СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ СОХРАННОСТЬ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2008 года по МПК A01N1/02 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способу консервации биологических образцов.

Уровень техники

Выделение интактных нуклеиновых кислот - ДНК и/или РНК - из биологических образцов является необходимым условием для многих видов экспериментов и аналитических исследований, включая клонирование генетического материала и разные виды молекулярной диагностики, основанные на размножении нуклеиновых кислот, таких как ПЦР (полимеразная цепная реакция) или изотермические способы размножения, рассмотренные, например, в работах [1, 2]. Часто между забором биологического материала и выделением из него нуклеиновых кислот проходит много времени; часто собранный материал должен быть транспортирован на значительное расстояние при относительно высокой температуре. Бывает также удобно собрать серию образцов в течение некоторого времени, а затем все образцы обрабатывать одновременно. Во всех этих и во многих других случаях образцы должны храниться в течение некоторого, подчас длительного, времени и очень важно обеспечить такие условия хранения, чтобы сохранилась целостность (интактность) нуклеиновых кислот.

Важно, чтобы условия хранения были совместимы с последующим использованием нуклеиновых кислот. Например, в образец не должны вводиться препараты (например, ванадат-рибонуклеозидные комплексы), которые в дальнейшем могут привести к ингибированию ПЦР. Важно также, чтобы способ хранения образцов не требовал использования дорогостоящего и громоздкого оборудования (например, низкотемпературных морозильников), был дешевым и простым.

К настоящему времени предложено много способов хранения биологического материала. Наиболее распространенным является хранение в замороженном состоянии. Чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот, стараются замораживать образцы очень быстро (например, в жидком азоте) и хранить их при очень низкой температуре (например, при -80°С). Помимо того, что этот способ слишком дорог и недоступен для многих клинических лабораторий, он также не обеспечивает полной сохранности нуклеиновых кислот, так как в процессе размораживания из-за разрушения внутриклеточных структур высвобождаются нуклеазы, которые быстро гидролизуют ДНК и - особенно - РНК. Чтобы сократить время размораживания и уменьшить деградацию нуклеиновых кислот, образец растирают в порошок в замороженном состоянии. Однако такой способ очень трудоемок и непригоден для диагностических целей, так как сопряжен с высоким риском взаимного загрязнения образцов.

Было предложено хранить образцы фиксированными в смеси 5% уксусной кислоты, 95% этанола и ингибиторов рибонуклеаз [3]. Помимо того, что это способ не обеспечивает полной сохранности РНК [4], он также сопряжен с деградацией ДНК (которая подвержена гидролизу в кислой среде). Были также предложены другие варианты спиртовых растворов, смесей спиртов с ацетоном (например, рассмотренные в публикации [4]), смеси метанола с полиэтиленгликолем [5]. Однако помимо того, что хранение в таких растворах не обеспечивает сохранности РНК при комнатной температуре [4], интенсивная деградация нуклеиновых кислот может происходить из-за реактивации нуклеаз в момент замены спиртов на водные растворы, в которых осуществляют выделение нуклеиновых кислот. Аналогичные проблемы возникают при использовании веществ, которые вызывают преципитацию РНК из водных растворов, такие как трифенилметановые красители или соли кобальта [6]; кроме того, в этом случае красители и ионы кобальта могут ингибировать последующую ПЦР.

Еще было предложено стабилизировать РНК в растворе сильным детергентом додецилсульфатом лития [7]. Мы пробовали использовать такой способ, но обнаружили, что при обработке образцов с высоким содержанием рибонуклеаз, таких как цельная кровь, РНК деградирует в первые же секунды после добавлении додецилсульфата. Дело в том, что додецилсульфат значительно быстрее увеличивает доступность нуклеаз к РНК, разрушая субклеточные структуры и РНК-белковые комплексы, чем инактивирует нуклеазы. Кроме того, инактивация рибонуклеаз додецилсульфатом в значительной мере обратима.

