СПОСОБ ДЛЯ ФИЛЬТРАЦИИ СОДЕРЖАЩЕЙ БЕЛОК ЖИДКОСТИ Российский патент 2020 года по МПК B01D61/14 B01D61/16 B01D61/58 B01D63/08 B01D65/02 B01D69/12 B01D71/34 B01D71/56 B01D71/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001]

Настоящее изобретение относится к способу для фильтрации содержащей белок жидкости.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002]

В последние годы растет потребность в мерах для улучшения вирусной безопасности не только для препаратов плазмы, получаемых из человеческой крови, но также и для биопрепаратов. Поэтому производители фармацевтических препаратов проводят исследования для того, чтобы ввести стадию удаления/инактивации вирусов в производственный процесс. В частности, способ удаления вирусов фильтрацией с помощью мембраны для удаления вирусов является эффективным способом, который может обеспечить уменьшение количества вирусов без денатурации полезных белков.

[0003]

Среди вирусов, в частности, парвовирус был зарегистрирован в отношении случая заражения человеческим парвовирусом B19 в области производных плазмы и случая заражения клеток CHO (яичника китайского хомячка) парвовирусом мыши в биофармацевтической области. В дополнение к этому, также сообщалось о случае, когда микробактерии, такие как разновидности Leptospira, оставались в биопрепаратах.

[0004]

У парвовируса, который является малым вирусом, нет никакой оболочки, и таким образом он является физико–химически устойчивым и стойким к нагреванию, низким значениям pH и обработке химическим агентом, которые соответствуют стадии инактивации, обычно выполняемой во время фармацевтического производственного процесса. Следовательно, существует растущая потребность в удалении вирусов и бактерий с помощью мембраны для удаления вирусов в качестве как способа удаления вирусов, имеющего отличающийся от способа инактивации механизм.

[0005]

В качестве мембраны фильтрации для удаления вирусов были известны мембраны, включающие в себя природный материал, такой как целлюлоза, а также включающие в себя синтетический полимерный материал, такой как поливинилиденфторид (PVDF) или полиэфирсульфон (PES) (см., например, Патентные документы 1 и 2, а также Непатентные документы 1–4). Мембрана для удаления вирусов, имеющая высокие свойства удаления относительно малого вируса (например, парвовируса), имеющего размер, близкий к размеру полезного белка, а также имеющая высокую эффективность фильтрации белка, была востребована в области фармацевтического производства, и эта потребность в мембране для удаления вирусов растет год от года.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

[0006]

Патентный документ 1: Японская отложенная патентная заявка № 2004–277323

Патентный документ 2: Американская опубликованная патентная заявка № 2016/0176921

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

[0007]

Непатентный документ 1: Manabe S., Removal of virus through novel membrane filtration method, Dev. Biol. Stand., (1996)88: 81–90.

Непатентный документ 2: Brandwein H. et al., Membrane filtration for virus removal, Dev Biol (Basel), (2000)102: 157–63.

Непатентный документ 3: Aranha–Creado et al., Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter, Biologicals (1998) Jun; 26(2):167–72.

Непатентный документ 4: L. Moce–Llivina et al., Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions, Journal of Virological Methods, (2003) April, Vol.109, Issue 1, Pages 99–101.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0008]

В последние годы все большую обеспокоенность вызывает риск загрязнения с высокой вероятностью микробактериями, такими как Leptospira licerasiae, и вирусами на заключительном этапе очистки биологического препарата, где клетки СНО используются в качестве клеток–хозяев. Существует немало препаратов в качестве препаратов на основе антител, которые концентрируются с 20 мг/мл до 100 мг/мл на конечной стадии ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF), после этого фильтруются с использованием стерилизационной мембраны, имеющей размер пор 0,22 мкм. Такая стадия не обязательно выполняется в асептических условиях, но выполняется в нестерилизованной среде, устанавливаемой вручную, и таким образом существуют опасения по поводу возникновения загрязнения, вызванного оператором, а также загрязнения, вызванного микробактериями и вирусами, при окончательной подготовке буфера. Однако такая конечная стадия UF/DF в фармацевтическом производственном процессе обычно выполняется после стадии удаления вирусов с помощью мембраны для удаления вирусов, и таким образом микробактерии и вирусы не могут быть удалены на такой конечной стадии UF/DF и последующей стадии стерилизации мембраной с размером пор 0,22 мкм. Авторы настоящего изобретения с таких точек зрения обнаружили, что стадия удаления микробактерий и вирусов после такой конечной стадии UF/DF является полезной для реализации безопасного фармацевтического производства.

[0009]

Раствор белка высокой концентрации, получаемый на конечной стадии UF/DF, может включать в себя мультимер, образованный ассоциацией мономеров содержащихся белков. В частности, агрегирование белков может быть вызвано напряжением сдвига на вышеупомянутой стадии очистки, как в UF/DF, приводя к увеличению мультимера до размеров видимых частиц. Мультимер белков, содержащихся в фармацевтическом лекарственном средстве, как известно, вызывает побочные эффекты в человеческом теле, и предпочтительно удалять этот мультимер. Кроме того, такие мультимерные частицы вызывают закупорку мембраны для удаления вирусов при использовании после конечной стадии UF/DF. Однако, вообще говоря, такие мультимерные частицы трудно удалить стерилизационной мембраной с размером пор 0,22 мкм, и удаление такого мультимера после вышеупомянутой стадии очистки, как при ультрафильтрации и т.п., до настоящего времени недостаточно изучено.

[0010]

Соответственно, идеально было бы фильтровать промежуточный продукт белкового препарата с помощью устройства для удаления вирусов, снабженного мембраной для удаления вирусов, чтобы обеспечить фильтрацию большего количества белков за короткое время, удаление мультимеров, а также удаление вирусов за счет достаточно высокой способности к удалению вирусов. Однако, например, мембрана для удаления вируса, включающая целлюлозу, хотя практически не забивается даже при фильтрации белкового раствора, содержащего 0,25 г/м² или больше мультимера, вызывает заметное уменьшение скорости фильтрации при фильтрации белкового раствора, имеющего высокую концентрацию, 20 мг/мл или больше, и таким образом имеет тенденцию к снижению количества белка, который может быть отфильтрован за единицу времени, по сравнению со случаем фильтрации раствора белка с низкой концентрацией.

[0011]

Авторы настоящего изобретения также нашли, что мембрана для удаления вирусов, включающая синтетический полимер, которая имеет высокую стойкость к давлению и не испытывает проблем даже при практическом увеличении давления до приблизительно 300 кПа, часто может быть неспособна к фильтрации из–за закупорки, образующейся при увеличении концентрации белков приблизительно до 20 мг/мл. Таким образом, в случае использования такой мембраны для удаления вирусов, включающей синтетический полимер, фильтрация обычно выполняется при низкой концентрации, 10 мг/мл или меньше (см., например, Патентный документ 1).

