Набор для выявления антител классов M и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2 Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 C12Q1/6806 G01N33/569 

Область техники.

Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и может быть использовано для одновременного дифференцированного определения специфических антител классов М и G к вирусу SARS-CoV-2 методом иммунохроматографии с использованием конъюгатов наиболее иммунодоминантных белков SARS-CoV-2 нуклеопротеина и spike-белка с наночастицами коллоидного золота для массового скрининга с целью выявления лиц, зараженных SARS-CoV-2 и реконвалесцентов.

Уровень техники

Для борьбы с любой эпидемией колоссальное значение имеет своевременная диагностика, и пандемия COVID-19 не является исключением. Поскольку ранние клинические проявления у инфицированных неспецифичны, необходимо в короткие сроки подтвердить диагноз и принять все необходимые меры для обеспечения безопасности больных и их окружения [1, 2, 3]. В то же время некоторые исследования показали, что у значительного числа инфицированных людей (около 44%) симптомы болезни могут отсутствовать, это создает дополнительные трудности в контроле за распространением COVID-19 в мире [2, 3, 4, 5, 6, 7].

Несмотря на то, что этот молекулярный метод широко применяется во всем мире, ограничения этой технологии очевидны. Ложноотрицательные результаты ОТ-ПЦР в диагностике подозрительных случаев COVID-19 представляют большую угрозу для общества и усложняет эпидемиологическую обстановку в целом. При развивающейся клинической симптоматики пациента и отрицательном результате ОТ-ПЦР незаменимым инструментом диагностики становятся серологические методы исследования, направленные на обнаружение специфических антител в плазме, сыворотке или цельной крови человека.

Серологические тесты обычно выявляют антитела к белку спайк (S) и/или нуклеопротеину (N), поскольку они являются наиболее иммуногенными белками SARS-CoV-2. Белок S, состоящий из субъединицы S2 и S1 с рецептор-связывающим доменом (RBD), образует шип оболочки и используется вирусом для соединения с рецептором клетки человека АСЕ-2. Поскольку антитела против S белка обладают нейтрализующим действием in vitro, было высказано предположение они могут быть маркером эффективного иммунного ответа [8, 9].

С другой стороны, использование нуклеопротеина в диагностике коронавирусов человека, включая SARS-CoV-1, ранее было рекомендовано для уменьшения периода «серологического окна» [10]. Кроме этого предполагается, что анализы с использованием полноразмерного белка N могут выявлять больше ложноположительных результатов, поскольку нуклеокапсидный белок имеет несколько консервативных областей с высокой (90,5%) гомологией последовательностей с другими коронавирусами человека: HCoV-229E, -NL63, -ОС43 и -HKU1 24 [10]. Несмотря на это высокая иммуногенность и стабильность нуклеопротеина позволяет использовать его при разработке вакцин в качестве мишени для нейтрализующих антител и дает основание применять его при разработке серологических тестов [11].

Известен патент CN 111398603 В (Китай) Тест-полоска для обнаружения нового антитела к коронавирусу, способ ее приготовления и применения, где в качестве антитела захвата выступают антитела мышиные моноклональные к IgG человека. Недостатком этой методики является отсутствие тестирования для выявления специфических IgM, которые начинают вырабатываться у некоторых лиц с первых дней болезни и может служить для скрининга остро заболевших лиц в дебюте заболевания, когда наиболее важна терапия и мониторинг состояния. Кроме того, использование антигена SARS-CoV-2 в конъюгате и на тестовой линии ведет к перерасходу сырья и удорожанию набора реагента.

Известен патент CN 111024954A (Китай) на устройство для иммунохроматографии с коллоидным золотом для комбинированного обнаружения антигена и антитела к COVID-19 и способ их использования, который представляет собой двойную тест-кассету с двумя тест-полосками, где одна тест-полоска предназначена для выявления нуклеопротеина коронавируса, а другая - для выявления IgM и IgG к нему. Недостатком данного метода является неоправданный перерасход сырья, т.к. хорошо известна динамика антителообразования при COVID-19, таким образом, целесообразно разделить аналиты (антиген и антитела) и использовать тесты на разных стадиях заболевания, когда обнаружение антител или антигена наиболее вероятна. Для конъюгирования используются частицы НКЗ с размером 55-65. Использование больших частиц может приводить к быстрой потере стабильности конъюгата. Апробация на клиническом материале представляла собой тестирование 10 образцов от лиц с подтвержденным диагнозом, что является недостаточным для полноценной апробации теста.

