КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ ЯВЛЯЮЩИХСЯ ЧЕЛОВЕКОМ, С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА (rFSH) Российский патент 2019 года по МПК A01K67/02 

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, с применением биологически активного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (rFSH). Изобретение также относится к способам повышения овуляции, эмбриопродукции или беременностей у млекопитающего, не являющегося человеком, с применением rFSH. Изобретение может применяться, в частности, у копытных, таких как бычьи или лошадиные, при искусственном оплодотворении или программах оплодотворения in vitro.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Возможность повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, таких как крупный рогатый скот, лошади или другие копытные, может обладать значительной пользой для владельцев. Это может достигаться через повышение фертильности и/или плодовитости у данных млекопитающих, не являющихся человеком. В настоящее время для повышения репродуктивной активности предложено несколько способов или протоколов, основанных на применении эстрадиола и других гормонов, таких как GnRH (гонадотропин-рилизинг гормон), LH (лютеинизирующий гормон), ФСГ (фолликулостимулирующий гормон) или прогестагены (такие как прогестерон), для имитации естественных или близких к естественным уровней гормонов, встречаемых у намеченного вида. Некоторые из данных протоколов включают в себя стадию синхронизации овуляции у самок для содействия стимуляции, росту и овуляции фолликулов синхронным образом, делая возможным искусственное оплодотворение в установленное время, избегая необходимости выявления эструса. Эти так называемые протоколы синхронизации широко используются в стадах коммерческого молочного и мясного направления во всем мире.

Одна из наиболее распространенных обработок, применяющихся для синхронизации появления фолликулярных волн, предусматривает применение различных типов эстрогенов. Однако во многих частях мира данный стероидный гормон не может применяться, и были разработаны альтернативные способы для регулирования фолликулярной и лютеиновой фаз, ставя своей целью, например, улучшение процесса суперовуляции коров-доноров эмбрионов в странах, в которых эстрадиол является недоступным. Подход, который, по-видимому, является перспективным вариантом, состоит в инициировании обработок ФСГ в момент появления новой фолликулярной волны, вслед за GnRH-индуцированной овуляцией. В дополнение, поскольку период полувыведения доступных в настоящее время продуктов ФСГ, как правило, короткий (приблизительно 6 ч), протоколы суперовуляции включают обработку ФСГ дважды в день на протяжении от 4 до 5 дней, что является достаточно времязатратным, напряженным и допускает наличие погрешности. Кроме того, эти частые манипулирования во время разработанных в настоящее время схем суперовуляции делают просто невозможным их применение, например, у крупного рогатого скота мясного направления, содержащегося на пастбищах. Вследствие этого, стандартный подход к суперовуляции основан на многократных инъекциях ФСГ в момент появления фолликулярных волн, что в норме происходит через 8-12 дней после естественно возникающих эструсов. Данный способ известен как «основанный на эструсе» и, являясь эффективным в показателях эмбриопродукции, обусловлен стадией эстрального цикла, и требует выявления эструса. Поздние исследования выявили, что в программах, «основанных на эструсе», норма оплодотворяемости является значительно более низкой по сравнению с современными протоколами синхронизации, что допускает более оптимальный интервал от осеменения до овуляции.

Были проведены исследования с целью определения, может ли продление протокола стимуляции ФСГ усилить овуляторный ответ. Похоже, что авторы делают заключение, что удлинение периода инъекций ФСГ с 4 последовательных дней до 7 последовательных дней могло бы поддержать рост фолликулов и привести к большему числу фолликулов, приобретающих способность к овуляции. Больше исследований, проводящихся в настоящее время, подтверждают данную гипотезу для различных пород крупного рогатого скота.

В другом сообщаемом протоколе коров обрабатывали ФСГ в течение 3 дней вместо 4, и последние 2 инъекции на 4 день были заменены 2 инъекциями eCG (лошадиного хорионического гонадотропина) (Barros et al., 2008). Похоже, что данная обработка увеличила количество эмбрионов, несмотря на то, что время обработки все еще является долгим. В дополнение, eCG представляет собой достаточно длинную молекулу, и было описано, что она индуцирует образование антител при повторном применении и, может быть, ограничивает широкое/частое применение данных типов протоколов.

В попытке уменьшить количество инъекций ФСГ был разработан альтернативный протокол, в котором ФСГ встроен в медленно высвобождающийся полимер (гиалуронан). С применением данной медленно высвобождающейся готовой формы однократная инъекция была выполнена после графиков «основанной на эструсе» суперовуляции. Однако авторы изобретения заключают, что либо гиалуронан является слишком вязким, либо что однократная внутримышечная инъекция приводит к слабому суперовуляторному ответу (Bo et al., 2010).

