восьмая 330 и девятая 340 области, каждая из которых обозначена полосатой заливкой на фиг. 1), также содержащие размораживающий раствор. Конкретное устройство, изображенное на фигуре один, является 0,25 мл трубкой, эмбрионы помещаются в центральную колонку; раствор для замораживания является 1,5 М этилен гликолем; а размораживающий раствор является 1:1 разведенным раствором для замораживания в DPBS, т.е. 0,75 М этиленгликоля в DPBS.

[0022] На Фигурах 2А и В (совместно составляющих фигуру 2) изображено общее представление о схемах замораживания (фиг. 2А) и размораживания (фиг. 2В), описанных в разделе «Примеры» настоящего описания.

Определения

[0023] Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже даны определения некоторых терминов. Специалисты в данной области техники должны принимать во внимание, что определения некоторых терминов могут быть приведены в других разделах описания и/или будут понятны из контекста.

[0024] Приблизительно: В настоящем документе термин "приблизительно" или "около" используется для одного или более значений, представляющих интерес, относящихся к значению, близкому к установленному стандартному значению. В некоторых вариантах реализации термин "приблизительно" или "около" относится к диапазону значений, находящихся в пределах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или менее в обе стороны (большую или меньшую) от установленного стандартного значения, если не указано иное или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда число будет превышать 100% от возможного значения).

[0025] Искусственное осеменение (ИО): В настоящем документе термин «искусственное осеменение (ИО)» относится к введению спермы рукой человека в матку самки крупного рогатого скота для достижения беременности. В многих вариантах реализации ИО используется в селекции, например, таким образом, что наступившая беременность вынашивается (или должна вынашиваться) в течение положенного срока. В некоторых вариантах реализации ИО выполняют с использованием собранной спермы. В некоторых вариантах реализации ИО выполняют с использованием изъятой спермы. В некоторых вариантах реализации ИО выполняют с использованием обработанной спермы; например, в некоторых вариантах реализации, сперму разделяют по полу, обогащая ее сперматозоидами только одного пола. Специалисты в данной области техники должны принимать это во внимание. Если не указано иное явным образом, термин «ИО» не охватывает процедуры переноса эмбрионов, где, например, сперму можно ввести корове с целью получения эмбрионов для переноса.

[0026] Бластоциста: В настоящем документе термин "бластоциста" относится к структуре, образующейся на ранних стадиях развития млекопитающих. Она содержит эмбриобласт (ICM), который впоследствии образует эмбрион. Трофобласт является наружным слоем клеток бластоцисты. Этот слой окружает эмбриобласт (являющийся источником эмбриональных стволовых клеток) и полость, заполненную жидкостью, известную как бластоцель. Из трофобласта формируется плацента. Использование бластоцисты для оплодотворения in vitro (экстракорпорального оплодотворения, ЭКО) включает культивирование оплодотворенной яйцеклетки до имплантации в матку особи крупного рогатого скота.

[0027] Порода: В настоящем документе термин «порода» относится к группе копытных (например, крупного рогатого скота), имеющей общих предков и/или обладающих некоторыми общими различимыми характерными признаками, которые не встречаются у копытных других пород. Специалисты в данной области техники знакомы со стандартами и/или характеристиками пород. Во многих вариантах реализации конкретную породу получают и/или поддерживают путем спаривания конкретного или конкретных родителей (например, конкретного самца-производителя с конкретной производительницей или с любой производительницей из конкретной линии производительниц) друг с другом.

[0028] Сопоставимый: Термин "сопоставимый" используется в настоящем документе для описания двух (или более) наборов условий, обстоятельств, особей или популяций, достаточно сходных друг с другом для обеспечения возможности сравнения полученных результатов или наблюдаемых явлений. В некоторых вариантах реализации сопоставимые наборы условий, обстоятельств, особей или популяций характеризуются множеством в значительной степени идентичных особенностей и одной или небольшим количеством различающихся особенностей. Специалисты в данной области техники должны принимать во внимание, что наборы обстоятельств, особей или популяций сопоставимы друг с другом, если они характеризуются достаточным количеством и типом в значительной степени идентичных особенностей для получения обоснованного заключения о том, что различия в полученных результатах или наблюдаемых явлениях при различных наборах обстоятельств, особей или популяций вызваны или указывают на изменчивость различающихся особенностей. Специалисты в данной области техники должны принимать во внимание, что относительные формулировки, используемые в настоящем документе (например, усиленный, активированный, пониженный, ингибированный и т.д.) обычно относятся к сравнениям при сопоставимых условиях.

[0029] Метис: В настоящем документе термин «метис» относится к копытным (например, крупному рогатому скоту), полученным из гамет отдельных животных, относящихся к различным породам или видам копытных (например, крупного рогатого скота). Скрещивание часто выполняют в молочном скотоводстве с целью получения более здорового, более продуктивного крупного рогатого скота по сравнению с родительскими породами. Скрещивание является целенаправленным спариванием животных разных пород или линий; во многих вариантах реализации скрещивание выполняют с целью использования преимуществ гетерозиса (гибридной силы) для улучшения таких характеристик, как продуктивность, плодовитость и продолжительность жизни. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение охватывает представления о том, что последние разработки, касающиеся искусственного осеменения и/или оплодотворения in vitro, обычно не используемые в молочном животноводстве, можно использовать для получения и/или обеспечения определенных преимуществ при создании и/или поддержании гибридных линий молочного скота, описанных в настоящем документе. Как описано в настоящем документе, гибридные копытные, представляющие особый интерес, являются гибридами, у которых 50% соматических хромосом происходят от одной линии, а 50% - от другой линии животных (т.е. они получены скрещиванием особей F0 первой и второй линии, отличающихся друг от друга. Специалисты в данной области техники должны принимать во внимание, однако, что термин «метис» можно использовать в некоторых вариантах реализации (как понятно из контекста) для обозначения любой особи, чей геном в результате скрещивания не на 100% соответствует какой-либо породе. Диплоидная клетка: В настоящем документе термин «диплоидная клетка» относится к клетке с гомологичной парой каждой из ее аутосом и двумя копиями (2n) каждого аутосомного генетического локуса.

[0030] Стадия развития: В настоящем документе термин "стадия развития" относится к стадиям эмбрионального развития. В некоторых вариантах реализации стадии развития включают морулу, раннюю бластоцисту, бластоцисту и позднюю бластоцисту.

[0031] Прямой перенос: В настоящем документе термин «прямой перенос» относится к способу медленной криоконсервации эмбриона. Эмбрионы инкубируют в растворе для замораживания, содержащем криопротектор, например, этиленгликоль или глицерин, и подвергают постепенному снижению температуры до замораживания, а затем погружают в жидкий азот. В некоторых вариантах реализации эмбрион в растворе для замораживания загружают в трубку, которую подвергают воздействию замораживающих температур. Способ криоконсервации путем прямого переноса также называют медленным замораживанием.

[0032] Эмбрион: В настоящем документе термин «эмбрион» относится к оплодотворенному ооциту (яйцеклетке), подготовленному к немедленной имплантации в организм самки копытного или хранящемуся для возможной имплантации в организм самки копытного.

[0033] Перенос свежих эмбрионов В настоящем документе термин «перенос свежих эмбрионов» используется по отношению к способу имплантации эмбрионов в организмы реципиентов-копытных (например, крупного рогатого скота) после оплодотворения без криоконсервации. В некоторых вариантах реализации эмбрионы культивируют in vitro в течение нескольких дней перед имплантацией в организм реципиента-самки.

[0034] Гаметы: В настоящем документе термин «гаметы» используется по отношению к половым клеткам (например, сперматозоидам или яйцеклеткам) с гаплоидным числом хромосом, особенно зрелым сперматозоидам или яйцеклеткам, способных сливаться с гаметой противоположного пола с образованием оплодотворенной яйцеклетки. Гаметы образуются в процессе мейоза.

[0035] Сперма, разделенная по полу: В настоящем документе термин «сперма, разделенная по полу» относится к сперме, в которой в результате манипуляций отобраны сперматоциты только одного предпочтительного пола. В некоторых вариантах реализации сперму, разделенную по полу, также называют спермой с определенной половой принадлежностью. В некоторых вариантах реализации сперма, разделенная по полу, является «спермой, обогащенной клетками определенного пола», что относится к сперме, в результате манипуляций обогащенной сперматоцитами только одного предпочтительного пола. В некоторых вариантах реализации сперма, обогащенная клетками определенного пола, содержит по меньшей мере приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, или приблизительно 99% сперматоцитов только одного предпочтительного пола.

[0036] Геномный профиль: В настоящем документе термин "геномный профиль" относится к типичному поднабору общей информации, содержащейся в геноме. Как правило, геномный профиль содержит генотипы определенного набора полиморфных локусов. В некоторых вариантах реализации геномный профиль может коррелировать с определенной функцией, признаком или набором характеристик, например, конкретного животного, линии, породы или гибридной популяции.

[0037] Генотип: В настоящем документе термин «генотип» относится к диплоидной комбинации аллелей данного генетического локуса или набора смежных локусов в клетке или организме. Гомозиготный субъект несет две копии одного и того же аллеля, а гетерозиготный субъект несет два различных аллеля. В простейшем случае локуса с двумя аллелями «А» и «а» можно сформировать три генотипа: А/А, А/а и а/а.