Известен патент WO 2022041055 A1 (Китай) на набор для выявления антител SARS-CoV-2 и метод обнаружения. В качестве конъюгата используется конъюгат S белка, что может привести к ложноположительным результатам, поскольку не будут выявляться антитела к нуклеопротеину, которые вырабатываются в большом количестве в результате инфекции и длительно сохраняются в кровяном русле после выздоровления в то время как к S-белку антитела вырабатываются в меньшей степени. Такой набор реагентов можно использовать для оценки поствакцинального иммунитета при использовании вакцин, индуцирующих именно S-специфичный иммунный ответ. Однако в качестве метки используются квантовые точки, что лишает набор главного преимущества ИХА - бесприборности и невозможности использования для самотестирования в домашних условиях.

Значительная часть подобных тестов, зарегистрированных в РФ, имеют зарубежное место производства:

- Экспресс-тест COVID-19 IgG/IgM., номера партий: BNCP40200088, BNCP40200089, BNCP40200090, BNCP40200093 ООО «Биотек» производитель "Инзек Интернешнел Трейдинг Б.В.", Нидерланды;

- Экспресс-тест иммунохроматографический для обнаружения антител IgG и IgM к коронавирусу 2019-nCoV (STANDARD Q COVID-19 IgM/IgG Duo), серия KS2002. OOO «Уайт Продакт» производитель "СД Биосенсор Инк.", Республика Корея;

- Набор для обнаружения антител иммуноглобулинов класса IgG/IgM к SARS-CoV-2 (на основе коллоидного золота), партия 6603000 «ОМК»,производитель "Нанкин Вазим Медикал Текнолоджи Ко., Лтд", Китай;

- Набор реагентов "Экспресс тест Sinocare SARS-CoV-2 Antibody Test Strip" для качественного обнаружения общих антител IgG и IgM к коронавирусу методом иммунохроматографического анализа, с коллоидным золотом, серии 02G0513 01, 02G0513 02 ООО "Хирургические Инновации и Ко",производитель "Чанша Синокер Инк.", Китай;

- Кассетная тест-система "Covid-19 IgG/IgM", номер партии 20200328 варианты исполнения: I. №1, И. №2, ООО "Медтехника МОСКВА", производитель Hangzhou Testsea Biotechnology Co. Ltd., Китай;

- Экспресс-тест для определения антител IgG/IgM к коронавирусу (SARS-CoV-2) вызывающему тяжелый острый респираторный синдром с использованием метода коллоидного золота, лот 0320081 ООО "РУССКАЯ КОММЕРЧЕСКАЯ ГРУППА", производитель "Маккура Биотекнолоджи Ко. Лтд.", Китай;

- Тест-кассеты для быстрого определения COVID-19 IgG/IgM, номер модели ERCSS05310, партия №501 Общество с ограниченной ответственностью "Женел Трейд", производитель "Спринг Хелскеа Сервисез АГ", Швейцария и проч., что так же ведет к затратам на их перевозку, рискам, касающимся условий транспортировки, что может непосредственно влиять на качество медизделий.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является изобретение «Набор для обнаружения антител IgM/IgG к новому коронавирусу (SARS-CoV-2)» (Патент CN 111187354 B).

Предлагается набор для обнаружения антител к SARS-CoV-2 (IgM/IgG) с применением метода захвата коллоидным золотом, непрямого метода коллоидного золота и сэндвич-метода с двойным антигеном коллоидного золота. Антиген представляет собой высокоактивный рекомбинантный антиген, экспрессируемый путем слияния фрагментов N-белка и доминирующих эпитопов S-белка, и используется непрямая маркировка коллоидным золотом. Подушка для образца предварительно обработана. Набор позволяет напрямую и вручную интерпретировать результат с высокой точностью.

Технической задачей разработки заявляемого изобретения является создание тест-системы иммунохроматографической для быстрого, бесприборного, дифференцированного выявления антител классов М и G к SARS-CoV-2 с использованием наиболее иммунодоминантных белков коронавируса с целью высокоэффективной скрининговой диагностики новой коронавирусной инфекции.

Для решения этой задачи мы предлагаем набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецептор-связывающему домену спайк белка коронавируса SARS - CoV -2, в образце биологической жидкости человека, характеризующийся тем, что он содержит картридж с отверстием для внесения буферного раствора, отверстием для внесения образца, аналитическим окном для детекции результата, внутри которого размещена тест-полоска, состоящая из подложки, на поверхности которой последовательно расположены мембраны в следующем порядке: впитывающая мембрана для нанесения образца, мембрана для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, нитроцеллюлозная мембрана-иммуносорбент с нанесенными тестовыми линиями мышиных моноклональных антител к IgM и IgG человека и контрольной линией с нанесенными козьими антителами к IgG мыши, адсорбирующая мембрана, причем мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас %:

трис-оксиметил аминометана 1%,

трис оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%,

казеинат натриевая соль 1%,

поливинилпирролидон 0,1%,

азид натрия 2%,

твин-20 1%,

мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%,

мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас %:

натрий гидрофосфат безводный 1,5%,

поливиниловый спирт 0,5%,

альбумин бычий сывороточный 1%,

тритон-Х-100 0,1%,

азид натрия 2%.

