УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к составу и способу стабилизации нуклеиновых кислот, в частности, РНК, в т. ч. содержащуюся в клетках РНК, в биологической пробе, в частности, в цельной крови, предпочтительно с последующим выделением нуклеиновых кислот, а также к устройству для применения в качестве трубки для взятия крови, содержащей соответствующий состав для стабилизации всех нуклеиновых кислот, в частности, всей рибонуклеиновой кислоты, и для последующего выделения.

Состав для стабилизации нуклеиновых кислот из биологической пробы, в частности, цельной крови, способ и применяемая в этом способе трубка для взятия крови, содержащая состав, отличаются тем, что достигается эффективная стабилизация нуклеиновых кислот, в частности, РНК, в цельной крови и обеспечивается быстрый и эффективный способ выделения. При этом стабилизации подвержены все нуклеиновые кислоты, в частности, вся рибонуклеиновая кислота, в т. ч. на содержащиеся в бесклеточной плазме нуклеиновые кислоты, в частности, РНК, и нуклеиновые кислоты, содержащиеся в клетках крови, в частности, РНК.

Уровень техники

Для стабилизации содержащейся в пробе РНК WO 02/056030 А2 описывает ёмкость с заданным вакуумом для размещения заданного объёма пробы, при этом в ёмкость помещено средство для ингибирования индукции гена и против энзиматического разложения нуклеиновых кислот, в частности, меркаптоэтанол, дитиотреитол и хаотропная соль, в частности, гуанидинийизотиоцианат или гуанидиниийгидрохлорид.

В WO 00/09746 А1 описан сосуд для взятия крови, содержащий для лизиса клеток и для стабилизации нуклеиновых кислот раствор с содержанием гуанидиния, буфера, детергента и восстановителя, в частности, дитиртреитила, β-меркаптоэтанола и три(2-каробоксиэтил)фосфина. Восстановитель, в частности, β-меркаптоэтанол или три(2-каробоксиэтил)фосфин, в нём считаются по существу предназначенными для стабилизации РНК в сыворотке.

В WO 2009/018034 А1 показаны повышение растворимости додецилсульфата натрия в буфере для лизиса клеток в результате добавки не ионного детергента и способ выделения РНК из ткани животного путём добавки буфера для лизиса, состоящего из 2М NaCl, 1,2% додецилсульфата натрия, 12 mM ЭДТУ, 24 mM трис-HCl, рН 8,0, с 2% Tween и последующая добавка десятикратного объёма экстрагированного буфера, состоящего из 50 мМ трис-HCl, рН 7, 10 мМ ЭДТУ, 7 М гуанидиновой соляной кислоты, 5 % Tween 20.

WO 2007/060248 А1 нацелена на лизис клеток, а именно ткани печени, предусматривает применение хаотропной соли и последующую добавку не хаотропной соли для образования нуклеиновых кислот на материале носителя.

В DE 101 47 439 А1 указано в отношении выделения РНК из крови, что добавляется реагент для лизиса и затем путём центрифугирования отделяют содержащие РНК компоненты клетки. Осаждённую РНК очищают посредством вторичного суспендирования гуанидинийгидрохлоридом и отделением примесей, например, протеина, переводят в осадок спиртом и отделяют.

В DE 10 2014 220 090 В3 описан сосуд для сбора содержащих нуклеиновые кислоты биологических проб, в который может быть помещён пробоотборный тампон, причём в сосуде содержится жидкость для лизиса.

В CN 104673623 А, согласно резюме на английском языке, описаны состав для стабилизации гематоцитов-нуклеиновых кислот и РНК без клеток и пробоотборный сосуд с крышкой.

Задача изобретения

Задачей изобретения является создание альтернативного состава и предпочтительно альтернативного способа стабилизации и последующего выделения всех нуклеиновых кислот из цельной крови. Предпочтительно состав должен стабилизировать общую РНК из цельной крови и обеспечить применение быстрого способа выделения всех нуклеиновых кислот, в частности, РНК. Также предпочтительно состав должен обеспечить возможность стабилизации нуклеиновых кислот при переменном объёме крови, вследствие чего не потребуется обязательное применение содержащей состав трубки для взятия крови и помещения в неё заданного объёма крови.

