СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФИБРОАДЕНОМЫ И РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии.

Известен способ дифференциальной диагностики фиброаденомы, являющейся доброкачественной опухолью, и рака молочной железы в гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Способ основан на микроскопических различиях расположения и количества опухолевых клеток и стромы в этих образованиях. К дифференциально-диагностическим критериям относят мономорфизм или полиморфизм формы и размеров клеток и их ядер, степень их митотической активности и другие характеристик. /Ласкина А.В. Опухоли молочной железы. - В кн.: Руководство по патологоанатомической диагностике опухолей человека. - Изд. 2-е /Под ред. Н.А.Краевского, А.В.Смольянникова.-М.: Медицина, 1976, - с. 191- 211/.

Недостатком способа является отсутствие облигатных признаков, позволяющих различать переходные формы опухолей, то есть фиброаденом с признаками озлокачествления, от начальных форм рака. Учитывая, что малигнизация фиброаденом наблюдается в 5% от общего их числа (Ермолова В.Д. Опухоли молочной железы. - В. кн.: Руководство по патологоанатомической диагностике опухолей человека /Под ред. Н.А.Краевского, А.В.Смольянникова и Д.С.Саркисова.- 3-е изд. -М. : Медицина, 1982, с. 210 - 232/, число наблюдений фиброаденом, требующих дифференциальной диагностики от рака молочной железы, является значительным. Наиболее достоверным признаком в таких случаях является инвазивный рост /Головин Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей: руководство для врачей. - Л.: Медицина, 1982, 304 с/, что знаменует собой уже распространенную форму заболевания.

Известен способ диагностики рака в гистологических срезах, выбранный в качестве прототипа, основанный на иммунологическом выявлении индивидуальных веществ в клетках /Франк Г.А., Пугачев К.К., Шабалова И.П., Шимбирева И.Б. //Арх. пат. - 1990, - т. 52, вып. 8 -с.70-74/, которые при этом окрашиваются в те или иные цвета. В настоящее время известно значительное число разнообразных типов биологических веществ, например онкофетальные антигены, изоэнзимы и другие, которые относят к опухолевым маркерам /Ромененко А.М.// Арх. пат. - 1989, т. 51, вып. 4-с. 58-62/. Недостатком способа является то, что опухолевые маркеры невозможно использовать для дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы, так как они не позволяют отличить доброкачественные клетки от злокачественных.

Задача предлагаемого способа заключается в разработке иммуногистохимической реакции, позволяющей на основе различий детекции белков семейства макроглобулинов /не являющихся специфической принадлежностью эпителиальных клеток молочной железы/ показать различия фиброаденомы и рака молочной железы, тем самым повысив точность их диагностики и дифференциальной диагностики.

Известно, что злокачественный рост сопровождается увеличением активности лизосомальных протеиназ /Веремеенко К.Н. Глобородько О.П., Кизим А.М. Протеолиз в норме и при патологии. Киев: Здоровья, 1988 200с/. Концентрация ингибиторов протеиназ, к которым относятся белки семейства макроглобулинов, хорошо коррелирует с массой злокачественной опухоли, что связывают с локальным биосинтезом белков опухолевыми клетками /Зорин Н.А., Зорина Р.М., Горин В.С.// Акушерство и гинекология, - 1986, N 6, с. 6-9/.

По результатам иммунологического исследования сыворотки крови можно видеть, что в организме здоровых людей доминирует альфа 2-макроглобулин /МГ/, а свойство ассоциированного с беременностью альфа 2-гликопротеина /АБГ/, являющихся основными представителями белков семейства макроглобулинов, имеет ограниченное значение. При раке происходит блокирование биосинтеза МГ, что восполняется биосинтезом АБГ, способным выполнять основную функцию МГ - удаление протеиназ из тканей, разрушающихся при росте опухоли /Зорин Н.А., Зорина Р.М., Горин В.С. и др.// Клиническая лабораторная диагностика. - 1993, N 1, с. 52 - 56/.

Поставленная задача достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы в гистологических срезах, основанной на окраске цитоплазмы опухолевых клеток, отличающемся тем, что учитывают различия степени детекции МГ и АБГ, путем иммунопероксидазной реакции с использованием первичных антител против МГ и АБГ в концентрациях 10 мкг/мл и при высокой детекции МГ и низкой АБГ судят о фиброаденоме, а при низкой детекции МГ и высокой АБГ диагностируют рак молочной железы. Высокая детекция белка сопровождается селективной окраской его в коричневый цвет, а низкая детекция - в бледно-желтый цвет.

Сущность предлагаемого способа дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы в гистологических срезах заключается в следующем. Проводимая иммуногистохимическая реакция включает ряд этапов.