Техническим результатом изобретения является получение точного диагностического результата в процессе использования изобретения, что достигается за счет:

- Выбора наиболее иммунодоминантных белков SARS-CoV-2 и отработки технологии их конъюгирования с наночастицами коллоидного золота.

- Подбора состава буферных растворов для обработки мембран, разведения конъюгатов, образца.

- Подбора условий сорбции козьих антител к IgM и IgG человека и конъюгатов.

Набор применяет метод захвата коллоидного золота, непрямой метод коллоидного золота и метод сэндвича с двойным антигеном коллоидного золота.

Для набора не требуется прибор для обнаружения, результат интерпретируется напрямую, набор прост и удобен в эксплуатации, имеет короткое время обнаружения, около 10 минут. Заявленный набор не уступает в точности известным наборам того же назначения и способствует расширению арсенала диагностических средств, предназначенных выявления антител классов М и G к SARS-CoV-2 (Фиг. 1).

Краткое описание поясняющих материалов

Фиг. 1 - внешний вид заявляемого набора.

Фиг. 2 - внешний вид тест-полоски и схема нанесения образца и буфера.

Фиг. 3 - интерпретация результатов, полученных с помощью заявляемого набора.

Осуществление изобретения. Тест-полоска состоит из:

I. подложки из поливинилхлорида, размером 60×4 мм, толщиной 0,2-0,6 мм (фирма Современные технологии, Россия);

II. иммуносорбента, представляющего собой полоску нитроцеллюлозной мембраны с большой пропускной способностью, размером 30x4 мм, толщиной 185 мкм ± 20%, (фирма «Millipore», США, кат. № SHF1800425), с нанесенными на тестовые линии мышиными моноклональным антителами к IgM (III) (фирма «Имтек», Россия, кат № MGHIgm) и мышиными моноклональным антителами к IgG человека (IV) (фирма «Имтек», Россия, кат № MGHIgg) в концентрации ≥0,5 мг/мл в фосфатном буфере (рН 7,4) (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) и козьими антителами к IgG мыши (контрольная линия) в концентрации ≥1 мг/мл в трисовом буфере (V) (рН 7,4) (ООО Биосан», Новосибирск, кат №1-2012);

VI. мембраны для нанесения конъюгата (фирма «Millipore», США, кат № GFDX 203000), размером 6×4 мм, с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2 в концентрации ≥1 мг/мл, в фосфатном буфере (рН 7,4) (ЗАО «ЭКОлаб», Россия) и мышиных иммуноглобулинов класса G в концентрации ≥0,5 мг/мл в фосфатном буфере (рН 7,4) (ООО Биосан», Новосибирск, кат №1-2037) с коллоидными частицами золота (размер частиц 30 - 40 нм);

VII. впитывающей мембраны для нанесения образца (VIII) и буферного раствора (IX) размером 20×4 мм, толщиной 0,6-0,8 мм, плотностью 270±20 г/м² (фирма LF1, Whatman, Великобритания, кат №8121-1750);

X. мембраны для адсорбции, размером 16x4 мм, толщиной 0,3-0,5 мм, плотностью 179±5 г/м² («Millipore», США, кат № CFSP2 230 00).

Тест-полоска помещается в пластиковый картридж с тремя отверстиями: круглым отверстием с маркировкой «В» для внесения буферного раствора, расположенным в области впитывающей мембраны для нанесения образца, квадратным отверстием с маркировкой «S» для внесения образца крови, сыворотки или плазмы крови, расположенным в области впитывающей мембраны для нанесения образца, аналитического окна с маркировкой «С», «IgG», «IgM» расположенным в области нитроцеллюлозной мембраны (Фиг. 2)

Для одновременного дифференцированного определения специфических антител классов М и G к вирусу SARS-CoV-2 методом иммунохроматографии используется антиген Спайк RBD (рецептор-связывающий домен), который представляет собой фрагмент Arg319-Phe541 SARS-CoV-2 Спайк поверхностного гликопротеина [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, тяжелый острый респираторный синдром коронавируса 2] GenBank: QHD43416.1. Содержит на С-терминальном конце His6-MeTKy. Теоретическая молекулярная масса 25921 Da, включая His6-tag. Теоретическая pi: 8,91. Также используемый нуклеопротеин представляет собой полноразмерный нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 [коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома] GenBank: QHD43423.2. Содержит С-концевой линкер GS и His10-тег. Теоретический MW 47141 Da, включая линкер GS и His10-тег. Теоретическая pI: 10.07/. В основе работы теста лежит метод качественного иммунохроматографического анализа. При наличии в исследуемом образце антител к коронавирусу они связываются в области внесения пробы со специфичным конъюгатом, представляющим собой рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, конъюгированный с коллоидным золотом. При этом формируется комплекс «антитело-антиген конъюгата», который мигрирует с током жидкости. В тестовых зонах происходит его взаимодействие с антителами против IgM и IgG человека с образованием окрашенных комплексов. Наличие цветной линии указывает на положительный результат, а ее отсутствие - на отрицательный. Непрореагировавший конъюгат взаимодействует с антивидовыми антителами в области контрольной зоны (зона С) с образованием окрашенного иммунного комплекса. Цветная контрольная линия формируется всегда, независимо от наличия антител к коронавирусу в образце.