EP 2134165 предлагает альтернативный способ повышения воспроизводства с применением одноцепочечного ФСГ, в котором обе субъединицы ковалентно связаны линкерным пептидом, который вводится в однократной дозе от 7 до 13 дней после эструса. Согласно данному способу, животных готовят к инъекции ФСГ посредством идентифицирования даты (дня последней половой охоты) реперного эструса (или половой охоты), а затем вводят ФСГ в виде однократной инъекции между 7-8 днями полового цикла животного. Результаты являются удовлетворительными, но индивидуальное наблюдение и мониторинг животных требует определения наиболее эффективного режима обработки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, с применением биологически активного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (rFSH). Настоящее изобретение также предоставляет улучшенные способы для повышения воспроизводства, конкретно, фертильности и плодовитости, у млекопитающих, не являющихся человеком.

Более конкретно, изобретение предоставляет улучшенные основанные на rFSH композиции и способы обработки, которые обеспечивают улучшенную репродуктивную активность у млекопитающих, не являющихся человеком, посредством минимизации количества введений и дозировки.

Конкретная цель изобретения относится к аналогу рекомбинантного rFSH или к композиции, содержащей аналог rFSH, для применения с целью повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, подвергаемых протоколу фолликулярной синхронизации и/или обработки. Более предпочтительно, аналог rFSH вводят за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между приблизительно 0,01 мкг и приблизительно 5 мг.

Конкретная цель изобретения относится к применению аналога рекомбинантного rFSH или композиции, содержащей аналог rFSH, для повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, подвергаемых протоколу фолликулярной синхронизации и/или обработки. Более предпочтительно, аналог rFSH вводят за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между приблизительно 0,01 мкг и приблизительно 5 мг.

Еще одна цель изобретения заключается в аналоге rFSH (или композиции, содержащей аналог rFSH) для применения с целью повышения репродуктивной активности у одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, при этом указанный аналог rFSH вводят каждому из указанных одному или нескольким млекопитающим, не являющимся человеком, после фолликулярной синхронизации за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг.

Еще одна цель изобретения заключается в способе повышения репродуктивной активности у одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, включающем введение каждому из указанных одному или нескольким млекопитающим, не являющимся человеком, после фолликулярной синхронизации одного единственного введения аналога rFSH предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг.

Дополнительной целью изобретения является способ индуцирования суперовуляции у одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, включающий введение каждому из указанных одному или нескольким млекопитающим, не являющимся человеком, аналога rFSH, при этом указанный аналог rFSH вводят указанным млекопитающим, не являющимся человеком, после протокола и/или обработки фолликулярной синхронизации за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг.

Еще одной целью изобретения является способ повышения скорости овуляции у одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, включающий введение каждому из указанных одному или нескольким млекопитающим, не являющимся человеком, аналога rFSH, при этом указанный аналог rFSH вводят указанным млекопитающим, не являющимся человеком, за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг. Введение предпочтительно выполняют после фолликулярной синхронизации.

Еще одной целью изобретения является улучшенный способ выработки или получения яйцеклеток у одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, включающий введение каждому из указанных одному или нескольким млекопитающим, не являющимся человеком, аналога rFSH, при этом указанный аналог rFSH вводят указанным млекопитающим, не являющимся человеком, за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг.

Введение предпочтительно выполняют после фолликулярной синхронизации. Данный способ является особо предпочтительным для улучшения выполнения протоколов или процедур оплодотворения in vitro (IVF).

В данном отношении дополнительная цель изобретения относится к способу оплодотворения in vitro (IVF), включающему стадию получения яйцеклеток от донора-млекопитающего, не являющегося человеком, и стадию оплодотворения in vitro указанных яйцеклеток, в котором донора-млекопитающего, не являющегося человеком, обрабатывают посредством одного единственного введения аналога rFSH предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг для увеличения выработки яйцеклеток. Введение предпочтительно выполняют после фолликулярной синхронизации донора-млекопитающего, не являющегося человеком.

Еще одной целью изобретения является способ улучшения количества и качества желтого тела у млекопитающего, не являющегося человеком, включающий введение указанному млекопитающему, не являющемуся человеком, аналога rFSH, в котором указанный аналог rFSH вводят указанному млекопитающему, не являющемуся человеком, за одно единственное введение предпочтительно в диапазоне доз между 10 мкг и 1 мг.

В отдельном варианте осуществления изобретение относится к способу, включающему:

(a) предоставление млекопитающего, не являющегося человеком (например, копытного), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (например, копытных), которые были обработаны для синхронизации фолликулов; или обработку млекопитающего, не являющегося человеком (например, копытного), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (например, копытных), для синхронизации фолликулов;

(b) введение указанному млекопитающему, не являющемуся человеком, или группе млекопитающих одной однократной дозы аналога rFSH в диапазоне доз между приблизительно 0,01 мкг и приблизительно 5 мг, предпочтительно посредством инъекции, более предпочтительно посредством внутримышечной инъекции; и

(c) осеменение млекопитающего, не являющегося человеком, или группы млекопитающих, не являющихся человеком, предпочтительно посредством искусственного оплодотворения, предпочтительно близко ко времени овуляции, а более предпочтительно от 2 до 7 дней, даже более предпочтительно от 4 до 6 дней после стадии (b) введения.