1. Регидратация срезов и удаление из них остатков парафина. Для этого срезы проводят через три порции о-ксилола, абсолютный этанол, спирт 70% и 56%, а также забуференный физиологический раствор /ЭФР/ - по три минуты в каждой порции жидкости.

2. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель 3%-ной перекиси водорода на 10 минут.

3. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов достигают путем нанесения на срез лошадиной сыворотки в разведении 1:20 на 30 минут.

4. Этап обработки гистологических срезов первичными антителами против МГ и АБГ в концентрации 10 мкг/мл, разведенными в ЭФР с добавлением 3%-ного альбумина и 0,01%-ного азида натрия. Инкубирование срезов осуществляют в течение 30 минут при температуре 37^oC.

5. Инкубация гистологических срезов вторичными антигенами в разведении 10 мкг/мл ЭФР на 30 минут.

6. Обработка срезов комплексом авидин-пероксидаза в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 минут.

7. Проявление пероксидазной активности 3,3-диаминобензидина тетрахлоридом /ДАБ/ в ЭФР в соотношении 500 мкг ДАБ на 1 мл ЭФР. К свежеприготовленному раствору прибавляют 0,03%-ную перекись водорода и срезы инкубируют с субстратом в течение 10 минут. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду. В дальнейшем срезы проводят по спиртам восходящей концентрации и трем порциям о-ксилола, заключают в бальзам.

Следует отметить, что при проведении всякой иммуногистохимической реакции используют "положительный" контроль, то есть срезы аналогичного исследуемому материала с заведомо позитивной реакцией. Другими словами "положительный" контроль является эталоном качества окраски срезов. В каждом случае применяют и "отрицательный" контроль, то есть срезы аналогичной исследуемой ткани, в которых при проведении реакции опущены 4 или 5 этапы ее с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими слова, применяют тест на качество набивки эндогенной пероксидазы, которая при недостаточном устранении на втором этапе реакции может быть проявлена иммунопероксидазным методом и вызовет ложные представления о степени детекции искомого белка.

В результате реакций на МГ и АБГ получают селективную окраску МГ или АБГ в желто-коричневые цвета. При раке молочной железы определяется яркая окраска цитоплазмы опухолевых клеток, достигающая коричневого цвета /детекция АБГ/ и бледно-желтого цвета /детекция МГ/. Паренхима фиброаденомы молочной железы обнаруживает прямо противоположную раку детекцию белков: АБГ имеет бледно-желтую окраску, а МГ - коричневую. Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить количество МГ и АБГ в гистологическом срезе ткани опухоли молочной железы. По высокой детекции МГ и низкой АБГ судят о принадлежности опухоли к фиброаденоме, а по низкой детекции МГ и высокой АБГ - диагностируют рак молочной железы. Способ повышает точность диагностики фиброаденомы и рака молочной железы и позволяет облегчить дифференциальную диагностику данных опухолей молочной железы.

Пример 1.

Иммуногистохимическая детекция МГ и АБГ в ткани опухоли молочной железы.

Фрагменты операционного материала фиксируют 15%-ным водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающийся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 минут, две порции 70%- и 80%-ного этанола по 6 часов в каждой, три порции 96%-ного этанола по 6 часов в каждой, абсолютный спирт 30 минут, абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 часов, ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 часа, три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе и наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 минут в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 37^oC в течение трех часов. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола /абсолютный, 96%, 70% и 56%-ный/ по три минуты в каждой. Далее срезы переводят на 5 минут в 0,05 М раствор ЭФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы /этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри/ осуществляют свежим 3%-ным раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 минут. ЭФР 5 минут. Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина /50 мг альбумина в 1 мл ЭФР/. После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг среза. На последний наносят каплю афинно очищенных кроличьих антител против МГ /один микропрепарат/ и АБГ /второй микропрепарат/ в концентрации 10 мкг/мл ЭФР. Растворы антител включают в себя 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов проводят в течение 30 минут при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры /для этого на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЭФР/. Две порции ЭФР по 5 минут в каждой, после чего раствор ЭФР меняют на новый. Инкубируют гистологические срезы во вторичных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЭФР в течение 30 минут. ЭФР 5 минут. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 минут. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЭФР. ЭФР 5 минут. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03%-ном растворе субстрата в течение 10 минут. Раствор получают, смешивая непосредственно перед применением 1 мг ДАБ с 2 мл ЭФР и 0,2 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Реакцию останавливают с ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Результат читают под разными увеличениями светового микроскопа по наличию окраски цитоплазмы клеток в опытных микропрепаратах и "положительном" контроле. Использование способа показало, что цитоплазма паренхиматозных клеток опухоли имеет коричневую окраску в срезах, где в качестве первичных антител были использованы кроличьи антитела против МГ; в микропрепаратах, где первичные антитела были против АБГ, цитоплазма имеет бледно-желтую, неравномерную в разных клетках окраску. Эти данные позволяют считать опухолевый процесс доброкачественным. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить токсичность патогистологической диагностики опухолей молочной железы.