Наиболее сильным из известных денатурантов рибонуклеаз является тиоцианат гуанидина, который широко используют при выделении РНК [8]. Однако не известны примеры успешного использования этого вещества для длительного хранения биологического материала. Более того, автор патента [4] демонстрирует, что в присутствии тиоцианата гуанидина РНК практически полностью деградирует уже за 12 часов при +4°С, указывая на возможность того, что сам гуанидин является катализатором гидролиза РНК. Этот же автор предлагает использовать "высаливание" образцов высокими концентрациями солей (предпочтительно сульфатом аммония), достаточными для преципитации РНК. Хотя автор патента [4] приводит положительные примеры использования высаливания для консервации кусочков тканей, он вскользь упоминает возможность использования такого способа и для консервации клеточных суспензий, в частности, крови. При проверке данного способа консервации крови, было обнаружено, что (1) при концентрации сульфата аммония, рекомендованной автором патента [4], не образуется осаждаемого преципитата. Вместо этого образуется желеобразная масса, которая лишь немного уплотняется при центрифугировании. Из этой массы не удалось выделить нуклеиновые кислоты. При добавлении тиоцианата гуанидина она растворилась, но из полученного раствора не удалось осадить нуклеиновые кислоты способами, обычно применяемыми для осаждения РНК и ДНК из гуанидинтиоцианатных лизатов в отсутствие сульфата аммония, например, добавлением изопропанола.

В качестве прототипа настоящего изобретения может быть рассмотрен патент [4], а также родственные патенты [9, 10].

Мы усомнились в том, что сам тиоцианат гуанидина может вызывать деградацию РНК и предположили, что быстрая деградация РНК, описанная в патенте [4], была вызвана какими-то иными факторами. В случае биологических образцов, особенно животных тканей, таких факторов может быть множество. Прежде всего, это рибонуклеазы, ионы двух- и трехвалентных металлов и перекиси, являющиеся источником свободных радикалов. К сожалению, автор патента [4] не дает детального описания эксперимента, а лишь указывает, что "образцы были помещены в раствор, основанный на 4М тиоцианате гуанидина при 4°С на 12 часов" ("samples were placed... in a 4 molar guanid-inium isothiocyanate (GITC) based RNA extraction solution (lanes 1, 3, and 5) at 4°C for 12 hours" - см. подпись к фиг.2 патента [4]). Поэтому неясно, какие еще вещества и в каких концентрациях присутствовали в растворе, а также в каких условиях (рН, освещенность) проводился эксперимент.

В процессе экспериментов было установлено, что при правильном составе консервирующего раствора, приготовленного на основе тиоцианата гуанидина, РНК и ДНК остаются интактными при +4°С в течение, по крайней мере, 2 недель. Более того, в таком растворе РНК сохраняется в существенно интактном состоянии при комнатной температуре до 3 суток. Также установлено, что сохранность РНК при комнатной температуре можно продлить, по крайней мере, до 2 недель, если высадить нуклеиновые кислоты водорастворимым органическим растворителем (чертеже). Таким образом, было продемонстрировано, что тиоцианат гуанидина не является фактором, вызывающим деградацию РНК.

Целью данного изобретения является повышение сохранности РНК и ДНК в течение длительного времени, в том числе при относительно высоких температурах. Другой задачей является разработка способа, совместимого с последующим выделением чистых нуклеиновых кислот из консервированных образцов и разными методами анализа, включая ПЦР и иные системы размножения нуклеиновых кислот.

Сущность изобретения

Указанные цели решаются тем, что предложен способ консервации биологических образцов, который включает получение лизата путем смешивания биологического материала с консервирующим раствором, содержащим соединение гуанидина в количестве, достаточном для существенно полной денатурации содержащихся в образце нуклеаз, причем консервирующий раствор также содержит следующие компоненты, препятствующие деградации нуклеиновых кислот: (1) восстановитель белковых S-S-связей в количестве, обеспечивающем существенно полное восстановление S-S-связей в белках лизата; (2) сильный детергент, не образующий нерастворимого соединения с гуанидином, в количестве, достаточном для формирования мицелл в лизате; (3) по крайней мере, один комплексен ионов двух- и трехвалентных металлов в количестве, обеспечивающем его молярную концентрацию в лизате заведомо более высокую, чем ожидаемая максимальная молярная концентрация ионов двух- и трехвалентных металлов; (4) буфер, поддерживающий значение рН лизата в диапазоне от 6 до 8.