Данный способ избегает необходимости выявления или осуществления контроля над эструсом и является более эффективным, особенно для групп млекопитающих, не являющихся человеком.

В еще одном отдельном варианте осуществления изобретение относится к способу, включающему:

(a) предоставление копытного или группы копытных, которые были обработаны для синхронизации фолликулов; или обработку копытного или группы копытных для синхронизации фолликулов;

(b) введение указанному копытному или группе копытных одной однократной дозы аналога rFSH в диапазоне доз между приблизительно 10 мкг и приблизительно 1 мг, предпочтительно посредством инъекции, более предпочтительно посредством внутримышечной инъекции;

(c) получение яйцеклеток от копытного предпочтительно посредством фолликулярной аспирации;

(d) необязательно, оплодотворение in vitro полученных яйцеклеток; и

(e) необязательно имплантацию оплодотворенных яйцеклеток животному-реципиенту, предпочтительно животному-реципиенту, предварительно обработанному посредством введения одной однократной дозы аналога rFSH в диапазоне доз между приблизительно 10 мкг и приблизительно 1 мг.

Аналог rFSH для применения в настоящем изобретении представляет собой предпочтительно одноцепочечный rFSH. Кроме того, аналог rFSH предпочтительно применяют по существу в очищенном виде, необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами или носителями.

Изобретение может применяться у млекопитающих, не являющихся человеком, и предпочтительно у любого копытного, такого как коровы, мелкие жвачные, лошади, овцы или козы. Композиции и способ изобретения являются особо эффективными для повышения фертильности и/или плодовитости и, особенно, суперовуляции, скорости овуляции, продукции яйцеклеток или количества и качества желтого тела (CL) у коров.

ПОДПИСИ К ФИГУРАМ

Фиг. 1: протокол, применяемый для повышения репродуктивной активности с аналогом rFSH.

Фиг. 2: нуклеотидная и аминокислотная последовательность аналога rFSH бычьих для применения в изобретении. Подчеркнута последовательность линкера CTP, который связывает бета- и альфа-субъединицы. Подчеркнутые и выделенные жирным шрифтом нуклеотиды кодируют сигнальный пептид.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет способы повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, и предпочтительно копытных, даже более предпочтительно крупного рогатого скота. В частности, применяют рекомбинантный одноцепочечный ФСГ для стимулирования фертильности и/или плодовитости у самок млекопитающих, не являющихся человеком, как проиллюстрировано с помощью суперовуляции, увеличения эмбриопродукции и/или увеличения беременностей. Рекомбинантный одноцепочечный ФСГ является также эффективным для стимулирования роста и созревания фолликулов, приводя к улучшенному получению яйцеклеток, суперовуляции и скорости овуляции, и для улучшения количества и качества желтого тела (CL).

Рекомбинантный одноцепочечный ФСГ может применяться в протоколах и/или обработках осеменения, в том числе для трансплантации эмбрионов и оплодотворения in vitro. Изобретение может применяться у любого копытного, предпочтительно бычьих.

Определения

В контексте настоящего изобретения термин «повышающий репродуктивную активность» или «повышенная репродуктивная активность» относится к повышению вероятности, что млекопитающее, не являющееся человеком, или множество млекопитающих, не являющихся человеком, будут способны к зачатию и плодовиты.

Повышение репродуктивной активности включает в себя стимуляцию роста и/или созревания фолликулов или улучшение количества и качества желтого тела. Повышенная репродуктивная активность также включает в себя повышенную вероятность, что млекопитающее, не являющееся человеком, или множество млекопитающих, не являющихся человеком, которые были подвергнуты осеменению, станут беременными, будут давать живое потомство, или у них разовьются жизнеспособные эмбрионы.

Повышение репродуктивной активности также включает в себя повышение количества жизнеспособных эмбрионов млекопитающего, не являющегося человеком, или множества млекопитающих, не являющихся человеком, производимых in utero и/или in vitro. Повышение репродуктивной активности включает в себя повышение фертильности, плодовитости, суперовуляции, нормы овоцитов, скорости овуляции, эмбриопродукции и/или беременностей. Предпочтительно увеличение происходит приблизительно по меньшей мере на 1% по сравнению с необработанными млекопитающими, не являющимися человеком, более предпочтительно по меньшей мере на 2%, 3%, 4%, 5%, 10% или более.

Термин «фертильность» или «фертильный» относится, в контексте данного изобретения, к способности продуцировать годные для оплодотворения яйцеклетки.

