СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и раскрывает процедуру проведения диагностического исследования степени злокачественности рака щитовидной железы.

Распространенность рака щитовидной железы (ЩЖ) в России в 2009 г. составила 78,5 человек на 100 тысяч населения. При аутопсии лиц, умерших от нетиреоидных заболеваний, узлы в щитовидной железе находят более чем у 50% больных. По этим причинам одним из актуальных вопросов является точная и своевременная диагностика рака щитовидной железы.

Это имеет важное значение для выбора одной из программ дальнейшего лечения пациента, которые чрезвычайно различаются по объему и последствиям в зависимости от вида опухоли.

Высокодифференцированный рак - это одна из опухолей, которая на первый взгляд выглядит как нормальная исходная ткань, в данном случае как ткань щитовидной железы. Высокодифференцированные раки щитовидной железы составляют около 90% всех злокачественных поражений щитовидной железы.

Различают два типа высокодифференцированного рака щитовидной железы: папиллярный и фолликулярный.

Папиллярные раки под микроскопом имеют множественные выступы, которые делают их похожими на лист папоротника или ветку пальмы. Если ткань щитовидной железы тщательно обследуется под микроскопом, то крошечные участки папиллярного рака находят в 10% "нормальных" щитовидных желез. Чем тщательнее гистолог смотрит, тем чаще он находит эти крошечные островки рака. Эти микроскопические формы рака не имеют клинического значения. Другими словами, у этих маленьких опухолей нет тенденции к росту и увеличению и способности стать настоящими злокачественными.

Высокодифференцированный папиллярный рак щитовидной железы не всегда можно отличить от доброкачественной аденомы. В злокачественной опухоли с низкой степенью дифференцировки ткани даже опытный патоморфолог не всегда определит гистогенез, так как недифференцированный рак, по данным гистологического исследования, трудно отличить от саркомы.

Когда папиллярный рак вырос достаточно, чтобы сформировать узел в щитовидной железе, мы считаем его клинически важным. В этом случае есть вероятность его непрерывного роста и распространения в организме. Папиллярные опухоли составляют 70-80% всех случаев рака щитовидной железы и могут появиться в любом возрасте.

Ткань нормальной щитовидной железы состоит из структур округлой формы, называемых фолликулами. Когда рак щитовидной железы содержит такие структуры, он называется фолликулярным раком.

Фолликулярный рак составляет около 10-15% всех видов рака щитовидной железы в США и несколько чаще поражает престарелых пациентов, чем папиллярная карцинома и является более агрессивным, чем папиллярный рак.

Гистопатологическую дифференцировку ткани опухоли (G), характеризующую степень злокачественности опухоли, обозначают символами GX, G1, G2, G3, G4.

GX - степень дифференцировки ткани не может быть установлена.

G1 - высокая степень дифференцировки.

G2 - средняя степень дифференцировки.

G3 - низкая степень дифференцировки.

G4 - недифференцированная опухоль.

Чем ниже степень дифференцировки, тем злокачественнее опухоль, тем выше ее инвазивность и способность к метастазированию, тем хуже прогноз. Кроме того, чем ниже степень дифференцировки, тем чувствительнее опухоль к лучевым и цитостатическим лекарственным воздействиям. Таким образом, степень дифференцировки ткани опухоли существенно влияет на программу лечения онкологического больного и служит одним из критериев прогноза.

Для верификации характера патологических процессов, происходящих в щитовидной железе, в настоящее время широко используется тонкоигольная пункционная аспирационная биопсия узлов с последующим цитологическим исследованием пунктатов. Чувствительность и специфичность тонкоигольной биопсии под контролем ультразвукового исследования высока при папиллярных и медуллярных карциномах (Шойхет Я.Н. и соавт., 2005; Frates M.C. et al., 2005). В отношении фолликулярного рака эти цифры значительно ниже, что обусловлено отсутствием цитологических критериев разграничения фолликулярной аденомы и карциномы (Поляков В.Г. и соавт., 2007; Carpi A. et al., 2000).

Известен целый ряд способов и исследований с применением микроскопии, проведение которых позволяет подтвердить или опровергнуть диагноз злокачественного новообразования. Среди них одно из самых значимых мест занимает цитологическое исследование биоптата или соскоба из очага поражения. Однако данное исследование на некоторых своих этапах является субъективным (оценка относительных и абсолютных размеров клеточных элементов, трудности учета неизбежной вариабельности условий подготовки материала, что приводит к вариабельности как цветовых, так и размерных характеристик клеток препарата).