Предложенный способ консервации обеспечивает хранение образцов в течение длительного времени, а также безопасную транспортировку образцов при температуре окружающей среды. Наконец, предложенный способ консервации совместим с процедурой последующего выделения нуклеиновых кислот.

Перечень чертежей

Изобретение поясняется чертежом:

применение способа для консервации образцов крови, особенно богатой рибонуклеазами и ионами железа, где: (А) - препараты цельной крови анализировали с помощью электрофореза в ПААГ, с последующим окрашиванием бромистым этидием, выявляющим преимущественно ДНК, (Б) - данные авторадиографии, полученные с использованием фосфоимиджера "Cyclon".

Описание изобретения

Основываясь на результатах исследований, предложен способ консервации биологических образцов, обеспечивающий существенную сохранность РНК и ДНК в процессе хранения образцов до выделения нуклеиновых кислот. Суть предлагаемого изобретения состоит в том, что биологические образцы смешивают с консервирующим раствором, который (1) содержит, помимо тиоцианата гуанидина, ряд компонентов, препятствующих деградации нуклеиновых кислот под действием факторов, присутствующих в биологических образцах или образующихся при их хранении и (2) имеет значение рН, при котором наблюдается наименьшая скорость гидролиза ДНК и РНК и наименьшая скорость образования свободных радикалов. При необходимости, в процессе добавления консервирующего раствора образец гомогенизируют. В дальнейшем, обработанный таким образом образец будем называть лизатом.

Согласно изобретению консервирующий раствор содержит следующие компоненты, препятствующие деградации нуклеиновых кислот.

(1) Соединение гуанидина, предпочтительно тиоцианат гуанидина, но возможно также использование хлорида или иных солей гуанидина, а также смесей разных соединений гуанидина. Конечная концентрация соединения гуанидина в лизате должна обеспечивать, с учетом присутствия других компонентов консервирующего раствора, существенно полную денатурацию белков, прежде всего полную денатурацию рибонуклеаз и дезоксирибонуклеаз (вместе - нуклеаз). В случае тиоцианата гуанидина, предпочтительная концентрация в лизате равна 4 М, в случае хлорида гуанидина - 6 М.

(2) Соединение, восстанавливающее S-S-связи в белках, - с целью существенно полной инактивации нуклеаз с учетом присутствия других компонентов консервирующего раствора. Предпочтительным соединением является 2-меркаптоэтанол (β-меркаптоэтанол) в силу его относительной дешевизны, но возможно использование и других восстановителей, таких как дитиотрейтол, тиомочевина и глутатион. Конечная концентрация восстановителя в лизате должна обеспечивать, с учетом присутствия других компонентов консервирующего раствора, существенно полное восстановление S-S-связей в белках лизата. Предпочтительная концентрация 2-меркаптоэтанола в лизате - от 1 до 2% (по объему). Предпочтительная концентрация других восстановителей может быть другой. Например, восстановительный потенциал дитиотрейтола выше, чем 2-меркаптоэтанола, поэтому его предпочтительно использовать в 4-6 раз более низкой концентрации.

(3) Сильный детергент, не образующий нерастворимого соединения с гуанидином при их совместном присутствии в консервирующем растворе при температуре его хранения (которой предпочтительно является комнатная температура). Детергент способствует полной инактивации нуклеаз, а также улучшает лизис клеток и тканей образца. Предпочтительным детергентом является саркозил (N-додецилсаркозин или N-лаурилсаркозин), но возможно использование и других детергентов, таких как эфиры полиэтиленгликоля, известные под торговой маркой Triton (например, Triton Х-100 - терт-октилфениловый эфир полиэтиленгликоля) и полиоксиэтиленсорбитаны, известные под торговой маркой Tween (например, Tween 20 - монолаурат полиоксиэтилен-сорбитана), или их химические аналоги. Не годится, например, додецилсульфат, образующий с гуанидином нерастворимое соединение при комнатной температуре. Концентрация детергента в лизате должна быть достаточно высокой для формирования мицелл. Предпочтительная концентрация саркозила в лизате - 0,5%.