Термин «плодовитый» или «плодовитость» относится, в контексте данного изобретения, к способности к завершенной беременности.

Термин «суперовуляция» относится, в контексте данного изобретения, к повышению количества овулировавших фолликулов и/или к образованию яйцеклетки, способной к оплодотворению.

Термин «беременная» относится к млекопитающему, не являющемуся человеком, или к группе млекопитающих, не являющихся человеком, некоторые из которых в настоящее время являются беременными или которые были подвергнуты осеменению и могут быть беременными.

Как применяется в данном документе, термин «эструс» относится к периоду, во время которого млекопитающее, не являющееся человеком, наиболее вероятно может забеременеть. Эструс могут быть выявлен или отслежен посредством поведенческой демонстрации, что млекопитающее, не являющееся человеком, находится в фазе половой охоты, включая демонстрирование состояния половой охоты.

«Осеменение» относится к введению семенной жидкости посредством любого способа, известного в отрасли изобретения, включая, но не ограничиваясь, естественное и искусственное оплодотворение (AI) и оплодотворение in vitro (IVF).

«Группа» животных обозначает любую группу по меньшей мере из 2 млекопитающих, не являющихся человеком, например, стадо или отару.

«Копытное» относится к любому животному, имеющему копыта, и особенно к двум таксономическим порядкам непарнокопытных и китопарнокопытных.

Термин «введение» относится ко всем путям введения, таким как пероральный, энтеральный, мукозальный, парентеральный или чрескожный. Предпочтительным путем введения является инъекция.

Термин «фолликулярная синхронизация» относится, в контексте данного изобретения, к синхронизации появления фолликулярных волн.

Аналог рекомбинантного ФСГ

Фолликулостимулирующий гормон принадлежит к классу гормонов фертильности. ФСГ состоит из двух цепей (или субъединиц), названных альфа и бета. В физиологических условиях обе субъединицы связаны нековалентной связью. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности ФСГ различных видов, такие, как бычий ФСГ, были раскрыты и являются доступными в общедоступных базах данных (Kim KE et al., 1988, «nucleotide sequence of the bovine gene for follicle-stimulating hormone beta-subunit», DNA1988, 7(4): 227-233), или ФСГ человека: номер банка генов: CAA43996.1.

Настоящее изобретение задействует аналог ФСГ. Термин «аналог» обозначает, в целом, соединение, которое имитирует физиологическое действие природного соединения. Аналог является структурно-идентичным природному соединению и может представлять структурные различия как результат, например, способов производства, или поскольку различия обеспечивают аналогу благоприятную активность.

В предпочтительном варианте осуществления аналог ФСГ изобретения представляет собой ФСГ, имеющий две ковалентно связанные альфа- и бета-субъединицы. Данный предпочтительный аналог ФСГ может быть также назван «одноцепочечным» ФСГ.

В предпочтительном варианте осуществления в изобретении применяется рекомбинантный ФСГ, в котором альфа-субъединица ковалентно связана с бета-субъединицей посредством линкерного пептида. Изобретение демонстрирует, что данный рекомбинантный одноцепочечный аналог ФСГ предоставляет улучшенные свойства для повышения репродуктивной активности у копытных. Линкерным пептидом может быть любой линкерный пептид, который не воздействует на конформацию или активность ФСГ. В предпочтительном варианте осуществления линкер представляет собой CTP-линкер, например, линкер, который включает в себя последовательность карбокситерминального пептида человеческого хорионического гонадотропина, как описано в US 6242580 и US 2008/0312151. В еще одном варианте осуществления линкер представляет собой пептид, включающий в себя последовательность (G₄S), которая может быть повторена несколько раз.

кДНК и аминокислотная последовательность рекомбинантного бычьего аналога ФСГ для применения в настоящем изобретении предоставлена на фиг. 2 (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4). Первая часть (аминокислоты 1-129) соответствует последовательности бета-субъединицы бычьего ФСГ (SEQ ID NO: 2), центральная часть соответствует линкеру карбокситерминального пептида (аминокислоты 130-157), а третья часть (аминокислоты 158-253) соответствует последовательности альфа-субъединицы бычьего ФСГ (SEQ ID NO: 1, см. также EP 2134165).

Один вариант осуществления изобретения применяет одноцепочечный рекомбинантный бычий ФСГ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или аминокислотную последовательность, обладающую 90% или большей, предпочтительно 95% или большей, гомологичностью к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Когда способ предназначен для обработки коров, является предпочтительным применение бычьего аналога ФСГ, как раскрыто выше, т.е. рекомбинантного ФСГ, в котором альфа- и бета-домены являются производными бычьего ФСГ и связаны линкерным пептидом.

Когда способ предназначен для обработки другого копытного, является предпочтительным применение аналога ФСГ, производного от указанного копытного.