Приготовление иммунохроматографического набора реагентов обнаружения антител к COVID-19 включает следующие этапы:

1.1. Приготовление наночастиц коллоидного золота (НКЗ).

1.2. Приготовление конъюгата антигенов с НКЗ.

2. Подготовка мембраны для образца.

2.1. Приготовление раствора для обработки мембраны для образца

2.2. Обработка мембраны для образца

2.3. Сушка мембраны для образца

2.4. Нарезка мембраны для образца

3. Подготовка мембраны для конъюгата.

3.1. Обработка мембраны для конъюгата

3.2. Сушка мембраны для конъюгата

3.3. Нарезка мембраны для конъюгата

4. Подготовка мембраны для адсорбции

5. Приготовления рабочих разведений антител

5.1. Приготовление буферного раствора для нанесения тестовой и контрольной линий

5.2. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции тестовой линии

5.3. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции контрольной линии

6. Сорбция антител

6.1. Сушка подложек с нанесенными антителами.

7. Приготовление рабочего разведения конъюгата

7.1. Приготовление рабочего раствора конъюгата

7.2. Сорбция конъюгата

7.3. Сушка и нарезка нанесенного конъюгата

8. Сборка и нарезка иммуносорбента (мастершита)

1.1. Приготовление наночастиц коллоидного золота (НКЗ).

Проводят по следующей методике:

Приготовление раствора цитрата натрия: 0,2300 г цитрата натрия развести в 10 мл деионизованной воды.

Приготовление раствора хлорида золота: 0,1 г хлорида золота (III) развести в 10 мл деионизованной воды.

Приготовление наночастиц коллоидного золота: 500 мл деионизованной воды поместить в круглодонную колбу вместимостью 1000 мл, поставить на магнитную мешалку со скоростью 700 об/мин и нагреть до температуры 96-98°С. Контроль температуры вести по ртутному термометру. Внести 10 мл раствора хлорида золота (III). Довести температуру до 96-98°С. Контроль температуры вести по ртутному термометру. Внести 10 мл раствора цитрата натрия (одной порцией), перемешивать 8 минут. Снять колбу с коллоидным золотом с мешалки, дать остыть до комнатной температуры. На спектрофотометре снять спектр поглощения в диапазоне от 450 нм до 620 нм с шагом в 1 нм относительно воздуха, определить максимум поглощения. Для снятия спектра коллоидное золото развести детонизованной водой 1:10. Хранить коллоидное золото при температуре 2-8°С в защищенном от света месте не более 6 месяцев от даты изготовления.

1.2. Приготовление конъюгата антигенов с НКЗ.

Проводят по следующей методике:

Приготовление 0,1 М раствора карбоната натрия: 1,059 г карбоната натрия развести в 100 мл деионизованной воды.

Определение рН изоэлектрической точки антигенов: В эппендорфах приготовить ряд растворов коллоидного золота с добавлением различного количества 0,1М карбоната натрия:

В каждый из этих растворов добавить по 12-18 мкг антигенов, перемешать, через 20 мин сравнить цвет. Первая пробирка, в которой не наблюдается изменения окраски относительно исходного цвета коллоидного золота, указывает на количество карбоната натрия, которое следует добавлять при конъюгации для достижения рН изоэлектрической точки.

Приготовление конъюгата антигенов с коллоидным золотом.

К требуемому количеству коллоидного золота добавить 0,1М раствор карбоната натрия, необходимый для достижения рН изоэлектрической точки для данного вида антигенов.

Перемешивать на магнитной мешалке в течение 3 минут. Добавить антигены из расчета 12-18 мкг на 1 мл коллоидного золота. Перемешивать на магнитной мешалке в течении 15 минут. Добавить 10% раствор БСА из расчета 0,02 мл на 1 мл коллоидного золота. Перемешивать на магнитной мешалке в течении 10 минут. Центрифугировать при 12000g, 4°С в течение 30 минут. Осторожно пипеткой удалить надосадочную жидкость. Добавить деионизованную воду в количестве, равном изначальному количеству коллоидного золота, перемешать при помощи вортекса. Центрифугировать при 12000g, 40С в течение 30 минут. Осторожно пипеткой удалить надосадочную жидкость. Добавить деионизованную воду в количестве, в 20 раз меньшем изначального количества коллоидного золота. Полученный конъюгат перенести во флакон из темного стекла. На спектрофотометре измерить оптическую плотность конъюгата при разведении его деионизованной водой 1:100 относительно воды при длине волны, равной максимуму поглощения данной серии коллоидного золота. В качестве консерванта добавить азид натрия до 0,1% к объему конъюгата. Хранить конъюгаты с коллоидным золотом при температуре 2-8°С в защищенном от света месте не более 12 месяцев от даты изготовления.