(4) По крайней мере, один комплексон (хелатор) ионов двух- и трехвалентных металлов, являющихся эффективными катализаторами гидролиза РНК [11]. Особенную опасность представляют ионы Fe²⁺ и Fe³⁺, присутствующие в животных тканях в больших количествах в составе гемоглобина и высвобождающиеся при его денатурации. Предпочтительным комплексоном является ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат), константы связывания которого с ионами железа составляют ≈10^-14 М^-1 (Fe²⁺) и ≈10^-24 М^-1 (Fe³⁺) [12]. Также могут быть использованы другие комплексоны, такие как ЭГТА (этиленгликоль-бис[2-аминоэтил]-N,N,N',N'-тетраацетат), 8-гидроксихинолин и 1,10-фенантролин. Молярная концентрация комплексона должна быть заведомо выше, чем ожидаемая максимальная молярная концентрация ионов двух- и трехвалентных металлов. Предпочтительная концентрация ЭДТА в лизате - 10-20 мМ.

(5) Буфер, поддерживающий значение рН в диапазоне от 6 до 8. При рН>8 возможен щелочной гидролиз РНК, а при рН<6 возможна кислотная апуринизация ДНК с последующей деградацией ее сахарофосфатного остова [13]. Кроме того, при понижении значения рН от 6 до 4 многократно ускоряется так называемая реакция Фентона [14], при которой с участием Fe²⁺ из перекисей, которые могут присутствовать в тканях или образовываться под действием света при наличии растворенного кислорода, образуются свободные радикалы, прежде всего гидроксил-радикалы, вызывающие негидролитический распад как РНК [15], так и ДНК [16]. Как правило, биологические лизаты имеют кислую реакцию, поэтому предпочтительным буфером является соль лимонной кислоты, например, трехзамещенный цитрат натрия, который эффективно поддерживает рН на уровне выше 6, одновременно являясь эффективным комплексоном ионов Fe³⁺ [12]. Предпочтительная концентрация буфера в лизате - 20-30 мМ, но при необходимости могут быть использованы и более высокие концентрации.

Следует отметить, что, кроме буфера, реакции Фентона препятствуют и другие компоненты консервирующего раствора, такие как восстановители S-S-связей и комплексоны ионов двух- и трехвалентных металлов [14], а во избежание образования перекисей лизат следует хранить в защищенном от света месте и/или в светозащитной посуде.

Предпочтительный состав консервирующего раствора и предпочтительный способ консервации биологического образца приведен в примере 1, а результат его применения для консервации образцов крови, особенно богатой рибонуклеазами и ионами железа, показан на чертеже.

Согласно изобретению сохранность РНК в лизате может быть дополнительно увеличена путем последующего смешивания лизата с водорастворимым органическим растворителем, способного вызывать преципитацию нуклеиновых кислот. Такими свойствами обладают многие органические растворители, например, низкомолекулярные спирты (такие как метанол, этанол и изопропанол), ацетон, полиэтиленгликоль и диметилсульфоксид [17]. Предпочтительным согласно изобретению является изопропанол. Количество добавляемого органического растворителя должно обеспечивать существенно полную преципитацию нуклеиновых кислот, но при этом не быть избыточным, чтобы не вызвать чрезмерную преципитацию белков. Предпочтительное количество изопропанола - 2 объема на 1 объем лизата; оптимальное количество других растворителей может быть иным и должно быть установлено в предварительных экспериментах. Предпочтительный способ консервации биологического образца с применением изопропанола приведен в примере 2, а результат его применения для консервации образцов крови показан на чертеже.