[0012]

По этим причинам не было ни одного исследования способа фильтрации в таких условиях, когда промежуточный продукт белкового препарата с высокой концентрацией белка, увеличивающейся на стадии очистки, такой как хроматография или окончательная ультрафильтрация, подается в устройство для удаления вирусов под высоким давлением, а также не было никаких разработок мембраны для удаления вирусов, подходящей для такого способа. Следовательно, одной задачей настоящего изобретения является предложить способ, который позволял бы фильтровать жидкость, содержащую белки в высокой концентрации, с высокой эффективностью.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

[0013]

Один аспект настоящего изобретения предлагает способ для фильтрации жидкости, содержащей белок в концентрации 20 мг/мл или больше и 100 мг/мл или меньше, включает в себя стадию предварительной фильтрации содержащей белок жидкости предварительным фильтром, имеющим размер пор 0,08 мкм – 0,25 мкм и содержащим гидрофобную смолу, и стадию удаления вирусов путем фильтрации содержащей белок жидкости мембраной для удаления вирусов, содержащей синтетический полимер, после стадии предварительной фильтрации, в котором содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации включает в себя 0,25 г или больше тримера или более высокого мультимера белков, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм, на 1 м² мембраны для удаления вирусов.

[0014]

В этом способе предварительный фильтр может включать в себя материал, выбираемый из группы, состоящей из полиамидной смолы, смолы на основе полисульфона и фторкаучука.

[0015]

В этом способе предварительный фильтр может включать в себя полиэфирсульфон или поливинилиденфторид.

[0016]

В этом способе содержащая белок жидкость до выполнения стадии предварительной фильтрации может дополнительно включать в себя частицы, которые представляют собой мультимеры белков и имеют диаметр 100 нм или больше.

[0017]

Способ может дополнительно включать в себя стадию диафильтрации содержащей белок жидкости перед стадией предварительной фильтрации.

[0018]

Способ может дополнительно включать в себя стадию ультрафильтрации содержащей белок жидкости перед стадией предварительной фильтрации.

[0019]

Способ может не включать в себя дополнительную стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии диафильтрации.

[0020]

Способ может дополнительно включать в себя стадию фильтрации с тангенциальным потоком при помощи устройства фильтрации с тангенциальным потоком перед стадией предварительной фильтрации.

[0021]

Способ может дополнительно включать в себя стадию перемешивания содержащей белок жидкости в течение 2 час или больше перед стадией предварительной фильтрации.

[0022]

Способ может не включать в себя никаких других стадий между стадией предварительной фильтрации и стадией удаления вирусов.

[0023]

В этом способе стадия предварительной фильтрации и стадия удаления вирусов могут выполняться последовательно.

[0024]

В этом способе предварительный фильтр может быть листовым фильтром.

[0025]

В этом способе предварительный фильтр может включать в себя многослойную мембрану.

[0026]

В этом способе предварительный фильтр может включать в себя многослойную мембрану, в которой каждый слой отличается размером пор фильтра.

[0027]

В этом способе вязкость содержащей белок жидкости, отфильтрованной предварительным фильтром, может быть более низкой, чем вязкость содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром.

[0028]

В этом способе белок может включать в себя антитело. Антитело может быть моноклональным антителом.

[0029]

В этом способе мембрана для удаления вирусов может включать в себя поливинилиденфторид. Логарифмический коэффициент удаления (LRV) парвовирусов мембраной для удаления вирусов может составлять 4,0 или больше.

[0030]

В этом способе мембрана для удаления вирусов может включать в себя первичную поверхность, к которой подается содержащая белок жидкость, отфильтрованная предварительным фильтром, и вторичную поверхность, из которой вытекает жидкость, которая проникает через мембрану для удаления вирусов; в том случае, когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм, подается через первичную поверхность к мембране для удаления вирусов для захвата коллоидов золота с тем, чтобы измерить яркость в поперечном сечении мембраны для удаления вирусов, значение, получаемое путем деления стандартного отклонения значения площади спектра вариации яркости на среднее значение площади спектра вариации яркости, может составлять 0,01 или больше и 1,50 или меньше; а толщина зоны в поперечном сечении мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, может составлять 10 мкм или больше и 30 мкм или меньше.

[0031]

В этом способе содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации может иметь значение рН 4,0 или больше и 8,0 или меньше. Содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации может иметь ионную силу 0 ммоль/л или больше и 300 ммоль/л или меньше. Содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации может включать в себя добавку, содержащую по меньшей мере одно вещество, выбираемое из группы, состоящей из сахара и основной аминокислоты.

[0032]

В этом способе предварительный фильтр может быть стерилизуемым на месте.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0033]

Настоящее изобретение позволяет обеспечить способ, который может с высокой эффективностью фильтровать жидкость, содержащую белок в высокой концентрации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0034]

[Фиг. 1] Фиг. 1 представляет собой схематический вид мембраны для удаления вирусов, имеющей форму мембраны из полого волокна, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения.

[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет собой схематический вид зоны захвата вирусов в мембране для удаления вирусов, имеющей форму мембраны из полого волокна, в соответствии со Справочным примером настоящего изобретения.

[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет собой схематический вид зоны захвата вирусов в мембране для удаления вирусов, имеющей форму мембраны из полого волокна, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения.

[Фиг. 4] Фиг. 4 представляет собой схематический вид мембраны для удаления вирусов, имеющей форму плоской мембраны, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения.

[Фиг. 5] Фиг. 5 представляет собой таблицу, показывающую условия производства и результаты оценки мембраны для удаления вирусов для каждого Примера по настоящему изобретению.

[Фиг. 6] Фиг. 6 представляет собой график, показывающий распределение размера белковых частиц в соответствии с Примерами настоящего изобретения.

[Фиг. 7] Фиг. 7 представляет собой график поглощения в гель–проникающей хроматографии для содержащей мультимер жидкости согласно Примерам настоящего изобретения.

[Фиг. 8] Фиг. 8 представляет собой график, показывающий изменение во времени общего количества фильтрата для каждой мембраны для удаления вирусов в соответствии с Примером 1 по настоящему изобретению и Сравнительным примером 1.

[Фиг. 9] Фиг. 9 представляет собой график, показывающий время, требуемое для фильтрации каждой мембраной для удаления вирусов в соответствии с Примерами настоящего изобретения и Сравнительными примерами.

