Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах Российский патент 2020 года по МПК G01N33/483 

Предметом настоящего изобретения является быстрый и точный способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах, который может быть введен в рутинную практику любых аналитических и ветеринарных лабораторий и лабораторий, специализирующихся на вопросах репродуктивной функции человека.

Целостность хроматина/ДНК спермы является важным, независимым параметром качества спермы, который связан с потенциалом мужской фертильности, жизненно важна для успешной беременности и передачи генетического материала потомству.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двухцепочечными и одноцепочечными разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков-протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирование бластоцисты в предимплантационный период эмбрионального развития (т.е. до нидации зародыша к стенке матки).

В настоящее время в практике используется несколько методов для оценки состояния хроматина/ДНК сперматозоида. Эти методы могут давать диагностическую и прогностическую информацию, дополняющую, но отличную от информации, получаемой из стандартных параметров спермы (концентрация, подвижность и морфология).

Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде.

В настоящее время стандартным методом для исследования фрагментации ДНК в сперматозоидах является определение структуры хроматина по Эвенсону (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994).

В SCSA сперма подвергается воздействию кислотой и окрашивается метахроматическим ДНК-красителем акридиновым оранжевым (АО). ДНК, денатурирующая в кислоте (фрагментированная, то есть аномальная), флуоресцирует красным, в то время как неповрежденная двухцепочечная ДНК флуоресцирует зеленым. Соотношение красной и зеленой флуоресценции в образце спермы контролируют с помощью проточной цитомерии (ПЦМ). ПЦМ в SCSA - метод исследования в режиме поштучного анализа клеточных элементов по сигналам флуоресценции, а именно, с исследованием одиночных клеток в потоке. Основа метода заключается в использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; облучении клетки лазерным излучением; регистрации сигналов флуоресценции от каждой клетки.

Предполагается, что клетки «ненормальные», когда количество красной флюоресценции превышает определенный порог. Доля этих клеток рассматривается как индекс фрагментации ДНК (IF). SCSA «предсказывает бесплодие», когда IF превышает 30%, обосновывая его клиническое применение и широкое использование в проводимых исследованиях.

Однако метод SCSA, хотя и является надежным и высоко воспроизводимым, является дорогим методом, трудным для выполнения и не очень подходящим для рутинных лабораторных исследований (De Jonge, 2002). По этой причине качество ДНК сперматозоидов до сих пор широко не определяется, несмотря на то, что подтверждено его клиническое значение при изучении бесплодия.

Наиболее близким аналогом является способ по патенту RU 2657609 C1 14.06.2018, заключающийся в том, что спермопробу эякулят размораживают, фиксируют мазок спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°С. Приготавливают краситель смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-ного акридин оранжевого. Образцы погружают в краситель на 5-7 мин, далее мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин, микроскопируют. Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба эякулят выбраковывается.

Недостатками известного способа является низкая точность, длительность и сложность определения индекса фрагментации, обусловленная использованием криоконсервированного эякулята, длительное фиксирование мазка и использование специального флюрохромного красителя.

Технической проблемой заявленного способа является устранение указанных недостатков аналога.

Технический результат заключается в упрощении способа при повышении точности и сокращении времени, затрачиваемого на определение целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах.

Заявленный технически результат достигается в заявленном способе для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах, при котором подготавливают мазок эякулята к исследованию, фиксируют мазок, приготовляют краситель, окрашивают IF слайд красителем, вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК , %, при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, отличающемся тем, что

- используют свежий (нативный) эякулят;

- подготовляют мазок эякулята к исследованию путем промывания разжиженного эякулята фосфатно-солевым буфером с pH7,2 и центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 минут, при этом повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH7,2 и доводят концентрацию до 20×10⁶ клеток/мл;

- фиксируют мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, после чего сушат на воздухе в течение 30 минут, получая IF слайд;

- указанный IF слайд фиксируют фиксирующим раствором спирта 96%, инкубируя в течение 30 минут при +4°С, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут;

- погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl), инкубируя при +4°С в течение 5 мин.;

- после этого IF слайд промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 мин.;

- окрашивают IF слайд в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий в течение 5 минут при комнатной температуре;

- слайд кратко промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе;

- посредством цитометрии изображения производят анализ полученных результатов и вычисляют количество сперматозоидов, с фрагментированными участками ДНК. Приготовление красителя заключается в смешивании 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера McIlvaine с pH3,5-глицерин 50%.

В международных исследованиях обнаружено, что ядра сперматозоидов с красной флуоресценцией в тесте SCSA соответствуют тем, которые окрашены в темно-фиолетовый цвет тиазиновым красителем толуидиновый синий. Доля темно-фиолетовых клеток также коррелирует с долей сперматозоидов, содержащих разрывы нитей ДНК, измеренной прямым методом обнаружения фрагментации ДНК, то есть анализом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL).

Заявленный способ основан на метахроматических свойствах тиазинового красителя толуидиновый синий. Способ заключается в окрашивании клеток красителем толуидиновый синий, после обработки соляной кислотой.

Молекула красителя толуидиновый синий связывается с фосфатными группами аномальной ДНК. Чем больше аномалий хроматина/ДНК, тем доступно больше фосфатных групп и яркость окрашивания увеличивается.

Поэтому спектр светло-голубой (сперма с нормальным хроматинома/ДНК), фиолетовый (сперма с некоторыми отклонениями хроматина/ДНК), темно-фиолетовы (сперма с аномальным хроматином/ДНК).