Раскрытие изобретения

Изобретение решает задачу посредством признаков формулы изобретения, в частности, с помощью состава для стабилизации всех нуклеиновых кислот цельной крови, в частности, РНК, и способа стабилизации всех нуклеиновых кислот цельной крови для последующего выделения, и, при этом, предназначено для лизиса клеток, в результате которого нуклеиновые кислоты клеток во время контактирования с составом, в частности, в момент взятия крови, высвобождаются с сохранением свойств и концентрации и затем могут быть выделены. При этом состав отличается тем, что он предупреждает, в частности, распад РНК в цельной крови, в которую он примешан. Изобретение относится соответственно к применению состава, содержащегося предпочтительно в трубке для взятия крови, в способе, в частности, в качестве средства стабилизации и выделения общей РНК из крови без этапа осаждения и отделения РНК перед её адсорбцией адсорбентом. Для выделения смесь из крови и водного состава может контактировать с адсорбентом без необходимости осаждения РНК. Выделение РНК в результате контакта смеси из водного состава и крови с адсорбентом может производиться непосредственно из всей смеси водного состава с кровью, т. е., например, без осаждения и отделения нуклеиновых кислот из смеси, факультативно после хранения, во время которого смесь перевозилась, например, с места взятия крови к месту проведения способа анализа.

Биологическая проба является предпочтительно жидкой и содержит факультативно клетки человека или животного. Биологическая проба может быть, например, биологической жидкостью, например, спинномозговой жидкостью, мочой, мокротой, биопсией с содержанием разрозненных или гомогенизированных клеток и, в частности, цельной кровью, называемой также просто кровью. Описание относится к цельной крови взамен биологических проб.

Состав в виде водного раствора содержит, по меньшей мере, одну соль гуанидиния, предпочтительно гуанидинийтиоцианат, по меньшей мере, одно буферное вещество, предпочтительно 2-(N-морфолин)этансульфоновую кислоту, не ионный детергент, предпочтительно Triton Х-100 и комплексообразователь для двухвалентных катионов, предпочтительно этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТУ) или состоит из них и, в частности, не содержит восстановителей, например, тиоловых соединений или их соединений-предшественников, в частности, не содержит ß-меркаптоэтанола и дитиотреитола.

В виде водного раствора состав содержит, по меньшей мере, одну соль гуанидиния, например, в количестве от 1,8 до 2,6 М, предпочтительно от 2,0 до 2,4 М, более предпочтительно 2,2 М, по меньшей мере, одно буферное вещество при концентрации, которая доводит объём крови до показателя рН от 5,0 до 8,0, например, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4. 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0 – 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,8, 7,9, предпочтительно рН от 6,5 до 7,3, например, 2-(N-морфолин)этансульфоновую кислоту в количестве до 50 мМ, предпочтительно, по меньшей мере, 70 мМ, например, 100 мМ или до 74 мМ, не ионный детергент, например, Triton Х-100 в количестве от 10 до 20 вес./об. %, предпочтительно от 12 до 18 вес./об. %, комплексообразователь для двухвалентных катионов, в частности, ЭДТУ, в количестве, например, от 50 до 100 мМ, предпочтительно от 70 до 80 мМ, более предпочтительно около 72 мМ, например, до соотношения между объёмом крови и объёмом водного состава 1 : 13 или 1 : 3, или до 1 : 2, предпочтительно до 1 : 2,6, или до 1 : 2,5 или 1 : 2,4, или состоит из них.

Предпочтительно изобретение относится к составу для применения в качестве лизирующего агента для содержащихся в биологической пробе, в частности, в цельной крови, клеток, в качестве стабилизирующего средства для всех нуклеиновых кислот биологической пробы и для отделения посредством адсорбции нуклеиновых кислот из смеси биологической пробы с составом с помощью адсорбера для нуклеиновых кислот, при этом состав в виде водного раствора содержит:

а) по меньшей мере, одну соль гуанидиния,

б) по меньшей мере, одно буферное вещество для буферирования до рН 5,0 - 8,0,

в) по меньшей мере, один не ионный детергент,

г) по меньшей мере, один комплексообразователь для двухвалентных катионов и

д) не содержит восстановителей.

Предпочтительно состав состоит из водного раствора с содержанием:

а) по меньшей мере, одной гуанидиновой соли,

б) по меньшей мере, одного буферного вещества,

в) по меньшей мере, одного не ионного детергента,

г) по меньшей мере, одного комплексообразователя и факультативно протеиназы и/или дезоксирибонуклеазы.