[0038] Генотипирование: В настоящем документе термин «генотипирование» относится к экспериментальному, вычислительному или осуществляемому посредством наблюдений протоколу различения генотипов особей по одному или более из четко определенных локусов. Специалисты в данной области техники должны знать о разнообразных технологиях, которые можно практично и эффективно использовать для выполнения генотипирования. В некоторых вариантах реализации генотипирование включает непосредственное обнаружение нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах реализации генотипирование включает непрямое обнаружение нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, например, путем обнаружения или анализа установленного маркера или явления, коррелирующего с присутствием нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности.

[0039] Гаплоидная клетка: В настоящем документе термин «гаплоидная клетка» относится к клетке с одинарным набором (1n) хромосом - половинным от количества хромосом в соматических клетках.

[0040] Телка: В настоящем документе термин "телка" относится к самке крупного рогатого скота, у которой еще не было телят.

[0041] Гибрид: В настоящем документе термин «гибрид» относится к копытным (например, крупному рогатому скоту), полученным в результате скрещивания мужских и женских гамет различных пород или линий копытных. Таким образом, обычно 50% аутосомного генома (например, соматического генома) гибрида получено от первой породы/линии, и 50% - от второй породы/линии. Особый интерес, как описано в настоящем документе, представляют гибриды, у которых 50% соматических хромосом получены от первой породы и 50% - от второй породы.

[0042] Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) В настоящем документе термин «экстракорпоральное оплодотворение» относится к способу оплодотворения яйцеклетки вне живого организма. ЭКО является процессом, при котором яйцеклетку оплодотворяют спермой вне организма (т.е. in vitro, что буквально переводится как «в пробирке», но в данной области техники относится к процессам, выполняемым, например, в лаборатории или других искусственных условиях). В некоторых вариантах реализации процесс ЭКО может включать мониторинг и/или стимуляцию овуляторного процесса у самки, получение ооцита или ооцитов (яйцеклетки или яйцеклеток) из яичников самки и/или контакт спермы и яйцеклеток друг с другом в лаборатории (например, в жидкой среде) с целью оплодотворения. В некоторых вариантах реализации ЭКО включает культивирование оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) в ростовой среде и/или ее имплантацию в матку самки или хранение для последующего анализа или имплантации. В некоторых вариантах реализации ЭКО может включать сортировку оплодотворенных яйцеклеток по конкретным желательным признакам (например, полу).

[0043] Линия: В настоящем документе термин «линия» относится к линии крупного рогатого скота, происходящей от общих предков, разработанной и поддерживаемой посредством селекции.

[0044] Спаривание: В настоящем документе термин «спаривание» относится к процессу, ведущему к образованию эмбриона, как правило, из двух гамет противоположного пола. В некоторых вариантах реализации спаривание происходит естественным путем. В некоторых вариантах реализации спаривание включает искусственное осеменение. В некоторых вариантах реализации спаривание включает ЭКО. В многих вариантах реализации, описанных в настоящем документе, спаривание используют для получения гибридного потомства. В многих вариантах реализации спаривание используют для получения метисного потомства.

[0045] Морула: В настоящем документе термин "морула" относится к стадии эмбрионального развития. Морула - эмбрион на ранней стадии развития, состоящий из шаровидного скопления клеток (называемых бластомерами), находящихся внутри блестящей оболочки, и образующийся из одноклеточной зиготы путем серии делений. За счет дифференцировки клеток и образования полости из морулы образуется бластоциста. После начала формирования в моруле полости, заполненной жидкостью, начинается новый этап эмбрионального развития - стадия бластоцисты. Во время образования бластоцисты клетки морулы дифференцируются в эмбриобласт, растущий внутри бластоцели, и клетки трофобласта, растущие на наружной поверхности.

[0046] Естественное спаривание: В настоящем документе термин «естественное спаривание» относится к традиционному способу разведения скота путем спаривания самцов и самок без искусственного осеменения или методик на основе ЭКО.

[0047] Контейнер: В настоящем документе термин «контейнер» относится к устройству, содержащему один или более криоконсервированных эмбрионов. Контейнер может содержать ряд областей или камер для: воздуха, размораживающего раствора или эмбриона в растворе для криоконсервации. В некоторых вариантах реализации контейнер является или включает трубку.

[0048] Практически: В настоящем документе термин "практически" относится к качественным условиям проявления полной или близкой к полной степени характеристики или свойства, являющихся объектом интереса. Специалист в области биологии должен понимать, что биологические и химические явления редко доходят или вообще не доходят до завершения и/или развиваются во всей полноте или достигают или избегают абсолютного результата. В связи с этим термин "практически" используют в настоящем документе для обозначения потенциальной неполноты, свойственной многим биологическим и химическим явлениям.

[0049] Признак: В настоящем документе термин "признак" относится к обнаружимому атрибуту особи. Как правило, экспрессия определенного признака может быть полностью или частично обусловлена генетической конституцией особи. В некоторых вариантах реализации признак является характерной особенностью конкретной особи, линии, породы или гибрида, например, в том отношении, что его можно использовать (отдельно или в составе набора) для различения указанной особи, линии, породы или гибрида от других животных.

[0050] Копытные: В настоящем документе термин «копытные» относится к разнородной группе крупных млекопитающих, которая включает лошадей, бычьих/крупный рогатый скот, свиней, коз, буйволов, овец, жирафов, верблюдов, оленей и бегемотов. Большинство наземных копытных используют свои пальцы, обычно выглядящие как копыта, для переноса веса всего организма при передвижении. В некоторых вариантах реализации данный термин означает, грубо говоря, «животное с копытами» или «копытное животное».

[0051] Витрификация: В настоящем документе термин «витрификация» относится к способу криоконсервации яйцеклеток (ооцитов) и эмбрионов. В некоторых вариантах реализации эмбрионы помещают в уравновешивающий раствор и раствор для витрификации, содержащие криопротекторы, например, этиленгликоль и глицерин, и погружают в жидкий азот в процессе криоконсервации.

[0052] Зигота: В настоящем документе термин «зигота» относится к клетке, образованной при объединении двух гамет при половом размножении. Это - самая ранняя стадия эмбрионального развития. Зигота образуется при объединении двух гамет и является первым этапом развития уникального организма. Зиготы образуются путем оплодотворения из двух гаплоидных клеток - яйцеклетки (женской гаметы) и сперматозоида (мужской гаметы), которые объединяются с образованием единой диплоидной клетки.

Подробное описание некоторых вариантов реализации

[0053] Настоящее изобретение частично основано на открытии возможности криоконсервации эмбрионов копытных с повышенной частотой зачатия по сравнению с большинством стандартных технологий, при которых частота зачатия обычно значительно меньше частоты, достигаемой при использовании свежих эмбрионов.

[0054] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, включающие этапы получения эмбрионов in vitro; криоконсервации эмбрионов; и переноса эмбрионов для имплантации в организмы реципиентов-копытных, причем криоконсервация и перенос выполняются таким образом, который позволяет достичь частоты беременности, равной по меньшей мере приблизительно 10%. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены эмбрионы, криоконсервированные описанными способами. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены контейнеры для замораживания, хранения и размораживания криоконсервированных эмбрионов.

Эмбрионы, полученные in vitro

[0055] Использование эмбрионов, полученных in vitro (IVP), значительно возросло за последнее десятилетие (Hasler, 2014). Большая часть этого роста имела место в Бразилии. В 2013 году в организмы реципиентов было перенесено более 393000 IVP-эмбрионов, и 78% из них были получены в Южной Америке. В том же году лишь 8,9% из общего количества перенесенных IVP-эмбрионов замораживались; для эмбрионов in vivo эта доля составила 59% (Perry, 2013).

[0056] IVP-эмбрионы менее устойчивы к криоконсервации, чем эмбрионы, полученные in vivo, и эмбриональная телячья сыворотка (FBS), добавленная в среду для культивирования эмбрионов, может обеспечить более выраженное накопление липидов в цитоплазме эмбрионов (Mucci et al., 2006), что является одним из факторов, обуславливающих повышенную чувствительность IVP-эмбрионов к замораживанию.

[0057] В настоящее время методика криоконсервации, наиболее часто используемая для IVP-эмбрионов, является витрификацией (Dode et al., 2013) из-за ее простоты, скорости и низкой стоимости. Вместе с тем, эта методика требует применения высоких концентраций криопротекторов и наличия обученного персонала и лабораторной структуры для восстановления эмбрионов перед переносом (Vajta et al., 1998), что ограничивает ее применение в полевых условиях и в крупных масштабах.

[0058] С другой стороны, хотя медленное замораживание эмбрионов для последующего прямого переноса связано с несколько большими эксплуатационными затратами, оно позволяет использовать более низкие концентрации криопротектора и, следовательно, является менее токсичным для эмбрионов (Voelkel and Hu, 1992).