[Фиг. 10] Фиг. 10 представляет собой график, показывающий изменение во времени общего количества фильтрата для каждой мембраны для удаления вирусов в соответствии с Примером 2 по настоящему изобретению и Сравнительным примером 2.

[Фиг. 11] Фиг. 11 представляет собой график, показывающий изменение во времени общего количества фильтрата для каждой мембраны для удаления вирусов в соответствии с Примером 3 по настоящему изобретению и Сравнительным примером 3.

[Фиг. 12] Фиг. 12 представляет собой график, показывающий изменение во времени общего количества фильтрата для каждой мембраны для удаления вирусов в соответствии с Примером 4 по настоящему изобретению и Сравнительным примером 4.

[Фиг. 13] Фиг. 13 представляет собой график, показывающий изменение во времени общего количества фильтрата для каждой мембраны для удаления вирусов в соответствии с Примерами 5 и 6 по настоящему изобретению и Сравнительным примером 6.

[Фиг. 14] Фиг. 14 представляет собой график, показывающий время, требуемое для фильтрации каждой мембраной для удаления вирусов в соответствии с Примерами настоящего изобретения и Сравнительными примерами.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0035]

Далее будут описаны варианты осуществления настоящего изобретения. В последующем описании чертежей одинаковые или подобные детали обозначаются одинаковыми или подобными ссылочными обозначениями. Чертежи, однако, являются схематичными, и неточно отражают конкретные размеры и т.п. Соответственно, конкретные размеры и т.п. следует понимать с учетом последующего описания и включать в рассмотрение любую деталь, соотношение размеров которой отличается от приведенных чертежей.

[0036]

Способ для фильтрации содержащей белок жидкости в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способом для фильтрации жидкости, содержащей белок в концентрации 20 мг/мл или больше и 100 мг/мл или меньше, и включает в себя стадию предварительной фильтрации содержащей белок жидкости предварительным фильтром, имеющим размер пор 0,08 мкм – 0,25 мкм и содержащим гидрофобную смолу, и стадию удаления вирусов путем фильтрации содержащей белок жидкости мембраной для удаления вирусов, содержащей синтетический полимер, после стадии предварительной фильтрации, в котором содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации включает в себя 0,25 г или больше тримера или мультимера белков, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм, на 1 м² мембраны для удаления вирусов. Бактерии также могут быть удалены на этой стадии удаления вирусов.

[0037]

Фраза «содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации включает в себя 0,25 г или больше тримера или мультимера белков, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм, на 1 м² мембраны для удаления вирусов», означает, что удовлетворяются следующие два требования.

(1) Средний диаметр тримера или мультимера, получаемого при фракционировании обрабатываемой жидкости с помощью гель–проникающей хроматографии (SEC) и т.п., измеряемый в соответствии со способом динамического светорассеяния (DLS), составляет меньше чем 100 нм.

(2) Количество мультимера, содержащегося в обрабатываемой жидкости, вычисляемое по относительной площади, вычисляемой из площади пика тримера или мультимера на графике, получаемом при фракционирования обрабатываемой жидкости с помощью гель–проникающей хроматографии, общему количеству обрабатываемой жидкости на 1 м² мембраны для удаления вирусов, полной концентрации белков согласно следующему уравнению (1), составляет 0,25 г или больше.

(Количество мультимера на 1 м² мембраны для удаления вирусов: г/м²)

= (Общее количество обрабатываемой жидкости на 1 м²: л/м²) × (Полная концентрация белков: г/л) ×

(Относительная площадь пика тримера или мультимера на графике гель–проникающей хроматографии: %)

/100 (1)

[0038]

В большинстве случаев можно считать, что средний диаметр во фракции, включающей в себя большое количество мультимера, имеет нормальное распределение, и можно считать, что в том случае, когда средний диаметр, измеренный с помощью DLS, составляет менее 100 нм, 50% или больше веществ, включенных в целевой раствор, включают в себя частицы, имеющие диаметр менее 100 нм. Соответственно, можно считать, что большая часть тримера или мультимера белков, включенных в содержащую белок жидкость, удовлетворяющую требованию (1), включает в себя частицы, имеющие средний диаметр менее 100 нм.

[0039]

Содержание и размер тримера или мультимера, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм, включенного в содержащую белок жидкость, могут быть определены с помощью аналитической системы, в которой связаны блок, который обеспечивает фракционирование в зависимости от размера, такой как SEC, аналитический блок, который может количественно определять количество образца, полученного фракционированием, такой как УФ–детектор, и блок, который может анализировать размер, такой как DLS. Например, в соответствии со Справочным документом (Biotechnol. Prog., 2015, Vol. 31, № 3), содержание мультимера, содержащегося в следовом количестве, которое не может быть обнаружено одним УФ–детектором, было идентифицировано с использованием устройства, в котором связаны SEC, УФ–детектор и DLS. Следует отметить, что если концентрация мультимера повышается путем концентрирования и т.п. содержащей белок жидкости, можно определять количество мультимера с помощью одного УФ–детектора.

[0040]

Примерным белком здесь является белок антитела. Белком антитела в качестве одного примера физиологически активного вещества является молекула гликопротеина (также называемого «гамма–глобулин или иммуноглобулин»), который продуцируется В–лимфоцитами в качестве защитного механизма против инфекции позвоночных животных, как это обычно определяют в биохимии. Например, белок антитела, очищенный с помощью одного варианта осуществления, используется в фармацевтических препаратах для человеческого использования, и имеет по существу ту же самую структуру, что и у белка антитела в организме человека, которому он вводится.

[0041]

Белок антитела может быть человеческим белком антитела или белком антитела, полученным из млекопитающего, отличающегося от человека, такого как корова или мышь. Альтернативно белок антитела может быть белком химерного антитела с человеческим IgG, а также белком гуманизированного антитела. Такой белок химерного антитела с человеческим IgG означает белок антитела, в котором в то время, как переменный домен получен из живого организма, отличающегося от человека, такого как мышь, другие постоянные домены заменены иммуноглобулином, полученным из человека. Белок гуманизированного антитела означает белок антитела, в котором в то время, как антигенсвязывающий участок (CDR) в переменном домене получается из живого организма, отличающегося от человека, другие каркасные участки (FR) имеют человеческое происхождение. Белок гуманизированного антитела дополнительно имеет уменьшенную иммуногенность по сравнению с белком химерного антитела.