Антиген представляет собой высокоактивный рекомбинантный антиген, экспрессируемый путем слияния фрагментов N-белка и доминирующих эпитопов S-белка, и используется непрямая маркировка коллоидным золотом.

2. Подготовка мембраны для образца.

2.1. Приготовление буферного раствора для обработки мембраны для образца.

В необходимом количестве чистой деионизированной воды растворить компоненты, перечисленные в Таблице 2, до достижения следующих концентраций в мас %:

Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 8,0±0,1.

2.2. Обработка мембраны для образца

Работа с мембранами проводится в перчатках. Необходимо выложить лист мембраны размером 20,4*25,4 см в чистый и сухой пластиковый лоток с размером по дну не более 25*30 см. Мерным цилиндром отмерить 50 мл буферного раствора для пропитки мембраны для образца и влить в лоток. Небольшим покачиванием распределить буферный раствор по всей поверхности мембраны в лотке. Качать на шейкере 15 минут с каждой стороны (режим 13 оборотов в минуту). Переворачивать, используя металлические или пластиковые пинцеты. Повторить операцию для необходимого количества мембран.

2.3. Сушка мембраны для образца

Сушка мембран для образца осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.

2.4. Нарезка мембраны для образца

Необходимое количество пропитанных мембран для образца сложить в стопку и поместить в автоматический резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран для образца по 1,9 см. Произвести нарезку мембран. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.

3. Подготовка мембраны для конъюгата.

Приготовление буферного раствора для пропитки мембраны для конъюгата, представляющего собой водный раствор, содержащий компоненты, приведенные в Таблице 3 при их соотношении в мас %.

В необходимом количестве чистой деионизированной воды растворить натрий гидрофосфат безводный и поливиниловый спирт. Для этого поместить стакан на магнитную мешалку с нагревом и перемешивать в течение 1-2 ч. Охладить полученный раствор до комнатной температуры. Взвесить и добавить в полученный раствор альбумин бычий сывороточный, тритон-Х-100, азид натрия в колическвах, соответствующих приведенным в Табл. 3. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,4±0,1. При необходимости провести корректировку рН. Хранить раствор для пропитки мембран пгш температуре 2-8°С в течение 14 суток.

3.1. Обработка мембраны для конъюгата

Работа с мембранами проводится в перчатках. Необходимо выложить мембрану в чистый и сухой лоток. Мерным цилиндром отмерить 20 мл буферного раствора для пропитки мембран и влить в лоток. Небольшим покачиванием распределить буферный раствор по всей поверхности мембраны в лотке. Качать на шейкере 15 минут с каждой стороны (режим 13 оборотов в минуту).

Повторить операцию для необходимого количества мембран.

3.2. Сушка мембраны для конъюгата

Сушка мембран для образца осуществляют при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.

3.3. Нарезка мембраны для конъюгата

Необходимое количество мембран сложить в стопку и поместить в резак. Произвести нарезку мембран по 0,9 см.

4. Подготовка мембраны для адсорбции

Нарезка мембраны для адсорбции

Мембраны для адсорбции не требуют обработки. Необходимое количество мембран сложить в стопку и поместить в резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран. Произвести нарезку мембран по 1,5 см. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%.

5. Приготовления рабочих разведений антител

5.1. Приготовление буферного раствора для нанесения тестовой и контрольной

линий.

Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 200 мл следующие компоненты (Таблица 4):

С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 90 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,4±0,1. Хранить раствор для сорбции при температуре 2-8°С в течение 14 суток.

5.2. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции тестовой линии

В буфер для сорбции внести моноклональные антитела к IgM, IgG человека в концентрации 0, 5 мг/мл. Тщательно перемешать полученные растворы на вортексе или магнитной мешалке в зависимости от объема серии.

5.3. Приготовление рабочего раствора антител для сорбции контрольной линии

В буфер для сорбции контрольной линии внести козьи антитела к IgG кролика до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Объем раствора и антител рассчитать, исходя из концентрации, указанной в спецификации к реагенту. Тщательно перемешать полученный раствор на вортексе или магнитной мешалке в зависимости от объема серии.

6. Сорбция антител

Сорбцию проводят с помощью диспенсера «AUTOKUN», HGS510.

