СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНОМАЛИИ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ МУЖСКОЙ ИНФЕРТИЛЬНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики и лечения мужского бесплодия у инфертильных пациентов, а также в программах экстракорпорального оплодотворения за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина.

Разработанное техническое решение относится к области репродуктивной медицины; обладает доступностью для андрологических клиник и центров репродукции, не оснащенных уникальным оборудованием типа проточного цитофотометра, электронного микроскопа, ультрамикротома и т.п. приборами, требующими для обслуживания специально подготовленного персонала; работает в режиме экспресс-анализа (около 2 часов) за счет упрощенной пробоподготовки образцов спермы по сравнению с методом электронной микроскопии (2 недели), что существенно сокращает время, затрачиваемое на проведение диагностики - одновременно можно анализировать от 10 до 20 образцов спермы; обладает прогностическим эффектом для выбора стратегии лечения специфической патологии, связанной с незавершенной дифференцировкой сперматозоидов (в том числе методами антиоксидантной терапии); дает возможность получить принципиально новую, по сравнению с известными рутинными методами диагностики мужского бесплодия, информацию о системной патологии всех сперматозоидов пациентов; обладает функциями возможного тестирования эффективности в условиях длительного хранения (биомедицинской тест-системы (БМТС)) на доступных клеточных моделях, например на замороженных образцах спермы доноров, дает возможность использовать только общедоступные, экономически выгодные и сертифицированные реагенты.

Актуальность разработки эффективных методов диагностики причин бесплодия обусловлена сложной демографической ситуацией в стране и большим количеством бесплодных браков (15% супружеских пар), причем у половины этих пар бесплодие связано с мужским фактором.

Всего в мире насчитывается порядка 60-80 млн людей, страдающих бесплодием. Ежегодный прирост составляет 2 млн человек.

Снижение фертильности мужчин обусловлено недостаточным количеством сперматозоидов и/или их плохим качеством.

Наличие в эякуляте сперматозоидов с декомпактизованным хроматином служит причиной невынашивания беременности.

Одним из ключевых процессов дифференцировки сперматозоидов у человека является кардинальное ремоделирование структуры хроматина клеток. Этот многостадийный процесс включает в себя глобальную замену гистонов в хроматине на вновь синтезирующиеся более простые белки - протамины с участием транзиторных белков и гистоновых шаперонов. Смысл этого ремоделирования состоит в достижении максимально плотной упаковки генома (ДНК), что обеспечивает выключение экспрессии генов, с одной стороны, и повышает степень защиты ДНК от повреждений в течение процесса оплодотворения.

Такая сложная программа не может не являться уязвимой. Действительно, большой блок экспериментальных данных, представленных в мировой литературе, свидетельствует о представленности в популяции клеток эякулята аномальных морфологически и функционально сперматозоидов, хроматин которых описывается в терминах «незрелого хроматина». Биохимические и молекулярно-биологические исследования при этом выявляют в этих клетках нарушения процесса ремоделирования хроматина, приводящие к неспособности сперматозоидов к оплодотворению и нормальному развитию зиготы, т.е. к мужской инфертильности.

Очевидно, что создание системы тест-оценки такого нарушения ремоделирования хроматина принципиально необходимо.

Основным способом диагностики мужского бесплодия является макро- и микроскопическое исследования спермы (Лабораторная диагностика мужского бесплодия: Метод. рекомендации. - М., 1979. - 20 с.). Этот способ позволяет провести подсчет сперматозоидов в 1 мл во всем эякуляте, определить количество подвижных сперматозоидов, процент морфологически измененных форм сперматозоидов и концентрацию лейкоцитов. Данный способ позволяет сделать вывод о видимой патологии спермы - наличии повышенного содержания лейкоцитов и эритроцитов, указывающих на воспалительные и инфекционные заболевания половых путей; наличии малого количества сперматозоидов или их полного отсутствия; наличии аномальных (патологических, дегенеративных) форм сперматозоидов; снижении процента подвижных сперматозоидов.

При использовании данного способа причины патологических изменений в сперме выявить не удается, следовательно, провести назначение адекватного лечения мужского бесплодия крайне затруднено.

Известен (патент RU 2118822, опубл. 10.09.1998) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, причем состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Известен (патент RU 2437100, опубл. 20.12.2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, включающий исследование состояния хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа и красителя. При реализации способа определяют количество сперматозоидов в 1 мл раствора, концентрацию сперматозоидов доводят до 10-50 млн/мл буфером PBS, покровные стекла покрывают слоем полилизина, проводят иммобилизацию сперматозоидов на подготовленных покровных стеклах площадью около 3×5 мм², фиксируют и окрашивают ядра иммобилизированных сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом DAPI с получением контрольных образцов, вторую часть иммобилизированных сперматозоидов обрабатывают микрококковой нуклеазой, проводят фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, ДНК-связывающим флуорохромом DAPI, окрашенные препараты контрольных сперматозоидов и сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, фотографируют с использованием микроскопа и анализируют полученные изображения путем сравнения яркости изображений сперматозоидов, причем об аномалии упаковки хроматина сперматозоида судят по количеству ДНК, расщепленной нуклеазой, относительно общего количества ДНК в контроле.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (патент RU 2426993, опубл. 27.03.2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации известного способа образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 1%-ного раствора Тритон Х-100, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и нерастворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

В данном случае критерием при определении мужского бесплодия является упаковка хроматина.