В заявленном способе применяется цитометрии изображения для обнаружения сперматозоидов с нарушением целостности хроматина/ДНК. В отличие от ПЦМ, цитометрия изображение (ЦИ) - это статическая визуализация клеток, визуальная интерпретации данных с использованием оптической микроскопии. Перед анализом, клетки обычно окрашивают для повышения контрастности, или для обнаружения специфических молекул путем маркировки их с флюорохромами.

IF слайды оценивают под световым микроскопом, головки сперматозоидов с хорошей целостностью хроматина/ДНК окрашиваются в светло-голубой, с нарушенной целостностью хроматина/ДНК (1 - цепочечные разрывы ДНК) окрашены в фиолетовый и темно-фиолетовый цвет. При IF более 30% сперматозоидов фертильность значительно снижается.

Заявленный способ реализован следующим образом.

Свежий эякулят разжижают при +37°С в течение 30 мин. Разжиженный эякулят промывают фосфатно-солевым буфером с pH7,2 и центрифугируют при 2400 об/мин в течение 10 минут. Повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH7,2 и доводят концентрацию до 20×10⁶ клеток/мл. Делают тонкий мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут. Высохший мазок фиксируют фиксирующим раствором (спирт 96%) инкубируя в течение 30 минут при +40°С, а затем сушат на воздухе в течение 30 минут. Предметное стекло погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl), инкубируя при +40°С в течение 5 мин. После этого предметное стекло промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 минут. Слайд окрашивают буферным 0,05% раствором красителя толуидиновы синий (смешать 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера McIlvaine с pH3,5-глицерин 50%) в течение 5 минут при комнатной температуре.

Слайд кратко промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе. Полученный слайд пригоден для длительного хранения в архиве.

При световой микроскопии подсчитывают в общей сложности 200-300 сперматозоидов в разных областях предметного стекла (ЦИ), используя иммерсионное масло и увеличение × 1000. Головки сперматозоидов с хорошей целостностью хроматина/ДНК бледно-голубые, головки с пониженной целостностью - фиолетовые, темно-фиолетовые, и классифицируются как аномальные клетки.

Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в фиолетовый, темно-фиолетовый цвета, нормальные - в бледно-голубой цвет. Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IF n , % вычисляют по формуле, , где С⁺ - количество сперматозоидов, окрашенных в фиолетовый, темно-фиолетовый, шт; С^- - количество сперматозоидов, окрашенных в бледно-голубой, шт.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений.

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктивным технологиям, и может быть использовано для определения количества сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК (IFn, %). Для этого используют свежий эякулят, мазок которого подготовляют к исследованию путем промывания разжиженного эякулята фосфатно-солевым буфером с pH 7,2 и центрифугирования при 2400 об/мин в течение 10 минут, при этом повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH 7,2 и доводят концентрацию до 20×10⁶ клеток/мл; затем фиксируют мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, после чего сушат на воздухе, получая слайд; указанный слайд фиксируют фиксирующим раствором спирта 96%, а затем сушат на воздухе и погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl), после чего промывают; окрашивают слайд в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий, промывают в дистиллированной воде и сушат на воздухе; посредством цитометрии изображения производят анализ полученных результатов и вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК по предложенной формуле, при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, и при более 30% сперматозоидов фертильность считают сниженной. Способ позволяет повысить точность определения количества сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК при его упрощении и сокращении времени проведения. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ определения количества сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК (IFn, %), при котором подготавливают мазок эякулята к исследованию, фиксируют мазок, приготовляют краситель, окрашивают слайд красителем, вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК, отличающийся тем, что

- используют свежий эякулят;

- подготовляют мазок эякулята к исследованию путем промывания разжиженного эякулята фосфатно-солевым буфером с pH 7,2 и центрифугирования при 2400 об/мин в течение 10 минут, при этом повторно суспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере с pH 7,2 и доводят концентрацию до 20×10⁶ клеток/мл;

- фиксируют мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле, после чего сушат на воздухе, получая слайд;

- указанный слайд фиксируют фиксирующим раствором спирта 96%, а затем осуществляют сушку на воздухе;

- погружают в гидролизующий раствор (0,1N HCl);

- после этого промывают слайд;

- окрашивают слайд в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий;

- слайд промывают в дистиллированной воде, а затем сушат на воздухе;

- посредством цитометрии изображения производят анализ полученных результатов и вычисляют количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК по следующей формуле:

,

где С⁺ - количество сперматозоидов, окрашенных в фиолетовый, темно-фиолетовый, шт; С - количество сперматозоидов, окрашенных в бледно-голубой, шт.,

при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, и при IFn более 30% сперматозоидов фертильность считают сниженной.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зафиксированный мазок на предварительно очищенном обезжиренном предметном стекле сушат на воздухе в течение 30 минут.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию указанного слайда, зафиксированного фиксирующим раствором спирта 96%, осуществляют в течение 30 минут при +4°С, а сушку на воздухе осуществляют в течение 30 минут.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию погружением в гидролизующий раствор (0,1N HCl) осуществляют при +4°С в течение 5 минут.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что слайд промывают 3 раза в дистиллированной воде в течение 2 минут.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что окрашивание слайда в буферном 0,05% растворе красителя толуидиновый синий осуществляют в течение 5 минут при комнатной температуре.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что приготовление красителя заключается в смешивании 0.5 мл красителя толуидиновый синий с 9,5 мл смеси буфера Макилвейна с pH 3,5 - глицерин 50%.