СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ МОЧИ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/493 C12Q1/68 

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения внеклеточных нуклеиновых кислот (ВНК) из мочи, которые могут быть использованы в амплификационном анализе для ранней диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.

Диагностика и выявление онкологических заболеваний на ранних стадиях является важной проблемой в медицине. Для диагностики рака используют такие методы, как рентгенологический, эндоскопический, ультразвуковой, морфологический. Однако эти методы не позволяют эффективно выявлять онкотрансформацию и не эффективны на ранних стадиях заболевания. Кроме того, морфологический анализ является инвазивным и может влиять на метастазирование опухоли.

Известны способы диагностики вирусных и онкологических заболеваний путем выявления ДНК в плазме периферической крови с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1, 2]. Недостатками этих способов являются инвазивность анализа (забор венозной крови), большая трудоемкость и длительность выделения ДНК и низкая достоверность результатов диагностики (34-39%) из-за низкого удельного содержания внеклеточной ДНК в небольшом объеме образца (ограничения метода выделения ДНК), что затрудняет клиническое использование данных способов.

В то время как прямой анализ пораженных тканей бывает затруднен или недоступен (нет симптоматики), а забор крови относится к инвазивным процедурам, моча является легкодоступным биологическим материалом для получения нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в амплификационном анализе.

Наиболее ближайшим к заявленному способу - прототипом, является способ диагностики рака почки путем выявления онкоспецифических маркеров в моче амплификационными методами [3], включающий следующие стадии: выделение ДНК из супернатанта мочи, выявление метилированных форм ДНК опухолевых супрессорных генов (VHL, р16, р14, АРС, RASSF1A и Timp-3) путем ПЦР, специфичной к метилированию, с последующим анализом продуктов реакции. Внеклеточную ДНК из супернатанта мочи больных раком почки выделяли при помощи обработки протеиназой К в присутствии додецилсульфата натрия в течение ночи при 37°С с последующей фенол/хлороформной экстракцией белков. К раствору ДНК добавляли 1/10 объема 10 М ацетата аммония, 2 мкл гликогена и 2,5 объема 100% спирта и инкубировали в течение ночи при - 20°С, затем центрифугировали образец при 16000 g в течение 20 мин при 4°С. Супернатант удаляли, преципитат ДНК высушивали и растворяли в воде. Выделенную внеклеточную ДНК модифицировали бисульфитом натрия; в амплификации использовали праймеры, специфичные к метилированным формам ДНК. Частота гиперметилирования промоторов опухолевых супрессорных генов составила 12% для VHL, 10% для p16, 18% для p14, 18% для АРС, 52% для RASSF1A и 60% для Timp-3.

Недостатками данного способа являются длительность выделения внеклеточной ДНК, неудобство работы с фенолом и хлороформом. Кроме того, данный способ диагностики является трудоемким (для получения 100% диагностической точности необходимо проанализировать гиперметилирование промоторов по крайней мере 6 генов) и применим только для диагностики рака почки.

Технической задачей изобретения является повышение достоверности диагностики, упрощение способа и расширение объема его использования.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Определяют рН исследуемой мочи и доводят рН до требуемого значения (до 6.0-8,0 - для выделения внеклеточной ДНК и 4,5-5.0 - для выделения внеклеточной РНК). Исследуемую мочу пропускают через разделительно-сорбирующую систему, состоящую из фильтрующего материала с размером пор не более 1,5 мкм и стекловолокнистого сорбента. Фильтрующий материал служит для разделения мочи на супернатант и клеточную фракцию, а сорбент - для сорбции внеклеточных нуклеиновых кислот (ВНК) из супернатанта мочи и клеточных элюатов. Время протекания мочи через систему можно уменьшить путем центрифугирования в течение 2-5 мин при 400 g. Далее проводят элюцию ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтрующем материале, путем промывания последнего фосфатным буферным раствором (ФБР), содержащим 5 мМ ЭДТА, а затем 0,125%-ным раствором трипсина. В процессе элюции ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, происходит их одновременное связывание с сорбентом. Затем фильтрующий материал удаляют, а стекловолокнистый сорбент промывают от примесей ненуклеотидной природы. Далее проводят элюцию суммарного пула ВНК (ВНК из супернатанта мочи и ВНК, элюированных с поверхности клеток мочи), связанных с сорбентом, и выявление известных специфических последовательностей нуклеиновых кислот методами амплификационного анализа с последующим анализом ПЦР продуктов и составлением заключения о наличии или отсутствии детектируемых нуклеотидных последовательностей.