Можно заметить, что по мере хранения лизата в присутствии изопропанола снижается количество ДНК, выделяемой из лизата по методу, изложенному в примере 3. Однако при этом не заметно увеличения содержания низкомолекулярных фрагментов, как следовало бы ожидать при деградации ДНК. Наиболее вероятная причина снижения выхода - потери ДНК, вызванные ухудшением ее растворимости при хранении в присутствии изопропанола. Вероятно, при хранении образуются плотные ДНК-белковые агрегаты, которые теряются при фенольной экстракции, переходя в органическую фазу. Поэтому, если желательно выделить ДНК из такого образца с максимальным выходом, образец перед фенольной экстракцией следует обработать протеиназой К (или другой подобной протеазой), предпочтительно в присутствии мочевины и детергента, как описано, например, в работе [18].

Лизат, полученный в результате смешивания биологического образца с консервирующим раствором согласно изобретению, полностью совместим с большинством из широко используемых процедур выделения нуклеиновых кислот. По химическому составу этот лизат близок лизату, получаемому при различных способах выделения нуклеиновых кислот, в том числе при выделении РНК с помощью экстракции кислым фенолом [19] и при выделении РНК и ДНК с помощью адсорбции на мелкодисперсных силикатных или стеклянных носителях [20], применяемых, например, в экстракторе NucliSens (Organon Teknika, Нидерланды). Фактически, процесс консервации образца заменяет стадию получения лизата, предусмотренную указанными способами.

Предложенный способ поясняется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Консервация образцов крови и костного мозга.

Ниже приведена процедура, рассчитанная для обработки 0,15 мл крови. Аналогичные результаты получаются при консервации 0,15 мл иных клеточных суспензий, например, костного мозга. При консервации образца другого объема следует пропорционально изменить объемы добавляемых растворов. При консервации твердых тканей их следует предпочтительно гомогенизировать в консервирующем растворе любым доступным способом (в блендоре, гомогенизаторе Поттера, ультразвуковом гомогенизаторе и т.п.).

0,15 мл свежесобранной крови вливали в пробирку, в которую заранее добавлен консервирующий раствор (0,3 мл), и быстро перемешивали. Консервирующий раствор имел следующий состав: 6 М тиоцианат гуанидина, 37,5 мМ цитрат натрия (рН 7,5), 0,75% саркозил, 20 мМ ЭДТА, 2% 2-меркаптоэтанол (конечные концентрации: 4 М тиоцианат гуанидина, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил, 13 мМ ЭДТА, 1,3% 2-меркаптоэтанол). Полученный лизат хранили при разных температурных режимах [комнатная температура ("к.т."), а также +4°С и -20°С] в течение 3, 7 и 14 суток. Затем выделяли нуклеиновые кислоты способом, описанным в примере 3, начиная с пункта 2, и часть полученного препарата, соответствующую 20 мкл крови, анализировали с помощью электрофореза в ПААГ. Результаты представлены на чертеже. За сохранностью ДНК, которая составляет до 90% массы выделенного препарата, следили по окраске бромистым этидием (А), а за сохранностью РНК - по сохранности внутреннего контроля, ³²Р-меченой РНК фага QP длиной 3821 нт, которую добавляли в кровь вместе с консервирующим раствором и отслеживали с помощью авторадиографии (Б). Образцы, полученные при консервации способом, описанным в этом примере, имеют нечетные номера. Дорожки "К" содержат контрольные образцы, из которых выделяли нуклеиновые кислоты немедленно после добавления консервирующего раствора, а дорожки "М" - наборы ДНК-маркеров размера.

Указанный выше консервирующий раствор стабилен при температуре выше +20°С и его можно хранить (предпочтительно в темноте) в течение, по крайней мере, двух месяцев без существенного ухудшения свойств. Однако при понижении температуры ниже +20°С из раствора могут выпадать кристаллы, которые можно растворить при нагревании. Поэтому, если ожидается, что температура окружающей среды может опускаться ниже +20°С, то консервирующий раствор предпочтительно разбавить, соответственно увеличив его объем, добавляемый к биологическому образцу, с тем чтобы были соблюдены указанные конечные концентрации реагентов. Например, консервирующий раствор, разбавленный в 1,125 раз, можно хранить при длительном понижении температуры до +15°С, при этом на 1 объем образца следует добавлять 3 объема консервирующего раствора.