Главным недостатком ближайшего аналога следует признать его невысокую точность из-за малой точности определения количества сперматозоидов в исходной нативной сперме.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании метода диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Для реализации разработанного способа предложено использовать тест-систему, в состав которой входят:

1. 4 мл - 10x PBS (натрий-фосфатный буфер)

2. 10 мл - 1xPBS с 1% Тритоном Х-100

3. 2 мл - 20 мМ Трис-HClpH - 7.6), 2 мМ CaCl₂ 2 мМ MgCl₂

4. 160 ед. Микрококковая нуклеаза (-20°С)

5. 40 мкл 0.5М ЭДТА

6. 40 мл 5% HClO₄

Тест-систему приведенного состава, рассчитанную на 20 проб, для достижения указанного технического результата предложено использовать следующим образом.

Аликвоту эякулята (мкл) (10×10⁶ сперматозоидов - 30 мкг по ДНК) с использованием автоматической пипетки перенесли в коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой, центрифугировали в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости вращения 5000 об/мин. Осадок промыли 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1xPBS) (1 мл), центрифугировали в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 5000 об/мин, супернатант удалили. Осадок суспендировали в 0.5 мл 1xPBS с 1% Тритоном Х-100 и инкубировали 10 мин во льду, затем центрифугировали в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости вращения 5000 об/мин. Образовавшийся супернатант удалили. Полученный осадок промыли 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1xPBS) (1 мл), центрифугировали в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 5000 об/мин, супернатант удалили. Полученный осадок суспендировали на персональной установке вортекс V-1 plus в 100 мкл раствора 20 мМ Трис-HCl (pH - 7.6), 2 мМ CaCl₂ и 2 мМ MgCl₂, добавили 8 ед. микрококковой нуклеазы (Micrococcal Nuclease) (на 10×10⁶ сперматозоидов (~30 мкгДНК) или соответственно уменьшили количество фермента) и инкубировали 20 мин при комнатной температуре (22-25°С). Реакцию останавливали добавлением ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота) до 10 мМ (2 мкл 0.5М ЭДТА) и инкубировали 20 мин во льду. Образцы суспендировали на персональной установке вортекс V-1 plus и центрифугировали в микроцентрифуге в течение 3 мин при скорости 2800 об/мин. К осадку нерастворимого хроматина (НРХ) добавили 1 мл 5% хлорной кислоты. К супернатанту - растворимому хроматину (РХ) - добавили 0.9 мл 5% хлорной кислоты. Пробирки с нерастворимым и растворимым хроматином инкубировали 10 мин при 95°С в термостате. Центрифугировали в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 3000-5000 об/мин, в супернатантах измеряли концентрацию ДНК на спектрофотометре при 270 и 290 нм в микрокюветах против 5% HClO₄, концентрацию ДНК определяли по формуле(1)

суммировали количество ДНК в нерастворимом и растворимом хроматине и вычислили их процентное соотношение.

Разработанный способ основан на количественной оценке степени защищенности ДНК в хроматине сперматозоидов от воздействия экзогенной эндонуклеазы (микрококковой нуклеазы) и количественной оценке глубины гидролиза ДНК нуклеазой до олиго- и мононуклеотидов. Результаты анализа могут быть получены в течение дня с момента получения образца. Разработанный метод позволяет количественно определять степень аномально упакованного хроматина (незрелого хроматина).

Реакция гидролиза ДНК экзогенной нуклеазой концентрационно-зависима и изначально требует выбора соотношении ДНК: фермент, удовлетворяющего ряду условий: достоверность отбора пробы для гидролиза, достаточность количества ДНК (сперматозоидов) для корректного определения фракций после гидролиза и достаточного количества ДНК для спектрофотометрического определения. Несоблюдение указанных условий приводит к понижению точности анализа. При подсчете концентрации клеток в микроскопической камере (типа камеры Горяева) велика ошибка (в 2-3 раза) при подсчете образцов с высоким содержанием клеток, затрудняет подсчет подвижность сперматозоидов в нативной (нефиксированной) сперме.

Разработанный способ реализуют следующим образом.

Очень важно тщательно суспендировать эякулят для корректного отбора пробы для определения концентрации ДНК и для дальнейшего проведения анализа.

В коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой вносят 50 мкл эякулята и осаждают сперматозоиды в микроцентрифуге в течение 30 секунд при скорости вращения 3000-5000 об/мин, осадок промывают 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1xPBS), затем повторно центрифугируют на микроцентрифуге в течение 30 секунд при скорости вращения 3000-5000 об/мин, удаляют супернатант, к осадку добавляют 1 мл 5% хлорной кислоты, кипятят на водяной бане в течение 9-11 минут с последующим осаждением материала на микроцентрифуге при скорости вращения 3000-5000 об/мин в течение 30 секунд. В отделенном супернатанте спектрофотометрически определяют концентрацию ДНК:

Экспериментально установлено, что использование нового приема определения концентрации сперматозоидов позволяет повысить точность разработанного способа примерно на 30-40%.