Состав применяется в качестве лизирующего агента для содержащихся в цельной крови клеток и в качестве стабилизирующего средства для содержащихся в них всех нуклеиновых кислот, а также для отделения посредством адсорбции нуклеиновых кислот непосредственно из смеси биологической пробы с составом посредством адсорбента для нуклеиновых кислот.

Буферное вещество выбирается, например, из трис(трис(гидроксиметил)аминометана), цитрата или фосфат(ди-натрийводородфосфат)дигидрата или фосфат-(натрийводородфосфат)дигидрата, бис трис-буфер(бис-(2-гидроксиметил)-имино-трис-(гидроксиметил)-метана). ACES (N-(2-ацетамид)-2-аминометансульфоновой кислоты), натрийводородкарбоната, предпочтительно 2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты.

Не ионный детергент выбирается, например, из Tween 20 (полиоксиэтилен(20)-сорбитан-монолаурат), Nonidet Р40 (4-нонифенол-полиэтиленгликоль), Tween 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Brij 58 (полиэтиленгликоль-гексадециловый простой эфир), Triton Х-114 (октилфенолполиэтиленгликолевый простой эфир), предпочтительно Triton Х-100 (полиэтиленгликоль-р-1,1,3,3-тетраметилбутил)фениловый простой эфир.

Состав обладает преимуществом, состоящим в том, что он вскрывает содержащиеся в цельной крови человека клетки и стабилизирует все нуклеиновые кислоты, в частности, РНК, из цельной крови, причём цельная кровь и состав могут находиться в переменном объёмном соотношении. Поэтому содержащая состав трубка для взятия крови может применяться для помещения в неё переменного объёма крови, например, крови с объёмным соотношением к составу 1 : 13 или 1 : 3, предпочтительно до 1 : 2 или до 1 : 2,6. Для размещения переменного объёма крови трубка для взятия крови, в которой содержится состав, может иметь, например, ручной поршень.

Состав отличается тем, что он не требует осаждения нуклеиновых кислот из смеси цельной крови с составом для стабилизации и выделения нуклеиновых кислот, в частности, РНК, из цельной крови. Поэтому способ согласно изобретению предпочтительно предусматривает отделение нуклеиновых кислот, в частности, РНК, из смеси цельной крови с составом без необходимости в этапе центрифугирования для отделения выпавших в осадок нуклеиновых кислот до адсорбирования этих кислот, в частности, РНК, адсорбентом.

Согласно изобретению предпочтительно вся РНК выделяется из смеси цельной крови с составом в результате того, что эта смесь факультативно после введения протеиназы, например, протеиназы К, и инкубации, например, при комнатной температуре в течение около 15 мин. факультативно до или после введения протеиназы и введения дезоксирибонуклеазы приводится в контакт с адсорбентом для нуклеиновых кислот, причём из смеси, факультативно содержащей добавленную протеиназу и/или дезоксирибонуклеазу, перед контактированием с адсорбентом не отделяется ни один компонент, затем вещества, оказавшиеся не связанными с адсорбентом, удаляются, например, промывкой адсорбента, а нуклеиновые кислоты, связанные с адсорбентом, элюируют, например, приведением в контакт адсорбента с водным буферным раствором с определённым рН, содержанием спирта и/или с концентрацией ионов, при которой связанные адсорбентом нуклеиновые кислоты высвобождаются.

Смесь из цельной крови и состава полностью и непосредственно после приготовления смеси может приводиться в контакт с адсорбентом для нуклеиновых кислот. Это обеспечивает то преимущество, что способ выделения нуклеиновых кислот, в частности, РНК, не требует инкубации для осаждения и центрифугирования перед контактированием смеси с адсорбентом, а также добавки дополнительных веществ, и поэтому он легко и быстро осуществим.

После контакта смеси из цельной крови и состава, в которой факультативно может содержаться протеиназа, может быть факультативно введена дезоксирибонуклеаза, в результате чего ДНК может быть усвоена и по существу выделена РНК.

Адсорбент для нуклеиновых кислот представляет собой, например, поверхность из силики (диоксида кремния), в частности, силико(гелевую) мембрану, силико(гелевую) взвесь или магнитные, покрытые силикой частицы, как, например, выпущенные в продажу фирмой PreAnalytiX под названием PAXgene, фирмой Macherey-Nagel под названием NucleoSpin, фирмой Roche под названием mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow или под названием High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit и предназначенные для выделения нуклеиновых кислот.