Белок является предпочтительно по существу чистым, т.е. со степенью чистоты, составляющей по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 97, 98 или 99%.

В предпочтительном варианте осуществления ФСГ вводят в композиции, содержащей подходящий фармацевтический состав. Фармацевтический состав может включать один или несколько эксципиентов или носителей.

В одном предпочтительном варианте осуществления бычий ФСГ обладает активностью выше 10000 МЕ/мг; более предпочтительно выше 13000 МЕ/мг, такой как приблизительно 16000 МЕ/мг. Согласно коэффициенту пересчета, опубликованному практическим комитетом ASRM (Fertility and Sterility, vol90, supl3, November 2008 - American Society for Reproductive Medecine), 10000 МЕ бычьего ФСГ соответствует 600 мкг.

Обработка

Как предварительно указано, изобретение относится к новым способам повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, с применением аналога рекомбинантного ФСГ. Изобретение может применяться в программах осеменения, конкретно, при искусственном оплодотворении копытных, например, для улучшения скорости овуляции и/или суперовуляции и/или количества и качества желтого тела у обрабатываемых животных; а также программах оплодотворения in vitro, например, для улучшения получения яйцеклеток от доноров-животных и/или нормы беременности у животных-реципиентов.

Более конкретно, цель изобретения относится к рекомбинантному аналогу ФСГ для применения с целью повышения репродуктивной активности у млекопитающих, не являющихся человеком, при этом указанный рекомбинантный ФСГ включает в себя альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида, и при этом указанный рекомбинантный ФСГ вводят указанным млекопитающим, не являющимся человеком, после фолликулярной синхронизации за одно единственное введение предпочтительно в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг.

Еще одна цель изобретения заключается в способе повышения репродуктивной активности или эмбриопродукции у млекопитающих, не являющихся человеком, включающем применение для указанных млекопитающих, не являющихся человеком, после фолликулярной синхронизации одного единственного введения аналога рекомбинантного ФСГ в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг, при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ включает в себя альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида.

Еще одна цель изобретения заключается в способе улучшения получения яйцеклеток у млекопитающих, не являющихся человеком, включающем применение для указанных млекопитающих, не являющихся человеком, после фолликулярной синхронизации одного единственного введения аналога рекомбинантного ФСГ в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг, при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ включает в себя альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида.

Еще одна цель изобретения заключается в способе повышения нормы беременности у млекопитающих, не являющихся человеком, включающем применение для указанных млекопитающих, не являющихся человеком, после фолликулярной синхронизации одного единственного введения аналога рекомбинантного ФСГ в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг, при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ включает альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида.

Еще одна цель изобретения заключается в способе повышения скорости овуляции у млекопитающих, не являющихся человеком, включающем применение для указанных млекопитающих, не являющихся человеком, после фолликулярной синхронизации одного единственного введения аналога рекомбинантного ФСГ в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг, при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ включает альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида.

Дополнительной целью изобретения является способ индуцирования суперовуляции у млекопитающих, не являющихся человеком, включающий введение млекопитающему, не являющемуся человеком, аналога рекомбинантного ФСГ, при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ включает в себя альфа-субъединицу и бета-субъединицу, которые ковалентно связаны посредством линкерного пептида, и при этом указанный рекомбинантный аналог ФСГ вводят указанному млекопитающему после фолликулярной синхронизации за одно единственное введение предпочтительно в дозе в диапазоне между 10 мкг и 1 мг.

В предпочтительном варианте осуществления способ включает:

(a) обработку млекопитающего, не являющегося человеком, (такого как копытное), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (такой как группа копытных), для синхронизации фолликулов, или предоставление млекопитающего, не являющегося человеком (такого как копытное), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (такой как группа копытных), которые были обработаны для синхронизации фолликулов;

(b) введение обрабатываемому млекопитающему, не являющемуся человеком (млекопитающим, не являющимся человеком), между 10 мкг и 1 мг аналога рекомбинантного ФСГ в однократной дозе; и

(c) необязательно, осеменение млекопитающего, не являющегося человеком (млекопитающих, не являющихся человеком), и/или сбор яйцеклеток предпочтительно близко ко времени овуляции, а более предпочтительно от 2 до 7 дней, даже более предпочтительно от 4 до 6 дней после стадии (b) введения.

В первой стадии обработки синхронизируют появление новой фолликулярной волны. Изобретение демонстрирует, что, в сочетании с рекомбинантным ФСГ изобретения, данная обработка позволяет улучшить эмбриопродукцию, даже при более низкой дозе гормона и с меньшим количеством инъекций.