Пример 2. Консервация образцов крови, включающая преципитацию нуклеиновых кислот с помощью органического растворителя.

0,15 мл свежесобранной крови смешивали с 0,3 мл консервирующего раствора как описано в примере 1, после чего добавляли 0,9 мл изопропанола и интенсивно перемешивали (то есть добавляли 2 объема изопропанола на 1 объем лизата). Полученную суспензию хранили при разных температурных режимах [комнатная температура ("к.т."), а также +4°С и -20°С] в течение 3, 7 и 14 суток. Затем выделяли нуклеиновые кислоты способом, описанным в примере 3, начиная с пункта 3 (предварительно подвергнув образец центрифугированию, как описано в пункте 2) и часть полученного препарата, соответствующую 20 мкл крови, анализировали с помощью электрофореза в ПААГ. Результаты представлены на чертеже. Образцы, полученные при консервации способом, описанным в этом примере, имеют четные номера. Остальные условия эксперимента те же, что в примере 1.

Если используют более разбавленный консервирующий раствор (см. пример 1), то соответственно увеличивают добавляемый объем изопропанола, чтобы соблюсти объемное соотношение 2:1 (изопропанол:лизат).

Пример 3. Выделение нуклеиновых кислот из цельной крови и костного мозга.

Все операции проводили в микроцентрифужных пробирках типа "Эппендорф", а центрифугирование осуществляли, если не указано иное, на холоде (4°С) в центрифугах MiniSpin™ (Eppendorf, Германия) на максимальной скорости (13400 об/мин), используя для выделения аликвоты 150 мкл цельной крови или костного мозга, или соответствующие количества препаратов, подвергнутых консервации как изложено в примерах 1 и 2.

(1) Лизис (эта стадия идентична консервации, поэтому ее пропускали, если выделяли нуклеиновые кислоты из хранившихся образцов). 150 мкл крови или костного мозга смешивали с 300 мкл лизирующего раствора, содержащего 6 М тиоцианат гуанидина, 37,5 мМ цитрат натрия (рН 7,5), 0,75% саркозил, 20 мМ ЭДТА, 2% 2-меркаптоэтанол (конечные концентрации: 4 М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил, 13 мМ ЭДТА, 1,3% 2-меркаптоэтанол). Раствор тщательно перемешивали. Инкубировали при 0°С (в ледяной бане) в течение 5 мин.

(2) Осаждение изопропанолом (эту стадию пропускали, если нуклеиновые кислоты уже подвергали преципитации изопропанолом при консервации). К лизату добавляли 900 мкл изопропанола, интенсивно перемешивали. Инкубировали при 0°С в течение 30 минут и центрифугировали в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали.

(3) Растворение осадка. К осадку приливали 400 мкл лизирующего раствора, разведенного водой в 1,5 раза. Конечные концентрации: 4 М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил, 13 мМ ЭДТА, 1,3% 2-меркаптоэтанол. Раствор тщательно перемешивали.

(4) Осаждение изопропанолом. Добавляли 800 мкл изопропанола, интенсивно перемешивали. Инкубировали при 0°С в течение 30 минут и центрифугировали в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали.

(5) Промывка осадка нуклеиновых кислот спиртово-солевым раствором. К осадку добавляли 400 мкл раствора, содержащего 165 мМ хлорид натрия, 110 мМ цитрат натрия (рН 7,0), 45% (по объему) 96% этанола. Перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин на встряхивателе Reax-Top™ (Heidolph, Германия) при максимальной интенсивности (2500 об/мин), после чего центрифугировали в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли.

(6) Растворение осадка. К осадку приливали 500 мкл раствора, содержащего 10 мМ Трис HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 8М мочевину, 2% SDS, 2% 2-меркаптоэтанол. Перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин на встряхивателе Reax-Top™ при максимальной интенсивности.