Исследуемая моча перед пропусканием через разделительно-сорбирующую систему может быть обработана гидролизующим и/или денатурирующим агентом (например, ферментом и/или детергентом) для разрушения комплексов ВНК с белками, фосфолипидами, липопротеинами и т.д., что приводит к повышению эффективности выделения ВНК, а это, в свою очередь, к увеличению количества специфических НК в пробе и повышению достоверности диагностики заявленного способа.

Использование фильтрующего материала, задерживающего клетки мочи, позволяет последовательно пропускать через стекловолокнистый сорбент супернатант мочи и элюаты с поверхности клеток мочи. В качестве фильтрующего материала могут быть использованы фильтровальная бумага, ватман марки 3ММ, материал из нитроцеллюлозы и другие материалы.

Стекловолокнистый сорбент связывает ВНК из супернатанта мочи и ВНК, элюированных с поверхности клеток мочи. В качестве стекловолокнистого сорбента могут быть использованы стекловата из нейтрального, щелочного, боросиликатного стекла или минеральная стекловата из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.

Использование системы, содержащей фильтрующий материал и стекловолокнистый сорбент значительно упрощает, удешевляет и ускоряет процедуру выделения ВНК из мочи по сравнению с прототипом, а также позволяет значительно увеличить объем исследуемого образца и, таким образом, повысить достоверность диагностики за счет увеличения содержания специфических последовательностей нуклеиновых кислот в пробе для дальнейшего амплификационного анализа.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Пропускание исследуемой мочи через систему, содержащую фильтрующий материал и стекловолокнистый сорбент, что позволяет одновременно разделять супернатант от клеточной фракции мочи и сорбировать ВНК на сорбенте. Отсутствие фильтрующего материала, задерживающего клетки мочи, приводило бы к разрушению клеток при пропускании мочи через стекловолокнистый сорбент, в результате чего большую часть выделенных нуклеиновых кислот составляли бы нуклеиновые кислоты клеток, что привело бы к понижению чувствительности диагностической системы.

2. Использование дополнительного диагностического объекта - ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, что позволяет увеличить чувствительность детекции специфических последовательностей ДНК и РНК за счет их повышенного удельного содержания на ранних стадиях патогенеза.

3. Последовательная двухстадийная элюция ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, что позволяет уменьшить количество балластных нуклеиновых кислот из нормальных клеток и увеличить удельное содержание выявляемых специфических последовательностей. В прототипе анализируют специфические последовательности внеклеточной ДНК, выделенной из супернатанта мочи.

Увеличение чувствительности вышеописанной диагностической системы позволяет выявлять и дифференцировать все опухоли организма (опухоли молочной железы, легкого, желудка и другие), в то время как способ-прототип позволяет выявлять только рак почки.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Предлагаемый способ диагностики был апробирован на образцах мочи здоровых доноров (n=10) и пациентов с доброкачественными (n=15) и злокачественными опухолями молочной железы (n=20) на различных стадиях заболевания. У всех пациенток моча была взята во время первичного установления диагноза. рН исследуемой мочи проверяли при помощи лакмусовой бумажки и доводили (если требовалось) до значения 6,0-8,0 путем добавления 0,1 М NaOH. Далее мочу помещали в колонку, содержащую систему, состоящую из бумажного фильтра и стекловаты из щелочного стекла (стекловолокнистый сорбент) и центрифугировали в течение 2 мин при 400 g. Затем проводили элюцию ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтре, путем промывания фильтра ФБР, содержащим 5 мМ ЭДТА, а затем 0,125%-ным раствором трипсина. Фильтр удаляли, сорбент промывали дважды от примесей ненуклеотидной природы буферным раствором, содержащим 4.5 М тиоцианата гуанидина, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl рН 6.4, а затем дважды буферным раствором, содержащим 70% этанола, 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 8.0. Суммарный пул внеклеточных ДНК, содержащий ВНК из клеточного элюата и ВНК из супернатанта мочи, элюировали с сорбента добавлением 100 мкл воды, с последующим центрифугированием в течение 1 мин при 10000 g.