[0059] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены усовершенствованные способы имплантации эмбрионов крупного рогатого скота, культивированных в сыворотке. Особи крупного рогатого скота, получающие оплодотворенные эмбрионы, ранее инкубированные с эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), характеризовались аналогичной частотой зачатия по сравнению с особями крупного рогатого скота, получившими эмбрионы без предварительного воздействия FBS. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота, обеспечивающий частоту зачатия у реципиентов - особей крупного рогатого скота, аналогичную частоте зачатия при использовании свежеперенесенных эмбрионов. Особи крупного рогатого скота, получавшие свежеоплодотворенные эмбрионы, характеризовались аналогичной частотой зачатия по сравнению с использованием витрифицированных эмбрионов и замороженных посредством прямого переноса/медленно замороженных эмбрионов. Это демонстрирует, что способ криоконсервации путем прямого переноса/медленного замораживания эмбрионов столь же жизнеспособен, как и способ витрификации. С точки зрения удобства, прямой перенос/медленное замораживание является подходящей заменой способа витрификации.

[0060] В некоторых вариантах реализации яйцеклетки подвергают созреванию in vitro до оплодотворения и криоконсервации. В некоторых вариантах реализации яйцеклетку инкубируют в присутствии кислорода (О₂). В некоторых вариантах реализации яйцеклетку инкубируют в присутствии диоксида углерода (СО₂). В некоторых вариантах реализации яйцеклетку инкубируют в присутствии 3-9% СО₂. В некоторых вариантах реализации яйцеклетку инкубируют в присутствии 5% СО₂. В некоторых вариантах реализации яйцеклетку инкубируют в присутствии 5% О₂.

Традиционное животноводство

[0061] Животноводство является содержанием сельскохозяйственных животных и уход за ними людьми с целью получения прибыли, при котором получают дальнейшее развитие генетические качества и поведение, считающиеся выгодными для людей. Данный термин может относиться к практике выборочного разведения и увеличения поголовья с целью стимуляции желательных признаков у животных, используемых для хозяйственных работ, спорта, удовольствия или исследований.

[0062] Животноводство сочетает искусство и науку о разведении животных путем объединения проверенной временем практики и современных научных знаний в систему, обеспечивающую благополучие животных и безопасное и эффективное содержание и обращение с животными. Практика животноводства меняется по мере того как ученые, специалисты сельского хозяйства и другие лица, работающие с животными, осваивают новые приемы или отказываются от приемов, которые более не являются необходимыми или целесообразными. Практика животноводства варьируется от обрезки рогов у скота для предотвращения травм у животных-членов стада и сельскохозяйственных рабочих до способов содержания, надлежащего кормления скота и разработки стратегий селекции.

[0063] Для облегчения разведения разработаны и могут использоваться такие методики, как искусственное осеменение и перенос эмбрионов. Например, поскольку такие технологии позволяют вынашивать производительницам чужие эмбрионы, их можно использовать для имплантации большого количества эмбрионов от высококачественных производительниц (или линии производительниц) в организмы суррогатных низкокачественных производительниц, тем самым увеличивая количество потомства, которое можно получить от высококачественных производительниц. Этот прием может резко увеличить количество потомства, которое можно получить при отборе небольшого количества животных-родителей наилучшего качества. Однако, как обсуждалось в настоящем документе, такие технологии обычно не используются в молочном животноводстве. В числе прочего, они часто считаются слишком дорогими для использования в молочном животноводстве. Кроме того, поскольку они усиливают конкретные генетические признаки в стаде, они снижают генетическое разнообразие в рамках стада, что приводит, в числе прочих рисков, к увеличению тяжести вспышек некоторых заболеваний. В числе прочего, настоящее изобретение учитывает представление о том, что такие способы, особенно в комбинации со стратегиями скрещивания, могут обеспечить значительные преимущества в области животноводства по сравнению с традиционными подходами.

Технологии оплодотворения и работы с эмбрионами

[0064] Разработаны и усовершенствованы различные методики, позволяющими контролировать и/или влиять на спаривание животных, при необходимости без осуществления полового акта у животных (например, естественного спаривания) или даже контакта животных. Такие типичные методики включают, например, экстракорпоральное оплодотворение, искусственное осеменение, криоконсервацию (замораживание) гамет и эмбрионов, индукцию множественных овуляций, перенос эмбрионов, определение пола сперматозоидов и эмбрионов, перенос ядер, клонирование и т.д.

[0065] Получение эмбрионов жвачных in vitro является трехэтапным процессом созревания яйцеклетки, оплодотворения яйцеклетки и культивирования in vitro. Только 30-40% таких яйцеклеток достигают стадии бластоцисты, на которой их можно перенести в организм реципиента или заморозить для использования в будущем. Качество яйцеклеток может радикально влиять на процент незрелых яйцеклеток, которые образуют бластоцисты, а культуральная среда, используемая после оплодотворения, сильно влияет на качество бластоцисты. В некоторых вариантах реализации использование спермы определенного пола в сочетании с получением эмбрионов in vitro является потенциально эффективным средством получения потомства желательного пола. Озабоченность по поводу использования технологии разделенной по полу спермы включают явное снижение фертильности отсортированной спермы, пониженной выживаемости отсортированной спермы после криоконсервации и уменьшение количества спермы, которое можно отделить за указанный период времени. Оценка качества эмбрионов является сложной задачей. Морфологическая оценка в настоящее время является наиболее популярным методом отбора до переноса эмбриона. Другие неинвазивные способы оценки включают определение сроков первого редукционного деления, связанных со способностью к развитию. Дополнительным ценным инструментом для оценки жизнеспособности культивированных эмбрионов является количественный анализ экспрессии генов. Существует значительное количество доказательств, демонстрирующих, что условия культивирования, воздействующие на эмбрион, особенно в период после оплодотворения, могут нарушать характер экспрессии генов в эмбрионе, что может иметь важные долгосрочные последствия.

[0066] ЭКО является методикой, при которой получают яйцеклетки коровы-донора путем аспирации из половых путей. Затем отобранные яйцеклетки инкубируют в течение 24 часов; это время называют периодом созревания. После созревания яйцеклетки оплодотворяют через 18-22 часа после формирования совместной культуры. Эмбрионы находятся в среде до 7 дня, когда они становятся готовы к переносу. Эта методика обеспечивает три основных преимущества по сравнению с традиционным получением эмбрионов in vivo. При ЭКО не нужна суперовуляция коров и не нужно синхронизировать их. Это является серьезным прорывом, так как коров-доноров не подвергают воздействию гормонов, которые могут нарушать репродуктивное здоровье животных, и их можно выполнять, не тратя время на предварительную подготовку к процедуре. Количество полученных эмбрионов в среднем составляет приблизительно 30% от количества собранных яйцеклеток, хотя оно меняется в зависимости от породы, коровы-донора, а также спаривания. Еще одно преимущество ЭКО состоит в том, что аспирацию у животных можно выполнять через каждые 20 дней вместо 60, как при сборе эмбрионов in vivo. Другим преимуществом ЭКО является то, что от животных можно получать потомство в очень молодом возрасте; это сильно влияет на селекцию, поскольку уменьшает интервал между поколениями животных с конкретным желательным признаком.

[0067] Искусственное осеменение (ИО) используют для получения потомства от генетически улучшенных самцов в течение более чем 200 лет. Хорошо известные способы криоконсервации (замораживания) и хранения спермы сделали ИО доступным для большего количества производителей животноводческой продукции. Так же, как и при криоконсервации спермы, замораживание эмбрионов обеспечило глобальную коммерциализацию животных с высокими генетическими качествами. Сперма быков особенно хорошо поддается замораживанию и длительному хранению. В молочной промышленности, связанной с содержанием большого количества молочных коров, ИО является простым, экономичным и успешным приемом. Более 60 процентов молочных коров в США разводят посредством ИО. Однако для мясного крупного рогатого скота, где размножающиеся популяции, как правило, содержатся на пастбищах, имеет место иная ситуация. В мясном животноводстве в США процент ИО составляет менее 5 процентов от общего количества осеменений.

[0068] Разработка технологии переноса эмбрионов позволяет производителям получить множественное потомство от генетически улучшенных самок. Оплодотворенные эмбрионы можно извлечь из самок (также называемых донорами эмбрионов) с наилучшим генотипом хирургическими или нехирургическими способами. Затем эмбрионы с наилучшим генотипом переносят в организмы самок (также называемых реципиентами эмбрионов) с менее качественным генотипом. Эффективные методики, используемые у крупного рогатого скота, позволяют извлечь оплодотворенные эмбрионы без операции, однако в ходе каждого нормального репродуктивного цикла образуется лишь один или, иногда, два эмбриона. Для увеличения количества эмбрионов, которые можно получить от генетически улучшенных самок, донора эмбрионов обрабатывают гормонами с целью индукции множественных овуляций, или суперовуляции.

[0069] Для мясного животноводства в США предпочтительны телята-бычки, характеризующиеся, как правило, повышенной массой тела и повышенной эффективностью кормления (по сравнению с телками) на кормовых площадках и при завершающих стадиях производства мяса. В противоположность этому, для молочной промышленности предпочтительны телки, которые в конечном итоге будут производить потомство и молоко для потребления человеком. Таким образом, требуются способы для определения пола сперматозоидов и эмбрионов, чтобы производители могли контролировать половую принадлежность потомства у своего скота.