На подложку наклеить нитроцеллюлозную мембрану CN140, отклеив защитный слой с этой зоны (см схему 1). На каждую подложку наносится рабочий раствор антител для тестовой и контрольной линии в объеме 1 мкл на см².

6.1. Сушка подложек с нанесенными антителами.

Сушка подложки с нанесенными антителами осуществляют при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные подложки хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте.

7. Приготовление рабочего разведения конъюгата

Приготовление буферного раствора для разведения конъюгата.

Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 200 мл следующие компоненты (таблица 5):

С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 90 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 8±0,1.

Взвесить и добавить Сахарозу 20%, трегалозу 5%. Перемешивать раствор на магнитной мешалке до полного растворения компонентов. Разбавить раствор очищенной водой до конечного объема 100 мл.

7.1. Приготовление рабочего раствора конъюгата

Определить рабочее разведение конъюгата. В качестве рабочего разведения принимается то, при котором достигаются устойчивые результаты со стандартным образцом предприятия СОП-300 «Стандартная панель отрицательных образцов предприятия содержащих и не содержащих антитела к коронавирусу SARS-CoV-2». В соответствии с заданием на приготовление конъюгата и результатами определения рабочего разведения рассчитать количество, необходимое для сорбции.

Расчет произвести по формуле:

, где

OD - рабочее разведение конъюгата;

V - количество рабочего разведения конъюгата необходимое для сорбции;

ОП - оптическая плотность конъюгата, указанная в паспорте.

В буфер для разведения конъюгата внести конъюгаты антигенов (антител) с НКЗ.

7.2. Сорбция конъюгата

Нанесение конъюгата

Обработанные листы мембран выложить в чистый и сухой лоток размером не более 25*30 см по дну так, чтобы лист мембраны строго горизонтально лежал на дне лотка. Нанести на каждый лист необходимый объем конъюгата из расчета 14 мкл на см². Качать на шейкере 10 минут, не переворачивая (режим 13 оборотов в минуту).

7.3. Сушка и нарезка нанесенного конъюгата

Сушка листов с нанесенным конъюгатом осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в течение 24 часов. Высушенные мембраны с нанесенным конъюгатом хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте. Необходимое количество пропитанных мембран для конъюгата (не более 20 шт) сложить в стопку и поместить в резак. Выбрать нужную программу для нарезки мембран для конъюгата по 0,9 см. Произвести нарезку мембран. Нарезанные мембраны хранятся при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30% в бумажном конверте.

8. Сборка и нарезка иммуносорбента (мастершита)

Сборка мастершита осуществляется при комнатной температуре (18-25°С) и относительной влажности не более 30%. Для сборки мастершита использовать предварительно обработанные (при необходимости) и нарезанные мембраны. С подложки с наклеенной мембраной CN140 снять (отклеить) защитный слой в зоне мембраны для адсорбции (см. схему 1). Наклеить полоску мембраны для адсорбции, выровняв ее по наружному краю с краем подложки. При этом на противоположном крае образуется нахлест на CN140 1-2 мм. Далее освободить от защитного слоя зону конъюгата (см. схему 1), наклеить мембрану с конъюгатом, выровняв ее по нижнему краю со стороны зоны для образца, при этом на противоположном крае образуется нахлест на CN140 1-2 мм. В последнюю очередь освободить подложку от оставшегося защитного слоя в нижней зоне и наклеить мембрану для образца, выровняв ее по нижнему краю с краем подложки.

Схема 1. Сборка мастершита

Произвести нарезку собранного мастершита на тест-полоски по 4 мм на высокоскоростном резаке HGS210, «AUTOKUN». Выбрать нужную программу для нарезки тест-полосок (ширина тест-полоски 4 мм).

9. Приготовление буферного раствора для разведения образца.

Взвесить и добавить в сухой мерный стакан объемом 1 л следующие компоненты:

С помощью мерного цилиндра отмерить и внести в стакан 900 мл очищенной воды. Поместить стакан на магнитную мешалку и перемешивать в течение 15 минут. Измерить рН полученного раствора. Значение рН должно соответствовать 7,2±0,1. Полученный раствор перенести в цилиндр и разбавить очищенной водой до конечного объема 1,0 л. Перенести раствор в колбу объемом 1 л.

Перечень специфического сырья:

Для исследования используются образцы сыворотки, плазмы или цельной крови человека, объемом не менее 10 мкл. Образцы сыворотки и плазмы (полученные с использованием гепарина, цитрата натрия в качестве антикоагулянта) до проведения анализа можно хранить при температуре от 2 до 8°С не более четырех суток. При необходимости хранения образцов сыворотки и плазмы более 7 дней рекомендуется разделить их на аликвоты и хранить при температуре от минус 20 до минус 70°С. Размороженные образцы перед исследованием нужно тщательно перемешать. При работе с размороженными образцами следует учитывать, что каждый цикл оттаивания-замораживания приводит к разрушению выявляемых антител, снижая качество исследуемого материала. С целью получения достоверных результатов исследования рекомендуется использовать только однократное замораживание-оттаивание образцов.