Если адсорбент состоит из покрытых силикой частиц, преимущественно магнитных, то предпочтительно добавляется разжижитель в эффективном объёме относительно смеси из цельной крови и состава. Разжижителем может служить, например, выпущенный в продажу фирмой Roche реагент DNA/RNA-Stabilization Reagent for Blood/Bone marrow (Roche, артикул № 11 934 317 001) или состав согласно изобретению, содержащий факультативно этанол до 30 об./об. %, предпочтительно 10 – 30 об./об. %, например, 20 об./об. %. В качестве эффективного объёма может быть определён такой объём, при котором РНК адсорбируется по существу не менее чем на 80% от общего количества, предпочтительно по существу полностью покрытыми силикой частицами. Эффективный объём, при котором разжижитель вводится в смесь из цельной крови и состава, составляет предпочтительно 50 – 150% к объёму смеси, например, 80 – 120%, предпочтительно 100% к объёму смеси до или после примешивания покрытых силикой частиц к смеси, которые являются предпочтительно магнитными. В частности, в данном варианте выполнения предпочтительна добавка протеиназы в смесь.

Покрытыми силикой частицами могут быть, например, частицы фирмы Chemagen или фирмы Applied Biosystems (RNA binding beads, Art.№100191) или фирмы Roche, mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow, Art.№ 11 934 333 001 или частицы согласно Hai N.H., Phu N.D., Luong N.H., Chau N., Chinh H.D., Hoang L.H., Leslie-Pelecky D.I., (2008), Mechanism for Sustainable Magnetic Nanoparticles under Ambient Conditions (Механизм устойчивости магнитных наночастиц в условиях окружающей среды), Journal of the Korean Physical Society, 52 (5), 1327-1331, или частицы согласно Quy D.V., Hieu N.V., Tra P.T., Nam N.H., Son N.T., Nghia P.T., Anh N.T.V., Hong T.T., Luong N.H. (2013), Synthesis of Silica-Coated Magnetic Nanoparticles and Application in the Detection of Pathogenic Viruses (Синтез покрытых силикой магнитных наночастиц и применение в обнаружении патогенных вирусов), Journal of Nanomaterial, DO1: 10.1155/2013/603940.

Также и при использовании адсорбента из покрытых силикой частиц, которые предпочтительно являются покрытыми силикой магнитными частицами, вся смесь из цельной крови и состава приводится в контакт с адсорбентом с добавленным в него разжижителем непосредственно или полностью или без предварительного отделения компонента смеси.

Согласно изобретению вся смесь может контактировать непосредственно с адсорбером, так как из смеси из цельной крови и состава не отделяется ни один компонент или фракция, в частности, не требуется центрифугирования данной смеси для отделения выпавшего в осадок компонента, например, отгонки выпавших в осадок нуклеиновых кислот с последующим отделением жидкой фазы и высвобождением нуклеиновых кислот. Теперь это объясняется тем, что состав не осаждает нуклеиновые кислоты, в частности, РНК, в смеси из цельной крови. Составу присуще то преимущество, что смесь из цельной крови и состава, факультативно с содержанием добавленной протеиназы и/или дезоксирабонуклеазы, может контактировать с адсорбентом для нуклеиновых кислот, в частности, с поверхностями из силики, без дополнительных этапов обработки и без добавок для того, чтобы связать нуклеиновые кислоты адсорбентом. Поэтому состав позволяет применять способ выделения нуклеиновых кислот, при котором не проводится отделения содержащей нуклеиновые кислоты фракции перед контактированием с адсорбентом, например, без осаждения центрифугированием с последующим высвобождением.

Состав стабилизирует нуклеиновые кислоты, в частности, РНК, в смеси из цельной крови и состава, например, при хранении в течение, по меньшей мере, 3 суток, предпочтительно, по меньшей мере, 5 суток, например, до 4 суток, в частности, без замораживания, например, при хранении, по меньшей мере, при 0⁰С, например, при комнатной температуре до 22,5⁰С. Соответственно способом предпочтительно предусмотрено выделение нуклеиновых кислот, в частности, РНК, из смеси, например, после хранения без замораживания или при, по меньшей мере, 0⁰С, например, при 15 – 25⁰С, в частности, при температуре до 22,5⁰С. В качестве альтернативы или дополнения в целях хранения смесь может замораживаться, например, при -40⁰С или ниже.