[0042]

Класс (изотип) и подкласс белка антитела особо не ограничивается. Например, белок антитела классифицируется на пять классов: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE, в зависимости от разности в структуре константного домена. Однако белок антитела, очищаемый способом фильтрации согласно варианту осуществления, может быть любым из этих пяти классов. Белок человеческого антитела классифицируется на четыре подкласса IgG1 – IgG4 класса IgG, а также два подкласса IgA1 и IgA2 класса IgA. Однако подкласс белка антитела, очищаемого способом фильтрации согласно варианту осуществления, может быть любым подклассом. Следует отметить, что связанный с антителом белок, такой как гибридный белок слияния Fc, в котором белок связан с доменом Fc, также может быть включен в белок антитела, очищаемый способом фильтрации согласно варианту осуществления.

[0043]

Белок антитела также может классифицироваться в зависимости от происхождения. Однако белок антитела, очищаемый способом фильтрации согласно варианту осуществления, может быть любым естественным белком человеческого антитела, рекомбинантным белком человеческого антитела, произведенным с помощью технологии генетической рекомбинации, белком моноклонального антитела, а также белком поликлонального антитела. Среди таких белков антитела белок антитела, очищаемый способом фильтрации согласно варианту осуществления, предпочтительно является человеческим IgG или моноклональным антителом с точки зрения потребности и важности лекарственных средств на основе антител, но не ограничивается этим.

[0044]

Концентрация белков в содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром составляет 20 мг/мл или больше, или 25 мг/мл или больше и 100 мг/мл или меньше, 90 мг/мл или меньше, 80 мг/мл или меньше, 70 мг/мл или меньше, 60 мг/мл или меньше или 50 мг/мл или меньше. Содержащая белок жидкость, имеющая концентрацию белка 20 мг/мл или больше, имеет тенденцию к легкому образованию мультимера белков, имеющего диаметр меньше чем 100 нм, а также частиц, имеющих диаметр 100 нм или больше. Например, мультимер белков антител IgG может вызывать серьезные побочные эффекты, поскольку он связывается с комплементом в состоянии несвязанности с антигеном как патоген, и таким образом вызывает аномальную активацию комплемента.

[0045]

Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром может включать в себя мультимер белков. Мультимер белков формируется путем агрегирования множества белковых мономеров. Мультимер белков означает, например, димер и тример белков (который сам по себе может быть связанным продуктом, таким как димер). «Мультимер» в настоящем изобретении конкретно относится к тримеру или мультимеру более высокого порядка. Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром содержит белки, имеющие средний диаметр меньше чем 100 нм, и включает в себя 0,25 г или больше, 0,35 г или больше, 0,50 г или больше, или 0,75 г или больше тримера или мультимера на 1 м² мембраны для удаления вирусов. Если тример или мультимер содержится в количестве 0,25 г или больше, эффект предварительного фильтра, описываемый ниже, имеет тенденцию к более легкому проявлению.

[0046]

Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром может включать в себя вирусы. Вирус имеет, например, диаметр 10 нм или больше и 30 нм или меньше, или 18 нм или больше и 24 нм или меньше. Вирус представляет собой, например, парвовирус. Парвовирус имеет диаметр приблизительно 20 нм. Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром может включать в себя бактерии. Примеры таких бактерий включают в себя род Leptospira, род Bacillus, род Paenibacillus, род Stenotrophomonas, род Ochrobactrum и род Pseudomonas.

[0047]

Растворителем содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром является, например, вода или буферный раствор. Буферный раствор здесь означает водный раствор, содержащий соль, конкретные примеры которого включают в себя фосфатный буфер, трис–буфер и ацетатный буфер, но особо не ограничивается при условии, что он является обычно используемым буфером. Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром может включать в себя, например, сахар и/или основную аминокислоту в качестве добавки (добавок). Добавление сахара, основной аминокислоты и/или подобного им может позволять ингибировать формирование мультимера, приводя к повышению эффективности фильтрации мембраны для удаления вирусов. Показатель ионов водорода (значение pH) содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром составляет, например, 4,0 или больше и 8,0 или меньше, 4,0 или больше и 7,5 или меньше, или 4,0 или больше и 7,0 или меньше. Ионная сила содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром составляет 0 ммоль/л или больше и 300 ммоль/л или меньше, 10 ммоль/л или больше и 280 ммоль/л или меньше, или 20 ммоль/л или больше и 250 ммоль/л или меньше.

[0048]

Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром представляет собой, например, раствор, подвергнутый любой или обеим операциям ультрафильтрации (UF) и диафильтрации (DF). Содержащая белок жидкость, например, подвергается любой или обеим операциям ультрафильтрации и диафильтрации путем использования рециркуляционного фильтра с тангенциальным потоком (с поперечным потоком). Диаобъем при диафильтрации равен, например, четырем. Диаобъем здесь соответствует отношению объема собранного фильтрата к объему удерживаемой жидкости на начальной стадии диафильтрации. Содержащая белок жидкость перед фильтрацией предварительным фильтром может быть механически перемешиваемым раствором или может быть раствором, подвергнутым любой или обеим операциям ультрафильтрации и диафильтрации с перемешиванием. Время перемешивания составляет, например, 2 час или больше, 4 час или больше или 6 час или больше.

[0049]