Рост фолликулов у млекопитающих, не являющихся человеком, таких как коровы, не является продолжительным, но бывает в виде волн (от 2 до 4 волн на цикл). Каждая волна начинается приблизительно, когда доминантный фолликул предыдущей волны достигает максимального размера, в это время многочисленные малые фолликулы начинают период быстрого роста. Из данной группы фолликулов один фолликул имеет возможность роста до гораздо большего размера, чем другие. Данный большой фолликул называется доминантный фолликул, поскольку он обладает способностью регулировать и ограничивать рост более мелких фолликулов, называемых подчиненными фолликулами. Через несколько дней после достижения максимального размера доминантный фолликул начинает регрессировать и погибает. Поскольку доминантный фолликул деградирует, его способность ограничивать другие фолликулы уменьшается; вследствие этого инициируется новая фолликулярная волна. Следствие данного динамического процесса состоит в том, что фолликулы всех размеров, включая по меньшей мере один большой фолликул, существуют каждый день эстрального цикла.

Синхронизация фолликулярных волн предоставляет возможность обработки всех млекопитающих, не являющихся человеком, в ограниченный период времени и, вследствие этого, получения экономической выгоды от осеменения. В результате синхронизации эстрального цикла высокий процент обработанных самок демонстрирует фертильные, точно синхронизированные эструс и овуляцию.

Протоколы синхронизации овуляции или синхронизированного искусственного оплодотворения относятся к способам и/или протоколам, которые искусственно стимулируют рост фолликулов и синхронизированной овуляции, так что овуляция инициируется в предварительно заданное время без необходимости отслеживать половое поведение. Обзор общепринятых способов и протокол, применяющийся у коров, описаны в статье Bo с соавт. в 28^th Annual meeting AETE- Saint Malo, France, 7-8^th September 2012 (Recent advances in the control of follicular development and superovulation protocols in cattle).

Появление новой фолликулярной волны может быть выполнено посредством гормональной или физической обработки. Гормональная обработка включает в себя введение подходящих гормонов, таких как простагландин (простагландины), прогестаген (прогестагены) или GnRH. Физическая обработка включает в себя абляцию фолликулов.

В предпочтительном варианте осуществления фолликулярную синхронизацию получают посредством гормональной обработки млекопитающего, не являющегося человеком (млекопитающих, не являющихся человеком), предпочтительно прогестагенами, комбинациями прогестаген-простагландин, исключительно простагландинами, комбинациями прогестаген-эстроген и комбинациями гонадотропин-простагландин с прогестагенами или без них.

В предпочтительном варианте осуществления фолликулярную синхронизацию получают посредством следующих обработок:

- PGF-2альфа или его аналогами;

- GnRH + PGF-2альфа;

- Прогестагеном (в виде прогестерона...), необязательно в сочетании с эстрогеном или PGF-2альфа или GnRH.

В области изобретения раскрыты конкретные дозировки и/или протоколы, такие как, например, у Thatcher et al, 2001 (American Association of Bovine Practitioner, AABP, Vancouver, 95-105); Diskin et al., 2001 (occasional publication №26, p. 175, British society of Animal Science); или у Pursley et al., 1995 (Theriogenology 44 p. 915). Также, прогестагены могут вводиться с применением специальных устройств, таких как импланты (например, PRID, of Ceva Sante Animale).

В еще одном варианте осуществления фолликулярную синхронизацию получают посредством абляции фолликулов. Абляция фолликула обозначает устранение, удаление или разрушение по меньшей мере одного фолликула. Фолликулярная абляция относится к физическим способам фолликулярной абляции, таким как каутеризация или трансвагинальная аспирация фолликулов под ультразвуковым наведением на случайно выбранных стадиях эстрального цикла (Bergfelt, 1997). Абляция может быть направлена на все фолликулы или только на один или два наиболее крупных фолликула (Baracaldo et al., 2000) для обеспечения подавления по меньшей мере доминантного фолликула.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу, включающему:

(a) обработку млекопитающего, не являющегося человеком, (такого как копытное), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (таких как копытные), прогестагеном, комбинацией прогестаген-простагландин, простагландином, комбинацией прогестаген-эстроген или комбинацией гонадотропин-простагландин с прогестагенами или без них для синхронизации фолликулов; или предоставление млекопитающего, не являющегося человеком (такого как копытное), или группы млекопитающих, не являющихся человеком (таких как копытные), которые были обработаны прогестагеном, комбинацией прогестаген-простагландин, простагландином, комбинацией прогестаген-эстроген или комбинацией гонадотропин-простагландин с прогестагенами или без них для синхронизации фолликулов;

(b) введение обрабатываемым млекопитающим, не являющимся человеком (таким как копытные), между 10 мкг и 1 мг аналога рекомбинантного ФСГ в одной однократной дозе; и

(c) необязательно, осеменение обрабатываемого млекопитающего, не являющегося человеком (такого как копытное), из (b) и/или сбор яйцеклеток у обрабатываемого млекопитающего, не являющегося человеком (такого как копытное), из (b) предпочтительно близко ко времени овуляции, а более предпочтительно от 2 до 7 дней, даже более предпочтительно от 4 до 6 дней после стадии (b) введения.