Известен подход к распознаванию в процессе диагностического поиска трехмерной структуры исследуемой ткани на основе компьютерного анализа изображений последовательных гистологических срезов (Rene Albert, Tomas Schinderwolf, Irith Baumann, Harry Harms., Three-Dimensional Image Processing for Morphometric Analysis of Epithelium Sections. Cytometry 13: 759-765 (1992)). Способ содержит в себе два возможных источника погрешностей, которые могут оказаться критическими при исследовании деталей клетки: во-первых, объемная структура клетки не измеряется прямо, а строится программой, во-вторых, точность построения ограничена снизу толщиной срезов, которые готовит микротом. Попытки повысить точность за счет использования ультрамикротомов приводят к необходимости применения указанных дорогостоящих устройств, а также к быстрому росту трудоемкости на гистологическом этапе и к росту вычислительной сложности программных алгоритмов. В качестве примера укажем, что для построения трехмерного образа клетки размером 10 микрометров (довольно обычный и не самый большой размер) с разрешением 10 нанометров (типичное разрешение, достигаемое предлагаемым способом исследований) необходимо с высокой точностью (10 нанометров) подготовить, микроскопировать и совместно обработать программным алгоритмом не менее 1000 гистологических препаратов.

Все больший практический интерес приобретает метод определения экспрессии молекулярных маркеров на клеточном уровне - иммуноцитохимический (ИЦХ). Тот факт, что пункционная биопсия более простая, малотравматичная процедура, практически не сопровождающаяся осложнениями, позволяющая получить достаточное количество клеточного материала для ИЦХ-исследования, говорит о неоспоримых преимуществах ИЦХ. Иммуноцитохимическое исследование не требует больших временных затрат, выполняется быстро в течение 2-3 ч.

Замечено, что мембранные и цитоплазматические маркеры чаще положительно окрашиваются в цитологических, чем в гистологических препаратах. Возможно, это связано с более щадящей обработкой цитопрепаратов, отсутствием потери и маскировки антигенов при проводке и депарафинизации материала с использованием агрессивных химических реагентов, что негативно сказывается на мембранных и цитоплазматических рецепторах (Глухова Е.И. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, при раке молочной железы. Автореф. дис.… канд. мед. наук. М., 2003; Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. Киев, Морион; 2003, с.28-31).

За последние годы достигнут значительный прогресс в клиническом использовании различных биологических маркеров. В их числе онкогены, рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), маркеры апоптоза, рецепторы факторов роста и т.д. Все эти показатели позволяют более детально изучить молекулярно-биологические особенности злокачественных опухолей, ассоциируются со степенью дифференцировки, способностью к инвазии и метастазированию, чувствительностью к химиотерапии, а следовательно, с особенностями течения и прогнозом заболевания в каждом конкретном случае.

В настоящее время имеется несколько сотен различных моно- и поликлональных антител, выявляющих экспрессию тех или иных белков, связанных со структурными компонентами клетки, продуктами клеточного синтеза (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторами и т.д. Основными маркерами, используемыми в диагностике ПР ЩЖ, являются: тиреоглобулин, тиреоидный транскрипционный фактор TTF1, цитокератин 19, молекула адгезии CD44v6, мезотелиальный антиген НВМЕ1, онкобелок р53, белок пролиферативной активности Ki 67.

Определена возможность использования ряда биологических маркеров: цитокератина 19, мезотелиального антигена НВМЕ1, молекулы адгезии CD44v6, онкобелка р53, белка пролиферативной активности Ki67 - для дифференциальной диагностики доброкачественных заболеваний и ПРЩЖ.

Маркеры, которые с абсолютной точностью позволяют определить малигнизацию фолликулярного эпителия отсутствуют, но, тем не менее, целесообразно для дифференциальной диагностики ПРЩЖ и доброкачественных узлов ЩЖ исследование двух и более маркеров. Коэкспрессия хотя бы двух маркеров позволяет диагностировать РЩЖ.

Также все большее распространение получает метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) - одного из видов сканирующей зондовой микроскопии, основанный на ван-дер-ваальсовских взаимодействиях зонда с поверхностью образца. Принцип действия АСМ основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. На малых расстояниях между двумя атомами действуют силы отталкивания, а на больших - силы притяжения.

С помощью АСМ можно получать изображения как физических объектов (поверхности твердых тел), так и биологических и химических объектов (вирусов и бактерий, атомов и молекул). Разрешение таких микроскопов достигает доли нанометров, что позволяет наблюдать атомы. В результате проведения АСМ можно строить объемный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность данного метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали.