Когда содержащая белок жидкость фильтруется с помощью по меньшей мере одной из ультрафильтрации и диафильтрации, легко образуются мультимеры белков, имеющие диаметр меньше чем 100 нм, и частицы, имеющие диаметр 100 нм или больше. Мультимеры белков, имеющие диаметр меньше чем 100 нм, и частицы, имеющие диаметр 100 нм или больше, в некоторых случаях могут формироваться также при механическом перемешивании. Стадия инактивации вирусов, отличающаяся от стадия фильтрации мембраной для удаления вирусов, может быть включена в стадию очистки производных плазмы, биопрепаратов и/или им подобного для повышения безопасности против вирусов. Примеры процедуры для использования в таком случае включают в себя обработку нагреванием, обработку при низком значении pH и обработку растворителем/детергентом (в дальнейшем иногда также упоминаемую как «обработка S/D»). Такие способы инактивации включают обеспечение химической или физической нестабильности живых организмов, что приводит к разрушению биоматериалов, которые образуют вирусные частицы, но могут одновременно вызывать денатурацию или агрегацию целевых белков, что приводит к образованию большого количества мультимеров, в том числе частиц, имеющих диаметр более 100 нм. Хотя мультимеры, включающие в себя вещества в виде частиц, возможно, удаляются до стадии удаления вируса в случае, когда выполняются обработка S/D и последующие стадии очистки, такие как стадия хроматографии, существует вероятность того, что раствор белка, включающий вещества в виде частиц, будет попадать в мембрану для удаления вирусов в том случае, когда обработка S/D выполняется на стадии, близкой к стадии удаления вирусов. «Стадия, близкая к стадии удаления вирусов» означает, что стадия обработки S/D выполняется в пределах одной или двух стадий перед стадией удаления вирусов. Известно, что денатурированный белок вызывает денатурирование/агрегацию неденатурированного белка, присутствующего вокруг денатурированного белка. При увеличении концентрации белкового раствора вероятность контакта денатурируемого белка с неденатурируемым белком увеличивается, облегчая тем самым процесс агрегации. Концентрация белкового раствора больше чем 30 мг/мл может не только вызвать заметное уменьшение потока через мембрану для удаления вирусов, сделанную из синтетического полимера, благодаря закупорке, но также может привести к уменьшению потока до такого уровня, на котором фильтрация больше не может осуществляться, даже в присутствии ничтожно малого количества мультимера. Например, мультимер белков антител IgG может вызывать серьезные побочные эффекты, поскольку он связывается с комплементом в состоянии несвязанности с антигеном как патоген, и вызывает аномальную активацию комплемента. В дополнение к этому, сообщалось, что мембрана для удаления вирусов, хотя по существу не блокирует белок и позволяет ему проникать, разделяет вирус и белок, имеющие близкие размеры, множеством слоев, каждый из которых имеет такое распределение пор по размерам, которое позволяет частично блокировать вирусы (Masanobu YOKOGI, «Virus Separation by Cellulose Hollow Fiber Membrane», Sen'i To Kogyo, vol. 55 (1999), No. 10, pp. 338–342). Однако если присутствуют частицы, имеющие размер, равный или больше чем размер вируса, такие как мультимеры белков, есть вероятность того, что мультимеры будут захватываться в порах, имеющих размер, подходящий для захвата вирусов, что будет приводить к увеличению вероятности попадания вируса в фильтрат.

[0050]

Предварительный фильтр, который фильтрует содержащую белок жидкость, является, например, листовым фильтром. Предварительный фильтр имеет размер пор 0,08 мкм или больше, или 0,10 мкм или больше, и 0,25 мкм или меньше, или 0,20 мкм или меньше. Предварительный фильтр содержит, например, гидрофобную смолу, такую как полиамидная смола, смола на основе полисульфона и фторкаучук. Без привязки к какой–либо конкретной теории, предполагается, что такая гидрофобная смола гидрофобным образом взаимодействует с мультимером белков и адсорбирует мультимер. Полиамид (PA), полиэфирсульфон или поливинилиденфторид являются предпочтительными, и поливинилиденфторид является более предпочтительным с точки зрения адсорбции белка. Поскольку предварительный фильтр имеет размер пор 0,08 мкм или больше, возможно фильтровать белковые мономеры в содержащей белок жидкости при высокой проницаемости, приводящей к повышению скорости извлечения белков. Предварительный фильтр имеет больший размер пор, чем размер мультимера, позволяя тем самым предотвращать забивание предварительного фильтра мультимером на ранней стадии. Кроме того, предварительный фильтр обладает гидрофобным взаимодействием, позволяя тем самым удалять тример или мультимер белков из содержащей белок жидкости даже в том случае, когда предварительный фильтр имеет больший размер пор, чем размер мультимера, что приводит к повышению эффективности при последующей фильтрации и свойств удаления вирусов мембраны для удаления вирусов. Если раствор содержит частицы, мультимеры, расположенные вокруг частиц, могут вступать в контакт с частицами, и таким образом удаляться предварительным фильтром вместе с частицами, приводя к повышению фильтруемого потока и способности к удалению вирусов мембраны для удаления вирусов. Предварительный фильтр имеет размер пор 0,25 мкм или меньше, что приводит к увеличению удельной площади поверхности и увеличению поверхности контакта с мультимерами, позволяя тем самым обеспечивать достаточную площадь для адсорбции мультимеров. В том случае, когда содержащая белок жидкость включает в себя большое количество мультимеров, предварительный фильтр может использоваться в комбинациях из двух или более его видов, или множество таких фильтров может быть соединено. В таком случае общая площадь, требуемая для предварительного фильтра, может быть определена, если заранее известно количество содержащихся мультимеров, а также количество мультимеров, подлежащих удалению используемым предварительным фильтром.

[0051]

Предварительный фильтр может включать в себя однослойную мембрану или многослойную мембрану, включающую два или три слоя. В том случае, когда предварительный фильтр включает в себя многослойную мембрану, соответствующие слои могут иметь один и тот же размер пор или различные размеры пор. Например, размеры пор всех трех слоев могут быть равны 0,1 мкм.

[0052]

Предварительный фильтр может стерилизоваться паром перед использованием. Давление при фильтрации содержащей белок жидкости предварительным фильтром составляет, например, 25 кПа (0,25 бар) или меньше. Предварительный фильтр может стерилизоваться на месте. Стерилизация на месте может предотвращать загрязнение бактериями и т.п. после стадии очистки, такой как ультрафильтрация или диафильтрация, позволяя тем самым гарантировать безопасность препарата. Стерилизация на месте относится к стерилизации внутренности устройства без его разборки.

[0053]

Частицы и тримеры или мультимеры белков в содержащей белок жидкости частично удаляются фильтрацией через предварительный фильтр, в соответствии как с исключением по размеру, так и благодаря гидрофобному взаимодействию. Исключение по размеру в настоящем изобретении означает, что частицы, имеющие больший размер, чем размер пор фильтра, захватываются фильтром, и таким образом удаляются из содержащей белок жидкости. Мультимеры, которые являются тримерами или мультимерами более высокого порядка, и которые имеют диаметр менее 100 нм, удаляются из содержащей белок жидкости предварительным фильтром, включающим в себя гидрофобную смолу. Вирусы, имеющие размер 50 нм или меньше, находящиеся в содержащей белок жидкости, обычно проникают через предварительный фильтр. Вязкость содержащей белок жидкости, отфильтрованной предварительным фильтром, в некоторых случаях может быть более низкой, чем вязкость содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром.

[0054]

Фильтрация содержащей белок жидкости предварительным фильтром может выполняться после ультрафильтрации (UF), диафильтрации (DF) или фильтрации с тангенциальным потоком (поперечным потоком).

[0055]

Как проиллюстрировано на Фиг. 1, мембрана 10 для удаления вирусов из содержащей белок жидкости, отфильтрованной предварительным фильтром, имеет первичную поверхность 1, с которой контактирует содержащая белок жидкость, и вторичную поверхность 2, из которой вытекает жидкость, проникшая через мембрану 10 для удаления вирусов.