На стадии (b) рекомбинантный аналог ФСГ может вводиться с применением любых средств или методик, известных как таковые в области изобретения, включая, без ограничения, системное введение, например, внутримышечное, внутривенное, подкожное и т.д. Предпочтительным путем введения является внутримышечная инъекция.

В предпочтительном варианте осуществления в композиции или способе изобретения применяют однократную дозу аналога rFSH, составляющую 50 мкг.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления в композиции или способе изобретения применяют однократную дозу аналога rFSH, составляющую 100 мкг.

Результаты, представленные в экспериментальной части, демонстрируют, что у синхронизированных млекопитающих, не являющихся человеком, таких как копытные, данное однократное введение вызывает продуцирование фертильных эмбрионов и существенно повышает репродуктивную активность.

В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя стадию (c) осеменения указанного копытного предпочтительно близко ко времени овуляции, а более предпочтительно от 2 до 7 дней, даже более предпочтительно от 4 до 6 дней после введения аналога rFSH.

Необязательно вводят дополнительные гормоны, такие как лютеинизирующий гормон, хорионический гонадотропин и простагландин, а также rFSH. В одном варианте осуществления простагландин вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, в дополнение к введению аналога rFSH. Простагландин необязательно вводят в виде однократной дозы, обычно посредством инъекции, или в виде многократных доз, вводимых с интервалом в несколько часов. В одном варианте осуществления первую дозу простагландина дают млекопитающему, не являющемуся человеком, после введения аналога rFSH, за которой следует вторая доза простагландина, которую дают млекопитающему, не являющемуся человеком, приблизительно от 6 часов до 1 дня после первой дозы простагландина.

В качестве альтернативы способ включает в себя стадию (c) получения или сбора яйцеклеток у обработанного млекопитающего, не являющегося человеком, из (b) предпочтительно близко ко времени овуляции, а более предпочтительно от 2 до 7 дней, даже более предпочтительно от 4 до 6 дней после введения аналога rFSH. Яйцеклетки могут быть получены посредством методик, хорошо известных в области изобретения, таких как, без ограничения, фолликулярная аспирация. Собранные яйцеклетки демонстрируют улучшенные характеристики плодовитости. Собранные яйцеклетки могут быть оплодотворены in vitro и в последующем перемещены млекопитающим-реципиентам, не являющимся человеком, например, копытным.

Изобретение может применяться у любых копытных, таких как коровы, овцы, козы, олени, яки, азиатские буйволы, бизоны, антилопы, газели, лоси, северные олени, лоси, толсторогие бараны, жирафы, верблюды, свиньи, лошади, альпаки и викуньи. Оно особенно подходит для обработки самок крупного рогатого скота мясного и молочного направления, включая телок.

Дополнительные аспекты и преимущества изобретения будут раскрыты в последующей экспериментальной части, которая иллюстрирует заявленное изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 - ДЕЙСТВИЕ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ОДНОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ 50 мкг АНАЛОГА rFSH У СИНХРОНИЗИРОВАННЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ ЯВЛЯЮЩИХСЯ ЧЕЛОВЕКОМ

Авторы изобретения обработали 14 телок молочного направления одной единственной внутримышечной инъекцией коровьего аналога rFSH (50 мкг/телку). Инъекцию выполняли через 30 ч (в окне от 24 до 48 ч) после фолликулярной абляции. Коровий аналог rFSH применяли, как показано на фиг.2. Протокол обработки представлен на фиг.1.

Все группы получали две инъекции простагландина PGF-2α на 2 день и 3 день после первой инъекции ФСГ (F0). Инъекцию hCG (человеческого хорионического гонадотропина) выполняли на 5 день после F0 и искусственное оплодотворение (AI) выполняли через 12 ч и 24 ч после обработки hCG. Сбор эмбрионов посредством нехирургической процедуры происходил через 7 дней после AI.

В качестве контрольной обработки применяли Folltropin®-V (Bioniche Animal Health Product, Canada). Folltropin®-V представляет собой очищенный лиофилизированный экстракт фоллитропина, полученный из гипофизов свиней. Folltropin®-V (50 мг) вводили внутримышечно, дважды в день, в уменьшающихся дозах в течение четырех дней (кумулированный ФСГ в конце обработки составляет 400 мг/телку). 14 телок молочного направления были обработаны Folltropin®-V.

Измеряли различные параметры:

- суперовуляцию: суперовуляция считалась успешной при >2 CL (желтых тел) в день промывания;

- скорость овуляции: основана на LSM (средние значения, полученные методом наименьших квадратов) овуляторного ответа на корову общей группы;

- качество эмбрионов: основано на LSM (средние значения, полученные методом наименьших квадратов) количества жизнеспособных эмбрионов на корову общей группы.