Использование АСМ позволяет получить различия для нормальных клеток и клеток папиллярного рака щитовидной железы. Новые возможности проявились в разнице микрорельефа поверхностей опухолевых клеток.

Предложенный нами способ направлен на преодоление недостатков ранее известных способов проведения исследования и направлен на установление диагноза рака ЩЖ и уточнение степени его злокачественности.

Целью изобретения является создание способа, позволяющего с высокой объективностью и достоверностью установить диагноз рака ЩЖ и определить степень его злокачественности для определения дальнейшей тактики лечения таких больных.

Технический результат, достигаемый при использовании предложенного способа, заключается в объективизации данных иммуноцитохимического исследования и объемной цитоморфометрии с помощью атомно-силовой микроскопии, что повышает достоверность установления диагноза рака ЩЖ и степени его злокачественности, а также повышает точность исследований за счет исследования определенных параметров, суммарные значения которых дают возможность сделать наиболее достоверные выводы о патологическом процессе и прогнозе его течения.

Способ осуществляется следующим образом: больного обследуют с помощью УЗИ и при наличии узловых образований в ЩЖ осуществляют тонкоигольную пункционную биопсию под контролем УЗИ. Из пунктатов готовят тонкие мазки. Если в результате пункции получена жидкость, ее предварительно центрифугируют и из осадка готовят несколько тонких мазков. Мазки высушивают на воздухе и затем окрашивают азурэозиновыми смесями по стандартной методике. Таким образом, готовят рутинные цитологические препараты.

Для проведения ИЦХ используют метод приготовления цитоспиновых препаратов с использованием жидкостной цитологии. Содержимое аспирата узловых образований щитовидной железы (после пункции) или соскоба помещают в специальную, питательную среду накопления, в микропробирку, содержащую 800 мкл питательной среды. Взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугируют в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Готовят два мазка на одно используемое в ИЦХ исследовании антитело и два - для проведения контроля. Полученные цитоспиновые препараты высушивают при комнатной температуре и затем используют для ИЦХ реакций, предварительно проведя контроль качества полученных монослойных мазков, для чего два цитопрепарата окрашивали рутинным методом по Лейшману (азур эозиновыми смесями).

ИЦХ исследование проводили методом Ultra Vision. Применение трехступенчатой системы детекции Ultra Vision LP (USA) повышает чувствительность метода вследствие того, что вторичные антитела наносят отдельно, а затем связывают с полимером, который содержит большое количество молекул фермента.

Полученные рутинные цитологические препараты щитовидной железы, окрашенные азур эозиновыми смесями и жидкостные иммуноцитохимические препараты анализировали для установления диагноза в два этапа: в начале посредством обычной световой микроскопии, а затем с помощью АСМ.

Для проведения АСМ используют атомно-силовой микроскоп, который входит в исследовательский комплекс Интегра производства «ЗАО НТ НДТ» г.Зеленоград, Россия. Сканирование осуществляют в полуконтактном режиме.

Полученные данные микрорельефа поверхностей клеток и его локальных свойств обрабатывают штатными программными средствами, входящими в состав программного обеспечения исследовательского комплекса Интегра.

Статистическую обработку результатов измерений морфологических параметров клеток (определение средних значений параметров, стандартных отклонений, достоверностей различий статистических параметров для клеток различных типов) осуществляют обычными статистическими методами с помощью пакета программ Statistica 6.0.

Изучены дооперационные пунктаты от 51 больного, и них 30 - по поводу папиллярного рака щитовидной железы, 9 - фолликулярных аденом, 10 - коллоидного зоба и 2 - аутоиммунного тиреоидита. Выполнено 204 иммуноцитохимических и АСМ исследований.

Основным маркером, используемым в диагностике ПР, являются тиреоглобулин.

При проведении ИЦХ исследований тиреоглобулин экспрессировался в 94% наблюдений папиллярного рака щитовидной железы и в таком же проценте доброкачественных заболеваний щитовидной железы (зоб, аденома, тиреоидит). Отсутствие экспрессии тиреоглобулина при ПР свидетельствует о снижении дифференцировки опухоли. Отрицательная экспрессия тиреоглобулина наблюдалась и при выраженных лимфоматозных тиреоидитах и гипотиреоидном зобе и недифференцированном раке. Положительная экспрессия тиреоидного фактора транскрипции (TTF1) отмечалась в 94% при ПРЩЖ.