Более точно изобретение описывается ниже с помощью примеров со ссылками на фигуры, на которых изображено:

фиг. 1 – целостность РНК, выделенной из цельной крови в смеси с составом согласно изобретению при разных объёмных соотношениях;

фиг. 2 – показатели концентрации РНК, выделенной из цельной крови в смеси с составом согласно изобретению при разных объёмных соотношениях,

фиг. 3 и 4 – сравнение целостности РНК из проб цельной крови (донор № 1 и донор № 2) после хранения в стабилизаторе согласно WO 00/09746 в сравнении с хранением в составе согласно изобретению,

фиг. 5 – кластерный анализ концентрации разных информационных РНК во всей РНК, выделенной из цельной крови в смеси с составом согласно изобретению,

фиг. 6 – корреляционная матрица для получения зависимых от хранения различий экспрессии,

фиг. 7, 8 – относительные количества определённых посредством ОТ-ПЦР информационных РНК в пробах от двух доноров, выделенных из цельной крови в смеси с составом согласно изобретению после хранения в течение 5 суток.

Состав согласно изобретению в виде водного раствора ввели в трубку для взятия крови, в которую поместили пробу крови. Эта трубка может использоваться непосредственно для взятия крови. В качестве альтернативы состав может быть смешан с цельной кровью, происходящей предпочтительно из непосредственно до этого отобранной пробы цельной крови. Лизис клеток из пробы крови и стабилизация нуклеиновых кислот, в частности, РНК, производились в целом путём смешения пробы цельной крови с составом.

Пример 1. Выделение РНК из цельной крови.

В качестве состава согласно изобретению применялся водный раствор, состоявший из 2,2 М гуанидинийтиоцианата, 72 мМ 2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты, 14,4 % (вес./об.) Triton _Х-100 и 72 мМ ЭДТУ в воде. Из этого состава его 6,5 мМ находились в обычной трубке для взятия крови, в которую поместили непосредственно перед этим взятую кровь, которую дополнительно не обрабатывали и которая не содержала никакой добавки. Эту цельную кровь поместили в трубку для взятия крови в объёме 0,5 мл, 1, 0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл и 2,5 мл. Перемешивание происходило при поступлении объёма крови, факультативно дополнительным встряхиванием, в частности, после попадания внутрь воздушного пузырька.

Смесь из состава и цельной крови разбавили протеиназой К (250 мкл, 18 мкг/мл). Смесь инкубировали в течение около 15 минут при комнатной температуре. После этого смесь полностью пропустили через колонку с адсорбентом (High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, выпущено в продажу фирмой Roche) для нуклеиновых кислот. Адсорбент промыли промывочным буфером в соответствии с указаниями изготовителя, затем элюировали связанные нуклеиновые кислоты посредством 100 мкл буфера для элюирования.

Качество элюированной РНК определяли посредством электрофореза в наномикросхемной системе для РНК (Agilent Technologies, США), обнаружение оценивалось посредством биоанализатора Agilent 2100, при этом так называемое RIN (RNA Integrity Number : число целостности РНК), которое определяли при анализе с помощью биоанализатора 2100, было указана как мера целостности РНК. На фиг. 1 результатом анализа показано для разных объёмных соотношений между цельной кровью и составом (РНК, Exact), что целостность РНК не зависит от объёмного соотношения или что состав стабилизирует РНК одинакового качества при разных объёмных соотношениях посредством цельной крови, и РНК может выделяться из их смеси.

На фиг. 2 приведена замеренная концентрация РНК в элюате, которая была выявлена при разных объёмных соотношениях. Результаты показывают вследствие пропорционального к объёму крови росту концентрации РНК в 100 мкл элюата, что состав (РНК, Exact) стабилизирует РНК в одинаковой мере при разных объёмных соотношениях и поэтому в одинаковой мере происходит выделение. Это свидетельствует о том, что состав является пригодным для лизиса клеток в цельной крови и для стабилизации нуклеиновых кислот в цельной крови при разных объёмных соотношениях.