[0070] Начиная с середины 1980-х годов, разработана технология переноса ядра из бластомеров (клеток эмбрионов на ранней и предположительно недифференцированной стадии дробления) или соматических клеток (фибробластов, клеток кожи, сердца, нерва или других клеток тела) в ооциты с удаленным ядром (неоплодотворенные яйцеклетки с удаленным ядром). «Перенос ядер» позволяет получить множественные копии животных, которые сами являются почти идентичными копиями других животных (трансгенных животных, генетически улучшенных животных или животных с высокой молочной продуктивностью или некоторыми другими желательными признаками и т.д.). Этот процесс также называют клонированием. На сегодняшний день перенос ядер соматических клеток используют для клонирования крупного рогатого скота, овец, свиней, коз, лошадей, мулов, кошек, кроликов, крыс и мышей.

[0071] Эта методика включает культивирование соматических клеток из соответствующей ткани (фибробластов) животного, подлежащего клонированию. Затем ядра культивируемых соматических клеток вводят путем микроинъекции в яйцеклетку с удаленным ядром, полученную от другой особи того же или близкородственных видов. Хотя этот процесс еще не изучен, ядро соматической клетки перепрограммируется, обеспечивая характер экспрессии генов, подходящий для управления нормальным развитием эмбриона. После дальнейшего культивирования и развития in vitro эмбрионы переносят в организм реципиента-самки, что в конечном итоге приводит к рождению живого потомства. Частота успешного размножения животных посредством переноса ядра часто составляет менее 10% и зависит от многих факторов, включая видовую принадлежность, источник яйцеклетки-реципиента, тип клетки-донора ядра, обработки донорных клеток перед переносом ядра, способы, используемые для переноса ядра и т.д.

[0072] В настоящем описании продемонстрирована эффективность усовершенствованных технологий криоконсервации при замораживании и размораживании эмбрионов копытных. В настоящем описании продемонстрировано, что такие технологии могут обеспечить значительные преимущества для молочного животноводства.

[0073] В некоторых вариантах реализации консервированные эмбрионы можно поставлять в другие хозяйства и предприятия, например, для получения гибридного потомства и/или стад. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ деловой деятельности, обеспечивающий скрининг гибридного крупного рогатого скота и восстановление высокопродуктивного гибридного крупного рогатого скота путем селекции с использованием гамет F0 от обоих родителей.

Криопротекторы

[0074] Как отмечено в настоящем документе, в настоящем изобретении предложены технологии криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота и/или достижения оплодотворения с использованием криоконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации криопротекторы для применения в соответствии с настоящим изобретением являются или содержат внутриклеточные криопротекторы. В некоторых вариантах реализации криопротекторы для применения в соответствии с настоящим изобретением являются или содержат внеклеточные криопротекторы. В некоторых вариантах реализации типичные криопротекторы (например, для применения в качестве внутриклеточных криопротекторов) могут являться или содержать: диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и их комбинации. В некоторых вариантах реализации типичные криопротекторы (например, для применения в качестве внеклеточных криопротекторов) могут являтся или содержать: сахарозу, трегалозу, декстрозу и их комбинации. В некоторых конкретных вариантах реализации криопротекторы для применения в соответствии с настоящим изобретением могут являтся или содержать пропиленгликоль.

Стадии эмбрионального развития

[0075] В некоторых вариантах реализации эмбрионы можно криоконсервировать на разных стадиях развития. В некоторых вариантах реализации эмбрионы можно криоконсервировать на стадии развития, выбранной из группы, состоящей из: морулы, ранней бластоцисты, бластоцисты и поздней бластоцисты. После образования бластоцисты эмбрион подготавливают к имплантации в стенку матки. В некоторых вариантах реализации стадия ранней бластоцисты характеризуется началом образования полости и неразличимостью клеток бластоцисты. В некоторых вариантах реализации стадия поздней бластоцисты характеризуется полностью сформированной полостью.

Устройства для криоконсервации

[0076] В настоящем изобретении предложены устройства для криоконсервации эмбрионов. В некоторых вариантах реализации устройство содержит криоконсервированный эмбрион в растворе для криоконсервации, размещенный в первой области устройства, причем по сторонам от указанной первой области находятся: вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся: четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор; по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся: шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух; по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся: восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающие растворы. В некоторых вариантах реализации одна или более из областей устройства является камерой.

[0077] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено множество устройств для криоконсервации эмбрионов. В некоторых вариантах реализации каждое множество устройств содержит эмбрион от одиночного спаривания.

[0078] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, включающие этапы получения множества эмбрионов; криоконсервации множества эмбрионов; и переноса эмбрионов с частотой зачатия приблизительно 40%. В некоторых вариантах реализации эмбрионы дополнительно хранят в течение периода времени между криоконсервацией и переносом в организм реципиента - особи крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации период времени между криоконсервацией и переносом в организм реципиента-особи крупного рогатого скота может составлять несколько минут, несколько часов, несколько дней, несколько недель, несколько месяцев, несколько лет или более (например, большого количества указанных единиц времени). В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 40 лет, приблизительно 35 лет, приблизительно 30 лет, приблизительно 25 лет, приблизительно 20 лет, приблизительно 15 лет, приблизительно 10 лет, приблизительно 9 лет, приблизительно 8 лет, приблизительно 7 лет, приблизительно 6 лет, приблизительно 5 лет, приблизительно 4 лет, приблизительно 3 лет, приблизительно 2 лет или приблизительно одного года. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 12 месяцев, приблизительно 11 месяцев, приблизительно 10 месяцев, приблизительно 9 месяцев, приблизительно 8 месяцев, приблизительно 7 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 4 месяцев, приблизительно 3 месяцев, приблизительно 2 месяцев, приблизительно 1 месяца или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 6 недель, приблизительно 5 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 3 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 2 недель, приблизительно 1 недели или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 24 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 2 часов или приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 60 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 2 минут или приблизительно 1 минуты.

[0079] В некоторых вариантах реализации эмбрионы можно хранить в течение нескольких минут, дней или лет до переноса в организм реципиента-особи крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации период времени, в течение которого можно хранить эмбрионы, может составлять несколько минут, несколько часов, несколько дней, несколько недель, несколько месяцев, несколько лет или более (например, большого количества указанных единиц времени). В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее чем приблизительно 40 лет, приблизительно 35 лет, приблизительно 30 лет, приблизительно 25 лет, приблизительно 20 лет, приблизительно 15 лет, приблизительно 10 лет, приблизительно 9 лет, приблизительно 8 лет, приблизительно 7 лет, приблизительно 6 лет, приблизительно 5 лет, приблизительно 4 лет, приблизительно 3 лет, приблизительно 2 лет или приблизительно одного года. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 12 месяцев, приблизительно 11 месяцев, приблизительно 10 месяцев, приблизительно 9 месяцев, приблизительно 8 месяцев, приблизительно 7 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 4 месяцев, приблизительно 3 месяцев, приблизительно 2 месяцев, приблизительно 1 месяца или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 6 недель, приблизительно 5 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 3 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 2 недель, приблизительно 1 недели или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 24 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 2 часов или приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 60 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 2 минут или приблизительно 1 минуты.

[0080] В некоторых вариантах реализации этап криоконсервации включает выполнение криоконсервации в устройстве. Эмбрионы можно криоконсервировать в устройствах в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации этап криоконсервации включает криоконсервацию множества эмбрионов, причем каждый эмбрион подвергают криоконсервации в отдельном устройстве, что приводит к получению набора устройств. В некоторых вариантах реализации множество устройств поддерживают в течение первого периода времени. В некоторых вариантах реализации после первого периода времени по меньшей мере один эмбрион переносят в организм реципиента-особи крупного рогатого скота; и, необязательно, оставшиеся эмбрионы поддерживают в течение второго периода времени. В некоторых вариантах реализации продолжительность периода времени может составлять до 40 лет. В некоторых вариантах реализации эмбрионы можно хранить в течение нескольких минут, дней или лет до переноса в организм реципиента-особи крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации второй период времени, в течение которого можно хранить эмбрионы, может составлять несколько минут, несколько часов, несколько дней, несколько недель, несколько месяцев, несколько лет или более (например, большого количества указанных единиц времени). В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 40 лет, приблизительно 35 лет, приблизительно 30 лет, приблизительно 25 лет, приблизительно 20 лет, приблизительно 15 лет, приблизительно 10 лет, приблизительно 9 лет, приблизительно 8 лет, приблизительно 7 лет, приблизительно 6 лет, приблизительно 5 лет, приблизительно 4 лет, приблизительно 3 лет, приблизительно 2 лет или приблизительно одного года. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 12 месяцев, приблизительно 11 месяцев, приблизительно 10 месяцев, приблизительно 9 месяцев, приблизительно 8 месяцев, приблизительно 7 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 4 месяцев, приблизительно 3 месяцев, приблизительно 2 месяцев, приблизительно 1 месяца или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 6 недель, приблизительно 5 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 3 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 2 недель, приблизительно 1 недели или менее. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 24 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 2 часов или приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах реализации эмбрионы хранят в течение периода времени, составляющего менее, чем приблизительно 60 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 2 минут или приблизительно 1 минуты.

[0081] В некоторых вариантах реализации устройство содержит контейнер для содержания одного или более криоконсервированных эмбрионов. В некоторых вариантах реализации контейнер содержит области или камеры для содержания эмбрионов в растворе, по сторонам от которых находятся пузырьки воздуха. В некоторых вариантах реализации контейнер содержит области или камеры для отделения эмбрионов от других эмбрионов. В некоторых вариантах реализации контейнер содержит трубку.