(7) Экстракция фенолом. Сначала к раствору добавляли 45 мкл 4 М хлорида натрия (до 300 мМ) для последующего осаждения. Далее добавляли 545 мкл (один объем) смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (24:24:1, по объему) (использовали фенол, насыщенный буфером Трис-HCl, рН 8,0). Перемешивали при комнатной температуре в течение 2 мин на встряхивателе Reax-Top™ при максимальной интенсивности. Центрифугировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирали 400 мкл водной фазы. Водную фазу промывали 400 мкл хлороформа (перемешивали в течение 1 мин, центрифугировали в течение 1 мин), отбирали 360 мкл водной фазы.

(8) Осаждение этанолом. К водной фазе добавляли 1 мл холодного (-20°С) 96% этанола и интенсивно перемешивали. Инкубировали при -20°С в течение 20 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли.

(9) Промывка осадка спиртом. К осадку приливали 400 мкл 75% этанола и мягко обмывали внутреннюю поверхность пробирки. Центрифугировали в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок подсушивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре.

(10) Растворение осадка. Осадок растворяли в 40 мкл 0,1 мМ ЭДТА, прогревали в течение 30 мин при 60°С, перемешивали на встряхивателе Reax-Top™ при максимальной интенсивности в течение 3 мин. После этого еще раз прогревали при 60°С в течение 15 мин, затем помещали в кипящую баню на 3 мин (чтобы расплавить возможные агрегаты молекул) и быстро охлаждали во льду.

Промышленная применимость

Основываясь на полученных результатах, можно констатировать, что способ консервации биологических образцов обеспечивает существенную сохранность РНК и ДНК в процессе хранения образцов до выделения нуклеиновых кислот в течение длительного времени, а также безопасную транспортировку образцов при температуре окружающей среды. Наконец, предложенный способ консервации совместим с процедурой последующего выделения нуклеиновых кислот.

Источники информации

1. Четверин А.Б., Четверина Е.В. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления // Патент РФ №2048522 (1995).

2. Четверин А.Б., Четверина Е.В. Точная диагностика с помощью молекулярных колоний // Молекуляр. биология. Т.36. С.320-327 (2002).

3. Esser С., Gottlinger С., Kremer J., Hundeiker C., Radbruch A. Isolation of full-sized mRNA from ethanol-fixed cells after cellular immunofluorescence staining and fluorescence-activated cell sorting (FACS) // Cytometry. V.21. P.382-386 (1995).

4. Lader E.S. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples // United States Patent 6204375 (2001).

5. Vincek, V., Nassiri, M., Nadji, M., Morales, A.R. Preservation of RNA and morphology in cells and tissues // United States Patent Application 20030211452 (2003).

6. Kamme F.C., Meurers B.H., Talantov D., Yu J. Preservation of RNA in a biological sample // United States Patent Application 20040259133 (2004).

7. Stefan M., Krehan A.-A., Boecher O., Waschuetza S. Use of lithium dodecyi sulfate for stabilizing RNA in solution, particularly during purification of RNA from cell lysate // Patent DE 10219117 (2003).

8. Chirgwin J.M., Przybyla A.E., MacDonald R.J., Putter W.J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry. V.18. P.5294-5299 (1979).

9. Lader E.S. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples // PCT publication WO 0006780 (2000).

10. Lader E.S. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples // United States Patent 6528641 (2003).

11. Feig A.L, Uhlenbeck O.C. The role of metal ions in RNA biochemistry // The RNA World, 2nd ed. (Eds. Gesteland R.F., Cech T.R., Atkins J.F.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. P.287-319 (1999).

12. Sillen, L.G., Martell, A.E. Stability Constants of Metal-Ion Complexes. The Chemical Society, London, 1964.

13. Дэвидсон Дж. Биохомия нуклеиновых кислот. "Мир", Москва, 1976.

14. Walling, С. Fenton's reagent revisited // Асе. Chem. Res. V.8. P.125-131 (1975).

15. Latham J.A., Cech T.R. Defining the inside and outside of a catalytic RNA molecule // Science. V.245. P.276-282 (1989).