Пример 2. Сравнение стабилизирующей способности состава согласно

изобретению с эталонным раствором

В качестве состава согласно изобретению (РНК, Exact) применили состав из примера 1 в количестве 6,5 мл, который смешали с предварительно перед этим взятой кровью без каких-либо других компонентов для приготовления смеси из состава и цельной крови. Для сравнения использовали раствор, который состоял из 4,0 М гуанидинийтиоцианата, 45 мМ трис/HCl, 18,0% (вес./об.) Triton Х-100 и 0,8% (вес./об.) дитиотреитола (DTT) в воде и который довели до показателя рН 6,0 (сравнение в соответствии с WO 00/09746 А1), 2,5 мл эталонного раствора смешали, как описано в WO 00/09746 А1 (в соотношении 1 + 1) с 2,5 мл пробы предварительно и непосредственно взятой крови. Смеси хранились при 22,5⁰С, и РНК выделяли с помощью NucleoSpin RNA Blood Midi Kit фирмы Macherey-Nagel из смесей. В эталонный раствор было добавлено, как предусмотрено протоколом фирмы Macherey-Nagel, 1/3 объёма 70%-го этанола. Для смеси с составом согласно изобретению эта мера не требуется. На фигурах 3 и 4 показаны результаты капиллярно-электрофоретического разделения элюатов на наномикросхеме биоанализатора 2100. Если РНК с высокой целостностью могла выделиться из смеси проб с содержанием состава согласно изобретению по истечении 3 и 5 суток, то при использовании эталонного раствора это было возможно только в день 0, т.е. сразу после смешения с кровью.

Пример 3. Стабилизация РНК и её выделение из цельной крови

В качестве состава согласно изобретению применялся состав из примера 1 в количестве 6,5 мл, который был смешан с 2,5 мл непосредственно перед этим взятой кровью, не содержавшей других добавок, для приготовления смеси из состава и цельной крови. Для сравнения в трубку для взятия крови набрали кровь, содержавшую ЭДТУ для ингибирования коагуляции (S-Monovetten EDTA-K3, выпущено в продажу фирмой Sarstedt). Кровь была взята от трёх разных доноров.

Смеси согласно изобретению и эталонные пробы инкубировали при 22,5⁰С, при этом была отобрана аликвотная проба немедленно (Т0 = нулевые сутки), через сутки (Т1) и через 3 суток (Т3) инкубации. Из отобранных аликвотных проб были выделены непосредственно и немедленно нуклеиновые кислоты, как описано в примере 1.

Для удаления ДНК элюированные нуклеиновые кислоты обработали дезоксирибонуклеазой (Thermo Fisher Sсientific, артикул № EN0521) и тестировали посредством анализа биочипом на концентрацию около 47000 транскриптов (информационных РНК) (humanHT-12 v4.0 Expression Bead Chip, фирма Agilent). При анализе сначала индицировали различия в количествах транскриптов с превышением более, чем в два раза при одинаковом количестве РНК. Поэтому на фиг. 5 одинаковые светлые места в матрице указывают на сопоставимость количеств транскриптов. На фиг. 5 приведены количества транскриптов для групп проб «Stabil» (состав согласно изобретению), не обработаны (лишь разбавлены посредством ЭДТУ), нулевые сутки (без добавки, выделение сразу после взятия крови) соответственно для проб, взятых у доноров 1, 2 и 3 в указанные моменты времени.

Аликвотные пробы, результаты анализа которых приведены на фиг. 5

Донор 1 2 3 Проба 1Т0 2Т0 3Т0 Проба 1Т1 1КТ1 2Т1 2КТ1 3Т1 3КТ1 Проба 1Т3 1КТ3 2Т3 2КТ3 3Т3 3КТ3

При этом эталонные пробы с содержанием ЭДТУ обозначены буквой «К».

Кластерный анализ выбранных в качестве примера 199 транскриптов, показанных на фиг. 5, поясняет, что пробы крови, смешанные с составом (Stabil) согласно изобретению, показывают для одного донора в разные моменты инкубации сопоставимый образец транскриптов, в то время как эталонные пробы (не обработанные), только разбавленные ЭДТУ, в различные моменты инкубации свидетельствовали о больших отличиях по каждому донору, что указывает на изменение количеств транскриптов в течение времени и по отношению к Т0 (нулевым суткам).