Примеры

[0082] Задачей настоящего исследования является сравнение частот беременности, получаемых после переноса свежих, витрифицированных или замороженных посредством прямого переноса IVP-эмбрионов крупного рогатого скота. Яйцеклетки (n=3171), полученные путем захвата яйцеклетки коров породы Girolando, отбирали и помещали на созревание in vitro на 24 часа при 38,5°С с 5% СО₂ в воздухе и при влажности насыщения. ЭКО выполняли с использованием размороженной спермы, разделенной по полу, полученной от 5 быков голштинской породы. После ЭКО предполагаемые зиготы лишали оболочек и культивировали в течение семи дней при тех же температуре и влажности, которые использовались при созревании in vitro и ЭКО, но при 5% СО₂ и 5% О₂. Эмбрионы I класса на стадиях BL или ВХ переносили в свежем, витрифицированном или замороженном посредством прямого переноса (DT) виде. Эмбрионы переносили в организмы ранее синхронизированных реципиентов. Полученная частота зачатия составила 51,35% (133/259) для свежих эмбрионов, 34,62% (84/234) для витрифицированных эмбрионов и 42,11% (96/228) для эмбрионов, замороженных посредством прямого переноса. Уровень вероятности р<0,05 считался значимым. Частоты, полученные для витрифицированных или замороженных посредством прямого переноса IVP-эмбрионов, показывают, что криоконсервация IVP-эмбрионов позволила получить аналогичные результаты по сравнению с частотами, полученными после переноса свежих IVP-эмбрионов. Освещены положительные аспекты возможности криоконсервации IVP-эмбрионов и удобства прямого переноса.

Пример 1: Материалы и способы

[0083] За исключением отмеченных случаев, все реагенты приобрели в Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США). Процедуры аспирации фолликулов, созревания in vitro и экстракорпорального оплодотворения, описанные в примерах 1-3, использовали в примерах 4 и 5.

Пример 2: Сбор яйцеклеток и созревание in vitro

[0084] Работу осуществляли путем выполнения 112 процедур захвата яйцеклеток (OPU) под контролем УЗИ у 36 самок-доноров, являющихся полукровками, полученными при скрещивании голштинской породы и породы Gyr. После сеанса аспирации яйцеклетки (n=3171) промывали в среде ТСМ-199 (GIBCO BRL, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США) с Hepes-буфером с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (GIBCO BRL; Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США), 0,20 мМ пирувата натрия и 83,4 мг/мл амикацина (BIOCHIMICO Institute, Рио-де-Жанейро, Бразилия). Яйцеклетки заранее отбирали и классифицировали в мобильной лаборатории в хозяйстве. После отбора яйцеклеток их доставляли в лабораторию в 5-мл полистироловых пробирках BD Falcon, содержащих 400 мкл среды ТСМ-199 с добавлением 10% FBS, 1 мг/мл ФСГ (Folltropin™, Bioniche Animal Health, Бельвиль, Онтарио, Канада), 50 мг/мл ХГЧ (Profasi™, Serono, Сан-Паулу, Бразилия) и эстрадиола (1 мг/мл), 0,20 мМ пирувата натрия и 83,4 мг/мл амикацина, покрытые 350 мкл минерального масла. Выделенные яйцеклетки доставляли в лабораторию, расположенную в Можи-Мирим, штат Сан-Паулу, Бразилия, и хранили в той же транспортной пробирке со средой для созревания в течение 24 часов, считая от момента захвата яйцеклеток.

Пример 3: Подготовка спермы и экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО)

[0085] ЭКО выполняли с применением спермы быков голштинской породы, обогащенной сперматозоидами женского пола. Сперму размораживали (35°С в течение 30 с) и дважды промывали центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин) в 1 мл TALP с добавлением 0,2 мМ пирувата и 83,4 г/мл амикацина, забуференной 10 мМ Hepes-буфером. Концентрацию спермы доводили до 2×10⁶ подвижных сперматозоидов (sptz)/мл. Дозу для осеменения объемом 10 микролитров (10⁵ sptz) добавляли к каждой 50-мкл капле TALP-FIV (TALP с 10 г/мл гепарина, 18 М пеницилламина, 10 М и 8 М гипотаурина и эпинефрина) под минеральным маслом. Позже в каждую каплю добавляли 25-30 яйцеклеток. Инкубирование выполняли в течение 20-24 ч при 38,5°С в инкубаторе с 5% СО₂ и максимальной влажностью воздуха.

Пример 4: Эксперимент I - свежие IVP-эмбрионы. перенесенные после культивирования в присутствии или в отсутствие эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)

Культивирование эмбрионов in vitro

[0086] Яйцеклетки (n=665) собирали путем аспирации фолликулов под контролем УЗИ от доноров породы Girolando (n=25). Их подвергали ЭКО с применением спермы тех же голштинских быков, разделенной по полу, и случайным распределением яйцеклеток между группами.

[0087] Группа с FBS - предполагаемые зиготы (n=303) культивировали в 100-мкл каплях SOF (синтетической яйцеводной жидкости) (Wells et al., 1999) с добавлением 2,5% FBS+0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) под минеральным маслом. На третий (D3) и пятый день (D5) IVC 50% объема капель заменяли новой средой ("подкормка"). Культуральная среда для «подкормки» является той же средой, которую использовали во время раннего эмбрионального развития.

[0088] Группа без FBS - предполагаемые зиготы (n=362) культивировали в 100-мкл каплях SOF, модифицированной без использования FBS и с добавлением лишь 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА)+10 мкМ ЭДТА под минеральным маслом. На третий (D3) и пятый день (D5) IVC 50% объема капель заменяли новой средой ("подкормка"). Культуральная среда для «подкормки» является той же средой, которую использовали во время раннего эмбрионального развития.

[0089] Через 7 дней культивирования эмбрионы из групп с (n=82) или без FBS (n=88) переносили в свежем виде ранее синхронизированным коровам-реципиентам. Коров использовали в качестве реципиентов во время первой трети лактации. Для синхронизации реципиентов использовали следующий протокол:

[0090] - Нулевой день (D0) - 2 мг бензоата эстрадиола (Sincrodiol®)+размещение интравагинального имплантата (CIDR®)

[0091] - Седьмой день (D7) - 5 мл простагландина (Lutalyse®)

[0092] - Девятый день (D9) - удаление имплантата и нанесение 1 мг ципионата эстрадиола (ЕСР®)

[0093] - Восемнадцатый день (D18) - перенос эмбриона

[0094] В эксперименте 1 сравнивали частоту зачатия для эмбрионов, культивированных в двух различных средах с добавлением FBS или без нее. Как видно в таблице 1, различия между двумя группами отсутствовали. Данный пример демонстрирует, что свежие эмбрионы, выращенные в средах с добавлением FBS и без FBS, характеризуются аналогичной жизнеспособностью и частотой зачатия.

^а р<0,05

Пример 5: Сравнение частоты зачатия для IVP-эмбрионов, перенесенных в свежем, витрифицированном или замороженном посредством прямого переноса виде

Культивирование эмбрионов in vitro (IVC)

[0095] После процедур, описанных в примерах 2 и 3, предполагаемые зиготы совместно культивировали (случайные группы по 25 яйцеклеток в капле) в инкубаторе (38,5°С с 5% СО₂ и максимальной влажности воздуха) с зернистыми клетками. Эмбрионы для переноса в свежем или витрифицированном виде культивировали в 100-мкл каплях SOF (Wells et al., 1999) с добавлением 2,5% FBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) под минеральным маслом. На третий (D3) и пятый день (D5) IVC 50% объема капель заменяли новой средой ("подкормка"). Культуральная среда для «подкормки» является той же средой, которую использовали во время раннего эмбрионального развития. Скорость дробления оценивали на третий день культивирования (D3).

[0096] Эмбрионы, предназначенные для замораживания путем прямого переноса, культивировали в 100-мкл каплях SOF, модифицированной без использования FBS и с добавлением лишь 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 10 мкМ ЭДТА под минеральным маслом. На третий (D3) и пятый день (D5) IVC 50% объема капель заменяли новой средой ("подкормка"). Культуральная среда для «подкормки» является той же средой, которую использовали во время раннего эмбрионального развития. Скорость дробления оценивали на третий день культивирования (D3).

[0097] В конце периода культивирования (D7) поздние бластоцисты, соответствующие 1 классу, загружали и переносили в свежем виде в организмы ранее синхронизированных реципиентов. В отсутствие доступного количества реципиентов для всех полученных эмбрионов избыточные эмбрионы витрифицировали согласно протоколу, описанному в публикации SANCHES et al. (2013) или замораживали для прямого переноса в более позднее время.

Витрификация эмбриона

[0098] В данной работе эмбрионы криоконсервировали способом витрификации согласно протоколу, ранее описанному в SANCHES et al., 2013.