16. Tullius T.D., Dombroski B.A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda represser and Cro protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.83. P.5469-5473 (1986).

17. Chomczynski P. Product and process for isolating DNA, RNA and proteins // United States Patent 5945515 (1999).

18. Chetverina H.V., Samatov T.R., Ugarov V.I., Chetverin A.B. Molecular colony diagnostics: Detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR // BioTechniques. V.33. P.150-156 (2002).

19. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. V.162. P.156-159 (1987).

20. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., Jarisen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. V.28. P.495-503 (1990).

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к способам подготовки к анализу нуклеиновых кислот, выделяемых из биологического материала, применяемого преимущественно для обнаружения специфических молекул РНК и ДНК в биологическом материале. Способ консервации включает получение лизата смешиванием биологического материала с консервирующим раствором, содержащим соединение гуанидина в количестве, достаточном для существенно полной денатурации содержащихся в образце нуклеаз, а также с компонентами, препятствующими деградации нуклеиновых кислот, а именно с восстановителем белковых S-S-связей в количестве, обеспечивающем существенно полное восстановление S-S-связей в белках лизата, с сильным детергентом, не образующим нерастворимого соединения с гуанидином, в количестве, достаточном для формирования мицелл в лизате, по крайней мере, с одним комплексоном ионов двух- и трехвалентных металлов в количестве, обеспечивающем его молярную концентрацию в лизате заведомо более высокую, чем ожидаемая максимальная молярная концентрация ионов двух- и трехвалентных металлов, и буфером, поддерживающим значение рН лизата в диапазоне от 6 до 8. Способ обеспечивает сохранность нуклеиновых кислот при длительном хранении образцов в незамороженном состоянии. 12 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ консервации биологических образцов, включающий получение лизата путем смешивания биологического материала с консервирующим раствором, содержащим соединение гуанидина в количестве, достаточном для существенно полной денатурации содержащихся в образце нуклеаз, отличающийся тем, что консервирующий раствор также содержит следующие компоненты, препятствующие деградации нуклеиновых кислот: (1) восстановитель белковых S-S-связей в количестве, обеспечивающем существенно полное восстановление S-S-связей в белках лизата; (2) сильный детергент, не образующий нерастворимого соединения с гуанидином, в количестве, достаточном для формирования мицелл в лизате; (3) по крайней мере, один комплексен ионов двух- и трехвалентных металлов в количестве, обеспечивающем его молярную концентрацию в лизате заведомо более высокую, чем ожидаемая максимальная молярная концентрация ионов двух- и трехвалентных металлов; (4) буфер, поддерживающий значение рН лизата в диапазоне от 6 до 8.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе смешивания с консервирующим раствором биологический материал гомогенизируют.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве восстановителя белковых S-S-связей используют вещество, выбранное из группы веществ, включающей 2-меркаптоэтанол, дитиотрейтол, тиомочевину и глутатион.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве восстановителя белковых S-S-связей используют 2-меркаптоэтанол.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве детергента используют вещество, выбранное из группы веществ, включающей саркозил, эфиры полиэтиленгликоля и полиоксиэтиленсорбитаны.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве детергента используют саркозил.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексона используют вещество, выбранное из группы веществ, включающей ЭДТА, ЭГТА, 8-гидроксихинолин и 1,10-фенантролин.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексона используют ЭДТА.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве буфера используют соль лимонной кислоты.10. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный лизат смешивают с водорастворимым органическим растворителем, способным вызывать преципитацию нуклеиновых кислот, взятым в количестве, достаточном для обеспечения существенно полной преципитации нуклеиновых кислот, присутствующих в лизате.11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют вещество, выбранное из группы веществ, включающей низкомолекулярные спирты, ацетон, полиэтиленгликоль и диметилсульфоксид.12. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют изопропанол.13. Способ по п.12, отличающийся тем, что объем добавляемого изопропанола вдвое больше объема лизата.