Для забора образцов цельной крови из вены необходимо использовать пробирки с антикоагулянтом (с гепарином, цитратом натрия или ЭДТА). Образцы венозной крови до проведения анализа можно хранить при температуре от 2 до 8°С не более суток. Замораживание проб цельной крови из вены не допускается.

Образцы цельной капиллярной крови из пальца должны исследоваться незамедлительно и хранению не подлежат.

Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием ли-пидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.

Образцы сыворотки и плазмы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 минут при 2500-3000 об/мин.

Порядок проведения анализа.

1. Извлечь тест-кассету из индивидуальной упаковки, промаркировать, положить устройство на ровную горизонтальную поверхность.

2. заполнить одноразовую пипетку исследуемым образцом до синей риски (10 мкл)

- удерживая пипетку вертикально, нажатием внести пробу в отверстие тест-кассеты, промаркированное знаком « S »(Фиг. 2),

- удерживая флакон-капельницу вертикально, внести 2 капли буферного раствора в отверстие тест-кассеты, промаркированное знаком « В » (Фиг. 2),

- запустить таймер.

3. Оценить результат реакции визуально через 10-15 минут. Не интерпретировать результаты позднее 20 минут после внесения пробы.

Учет и интерпретация результатов (Фиг. 3)

Отрицательный результат: в контрольной зоне (С) про-является красная линия, в тестовых зонах (IgM и IgG) окрашивания не происходит.

Положительный результат: проявляются две или три четкие красные или розовые линии. Одна линия должна находиться в контрольной зоне (С), другая (или другие) - в тестовых зонах (IgM и/или IgG).

Недействительный результат: в контрольной зоне (С) не появляется окрашенной линии независимо от наличия линий в тестовых зонах (IgM и IgG).

Интенсивность окраски линий может меняться в зависимости от концентрации антител к SARS-CoV-2 в исследуемом образце. Линия в тестовой зоне может быть слабо окрашена вследствие низкого уровня антител в пробе.

В случае получения недействительного результата анализ следует повторить с использованием другой тест-кассеты набора.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примерами.

Пример 1.

Исследование интерференции в заявляемом наборе реагентов

Потенциальные интерферирующие вещества добавляли в пулы сывороток, содержащих и не содержащих антитела к SARS-CoV-2. Образцы были испытаны с помощью заявляемого набора реагентов, обозначаемого далее как «HXA-COVTD-19-IgM/IgG» в трех повторах с последующей визуальной интерпретацией, происходящей через 10-15 минут после внесения образцов. Результаты представлены в таблицах 6,7.

Проведенные исследования показали, что интерферирующие вещества в исследованных концентрациях не оказывают влияния на результат анализа с помощью заявляемого набора реагентов.

Пример 2. Исследование перекрестной реактивности в наборе реагентов «ИХА-COVID-19-IgM/IgG».

Перекрестную реактивность «HXA-COVID-19-IgM/IgG» исследовали с использованием образцов сыворотки которые содержат антитела к патогенам: другие типы коронавируса, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, Adenovirus, Human Metapneumovirus (hMPV), Parainfluenza virus 1-4, Influenza A, Influenza B, Enterovirus 71, Respiratory syncytial virus, Rhinovirus, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonia, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, EB Virus. Полученные результаты представлены в Табл. 8

Проведенные испытания показали отсутствие перекрестной реактивности с другими патогенами при исследовании образцов сыворотки (плазмы) с помощью набора реагентов.

Пример 3. Оценка эквивалентности сыворотки крови человека к плазме крови человека в сравнении с набором-аналогом.

Была проведена оценка эквивалентности получаемых результатов при использовании образцов сыворотки крови человека и плазмы крови человека при использовании заявляемого набора в сравнении с набором-аналогом (Набор реагентов «COVID-19 IGG/IGM» ООО "БИОТЭК", РУ № РЗН 2020/10177 от 24.04.2020 г.). Результаты представлены в Табл. 9.

Представленные результаты исследования образцов плазмы показали, что тип биологического образца не оказывает влияния на результат анализа, а также, что вид антикоагулянта (гепарин или цитрат натрия, ЭДТА) не оказывают влияния на результат анализа. Результаты испытаний заявляемого набора реагентов «HXA-COVID-19-IgM/IgG» сопоставимы и совпадают с результатами исследования тех же образцов, полученными с помощью зарегистрированного в Российской Федерации набора реагентов Экспресс-тест COVID-19 IgG/IgM (Цельная кровь/сыворотка/плазма), номер партии BNCP40200082, ООО "БИОТЭК".