[0099] Вкратце, эмбрионы (Вх, n=234) помещали на 1 мин в уравновешивающий раствор (SE=10% ЭГ) + 10% диметилсульфоксида (ДМСО), а затем в раствор для витрификации на 20 секунд (VS=20% ЭГ + 20% ДМСО). Во время 20-секундного воздействия раствора для витрификации эмбрионы размещали в Cryotop® (Kitazato - Сидзуока -Япония) по три-пять эмбрионов на Cryotop и немедленно помещали в жидкий азот. Витрификация эмбрионов была основана на методике Cryotop, описанной в работе KUWAYAMA et al. (2005). В данной методологии используют концепцию минимального объема, при которой эмбрионы размещают в очень тонкой пластиковой пленке, присоединенной к пластиковому стержню, используемому для облегчения манипуляций.

Используемые растворы для витрификации получали в четырехлуночных планшетах (NUNC S/A, Роскилле, Дания). Среда TCM-HEPES (ТСМ-199 + 25 мМ Hepes + 10% FBS) являлась основой для получения растворов, содержащих EG и ДМСО, и эти реагенты добавляли только во время использования. В обеих группах в уравновешивающий раствор (ES) добавляли 20% FBS и раствор для витрификации (VS) с 0,5 М сахарозы. Вначале эмбрионы помещали в поддерживающую среду (TCM-HEPES), где их извлекали (по три-пять штук) и переносили в лунку 1, содержащую ES. В этом растворе эмбрионы оставались в течение минуты; вскоре после этого их переносили в лунку 2, содержащую VS, где экспонировали в течение 20 секунд. При этом эмбрионы непосредственно отбирали пипеткой и размещали на пластиковой пленке в наконечнике Cryotop, после чего образец помещали в жидкий азот.

Размораживание витрифицированных эмбрионов

[00100] Для размораживания витрифицированных эмбрионов устройства Cryotop, содержащие эмбрионы, помещали на воздух на четыре секунды, а затем погружали в прогревающий раствор (TCM-Hepes + 0,3-молярная сахароза) с температурой приблизительно 35°С. Удаление раствора для витрификации выполняли двукратным помещением (по 5 минут) в градиенты 0,3 М и 0,15 М сахарозы, соответственно, а затем переносили в поддерживающую среду TCM-Hepes (Vieira et al. 2002; Mezzalira et al, 2004).

Медленное замораживание эмбрионов

[00101] В целом, эмбрионы (n=228) криоконсервировали способом медленного замораживания, ранее описанным для эмбрионов, полученных in vivo (Voelkel and Hu, 1992). Бластоцисты и поздние бластоцисты помещали в раствор для замораживания (SC - de ), состоящий из 1,5 М этиленгликоля, на 10 минут. Чашку, содержащую SC и эмбрионы, оставляли на нагревательной плите при 35°С в течение этого периода. Эмбрионы загружали в 0,25-мл трубки, причем эмбрион размещали в центральной колонке, содержащей 1,5 М раствор этиленгликоля и окруженной четырьмя колонками с размораживающим раствором (SD - de ), отделенными друг от друга колонками с воздухом (фигура 1). Размораживающий раствор (SD) состоял из 0,75 М ЭГ (1,5 М ЭГ, разбавленного DPBS (Nutricell - Кампинас - Бразилия) в соотношении 1:1). После загрузки эмбрионы помещали в морозильник (ТК 1000® - Убераба -Бразилия), заранее стабилизированный при минус 6°С. Через две минуты после помещения в морозильник выполняли кристаллизацию («засев») колонок, находящихся непосредственно над и под колонкой с эмбрионом. Эмбрионы поддерживали в течение 10 минут при минус 6°С.

[00102] Запускали кривую замораживания, снижая температуру на 0,5°С в минуту до достижения уровня минус 32°С. В конце кривой замораживания эмбрионы погружали непосредственно в жидкий азот, где их хранили до переноса реципиенту. Общую схему см. также на фиг. 2А.

Размораживание и прямой перенос

[00103] Во время переноса эмбрионов, криоконсервированных путем прямого переноса, эмбрионы извлекали из контейнера с жидким азотом, помещали на воздух при комнатной температуре на 10 секунд, а затем погружали в теплую воду при 35°С на 30 секунд. Трубку высушивали бумажным полотенцем и слегка взбалтывали до перемешивания 5 колонок внутри нее. Целью этого действия являлось смешивание 4 колонок с размораживающим раствором с колонкой с раствором для замораживания в целях регидратации, уже начавшейся в трубке. После перемешивания колонок эмбрион переносили в рог матки реципиента. Общую схему см. также на фиг. 2В.

[00104] Самки, использовавшиеся в качестве реципиентов свежих, витрифицированных эмбрионов или эмбрионов, замороженных посредством прямого переноса, находились в первой трети лактации. Протокол синхронизации был аналогичен использованному в примере 4.

Статистический анализ

[00105] Частоту зачатия на 30 и 60 день анализировали биномиальной логистической регрессией в IBM SPSS Statistics версии 22 (IBM Inc., Армонк, штат Нью-Йорк, США), считая параметры протокола синхронизации, возраст реципиента, категорию животных (лактирующие или сухостойные) и быков, использованных при ЭКО, в качестве фиксированных эффектов. Уровень вероятности р<0,05 считали значимым.

Результаты

[00106] В примере 5 сравнивали частоту зачатия через 30 и 60 дней после переноса свежих, витрифицированных или замороженных посредством прямого переноса эмбрионов (таблица 2). В данном случае существовало различие между частотой зачатия при переносе свежих эмбрионов - 51,35% (133/259) по сравнению с обеими группами криоконсервированных эмбрионов. Однако различия в частоте зачатия при использовании витрифицированных эмбрионов (34,62% (84/234)) по сравнению с эмбрионами, замороженными посредством прямого переноса (42,11% (96/228)) отсутствовали (р<0,05).

^a,b р<0,05

Обсуждение

[00107] Подробно описано сравнение частоты зачатия для IVP-эмбрионов, перенесенных в свежем, витрифицированном или замороженном посредством прямого переноса виде. Это первое исследование такого рода, особенно учитывая согласованное количество перенесенных эмбрионов гибридов европейской коровы и зебу.

[00108] Данные, представленные Perry (2014) для 2013 г., показали, что в мире лишь 8,9% перенесенных IVP-эмбрионов подвергались криоконсервации. Безотносительно к теоретическим представлениям мы предполагаем, что этот низкий показатель может быть обусловлен повышенной чувствительностью и/или пониженной жизнеспособностью (например, при воздействии технологий ревитализации и/или переноса эмбрионов) указанных криоконсервированных эмбрионов по сравнению с свежими эмбрионами; этот низкий показатель является ограничительным аспектом применения этой технологии для большинства коммерческих лабораторий (George, 2008). Однако с учетом растущего количества IVP-эмбрионов поиск подходящих стратегий криоконсервации эмбрионов in vitro приобрел особую важность.

[00109] Более 90% распространяемых в мире эмбрионов получены in vitro (Perry, 2014), что означает значительные потери генетического материала, принадлежностей, материалов и качества продукта. Кроме того, при наличии требования работы только со свежими эмбрионами, возрастает важность техники перевозки эмбрионов, вводимых реципиентам. Помимо всех этих недостатков, утилизация избыточных эмбрионов увеличивает стоимость методики и снижает ее рентабельность и конкурентоспособность. Согласно данным PONTES (2013), In Vitro Brazil Company с 2002 по 2008 год уничтожила приблизительно 25000 IVP-эмбрионов из-за отсутствия общепринятого протокола криоконсервации.

[00110] Помимо проблем, связанных с криоконсервацией и/или использованием криоконсервированных эмбрионов, по-видимому, наблюдается значительный разрыв в технологиях, адаптированных для различных расовых типов крупного рогатого скота. Как известно, существуют различные репродуктивные различия между европейской коровой и зебу. Например, одно из этих различий относится к характеристикам органелл. При работе с эмбрионами in vivo VISINTIN et al. (2002) продемонстрировали специфические характерные различия эмбрионов Bos indicus и Bos taurus, особенно в количестве липидов в цитоплазме. Учитывая климатические и географические условия Бразилии, данная работа выполнена с использованием эмбрионов из стада молочных гибридов европейской коровы и зебу, состоящего из доноров породы Girolando. Этот гибрид производит 80% молока в Бразилии из-за его хорошей адаптируемости к производству молока в условиях пастбищ и по более низкой цене (Girolando, 2015).

[00111] Интерес к получению эмбрионов от коров породы Girolando в последние годы вызвал появление ряда публикаций. PONTES et al. (2010) выполнили сравнение получения эмбрионов путем аспирации фолликулов у доноров голштинской породы и породы Gir. В данном исследовании обнаружена большая эффективность получения эмбрионов/аспирации от коров Gir по сравнению с голштинской породой (3,2 и 2,2, соответственно). Однако получение эмбрионов от породы Girolando было в среднем вдвое более эффективным (5,5 бластоцист) по сравнению с указанными двумя другими породами. Настоящее изобретение учитывает, что такая улучшенная производительность IVP-эмбрионов гибридов европейской коровы и зебу дает возможность разработки улучшенных технологий криоконсервации эмбрионов, например, в свете большого количества образцов в экспериментах по исследованию выполнимости и получению беременностей.