В отношении разбавленных только с помощью ЭДТУ проб крови на третьи сутки по сравнению с нулевыми сутками была обнаружена для 768 транскриптов разница по концентрации, в то время как в отношении проб, разбавленных составом согласно изобретению, по каждому донору была определена существенно меньшая или отсутствующая разница по концентрации индивидуальной РНК в анализированных в более поздние моменты пробах по сравнению с нулевыми сутками (см. корреляционную матрицу на фиг. 6. Эталонные пробы = К, соответственно в моменты времени КТ0, КТ1, КТ3, при использовании состава согласно изобретению Т0, Т1, Т3).

Данный результат, учитывая постоянные количества транскриптов по отдельным донорам в течение 3 суток в смешанных с составом аликвотных количествах проб крови, свидетельствует о том, что состав по изобретению стабилизирует индивидуальные молекулы РНК из цельной крови во время инкубации и что состав, например, по сравнению с эталонными, содержащими ЭДТУ пробами существенно препятствует дегенерации и индукции информационной РНК.

Пример 4. Обратная транскрипция и ПЦР на основе РНК из цельной крови

Цельную кровь, взятую у двух разных доноров в количестве по 2,5 мл, разбавили сразу после взятия 6,5 мл состава согласно изобретению, состоявшего из 2,2 М гуанидинийтиоцианата, 72 мМ 2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты, 14,4% (вес./об.) Triton X-100 и 72 мМ ЭДТУ в воде и инкубировали при 22,5⁰С. Из этих смесей отобрали немедленно (нулевые сутки, Т0), через 3 суток (Т3), через 4 суток (Т4) и через 5 суток (Т5) соответственно аликвотные пробы и заморозили при -80⁰С. Затем одновременно все пробы разморозили и поместили на адсорбер для нуклеиновых кислот (NucleoSpin RNA Blood, фирма Macherey-Nagel). Адсорбент промыли в соответствии с указаниями изготовителя и элюировали нуклеиновые кислоты. В элюат добавили дезоксирибонуклеазу (дезоксирибонуклеаза I без содержания рибонуклеазы, артикул № EN0521, фирма Thermo Fisher Scientific). РНК подвергли обратной транскрипции с помощью « first strand cDNA synthesis kit, артикул № К1612, фирма Thermo Fisher Scientific) для получения комплементарной ДНК (кДНК). Данный продукт в виде двойной смеси увеличили и квантифицировали посредством праймеров, специфичных для нуклеотидных генов для ß-Actin, GAPDH, IL-8, c-FOS, IL-1B и TNF-α, посредством ПЦР в реальном масштабе времени с использованием Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (артикул № #К0222, фирма Thermo Fisher Scientific).

Для анализа использовали Ct-показатели, полученные для комплементарной РНК ß-Актина и GAPDH, в качестве внутреннего стандарта и были стандартизированы Ct-показатели, замеренные для IL-18, c-Fos, IL-1B и ТNF-α. Эти относительные показатели концентрации комплементарных ДНК для IL-18, c-Fos, IL-1B и ТNF-α при Т3, Т4 и Т5 были дополнительно соотнесены с соответствующей концентрацией при Т0. Эти результаты обозначены как ddCt и представлены на фиг. 7 для крови одного донора и на фиг. 8 для крови другого донора. Результаты по обеим пробам свидетельствуют о том, что состав согласно изобретению поддерживает стабильными относительные показатели концентрации специфически выявленных клеточных информационных РНК в цельной крови на протяжении инкубации при 22,5⁰С.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая применение состава в качестве лизирующего агента содержащихся в цельной крови клеток, в качестве средства для стабилизации общей РНК в цельной крови и для выделения РНК посредством адсорбции из смеси цельной крови с составом адсорбентом для нуклеиновых кислот и способ выделения всей РНК из цельной крови. В одном из вариантов реализации состав в виде водного раствора состоит из гуанидинийтиоцианата, по меньшей мере одного буферного вещества, по меньшей мере одного неионного детергента, этилендиаминтетраацетата, и необязательно протеиназы и/или дезоксирабонуклеазы и не содержит восстановителей, ингибирующих разложение и новый синтез РНК в цельной крови. Изобретение расширяет арсенал средств для лизиса клеток и выделения РНК из цельной крови. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Применение состава в качестве лизирующего агента содержащихся в цельной крови клеток, в качестве средства для стабилизации общей РНК в цельной крови и для выделения РНК посредством адсорбции из смеси цельной крови с составом адсорбентом для нуклеиновых кислот, где состав в виде водного раствора состоит из:

а) гуанидинийтиоцианата,

б) по меньшей мере одного буферного вещества, выбранного из 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), трис(трис(гидроксиметил)аминоматана), цитрата, фосфат(динатрийгидрофосфат)дигидрата, бис-трис-буфера (бис(2-гидроксиметил)-имино-трис-(гидроксиметил)-метан), ACES (N-(2-ацетамид)-2-аминометансульфоновой кислоты), натрийводородкарбоната или фосфат-(натрийводородфосфат)дигидрата для буферирования до рН 5,0-8,0,

в) по меньшей мере одного неионного детергента, и

г) этилендиаминтетраацетата,

д) необязательно протеиназы и/или дезоксирибонуклеазы и

е) не содержит тиоловые соединения или их предшественники-соединения в качестве восстановителя.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что оно предусматривает выделение нуклеиновых кислот из смеси, состоящей из цельной крови и состава, посредством контактирования смеси с адсорбентом для нуклеиновых кислот без предварительного осаждения и отделения нуклеиновых кислот центрифугированием смеси.

3. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что состав в смеси с цельной кровью используется при переменном объёмном соотношении до 1:13 между цельной кровью и этим составом.

4. Применение по любому из предыдущих пунктов в качестве лизирующего агента содержащихся в цельной крови клеток, в качестве средства стабилизации общей содержащейся в цельной крови РНК и для выделения путём адсорбции нуклеиновых кислот непосредственно из смеси биологической пробы с составом с помощью адсорбента для нуклеиновых кислот.

5. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что состав находится в трубке для взятия крови.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что трубка для взятия крови выполнена с возможностью вбирать в себя переменный объём биологической пробы.

7. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что адсорбция происходит непосредственно из смеси, при этом из смеси не выделяют ни одного компонента, необязательно в смесь вводят протеиназу и/или дезоксирибонуклеазу, и до контакта с адсорбентом нуклеиновых кислот их не осаждают и не выделяют.

8. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что состав в смеси с цельной кровью используется при переменном объёмном соотношении до 1:13 между цельной кровью и этим составом.

9. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что адсорбция происходит непосредственно из смеси, при этом из смеси не выделяют ни одного компонента, необязательно в смесь вводят протеиназу и/или дезоксирибонуклеазу, и до контакта с адсорбентом нуклеиновых кислот их не осаждают и не выделяют.

10. Способ выделения всей РНК из цельной крови, отличающийся тем, что смешивают цельную кровь с составом, состоящим в виде водного раствора из:

а) гуанидинийтиоцианата,

б) по меньшей мере одного буферного вещества, выбранного из 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES), трис(трис(гидроксиметил)аминоматана), цитрата, фосфат(динатрийгидрофосфат)дигидрата, бис-трис-буфера (бис(2-гидроксиметил)-имино-трис-(гидроксиметил)-метан), ACES (N-(2-ацетамид)-2-аминометансульфоновой кислоты), натрийводородкарбоната или фосфат-(натрийводородфосфат)дигидрата,

в) по меньшей мере одного неионного детергента и

г) этилендиаминтетраацетата,

д) необязательно протеиназы и/или дезоксирабонуклеазы

и не содержащим восстановителей, ингибирующих разложение и новый синтез РНК в цельной крови,

причем приготавливают смесь из цельной крови и состава при объёмном соотношении между кровью и составом до 1:13, необязательно хранят полученную смесь при температуре свыше 0°С, необязательно добавляют протеиназу и/или дезоксирабонуклеазу в смесь,

приводят в контакт смесь с адсорбентом для нуклеиновых кислот, причём из смеси не отделяют ни одного компонента перед контактированием с адсорбентом,

удаляют несвязавшиеся вещества с адсорбента и

элюируют РНК с адсорбента.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что контактирование смеси с адсорбентом происходит без предварительного осаждения, отделения и высвобождения нуклеиновых кислот из смеси.

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что хранение смеси проводится по меньшей мере в течение 3 суток при температуре не свыше 25⁰С.

13. Способ по любому из пп. 10 и 12, отличающийся тем, что смешивают биологическую пробу с составом при объёмном соотношении до 1:13, предпочтительно до 1:2.

14. Способ по любому из пп. 10-13, отличающийся тем, что адсорбентом являются частицы с кремнеземным покрытием и что в смесь из биологической пробы и состава вводят разбавитель в объёме не менее 50% к объёму смеси.