[0056]

Мембрана 10 для удаления вирусов имеет в своем поперечном сечении зону захвата вирусов, где захватываются вирусы. Количество вирусов, захваченных на зоне захвата вирусов в поперечном сечении, предпочтительно является однородным независимо от точки на поверхности фильтрации (первичной поверхности 1), через которую входит раствор. Причина этого состоит в том, что если количество вирусов, захваченных в мембране для удаления вирусов, является неоднородным в зависимости от точки на поверхности фильтрации, раствор концентрируется в некоторой точке на поверхности фильтрации, частично увеличивая количество вирусов в этой точке, и таким образом вирусы могут просочиться из этой точки при высокопроизводительной фильтрации в условиях высокого давления. В том случае, когда мембрана 10 для удаления вирусов имеет форму мембраны из полого волокна, количество вирусов, захваченных на зоне захвата вирусов, не является неоднородным, как проиллюстрировано на Фиг. 2, но предпочтительно однородным, как проиллюстрировано на Фиг. 3, в направлении периферии.

[0057]

Кроме того, в мембране 10 для удаления вирусов толщина зоны захвата вирусов предпочтительно является однородной. В том случае, когда мембрана 10 для удаления вирусов имеет форму мембраны из полого волокна, толщина зоны захвата вирусов предпочтительно является однородной в направлении периферии. В том случае, когда толщина зоны захвата вирусов является однородной, раствор может быть равномерно распределен в направлении периферии для уменьшения просачивания вирусов.

[0058]

Здесь может быть трудно визуально обнаружить вирусы, захваченные мембраной 10 для удаления вирусов. С другой стороны, коллоид золота не позволяет проходить свету, даже когда он имеет диаметр, сопоставимый с размером вируса, и поэтому он легко обнаруживается визуально. Следовательно, характеристики мембраны 10 для удаления вирусов могут быть оценены, например, путем фильтрования содержащего коллоид золота раствора мембраной 10 для удаления вирусов с последующим измерением относительной яркости зоны захвата коллоида золота, где коллоиды золота захватываются мембраной 10 для удаления вирусов, в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов.

[0059]

Что касается мембраны 10 для удаления вирусов, когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм, проходит через первичную поверхность 1 в мембрану 10 для удаления вирусов для захвата коллоидов золота для измерения яркости в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов, значение, получаемое путем деления стандартного отклонения значения площади спектра вариации в яркости на среднее значение площади спектра вариации в яркости, составляет 0,01 или больше и 1,50 или меньше. Это значение выражает коэффициент вариации количества коллоидов золота, захваченных в мембране 10 для удаления вирусов, и меньшее значение выражает более высокую однородность количества захваченных коллоидов золота на зоне захвата коллоида золота в мембране 10 для удаления вирусов.

[0060]

В мембране 10 для удаления вирусов значение, обозначающее коэффициент вариации, составляет 0,01 или больше и 1,50 или меньше, 0,01 или больше и 1,20 или меньше, 0,01 или больше и 1,00 или меньше, 0,01 или больше и 0,90 или меньше, или 0,01 или больше и 0,80 или меньше. Предел измерения коэффициента вариации составляет менее чем 0,01. Коэффициент вариации больше чем 1,50 может вызывать концентрирование раствора по меньшей мере в некоторой точке в направлении периферии мембраны, приводя тем самым к просачиванию вирусов.

[0061]

Если коэффициент вариации равен 0,01 или больше и 1,50 или меньше, это может обеспечить равномерный захват вирусов на зоне захвата вирусов мембраны (в направлении периферии относительно мембраны из полого волокна), и обеспечить поддержание высокой способности к удалению вирусов даже в случае увеличения общего количества вирусов, загружаемого в мембрану для удаления вирусов (количества вирусов, прикрепленных к белковому препарату, или их общего количества, подлежащего фильтрации).

[0062]

Коэффициент вариации измеряется, например, с помощью следующего способа. Образец вырезается из мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации раствора коллоида золота, и профиль яркости в каждой из множества точек в части, окрашенной коллоидами золота в поперечном сечении этого образца, измеряется с помощью оптического микроскопа. Коллоиды золота поглощают свет, и поэтому вариация яркости зависит от количества захваченных коллоидов золота. Здесь фоновый шум может быть в случае необходимости удален из профиля яркости. После этого строится график с толщиной по горизонтальной оси и вариацией яркости по вертикальной оси, и вычисляется площадь спектра вариации яркости, представленного этим графиком. Кроме того, значение, получаемое путем деления стандартного отклонения площади спектра вариации яркости на множестве точек на среднее значение площади спектра вариации яркости на этом множестве точек, вычисляется в качестве значения, указывающего коэффициент вариации количества захваченных коллоидов золота на зоне захвата коллоида золота в мембране 10 для удаления вирусов.

[0063]

Толщина зоны (плотного слоя), где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов во влажном состоянии, составляет 10 мкм или больше и 30 мкм или меньше, 10 мкм или больше и 29 мкм или меньше, 10 мкм или больше и 28 мкм или меньше, 10 мкм или больше и 20 мкм или меньше, 11 мкм или больше и 20 мкм или меньше, или 12 мкм или больше и 20 мкм или меньше. Если толщина зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, составляет больше чем 30 мкм, это указывает на то, что поры, имеющие большой размер, через которые могут пройти коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, присутствуют в большом количестве, и что распределение размера пор таким образом является широким. Следовательно, возможность утечки вирусов увеличивается при низком давлении фильтрации (скорости потока) и/или при остановке и начале или при пост–промывке, включающей сброс давления. С другой стороны, когда толщина зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, составляет меньше чем 10 мкм, это указывает на то, что поры, через которую могут пройти коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, присутствуют в небольшом количестве, и что распределение размера пор является таким образом узким. Следовательно, забивание белками и т.п. может происходить в узкой области, увеличивая тем самым снижение скорости фильтрации во время фильтрации и приводя к снижению окончательной производительности, и таким образом такая толщина является нежелательной.

[0064]

Толщина зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, определяется, например, следующим способом. Образец вырезается из мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации каждого из соответствующих растворов коллоидов золота, имеющих диаметры 20 нм и 30 нм. Профиль яркости в каждой из множества точек в части, окрашенной коллоидами золота в поперечном сечении этого образца, измеряется с помощью оптического микроскопа. В настоящем документе первое расстояние «a» от первичной поверхности 1 мембраны 10 для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая является самой близкой к первичной поверхности, измеряется в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «b» от первичной поверхности 1 мембраны 10 для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая является самой близкой ко вторичной поверхности 2, измеряется в направлении толщины.