[00112] IVP-эмбрионы в меньшей степени устойчивы к замораживанию по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo (Abe et al., 2002), и причиной этой повышенной чувствительности считали главным образом вышеуказанное накопление внутриклеточных липидов в цитоплазме IVP-эмбрионов (Abe et al, 2002;. Rizos et al, 2002;. Sudano et al, 2011). В данном контексте обнаружено, что добавление эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в среду, используемую при культивировании, обуславливало пониженную выживаемость эмбрионов после замораживания (Diez et al., 2001; Abe et al, 2002; Lonergan et al 2003). Однако максимальную концентрацию капель липидов в цитоплазме нельзя считать единственным вредоносным фактором для криоконсервирования; эта проблема является многофакторной, включая строгий контроль качества на всех стадиях IVP при получении высококачественных эмбрионов в целях их криоконсервации (Sudano et al., 2013).

[00113] В примере 4 в той же группе доноров выполнили аспирацию фолликулов и культивировали эмбрионы в отсутствие или в присутствии FBS. Цель заключалась в сравнении частоты беременности в обеих группах (с FBS или без нее) при переносе свежих эмбрионов. Существует несколько сообщений (George et al., 2008) о более выраженном удлинении плода и более заметном бластодиске у этих IVP-эмбрионов при культивировании с БСА по сравнению с эмбрионами, культивируемыми с FCS (эмбриональной телячьей сывороткой).

[00114] Прямое сравнение этих работ имело важное значение, например потому, что в большинстве других работ оценивали скорость повторного роста и выхода эмбрионов из оболочки, не достигая стадии переноса полученных эмбрионов. Кроме того, существует много различий между составом культуральной среды и условий культивирования в каждом из этих исследований.

[00115] В исследованиях, описанных в примере 4, не отмечено различий частоты беременности (Р<0,05) между группами, что позволило сделать вывод о том, что количество беременностей при внесении FBS в культуру in vitro согласовывалось с количеством беременностей при отсутствии использования FBS.

[00116] Настоящее изобретение принимает во внимание, что, помимо FBS и условий культивирования, существует еще один важный аспект, который следует учитывать, а именно криопротектор. Протоколы криоконсервации должны предотвращать образование кристаллов льда внутри клеток и принимать меры для минимизации токсического и осмотического стресса клеток во время замораживания (Campos-Chillon et al., 2006). Так, многие криопротекторы, например, глицерин и этиленгликоль (ЭГ), являются токсичными для эмбрионов (Dochi et al., 1988). Снижение времени воздействия этих криопротекторов на эмбрион перед замораживанием и после размораживания может снизить токсические эффекты, позволяя достичь повышенной жизнеспособности эмбрионов после размораживания (Sommerfield and Niemann, 1999).

[00117] В начале 1990-х гг. Voelkel and Hu (1992) продемонстрировали, что использование этиленгликоля в качестве криопротектора может быть альтернативой прямому переносу замороженных/размороженных эмбрионов при незначительно пониженной частоте зачатия по сравнению с частотой зачатия, достигаемой при использовании свежих эмбрионов (Voelkel and Hu, 1992, Leibo and Mapletoft, 1998). Способ прямого переноса включает этап регидратации эмбриональных клеток после размораживания, которую можно упростить, тем самым делая эту методику более доступной и простой для выполнения в полевых условиях. С тех пор прямой перенос стал общепринятым способом замораживания эмбрионов, полученных in vivo от доноров при суперовуляции.

[00118] Однако для IVP-эмбрионов наиболее широко используемым способом замораживания является витрификация (Morato and Mogas, 2014), главным образом из-за скорости замораживания и низкой стоимости. Это сильно повысило эффективность переноса эмбрионов и устранило его зависимость от наличия синхронизированных реципиентов. Независимо от используемого способа замораживания (витрификации или прямого переноса), частота зачатия при замораживании ниже, чем при использовании свежих эмбрионов (Leibo and Mapletoft, 1998). Недостатком витрификации является потребность в квалифицированных эмбриологах для повторного прогревания эмбрионов, что не входит в минимальную структуру, предусмотренную для лабораторий, и, следовательно, дополнительно затрудняет ее полевое и крупномасштабное применение (Morato and Mogas, 2014).

[00119] В настоящем исследовании авторы использовали протокол медленного замораживания (прямого переноса) эмбрионов с использованием 1,5 М этиленгликоля в качестве криопротектора эмбрионов. Однако в предыдущих экспериментах, выполненных группой авторов изобретения, обнаружено, что при замораживании эмбрионов в центральной колонке в 1,5 М этиленгликоле и внесении чистого DPBS в боковые колонки имел место пониженный выход эмбрионов из оболочки после размораживания. Безотносительно к теоретическим представления мы предполагаем, что одно из объяснений данных наблюдений может заключаться в очень быстрой регидратации эмбрионов во время прямого контакта с DPBS после размораживания.

[00120] Мы решили проверить возможность использования размораживающего раствора, состоящего из 0,75 М этиленгликоля и внесенного в четыре колонки по обеим сторонам от эмбриона. Таким образом, это могло замедлить приток воды к эмбриональным клеткам, что должно способствовать поддержанию их целостности. Аналогичная стратегия представлена для замораживания эмбрионов, полученных in vivo, при заполнении колонок по сторонам от эмбриона раствором под названием «стабилизирующая среда», состоящим из 0,37 М этиленгликоля (Voekel and Hu, 1992). В данной работе частота беременности в экспериментальной группе была аналогичной частоте беременности в контрольной группе (50%). Несмотря на относительно низкую частоту беременности (приблизительно 40%), важно учитывать, что снижение стресса для эмбрионов, полученных in vivo, поддерживает их развитие и обеспечивает повышенную частоту беременности. Таким образом, стратегию упаковки эмбрионов гибридов европейской коровы и зебу, полученных in vitro, можно считать успешной.

[00121] Еще одним важным моментом, обнаруженным в таких исследованиях, была минимальная выживаемость эмбрионов после замораживания при криоконсервации IVP-эмбрионов на стадии компактной морулы по сравнению с эмбрионами на стадии бластоцисты и поздней бластоцисты. Авторы обнаружили аналогичные результаты, рассмотрев частоту выхода морулы и бластоцисты из оболочки в качестве показателя выживаемости эмбрионов после криоконсервации медленным способом (Pollard and Leibo, 1993), однако согласованное мнение о лучшей для криоконсервации стадии эмбриона отсутствует (Saragusty and Arav, 2011).

[00122] Частота зачатия на 30 день после переноса свежих IVP-эмбрионов (51,4%) была выше (Р>0,05) частоты зачатия, полученной для IVP-эмбрионов, криоконсервированных посредством витрификации (34,6%) и прямого переноса (40,19%). Эти результаты были выше результатов, полученных в работе LIM et al. (2008), которые переносили IVP-эмбрионы, культивированные в отсутствие FBS и криоконсервированных посредством медленного замораживания (22,9%), а также выше, чем для IVP-эмбрионов, замороженных посредством витрификации с использованием методики открытой вытягиваемой трубки (Open Pulled Straw Technique, Vajta et al., 1998).

[00123] Безотносительно к теоретическим представлениям мы предполагаем, что комбинация культивирования без FBS со стратегией загрузки для размещения эмбрионов в трубчатом устройстве может быть причиной успешного применения нашего протокола. Кроме того, выполнена оценка частоты зачатия на 60 день беременности, которая была более высокой (Р>0,05) при переносе свежих эмбрионов (43,2%) по сравнению с результатами, аналогичными результатам, опубликованным Hasler et al. (1995), которые получили 42% частоту для IVP-эмбрионов европейской коровы, перенесенных на 7 день после оплодотворения.

[00124] Выводы, приведенные в настоящем документе, демонстрируют превосходство некоторых методологий прямого переноса (например, медленного замораживания) по сравнению с витрификацией, выполняемой согласно описанию в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения может быть желательно получить банк эмбрионов (например, с использованием технологий прямого переноса/медленного замораживания), который, например, можно поддерживать в первом местоположении (например, по месту получения). В некоторых вариантах реализации перенос таких поддерживаемых эмбрионов может оказаться более практичным, чем использование технологий витрификации.

[00125] В некоторых вариантах реализации технологии, описанные в настоящем документе, используют сперму, разделенную по полу; IVP обычно считается способом, обеспечивающим высокоэффективное использование спермы, разделенной по полу, что особенно важно для молочного животноводства.

[00126] В некоторых вариантах реализации можно использовать одно или более из изменений или усовершенствований, например, для снижения потерь эмбрионов на ранних стадиях развития, наблюдаемых в некоторых исследованиях, описанных в настоящем документе (например, при сравнении частоты беременности на 30 и 60 дни).

[00127] В числе прочего, в настоящем описании приведены достижения и успехи в получении беременности при использовании криоконсервации IVP-эмбрионов. Мы сделали вывод, что при использовании эмбрионов гибрида европейской коровы и зебу, полученных in vitro, можно получить частоту беременности приблизительно 40% после криоконсервации посредством витрификации или медленного замораживания/прямого переноса. Специалисты в данной области техники, читающие настоящее описание, должны принимать во внимание, что при применении описанной в нем информации в различных контекстах (например, у различных пород, различных видов, различных подвидов, различных скрещиваниях и/или различных гибридов, и т.д.) уместно ожидать достижения частоты беременности, равной по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 11%, приблизительно 12%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45% или приблизительно 50%, но в каждом случае существенно выше частоты, обычно наблюдаемой при использовании современных технологий (например, приблизительно 9%).