Для объективизации установления степени злокачественности рака ЩЖ определяют:

- степень экспрессии маркера

- высоту цитоплазмы клетки

- высоту иммунных комплексов

Полученным в результате ИЦХ исследованиям и АСМ показателям степени экспрессии, высоты цитоплазмы клетки и высоты иммунных комплексов присваивают определенное количество баллов, которые затем суммируются.

1. Определение степени экспрессии маркера.

Основным маркером, используемым нами, является тиреоглобулин. Выраженная экспрессия тиреоглобулина соответствует 6 баллам, средняя степень экспрессии соответствует 4-м баллам, слабая реакция - 2-м баллам, отсутствие реакции - 0 баллов.

2. Определение высоты цитоплазмы клетки методом АСМ: высота цитоплазмы клетки меньше 100 нм - 0 баллов; 100-200 нм - 2 балла; 200-260 нм - 4 балла; более 260 нм - 6 баллов.

3. Определение высоты иммунных комплексов:

- высокодифференцированный рак - 800-950 нм - 6 баллов,

- средней степени дифференцировки - 400-460 нм - 4 балла,

- низкодифференцированный рак - 100 нм и ниже - 2 балла,

- недифференцируемый рак - высота иммунных комплексов отсутствует - 0 баллов.

Таблица 1   G1 Баллы G2   G3   G4   Степень экспрессии тиреоглобулина Выраженная 6 Средняя 4 Слабая 2 Отсутствует 0 Высота цитоплазмы клетки >260 нм 6 200-260 нм 4 100-200 нм 2 <100 нм 0 Высота иммунных комплексов 800-950 нм 6 400-460 нм 4 100 нм и ниже 2 отсутствует 0

На основании предложенной шкалы (см. табл.1) выделяют следующие степени злокачественности:

1. Рак высокой степени дифференцировки (низкая степень злокачественности) - 18 баллов.

2. Рак средней степени дифференцировки (средняя степень злокачественности) - 12 баллов.

3. Рак низкой степени дифференцировки (высокая степень злокачественности) - 6 баллов.

4. Недифференцированный рак высочайшей степени злокачественности - 0 баллов.

Клинический пример.

Б-й К. 35 лет. Диагноз при обращении - опухоль правой доли щитовидной железы. Клинически и по данным ультрасонографии в толще правой доли щитовидной железы находится узловое образование размерами 2 см в диаметре, близко располагающееся к собственной капсуле органа, неоднородной эхоструктуры и не имеющее четких границ с окружающей тканью органа.

По данным пункционной биопсии с классическим цитологически анализом заключение - злокачественная опухоль щитовидной железы, папиллярный вариант. Предоперационный диагноз - рак правой доли щитовидной железы T2-3NxMx. При данном диагнозе основным типом операции является тотальная тириоидэктомия и удаление сторожевых лимфатических узлов шеи 6 группы с последующим пожизненным приемом гормональной заместительной терапии.

С учетом молодого возраста пациента и желанием избежать пожизненной гормональной зависимости произведен дополнительный цитологический анализ с применением цитохимических реакций и АСМ.

По данным цитохимической реакции с тиреоглобулином выявлена сильная экспрессия - вся цитоплазма клеток содержит цитосомы с гормоном, что соответствует 6-ти баллам. По результатам АСМ высота цитоплазмы равна 266 нм. - 6 балов, высота иммунных комплексов 800-950 нм, что соответствует 6 баллам. Общая сумма составила - 18 балов.

Заключение - высокодифференцированный папиллярный рак щитовидной железы низкой степени злокачественности. На основе этого анализа консилиум принимает решение о возможности выполнения органосохраняющей операции в объеме гемитириоидэктомии.

Б-му выполнена операция - гемитириоидэктомия справа с удалением 6 группы шейных лимфатических узлов. Плановое гистологическое заключение - высокодифференцированный папиллярный рак правой доли щитовидной железы T2N0M0 1 степени злокачественности без метастазов в лимфатические узлы.

Приведенный клинический пример демонстрирует возможность дооперационной уточняющей диагностики рака щитовидной железы, которая позволяет индивидуализировать лечебную тактику с использованием органосохраняющего подхода, позволяющего избегать калечащих инвалидизирующих операций.

Дополнительно используемая литература:

1. Волченко Н.Н., Гладунова З.Д., Славнова Е.Н. Цитологическая диагностика папиллярного рака щитовидной железы // Гормонозавивисмые опухоли: Материалы IX Всерос. конф. онкологов СПб, 2002. с.359-361.