[0065]

Затем значение «A» (= a/c (в процентах)), получаемое путем деления первого расстояния «a» на толщину «c» влажной мембраны для удаления вирусов и выражаемое в процентах, вычисляется в каждой из множества точек, и среднее значение «A» для этого множества точек вычисляется как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «B» (= b/c (в процентах)), получаемое путем деления второго расстояния «b» на толщину «c» влажной мембраны для удаления вирусов и выражаемое в процентах, вычисляется в каждой из множества точек, и среднее значение «В» для этого множества точек вычисляется как второй достигаемый уровень.

[0066]

Кроме того, как представлено следующим уравнением (2), значение, получаемое путем умножения разности между средним значением B₂₀ второго достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и средним значением A₃₀ первого достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, на среднее значение C_AVE среднего значения C₂₀ толщины влажной мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и среднего значения C₃₀ толщины влажной мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, вычисляется как толщина «T» зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов при пропускании через нее коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм. Толщина «T» зоны захвата коллоида золота также выражается как толщина «T» плотного слоя мембраны для удаления вирусов.

T= (B₂₀ – A₃₀) × C_AVE (2)

В вышеописанном способе зона, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, определяется как толщина области между первым достигаемым положением в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, и вторым достигаемым положением в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и было подтверждено, что коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, с учетом предела погрешности, захватываются внутри этой области.

[0067]

Толщина зоны (самого плотного слоя), где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов во влажном состоянии, предпочтительно составляет 2 мкм или больше и 10 мкм или меньше, более предпочтительно 3 мкм или больше и 10 мкм или меньше. Когда толщина такой зоны захвата коллоида золота составляет больше чем 10 мкм, эффективность фильтрации не только содержащего коллоид золота раствора, но также и содержащего вирус раствора имеет тенденцию к уменьшению. Толщина меньше чем 2 мкм не является предпочтительной, потому что увеличение общего количества вирусов, загружаемых в мембрану для удаления вирусов (количество вирусов, присоединяющихся к белковому препарату, или их общее количество, подлежащее фильтрации), и вариация в давлении фильтрации в течение операции, могут вызывать утечку вирусов.

[0068]

Толщина зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, определяется, например, следующим способом. Образец вырезается из мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации раствора коллоида золота, имеющего диаметр 15 нм. Профиль яркости в каждой из множества точек в части, окрашенной коллоидами золота в поперечном сечении этого образца, измеряется с помощью оптического микроскопа. В настоящем документе первое расстояние «d» от первичной поверхности 1 мембраны 10 для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая является самой близкой к первичной поверхности, измеряется в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «e» от первичной поверхности 1 мембраны 10 для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая является самой близкой ко вторичной поверхности 2, измеряется в направлении толщины.

[0069]

Затем значение «D» (= d/f (в процентах)), получаемое путем деления первого расстояния «d» на толщину «f» влажной мембраны для удаления вирусов и выражаемое в процентах, вычисляется в каждой из множества точек, и среднее значение «D» для этого множества точек вычисляется как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «E» (= e/f (в процентах)), получаемое путем деления второго расстояния «e» на толщину «f» влажной мембраны для удаления вирусов и выражаемое в процентах, вычисляется в каждой из множества точек, и среднее значение «E» для этого множества точек вычисляется как второй достигаемый уровень.

[0070]

Кроме того, как представлено следующим уравнением (3), значение, получаемое путем умножения разности между средним значением «E» второго достигаемого уровня и средним значением «D» первого достигаемого уровня на среднее значение «F» толщины используемой для фильтрации мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычисляется как толщина «T» зоны, в которой захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов. Толщина «T» зоны, в которой захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, также выражается как толщина «T» самого плотного слоя мембраны для удаления вирусов.

T= (E – D) × F (3)

[0071]

Когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 30 нм, фильтруется мембраной 10 для удаления вирусов, зона, где коллоиды золота, имеющие диаметр 30 нм, захватываются в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов во влажном состоянии, располагается в месте, соответствующем, например, 15% или больше и 60% или меньше, или 20% или больше и 55% или меньше толщины мембраны от первичной поверхности 1 при измерении оптическим микроскопом. Значение меньше чем 15% толщины мембраны заставляет вирусы и примеси быть захваченными в положении ближе к первичной поверхности мембраны, и происходит еще большая закупорка. Значение больше чем 60% толщины мембраны приводит к захвату вирусов в положении ближе ко вторичной поверхности мембраны, и таким образом вирусы могут иногда не захватываться. Здесь, даже в том случае, когда небольшое количество коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, захватывается в области меньше чем 15% или больше чем 60% мембранной толщины от первичной поверхности 1, случай, когда абсолютное значение спектра вариации яркости, определяемое путем вычитания профиля яркости, измеренного от константы (255) при измерении с помощью оптического микроскопа, составляет 10% или меньше относительно максимума абсолютного значения спектра, может рассматриваться как находящийся внутри пределов погрешности относительно захвата коллоидов золота в этой области в терминах способности к удалению вирусов этой мембраны для удаления вирусов, и поэтому можно считать, что зона, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 30 нм, располагается в месте, соответствующем 15% или больше и 60% или меньше толщины мембраны от первичной поверхности 1.

[0072]

Когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм, фильтруется мембраной 10 для удаления вирусов, зона, где коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм, захватываются в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов во влажном состоянии, располагается в месте, соответствующем, например, 25% или больше и 85% или меньше, или 30% или больше и 85% или меньше толщины мембраны от первичной поверхности 1 при измерении оптическим микроскопом. Значение меньше чем 25% толщины мембраны заставляет вирусы и примеси быть захваченными в положении ближе к первичной поверхности мембраны, и происходит еще большая закупорка. Значение больше чем 85% толщины мембраны приводит к захвату вирусов в положении ближе ко вторичной поверхности мембраны, и таким образом вирусы могут иногда не захватываться. В настоящем документе, даже когда коллоиды золота наблюдаются в области меньше чем 25% или больше чем 85% толщины мембраны от первичной поверхности 1, как в случае коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, случай, когда абсолютное значение спектра вариации яркости, определяемое путем вычитания профиля яркости, измеренного от константы (255) при измерении с помощью оптического микроскопа, составляет 10% или меньше относительно максимума абсолютного значения спектра, может рассматриваться как находящийся внутри пределов погрешности.