Результаты представлены в следующей таблице.

rFSH/однократная инъекция 50 мкг Включено в исследование телок (n) 14 Суперовулировано телок (n)* 13 Суперовулировано телок (%) 92,8 Скорость овуляции 81% Среднее количество CL 14,2 Количество жизнеспособных эмбрионов (VE) 7,9 VE против Folltropin®-V VE 134%

Результаты демонстрируют, что обработка изобретения может явно индуцировать суперовуляторный ответ у крупного рогатого скота. В качестве сравнения, у телок, обработанных в соответствии с контрольным протоколом (8 инъекций природного ФСГ, такого как Folltropin®-V, 400 мг), обработка изобретения (однократная инъекция аналога rFSH, 50 мкг) привела к более высокой скорости овуляции (81% против 76%) и большему количеству жизнеспособных эмбрионов (7,9 против 5,9). Соответственно, даже если одна телка не суперовулировала с обработкой изобретения (при том, что все проделано с контрольной обработкой), качество эмбрионов представляется лучшим с изобретением. Соответственно, комбинация обработки фолликулярной синхронизацией с однократной инъекцией аналога rFSH делает возможным устойчивое продуцирование суперовулированных эмбрионов.

ПРИМЕР 2 - ДЕЙСТВИЕ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ОДНОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ 100 мкг АНАЛОГА rFSH У СИНХРОНИЗИРОВАННЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ ЯВЛЯЮЩИХСЯ ЧЕЛОВЕКОМ

Авторы изобретения обработали 14 телок молочного направления одной единственной внутримышечной инъекцией коровьего аналога rFSH (100 мкг/телку). Инъекцию выполняли через 30 ч (в окне от 24 до 48 ч) после фолликулярной абляции. Коровий аналог rFSH применяли, как показано на фиг. 2. Протокол обработки представлен на фиг.1.

Все группы получали две инъекции простагландина PGF-2α на 2 день и 3 день после первой инъекции ФСГ (F0). Инъекцию hCG (человеческого хорионического гонадотропина) выполняли на 5 день после F0 и искусственное оплодотворение (AI) выполняли через 12 ч и 24 ч после обработки hCG. Сбор эмбрионов посредством нехирургической процедуры происходил через 7 дней после AI.

В качестве контрольной обработки применяли Folltropin®-V (Bioniche Animal Health Product, Canada). Folltropin®-V представляет собой очищенный лиофилизированный экстракт фоллитропина, полученный из гипофизов свиней. Folltropin®-V (50 мг) вводили внутримышечно, дважды в день, в уменьшающихся дозах в течение четырех дней (кумулированный ФСГ в конце обработки составляет 400 мг/телку). 14 телок молочного направления были обработаны Folltropin®-V.

Измеряли различные параметры:

- суперовуляцию: суперовуляция считалась успешной при >2 CL (желтых тел) в день промывания;

- скорость овуляции: основана на LSM (средние значения, полученные методом наименьших квадратов) овуляторного ответа на корову общей группы;

- качество эмбрионов: основано на LSM (средние значения, полученные методом наименьших квадратов) количества жизнеспособных эмбрионов на корову общей группы.

Результаты представлены в следующей таблице.

rFSH/однократная инъекция 100 мкг Включено в исследование телок (n) 14 Суперовулировано телок (n)* 12 Суперовулировано телок (%) 85,7 Скорость овуляции 88% Среднее количество CL 14,7 Количество жизнеспособных эмбрионов (VE) 3,8

Результаты демонстрируют, что обработка изобретения может явно индуцировать суперовуляторный ответ у крупного рогатого скота. В качестве сравнения, у телок, обработанных в соответствии с контрольным протоколом (8 инъекций природного ФСГ, такого как Folltropin®-V, 400 мг), обработка изобретения (однократная инъекция аналога rFSH, 100 мкг) приводит к более высокой скорости овуляции (88% против 76%). Соответственно, даже если одна телка не суперовулировала с обработкой изобретения (при том, что все проделано с контрольной обработкой), качество эмбрионов представляется равноценным между двумя продуктами. Обработка достигла более чем 70% суперовуляторного ответа, а также соответствовала критериям в отношении качества эмбрионов. Соответственно, комбинация обработки фолликулярной синхронизацией с однократной инъекцией аналога rFSH делает возможным устойчивое продуцирование суперовулированных эмбрионов.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и служит для повышения репродуктивной активности у крупного рогатого скота, с применением биологически активного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (rFSH). Изобретение также относится к способам для повышения овуляции или эмбриопродукции или беременностей у крупного рогатого скота, с применением rFSH. Изобретение может применяться, в частности, у копытных, таких как коровьи или лошадиные. 10 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 2 ил.