Острый вопрос в постановке определения показателей - условия и продолжительность хранения эякулята. Оптимально пригодны образцы, замороженные с криопротектором. Удовлетворяют условиям образцы, непосредственно после забора хранившиеся в холодильнике в течения дня. Образцы, хранившие долгое время при комнатной температуре, не пригодны для анализа. Такие образцы выявляются при проведении эксперимента по одному из параметров гидролиза (глубина гидролиза, оцениваемая по содержанию кислоторастворимого материала, резко отличается от нормы).

Из проведенных экспериментов стало очевидно, что наличие в семенной жидкости соматических клеток до 5% меняет картину гидролиза всего на 2-4% (для удаления соматических клеток использовали буфер, содержащий 0.5% SDS), что практически не влияет на точность анализа.

Также была исключено использование набора для обработки спермы методом градиента плотности SPERMGRAD («Vitrolife»), так как изучалась суммарная картина состояния хроматина в эякуляте. Данные, полученные использованным разработанным способом, определяют состояние популяции сперматозоидов в целом.

Экспериментально установлено, что анализы можно проводить без определения фракции кислоторастворимого хроматина, при этом точность определения существенно не меняется, а наоборот, аномалия становится более наглядной.

В целом разработанный метод позволил количественно определять степень аномально упакованного хроматина: нерастворимого хроматина (НРХ)% - 76.0±3.0%, растворимого хроматина (РХ) % - патология 24.0±3.0.

В таблице (ниже) сопоставлены данные по аномалиям упаковки хроматина, полученные с использованием разработанного метода, с медицинским заключением по результатам анализов спермограмм.

В целом примерно половина всех пациентов по нашему критерию должна быть отнесена к группе с отклонениями от нормы.

Разработанный метод позволяет количественно определить степень аномально упакованного хроматина. Пограничные значения патологии: нерастворимого хроматина (НРХ)% - 76.0±3.0, растворимого хроматина (РХ)% - 24.0±3.0.

Использование разработанного способа позволяет повысить точность определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии на 30-40%.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики и лечения мужского бесплодия у инфертильных пациентов, а также в программах экстракорпорального оплодотворения за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина. Способ определения аномалии упаковки хроматина сперматозоидов человека при мужской инфертильности, раскрытый в изобретении, подразумевает определение количества ДНК в нерастворимом и растворимом хроматине и вычисление их процентного соотношения согласно формуле:

, пограничное значение патологии нерастворимого хроматина(НРХ)% - 76,0±3,0, растворимого хроматина - 24,0±3,0. Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. 1 табл.

Способ определения аномалии упаковки хроматина сперматозоидов человека при мужской инфертильности с использованием биомедицинской тест-системы, характеризуемый тем, что аликвоту эякулята (мкл) (10×10⁶ сперматозоидов - 30 мкг по ДНК) с использованием автоматической пипетки переносят в коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой, центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости вращения 5000 об/мин, промывают осадок 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1×PBS) (1 мл), центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 5000 об/мин, супернатант удаляют, осадок суспендируют в 0.5 мл 1×PBS с 1% Тритоном Х-100 и инкубируют 10 мин во льду, затем центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости вращения 5000 об/мин, образовавшийся супернатант удаляют, полученный осадок промывают 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1×PBS) (1 мл), центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 5000 об/мин, супернатант удаляют, полученный осадок суспендируют на персональной установке вортекс V-1 plusB 100 мкл раствора 20 мМ Трис-HCl (рН - 7.6), 2 мМ CaCl₂ и 2 мМ MgCl₂, добавляют 8 ед. микрококковой нуклеазы (Micrococcal Nuclease) на 10×10⁶ сперматозоидов и инкубируют 20 мин при температуре 22-25°С, реакцию останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ и инкубируют 20 мин во льду, образцы суспендируют на персональной установке вортекс V-1 plus и центрифугируют в микроцентрифуге в течение 3 мин при скорости 2800 об/мин, к осадку нерастворимого хроматина добавляют 1 мл 5% хлорной кислоты, к супернатанту - растворимому хроматину добавляют 0.9 мл 5% хлорной кислоты, пробирки с нерастворимым и растворимым хроматином инкубируют 10 мин при 95°С в термостате, центрифугируют в микроцентрифуге в течение 30 сек при скорости 3000-5000 об/мин, в супернатантах измеряют концентрацию ДНК на спектрофотометре при 270 и 290 нм в микрокюветах против 5% HClO₄, концентрацию ДНК определяли по формуле:

суммируют количество ДНК в нерастворимом и растворимом хроматине и вычисляют их процентное соотношение, пограничное значение патологии нерастворимого хроматина (НРХ)% - 76,0±3,0, растворимого хроматина - 24,0±3,0.