Для выявления мелитированных последовательностей промоторных областей генов RARβ2 и RASSF1A проводили ПЦР, специфичную к метилированию.

После предварительной термической денатурации в реакционную смесь добавляли 1 ед. Taq ДНК полимеразы (производства СибЭнзим) и проводили 45 циклов ПЦР в следующем режиме:

- для метилированной формы промоторной области гена RARβ2 - 30 секунд при 94°С, 20 секунд при 65°С, 20 секунд при 72°С; были использованы праймеры [4]:

5'-CCG ААТ ССТ АСС CCG ACG - 3' (Праймер 1);

5'-TAG TAG TTC GGG TAG GGT TTA TC - 3' (Праймер 2);

- для неметилированной формы промоторной области гена RARβ2 - 30 секунд при 94°С, 20 секунд при 59°С, 20 секунд при 72°С; были использованы праймеры [4]:

5'-TTA GTA GTT TGG GTA GGG TTT ATT - 3' (Праймер 1);

5'-ССА ААТ ССТ АСС ССА АСА - 3' (Праймер 2);

- для метилированной формы промоторной области гена RASSF1A - 30 секунд при 94°С, 20 секунд при 65°С, 20 секунд при 72°С; были использованы праймеры [4]:

5'-GGG TTT TGC GAG AGC GCG - 3' (Праймер 1);

5'-GCT AAC AAA CGC GAA CCG - 3' (Праймер 2);

- для неметилированной формы промоторной области гена RASSF1A - 30 секунд при 94°С, 20 секунд при 65°С, 20 секунд при 72°С; были использованы праймеры [4]:

5'- GGT TTT GTG AGA GTG TGT TTAG - 3' (Праймер 1);

5'- САС ТАА САА АСА САА АСС ААС - 3' (Праймер 2);

После окончания 45 циклов ПЦР продукты были разделены в 6% полиакриламидном геле методом электрофореза и окрашены бромистым этидием.

Данные по выявленным мелитированным последовательностям промоторных областей генов RARR2 и RASSF1A в норме и при патологии представлены в таблице.

ГеныНормаОпухоли молочной железы, частота встречаемостидоброкачественныезлокачественныеRARβ2033%65%RASSF1A053%75%RARβ2 или RASSF1A067%95%

Данный пример иллюстрирует, что выделенные разработанным способом ВНК могут быть использованы для неинвазивной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей.

Пример 2.

Разработанный способ был применен для оценки эффективности антираковой терапии у пациентов с раком легкого (n=19). У всех пациентов была взята моча до и после проведения антираковой терапии. рН мочи проверяли с помощью лакмусовой бумажки и доводили (если требовалось) до значения 4,5-5,0 путем добавления 0,1 М уксусной кислоты. Далее мочу помещали в колонку, содержащую систему: ватман нейтрального стекла и центрифугировали в течение 5 мин при 400 g. Для выделения РНК, связанных с поверхностью клеток мочи, осажденных на ватмане, последний промывали 2 мл ФБР, содержащего 5 мМ ЭДТА, а затем 2 мл 0,125%-ного раствора трипсина. Затем ватман удаляли, сорбент промывали от примесей ненуклеотидной природы и элюировали суммарный пул внеклеточных РНК с сорбента аналогично примеру 1.

Выявление опухолевой РНК проводили методом RT-ПЦР. кДНК была синтезирована с рандомных гексамерных праймеров и коммерческого набора Reverse Transriptase Superscript II (Invitrogen). Для проведения RT-ПЦР использовали коммерческий набор AmplyTaq Gold (Applied Biosystems) с использованием праймеров, специфичных для гена hTERT [5]:

5'-TGA САС СТС АСС ТСА ССС АС-3' (Праймер 1),

5'-САС ТОТ СТТ CCG САА GTT САС-3' (Праймер 2);

Далее ПЦР продукты были разделены в 2%-ном агарозном геле методом электрофореза и оценены денситометрически при помощи Системы GS-690 Imaging Densitometry (Bio-Rad) и компьютерной программы Multi-Analyst/PC (Bio-Rad).