[00128] В особенности стоит отметить, что технологии, описанные в настоящем документе, особенно при их усовершенствовании и/или использовании (например, при достижении частоты беременности по меньшей мере 30%) стратегий эффективного медленного замораживания/прямого переноса, являются важным шагом к более широкому применению биотехнологий получения эмбрионов in vitro в животноводстве.

Эквиваленты

[00129] Специалист в данной области техники должен осознавать или быть способен выявить с помощью стандартных экспериментов большое количество эквивалентов конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Вышеприведенное описание предназначено не для ограничения рамок настоящего изобретения, а для объяснения прилагаемой формулы изобретения:

Изобретение относится к криоконсервации эмбрионов копытных для имплантации в организмы самок-реципиентов. Изобретение позволяет повысить процент оплодотворения. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Способ приготовления эмбрионов копытных, полученных in vitro, включающий следующие этапы:

культивирование незрелых яйцеклеток in vitro при первых условиях культивирования с получением зрелых яйцеклеток;

оплодотворение зрелых яйцеклеток спермой с образованием зигот;

удаление оболочек и культивирование зигот при вторых условиях культивирования, которые включают атмосферу в которой присутствует 5% O₂ и 5% СО₂, с приготовлением эмбрионов копытных, полученных in vitro;

получение эмбрионов копытных, полученных in vitro (IVP);

криоконсервацию указанных эмбрионов копытных; и перенос указанных эмбрионов копытных для имплантации в организмы реципиентов-копытных; при этом указанные криоконсервацию и перенос выполняют таким образом, который позволяет достичь для указанных IVP эмбрионов копытных частоты беременности, равной по меньшей мере приблизительно 10% после имплантации в организм реципиента-копытного.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сперма разделена по полу.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сперма не разделена по полу.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап культивирования незрелых яйцеклеток in vitro при первых условиях культивирования включает:

инкубирование яйцеклеток в пределах физиологически релевантного диапазона по меньшей мере одного из параметров, выбранных из группы, состоящей из: температуры, наличия или количества газа, влажности, рН, осмолярности и их комбинаций.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что наличие или количество газа выбирают из группы, состоящей из O₂ и CO₂.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап культивирования незрелых яйцеклеток in vitro при первых условиях культивирования включает:

инкубирование незрелых яйцеклеток при 35-40 °C в присутствии 3-9 % CO₂ и влажности насыщения.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап удаления оболочек и культивирования указанных зигот при вторых условиях культивирования включает инкубирование зигот при 35-40 °C и влажности насыщения.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап криоконсервации указанных эмбрионов копытных включает этапы:

инкубирование эмбрионов в растворе, содержащем криопротектор; и погружение эмбрионов в жидкий азот.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап криоконсервации указанных эмбрионов копытных включает этапы:

инкубирование указанных эмбрионов копытных в растворе для замораживания, состоящем из 1,0-4 M этиленгликоля, в течение 5-30 минут при первой температуре в диапазоне от приблизительно 10 °C до приблизительно 38 °C;

загрузку указанных эмбрионов в контейнер, где пузырьки воздуха отделяют эмбрионы от размораживающего раствора, содержащего этиленгликоль в изотонической разбавляющей среде;

воздействие температуры в диапазоне от приблизительно минус 2 °C до приблизительно минус 10 °C на указанные эмбрионы копытных в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 60 минут;

снижение температуры со скоростью в диапазоне от приблизительно минус 0,2 °C до приблизительно минус 0,8 °C в минуту до достижения второй температуры в диапазоне от приблизительно минус 30 °C до приблизительно минус 36 °C; и

погружение указанных эмбрионов копытных в жидкий азот для хранения.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что этиленгликоль присутствует в диапазоне конечных концентраций от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,3 моль.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанные эмбрионы копытных криоконсервируют для прямого переноса в организмы реципиентов-самок.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап переноса указанных эмбрионов копытных для имплантации включает этапы:

культивирование указанных эмбрионов копытных в среде с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА) под минеральным маслом в течение времени в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней; и

перенос указанных эмбрионов копытных в организмы реципиентов-копытных.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что среду выбирают из группы, состоящей из среды С4, синтетической яйцеводной жидкости (среды SOF), синтетической яйцеводной жидкости с аминокислотами (среды SOFaa) и их комбинаций.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что перенесенные эмбрионы находятся в стадии развития, выбранной из группы, состоящей из морулы, ранней бластоцисты, бластоцисты и поздней бластоцисты.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реципиентов-копытных синхронизируют.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реципиенты-копытные находятся в фазе естественного эструса.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные эмбрионы копытных являются свежими, витрифицированными или замороженными.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные реципиенты-копытные являются крупным рогатым скотом.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанных эмбрионов копытных выбирают из видов крупного рогатого скота, включая Bos taurus, Bos indicus и породы-гибриды Bos indicus-taurus.

20. Криоконсервированный эмбрион копытного, полученный способом согласно любому из пп. 1-19.

21. Устройство для криоконсервации и размораживания эмбрионов копытных, полученных in vitro, согласно любому из пп. 1-19, содержащее:

контейнер;

криоконсервированные эмбрионы копытного в растворе для криоконсервации, размещенные в первой области контейнера, по сторонам от указанной первой области находятся:

вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух, и по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся:

четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор, и по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся:

шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух, и по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся:

восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор.

22. Устройство по п. 21, отличающееся тем, что одна или более из областей является камерой, которая определена физическим отсеком, между которым и по меньшей мере одной из других смежных областей находится барьер.

23. Способ по п. 1, включающий этапы:

криоконсервация множества эмбрионов копытных; и

перенос множества эмбрионов в организмы реципиентов-копытных, причем криоконсервацию и перенос выполняют таким образом, который позволяет достичь частоты зачатия, равной по меньшей мере 30%.

24. Способ по п. 1, согласно которому этап криоконсервации указанных эмбрионов копытных включает следующие стадии:

помещение указанных эмбрионов копытных в раствор для замораживания (SC), состоящий из 1,0–4 М этиленгликоля, на 10 минут при температуре 35 °C;

размещение каждого эмбриона копытного в растворе для замораживания (SC) внутри контейнера, выполненного в размерах трубки, так что эмбрионы копытных в растворе для замораживания окружены четырьмя колонками размораживающего раствора (SD), разделенными колонками с воздухом, причем размораживающий раствор содержит 0,75 М этиленгликоля;

помещение контейнера в температурные условия, стабилизированные при температуре в диапазоне от приблизительно 0 °C до приблизительно минус 10 °C;

кристаллизацию колонок над и под указанными эмбрионами копытных через две минуты после помещения в морозильник;

поддержание указанных эмбрионов копытных в течение от 1 до 60 минут при температуре в диапазоне от приблизительно 0 °C до приблизительно минус 10 °C;

снижение температуры со скоростью в диапазоне от приблизительно минус 0,2 °C до приблизительно минус 0,8 °C в минуту до достижения второй температуры в диапазоне от приблизительно минус 30 °С до приблизительно минус 36 °C; и

погружение криоконсервированных эмбрионов копытных в жидкий азот.

25. Способ по п. 1, согласно которому перенос указанных эмбрионов копытных для имплантации включает размораживание указанных криоконсервированных эмбрионов копытных, полученных in vitro, при этом размораживание включает следующие этапы:

воздействие на контейнер, содержащий криоконсервированный эмбрион копытного в растворе для криоконсервации, размещенный в первой области контейнера, причем по сторонам от указанной первой области находятся:

вторая и третья области, каждая из которых содержит воздух, и по сторонам от указанных второй и третьей областей находятся:

четвертая и пятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор, и по сторонам от указанных четвертой и пятой областей находятся:

шестая и седьмая области, каждая из которых содержит воздух, и по сторонам от указанных шестой и седьмой областей находятся:

восьмая и девятая области, каждая из которых содержит размораживающий раствор при комнатной температуре воздуха в течение первого периода времени, причем первый период времени является достаточным для начала размораживания указанных криоконсервированных эмбрионов копытных;

помещение контейнера в размораживающую среду, характеризующуюся температурой размораживания в диапазоне от приблизительно 10 °C до приблизительно 38 °C, на второй период времени, причем второй период времени является достаточным для размораживания указанного раствора для замораживания; и

смешивание размораживающего раствора, раствора для замораживания и указанных эмбрионов копытных в контейнере.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что первый период времени соответствует температуре в диапазоне от приблизительно 10 °С до приблизительно 38 °C.

27. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что второй период времени соответствует температуре в диапазоне от приблизительно 20 °С до приблизительно 38 °C.

28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что размораживающая среда является или включает ванну с жидкостью.

29. Способ по п. 25, отличающийся тем, что температура размораживания находится в диапазоне от приблизительно 10 °С до приблизительно 38 °C.

30. Способ по п. 25, отличающийся тем, что этап смешивания достигается за счет аккуратного встряхивания контейнера.

31. Способ по п. 25, дополнительно включающий этапы:

культивирования указанных эмбрионов копытных в среде с добавлением бычьего сывороточного альбумина (BSA) под минеральным маслом, в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней; и

переноса эмбриона копытного в организм реципиента-копытного.

32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что перенос выполняют одновременно с или после этапа воздействия или этапа смешивания.

33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что этап переноса включает перенос в рог матки реципиента-копытного.