2. Абдулхалимова М.М., Митьков В.В., Бондаренко В.О. и др. Диагностика узловых образований щитовидной железы с использованием современных методов исследования // Ультразвуковая диагностика. - 2002. - №2. - С.7-15.

3. Васильев B.C., Захаров А.С. Трудности диагностики и лечения рака щитовидной железы // Сборник материалов II региональной конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы эксперементальной и клинической онкологии». - Томск, 2007. - С.21.

4. Воронецкий И.Б. Стандартизированная диагностика заболеваний щитовидной железы: Автореф. дис.… докт. мед. наук. - М., 1989. - 38 с.

5. Bakanidze L., Mardaleishvili K. Diagnostic and tactic mistakes in thyroid cancer // Annabs Biomed Res and Educ. - 2002. - Vol.2. - №2. - P.42-44.

6. Eliaei R., Bottici V., Luchetti F. et. al. Impact of routine measurement of serum calcitonin on the diagnosis and outcome of medullary thyroid cancer: Experience in 10,864 patients with nodular thyroid disorders // J. Clin. Endocrin. and Metab. - 2004. - Vol.89. - №1. - P.163-168.

Изобретение относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике в онкологии, и может быть использовано при диагностике степени злокачественности рака щитовидной железы. Для этого проводят тонкоигольную пункционную аспирационную биопсию узлов щитовидной железы. Из полученных пунктатов изготавливают мазки и проводят иммуноцитохимическое исследование с помощью световой микроскопии с последующим определением экспрессии тиреоглобулина. После этого методом атомно-силовой микроскопии проводят определение высоты цитоплазмы клетки и высоты иммунных комплексов, образованных при использовании в качестве маркера тиреоглобулина. Затем осуществляют оценку полученных данных с присвоением им соответствующих баллов. Выраженная экспрессия тиреоглобулина соответствует 6 баллам, средняя степень - 4-м баллам, слабая экспрессия - 2-м баллам, отсутствие экспрессии - 0 баллов. Высота цитоплазмы клетки меньше 100 нм - 0 баллов; 100-200 нм - 2 балла; 200-260 нм - 4 балла; более 260 нм - 6 баллов. Высота иммунных комплексов 800-950 нм - 6 баллов, 400-460 нм - 4 балла, при 100 нм и ниже - 2 балла, если высота иммунных комплексов отсутствует - присваивают 0 баллов. Затем баллы суммируют и определяют степень злокачественности рака щитовидной железы: 18 баллов - рак высокой степени дифференцировки, 12 баллов - рак средней степени дифференцировки, 6 баллов - рак низкой степени дифференцировки, 0 баллов - недифференцированный рак. Способ позволяет повысить достоверность установления диагноза рака ЩЖ и степени его злокачественности. 1 табл., 1 пр.

Способ диагностики степени злокачественности рака щитовидной железы, характеризующийся тем, что проводят тонкоигольную пункционную аспирационную биопсию узлов щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования, из полученных пунктатов изготавливают мазки, и проводят сначала иммуноцитохимическое исследование (ИЦХ) с помощью световой микроскопии с последующим определением экспрессии тиреоглобулина, после этого методом атомно-силовой микроскопии (ЛСМ) проводят определение высоты цитоплазмы клетки и высоты иммунных комплексов, образованных при использовании в качестве маркера тиреоглобулина, затем осуществляют оценку полученных данных с присвоением им соответствующих баллов: выраженная экспрессия тиреоглобулина соответствует 6 баллам, средняя степень экспрессии соответствует 4-м баллам, слабая степень экспрессии - 2-м баллам, отсутствие экспрессии - 0 баллов; высота цитоплазмы клетки меньше 100 нм - 0 баллов; 100-200 нм - 2 балла; 200-260 нм - 4 балла; более 260 нм - 6 баллов; высота иммунных комплексов, образованных при использовании в качестве маркера тиреоглобулина, при высокодифференцированном раке составляет 800-950 нм, что соответствует 6-ти баллам, при средней степени дифференцировки - 400-460 нм - 4-м баллам, при низкодифференцированном раке высота иммунных комплексов составляет - 100 нм и ниже и соответствует 2-м баллам, при недифференцированном раке высота иммунных комплексов отсутствует - присваивают 0 баллов; затем баллы суммируют и определяют степень злокачественности рака щитовидной железы: 18 баллов - рак высокой степени дифференцировки, 12 баллов - рак средней степени дифференцировки, 6 баллов - рак низкой степени дифференцировки, 0 баллов - недифференцированный рак.