Было показано, что маркер hTERT, ассоциированный с раком легкого, выявляется с высокой частотой (95%) у больных до проведения антираковой терапии. Пациентам была проведена операция с последующей лучевой терапией. Через 4 месяца провели мониторинг эффективности лечения путем вторичной диагностики онкологического заболевания. Маркер hTERT в пуле внеклеточных РНК был обнаружен у 3 больных. Таким образом, в результате мониторинга установлено отсутствие онкологического заболевания у 16 пролеченных пациентов и неэффективность хирургического и лучевого лечения и прогрессирование онкологического заболевания у 3 человек.

Пример 3.

Больной У., 1975 г.р. поступил в стационарное отделение «Центра новых медицинских технологий» г.Новосибирск, с диагнозом: язва желудка с наличием Helicobacter pylori. Мочу от данного больного предварительно обработали ферментом. Для этого мочу центрифугировали в течение 10 мин при 400 g, к полученному супернатанту мочи добавили липазу (из Rhizopus japanicus 1403) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем довели рН мочи до значения 7,0 и пропустили через колонку, содержащую нитроцеллюлозный фильтрующий материал с размером пор 1,2 мкм и минеральную стекловату из базальтового стекловолокна. Элюцию ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтре, а также элюирование суммарного пула внеклеточных ДНК с сорбента провели аналогично примеру 1.

Выявление бактерии Helicobacter pylori провели с использованием коммерческих наборов реагентов ПЦР «Биоком». Диагноз был подтвержден. Больному было проведено консервативное лечение. Через 2 месяца провели мониторинг эффективности лечения путем вторичной диагностики на Helicobacter pylori. В результате мониторинга установлено отсутствие Helicobacter pylori. Данный пример иллюстрирует, что предложенный способ диагностики с использованием ВНК мочи пригоден для выявления бактериальных инфекций.

Пример 4.

Больная А., 1963 г.р., поступила в Областной Онкологический Диспансер с диагнозом: плоскоклеточный недифференцированный центральный рак легкого со стадией T₂N₀M₀. Больной была проведена диагностика заявляемым способом с использованием коммерческих наборов реагентов ПЦР «Биоком» (код 4.3.63), ориентированных на выявление вируса Эпштейна-Барра с использованием в качестве диагностического материала мочи и венозной крови пациента.

Выделение суммарного пула внеклеточных ДНК из мочи проводили аналогично примеру 3, с тем отличием, что вместо липазы мочу предварительно обрабатывали субтилизином А.

Выделение суммарного пула внеклеточных ДНК из плазмы крови проводили способом, описанным в [6].

Выделение суммарного пула внеклеточных ДНК из мочи проводили аналогично примеру 3, с тем отличием, что вместо липазы мочу предварительно обрабатывали субтилизином А.

Выделение суммарного пула внеклеточных ДНК из плазмы крови проводили способом, описанным в [6].

Было показано, что независимо от источника ДНК, диагностическая точность способа составила 100%, что указывает на возможность использования мочи в качестве неинвазивного источника диагностического материала. Кроме того, данный пример иллюстрирует, что выделенные предложенным способом ВНК мочи пригодны для диагностики вирусных инфекций.

Пример 5.

Больная К., 1960 г.р., поступила в «Центр новых медицинских технологий» г.Новосибирск, с диагнозом цистит. Поскольку у женщин с различными заболеваниями мочеполовой системы зачастую обнаруживается микоплазмоз, пациентке была проведена диагностика микоплазмы.

Исследуемую мочу центрифугировали в течение 10 мин при 400 g, к полученному супернатанту добавляли лаурилсульфат натрия до конечной концентрации 1,0%, интенсивно перемешивали в течение 2 мин, а затем добавляли 4 М ацетат калия и центрифугировали в течение 15 мин при 15000 g. Далее довели рН супернатанта до значения 8,0 и провели выделение суммарного пула внеклеточных ДНК с использованием системы, содержащей бумажный фильтр и стекловолокнистый сорбент, как описано в примере 1.

Выделенную из мочи внеклеточную ДНК использовали для ПНР-анализа, ориентированного на выявление микоплазмы хоминис, основанного на использовании коммерческих наборов реагентов ПЦР «Биоком» (код 4.3.33.5). В результате проведенного анализа было показано, что в моче у больной К. обнаруживается Mycoplasma hominis.