Пример 2.

Иммуногистохимическая детекция МГ и АБГ в ткани опухоли молочной железы.

Фрагменты операционного материала фиксируют 15%-ным водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 минут, две порции 70%- и 80%-ного этанола по 6 часов в каждой, три порции 96-ного этанола по 6 часов в каждой, абсолютный спирт 30 минут, абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 часов, ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 часа, три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе и наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 минут в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при температуре 37^oC в течение трех часов. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола /абсолютный, 96%, 70% и 56%-ный/ по три минуты в каждой. Далее срезы переводят на 5 минут в 0,05 М раствор ЭФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы /этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри/ осуществляют свежим 3%-ным раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 минут, ЭФР 5 минут. Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина /50 мг альбумина в 1 мл ЭФР/. После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю афинно очищенных кроличьих антител против МГ /один микропрепарат/ и АБГ /второй микропрепарат/ в концентрации 10 мкг/мл ЭФР. Растворы антител содержат в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов проводят в течение 30 минут при температуре 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры, для чего на дно чашки Петри укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЭФР. Две порции ЭФР по 5 минут в каждой, после чего раствор ЭФР меняют на новый. Инкубируют гистологические срезы во вторичных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЭФР в течение 30 минут. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЭФР. ЭФР 5 минут. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03%-ном растворе субстрата в течение 10 минут. Раствор получают, смешивая непосредственно перед применением 1 мг ДАБ с 2 мл ЭФР и 0,2 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Реакцию останавливают ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Использование способа показало, что цитоплазма перенхиматозных клеток окрашена в разные цвета и имеет разную степень интенсивности окраски. В одних участках, соответствующих фиброаденоме, детакция МГ высокая, а АБГ - низкая. В участках опухоли, где имеются признаки повышения митотической активности опухолевых клеток, их мономорфизм, ядерная гиперхромия, признаки атипии клеток, выполнение просветов расширенных протоков пролифератами клеток, детекция в цитоплазме опухолевых клеток МГ низкая, а АБГ, напротив, высокая. Таким образом, применение способа позволило по высокой детекции МГ и низкой АБГ диагностировать в ткани молочной железы узлов фиброаденомы. Кроме того, на этом фоне, по низкой детекции МГ и высокой АБГ, можно судить о наличии участков малигнизации фиброаденоматоза. Применение способа повысило точность диагностики патологического процесса и облегчило дифференциальную диагностику рака и фонового состояния - фиброаденоматоза молочной железы.

Способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии. У обследуемого берут фрагмент операционного материала. Проводят регидратацию гистологических срезов и удаляют из них остатки парафина. Блокируют эндогенную пероксидазу и неспецифическую сорбцию иммуноглобулинов. Обрабатывают гистологические срезы первичным антителами против альфа 2-макроглобулина (МГ) и альфа 2-гликопротеина (АБГ). Инкубируют гистологические срезы вторичными антителами, получают селективную окраску МГ или АБГ в желто-коричневые цвета, по интенсивности которой определяют степень их детекции. При высокой степени детекции МГ, имеющего коричневую окраску, и низкой степени детекции АБГ, имеющего бледно-желтую окраску, квалифицируют опухоль как фиброаденому. При низкой степени детекции МГ, имеющего бледно-желтую окраску, и высокой степени детекции АБГ, имеющего коричневую окраску, диагностируют рак молочной железы.

Способ дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы в гистологических срезах, включающий окраску цитоплазмы опухолевых клеток, отличающийся тем, что проводят иммунопероксидазную реакцию, которую осуществляют с использованием антител против альфа 2-макроглобулина (МГ) и ассоциированного с беременностью альфа 2-гликопротеина (АБГ), получают селективную окраску МГ или АБГ в желто-коричневые цвета, по интенсивности которой определяют степень их детекции, и при высокой степени детекции МГ, имеющего коричневую окраску, и низкой степени детекции АБГ, имеющего бледно-желтую окраску, квалифицируют опухоль как фиброаденому, а при низкой степени детекции МГ, имеющего бледно-желтую окраску, и высокой степени детекции АБГ, имеющего коричневую окраску, диагностируют рак молочной железы.