В ходе внутренних клинико-лабораторных испытаний разработанного набора реагентов было проанализировано 332 образца сыворотки крови, характеризующихся следующими параметрами:

Проведенные исследования показали, что тест имеет высокие показатели чувствительности и специфичности при исследовании клинического материала.

Литература

1. Huang C, Wang Y., Li X., Ren L., Zhao J., Hu Y. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020; 395: 497-506.

2. Zhang J., Litvinova M., Wang W., Yan Wang, Deng X., Chen X. et al. Evolving epidemiology and transmission dynamics of coronavirus disease, 2019 outside Hubei province, China: a descriptive and modeling study. Lancet Infect. Dis. 2020; 20: 793-802.

3. Nussbaumer-Streit B., Mayr V., Dobrescu A.I., Chapman A., Persad E., Klerings I. et al. Quarantine alone or in combination with other public health measures to control COVID-19: a rapid review. Cochrane Database Syst Rev. 2020; 4CD013574.

4. Wölfel R., Corman V.M., Guggemos W., Seilmaier M., Zange S., Marcel A. Miilleret al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID- 2019. Nature. 2020; 581: 465-9.

5. He X., Lau E.H.Y., Wu P., Deng X., Wang J., Hao X. et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med. 2020; 26: 672-5.

6. Rothe C, Schunk M., Sothmann P., Bretzel G., Froeschl G., Wallrauch C. et al. Transmission of 2019-nCoV infection from an asymptomatic contact in Germany. N. Engl. J. Med. 2020; 382: 970-1.

7. Ferretti L., Wymant C, Kendall M., Zhao L., Nurtay A., Abeler-Dorneret L. al. Quantifying SARS-CoV-2 transmission suggests epidemic control with digital contact tracing. Science. 2020; 368eabb6936.

8. Perera R.A., Mok C.K., Tsang O.T., Lv H., Ko R.L., Wu N.C. et al. Serological assays for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), March 2020. Euro Surveill. 2020; 25(16):pii=2000421.

9. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S., Nguyen T.H.O., Chromikova V., McMahon M. et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat. Med.; 2020. Doi: 10.1038/s41591-020-0913-5.

10. Meyer B., Drosten C, Müller M.A. Serological assays for emerging coronaviruses: Challenges and pitfalls. Virus Res. 2014; 194: 175-83. Doi: 10.1016/j.virusres.2014.03.018.

11. Dutta N.K., Kaushiki M.;. James G T. The Nucleocapsid Protein of SARS-CoV-2: a Target for Vaccine Development. J. Virol. 2020; 94(13): e00647-20.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2, в образце биологической жидкости человека. Набор содержит впитывающую мембрану для нанесения образца и мембрану для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, где мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас. %: трис-оксиметил аминометана 1%, трис-оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%, казеинат натриевая соль 1%, поливинилпирролидон 0,1%, азид натрия 2%, твин-20 1%, мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%, мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором, приготовленным из компонентов в следующем их соотношении, мас. %: натрий гидрофосфат безводный 1,5%, поливиниловый спирт 0,5%, альбумин бычий сывороточный 1%, тритон-Х-100 0,1%, азид натрия 2%. Техническим результатом изобретения является получение точного диагностического результата в процессе использования изобретения. 3 ил., 11 табл., 3 пр.

Набор для выявления антител классов М и G к нуклеокапсиду (Nc) и рецепторсвязывающему домену спайк белка коронавируса SARS-CoV-2, в образце биологической жидкости человека, характеризующийся тем, что он содержит картридж с отверстием для внесения буферного раствора, отверстием для внесения образца, аналитическим окном для детекции результата, внутри которого размещена тест-полоска, состоящая из подложки, на поверхности которой последовательно расположены мембраны в следующем порядке: впитывающая мембрана для нанесения образца, мембрана для нанесения конъюгата с нанесенными и высушенными конъюгатами рекомбинантного антигена коронавируса SARS-CoV-2, нитроцеллюлозная мембрана-иммуносорбент с нанесенными тестовыми линиями мышиных моноклональных антител к IgM и IgG человека и контрольной линией с нанесенными козьими антителами к IgG мыши, адсорбирующая мембрана, причем мембрану для образца пропитывают буферным раствором, представляющим собой водный раствор, приготовленный из компонентов в следующем их соотношении, мас. %:

трис-оксиметил аминометана 1%,

трис-оксиметил аминометан гидрохлорида 0,1%,

казеинат натриевая соль 1%,

поливинилпирролидон 0,1%,

азид натрия 2%,

твин-20 1%,

мышиные антитела к эритроцитам человека 0,02%,

мембрану для конъюгата пропитывают водным раствором, приготовленным из компонентов в следующем их соотношении, мас. %:

натрий гидрофосфат безводный 1,5%,

поливиниловый спирт 0,5%,

альбумин бычий сывороточный 1%,

тритон-Х-100 0,1%,

азид натрия 2%.