Данный пример иллюстрирует, что выделенные предложенным способом ВНК из мочи пригодны для диагностики инфекций микоплазмы.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:

- упростить способ и уменьшить время выделения ВНК из анализируемого образца до 8-10 мин;

- повысить достоверность последующей диагностики инфекционных и онкологических заболеваний за счет дополнительного использования более специфичного диагностического показателя (ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи);

исключить получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов анализа за счет увеличения объема образца и количества специфических нуклеиновых кислот в пробе;

- расширить область применения ВНК из мочи за счет возможности ранней диагностики вирусных, бактериальных и онкологических заболеваний, а также выявление микоплазмы в организме;

- увеличить чувствительность детекции специфических (маркерных) последовательностей ДНК и РНК, связанных с поверхностью клеток мочи, что особенно важно на ранних стадиях развития патологий, когда основная масса внеклеточных нуклеиновых кислот связана с поверхностью клеток.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Tailor P., Saikia Т., Advani S., Mukhopadhyaya R. Activation of HHV-6 in lymphoproliferative disorders // Annanls of the New York Academy of Sciences, 2004. Vol.1022. P.282-285.

2. Sorenson G., Pribish D., Valone F., Memoli V., Bzik D., Yao S. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 1994. Vol.3. P.67-71.

3. Cairns P. Detection of promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in urine from kidney cancer patients // Annanls of the New York Academy of Sciences, 2004. Vol.1022. P.40-43.

4. Kowara R., Golebiowski F., Chrzan P., Skokowski J., Karmolinski A., Awelczyk T. Abnormal FHIT gene transcript and c-myc and c-erbB2 amplification in breast cancer // Acta Biochimica Polonica, 2002, Vol.49. P.341-350.

5. Lonn U., Lonn S., Nilsson В., Stenkvist B. Prognostic value of erb-B2 and myc amplification in breast cancer imprints. Cancer, 1995, Vol.75. P.2681-2687.

6. Engel E., Schmidt В., Carstensen Т., Weickmann S., Jandrig В., Witt C., Fleischhacker M. Detection of tumor-specific mRNA in cell-free lavage supernatant in patients with lung cancer // Annanls of the New York Academy of Sciences, 2004. Vol.1022. P.140-146.

7. Лактионов П., Тамкович С., Рыкова E., Власов В. Способ ранней диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. Патент РФ №2251696, кл. G01N 33/53, оп. 27.01.2005, Бюл. №13.

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения внеклеточных нуклеиновых кислот (ВНК) из мочи, которые могут быть использованы в амплификационном анализе для ранней диагностики инфекционных и онкологических заболеваний. Для исследования интактную или обработанную ферментами и/или детергентами мочу пропускают через разделительно-сорбирующую систему, состоящую из фильтрующего материала с размером пор не более 1,5 мкм и стекловолокнистого сорбента. Далее проводят двухстадийную элюцию ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтрующем материале, путем промывания последнего фосфатным буферным раствором, содержащим 5 мМ ЭДТА, а затем 0,125%-ным раствором трипсина. Затем фильтрующий материал удаляют, а сорбент промывают от примесей ненуклеотидной природы и элюируют с последнего суммарный пул ВНК. Использование способа позволяет упростить процедуру выделения ВНК, выделить ВНК из супернатанта мочи и ВНК, связанные с поверхностью клеток мочи, что дает возможность повысить достоверность и чувствительность дальнейшего исследования. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ выделения внеклеточных нуклеиновых кислот (ВНК) из мочи для выявления специфических последовательностей нуклеиновых кислот амплификационными методами, отличающийся тем, что исследуемую мочу пропускают через систему, содержащую фильтрующий материал с размером пор не более 1,5 мкм и стекловолокнистый сорбент, проводят двухстадийную элюцию ВНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтрующем материале, путем промывания последнего фосфатным буферным раствором, содержащим 5 мМ ЭДТА, а затем 0,125%-ным раствором трипсина, после чего фильтрующий материал удаляют, а сорбент промывают от примесей ненуклеотидной природы и элюируют с последнего суммарный пул ВНК.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что мочу предварительно обрабатывают гидролизующим и/или денатурирующим агентом, в частности ферментом и/или детергентом.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фильтрующего материала используют преимущественно фильтровальную бумагу, ватман 3ММ, нитроцеллюлозу.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стекловолокнистого сорбента используют стекловату из нейтрального, щелочного или боросиликатного стекла, минеральную стекловату из базальтового стекловолокна, содержащие в качестве основного компонента двуокись кремния.