[0073]

Когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, фильтруется мембраной 10 для удаления вирусов, зона, где коллоиды золота, имеющие диаметр 15 нм, захватываются в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов во влажном состоянии, располагается в месте, соответствующем, например, 60% или больше и 100% или меньше, или 65% или больше и 100% или меньше толщины мембраны от первичной поверхности 1 при измерении оптическим микроскопом. Значение меньше чем 60% толщины мембраны заставляет вирусы и примеси быть захваченными в положении ближе к первичной поверхности мембраны, и происходит еще большая закупорка. В настоящем документе, даже когда коллоиды золота наблюдаются в области меньше чем 60% толщины мембраны от первичной поверхности 1, как в случаях коллоидов золота, имеющих диаметры 30 нм и 20 нм, случай, когда абсолютное значение спектра вариации яркости, определяемое путем вычитания профиля яркости, измеренного от константы (255) при измерении с помощью оптического микроскопа, составляет 10% или меньше относительно максимума абсолютного значения спектра, может рассматриваться как находящийся внутри пределов погрешности.

[0074]

Положение захвата каждого из соответствующих коллоидов золота, имеющих диаметры 30 нм, 20 нм и 15 нм, последовательно измеряется относительно коллоидов золота, захваченных мембраной. Соответственно, коллоиды золота, которые не захвачены мембраной и проникают через мембрану, не измеряются. Другими словами, положение захвата каждого коллоида золота, входящего в мембрану, не измеряется, но положение захвата на мембране коллоидов золота, захваченных мембраной, измеряется.

[0075]

В том случае, когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 10 нм, фильтруется мембраной 10 для удаления вирусов, почти никакие коллоиды золота, имеющие диаметр 10 нм, не захватываются в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов. Это может быть подтверждено следующим: спектр яркости не может быть значимо обнаружен при наблюдении с использованием оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). Это также может быть подтверждено уменьшением логарифмического коэффициента удаления (LRV), который будет описан позже. В настоящем документе то, что никакие коллоиды золота, имеющие диаметр 10 нм, не захватываются, означает, что полезный белок, имеющий диаметр приблизительно 10 нм, такой как IgG, может достигать высокой проницаемости.

[0076]

Синтетический полимер в качестве материала мембраны для удаления вирусов предпочтительно является термопластической кристаллической смолой, которая легко обрабатывается, например сжатием, экструдированием, литьем под давлением, раздуванием и формованием с раздувом, и обладает превосходной стойкостью к давлению при фильтрации. В частности, полиолефиновая смола и фторкаучук являются предпочтительными благодаря их сбалансированным термостойкости и формуемости, и в частности смола поливинилиденфторида является предпочтительной.

[0077]

В настоящем документе такая гидрофобная термопластическая кристаллическая смола вызывает адсорбцию белков и т.п., приводя к быстрому загрязнению, закупорке и т.п. мембраны, и соответственно к быстрому уменьшению скорости фильтрации. Следовательно, в том случае, когда гидрофобная смола используется в качестве материала мембраны для удаления вирусов, гидрофильность придается мембране для того, чтобы предотвратить окклюзию благодаря адсорбции белков и т.п. Для того, чтобы придать гидрофильность, предпочтительно, чтобы мембрана имела гидрофильные цепи, привитые способом графт–полимеризации.

[0078]

Мембрана 10 для удаления вирусов имеет, например, форму мембраны из полого волокна. Альтернативно мембрана 10 для удаления вирусов может иметь форму плоской мембраны, как проиллюстрировано на Фиг. 4. Мембрана предпочтительно представляет собой мембрану в виде полого волокна, потому что она может быть упакована в контейнер для того, чтобы изготовить компактный фильтр, имеющий большую площадь мембраны.

[0079]

Толщина мембраны 10 для удаления вирусов, показанной на Фиг. 1, в сухом состоянии составляет, например, 40,0 мкм или больше и 60,0 мкм или меньше, и более предпочтительно 42,0 мкм или больше и 55,0 мкм или меньше. Толщина мембраны меньше чем 40,0 мкм может привести к уменьшению прочности мембраны, так что она не сможет выдерживать давление фильтрации, а толщина мембраны больше чем 60,0 мкм может привести к уменьшению скорости фильтрации.

[0080]

Размер пор уменьшается и становится постоянным от первичной поверхности к вторичной поверхности в поперечном сечении мембраны 10 для удаления вирусов, и мембрана 10 для удаления вирусов предпочтительно имеет самый плотный слой около внешнего слоя вблизи от вторичной поверхности. Поскольку мембрана 10 для удаления вирусов имеет самый плотный слой около внешнего слоя, утечка вирусов при низком давлении фильтрации (скорости потока) и/или при фильтрации в стартстопной системе или в системе с пост–промывкой может быть уменьшена еще больше.

[0081]

Логарифмический коэффициент удаления (LRV) вирусов мембраной 10 для удаления вирусов предпочтительно составляет, например, 4,00 или больше, потому что вирусы в достаточной степени удалены мембранной фильтрацией, и логарифмический коэффициент удаления более предпочтительно составляет 4,50 или больше, 5,00 или больше, или 6,00 или больше. Считается, что логарифмический коэффициент удаления вирусов, равный 6,00 или больше, позволяет удалять вирусы, что практически приводит к отсутствию утечки вирусов.

[0082]

Мембрана 10 для удаления вирусов имеет логарифмический коэффициент удаления (LRV) коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, составляющий, например, 1,00 или больше, предпочтительно 1,20 или больше. Мембрана 10 для удаления вирусов имеет логарифмический коэффициент удаления коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, составляющий, например, 1,00 или больше, предпочтительно 1,20 или больше. Мембрана 10 для удаления вирусов имеет логарифмический коэффициент удаления коллоидов золота, имеющих диаметр 15 нм, составляющий, например, 0,10 или больше, предпочтительно 0,20 или больше. Мембрана 10 для удаления вирусов имеет логарифмический коэффициент удаления коллоидов золота, имеющих диаметр 10 нм, составляющий, например, меньше чем 0,10.

[0083]

Давление появления пузырьков, измеренное в мембране 10 для удаления вирусов, составляет, например, 1,30 МПа или больше и 1,80 МПа или меньше, более предпочтительно 1,40 МПа или больше и 1,80 МПа или меньше, 1,45 МПа или больше и 1,80 МПа или меньше, или 1,50 МПа или больше и 1,80 МПа или меньше. Характеристики мембраны для удаления вирусов могут также выражаться как отношение давления появления пузырьков (МПа) к поверхностному натяжению (Н/м) растворителя, используемого для измерения. В том случае, когда гидрофторэфир, имеющий поверхностное натяжение 13,6 мН/м, используется в качестве тестовой жидкости для погружения мембраны, отношение давления появления пузырьков к поверхностному натяжению составляет 96 или больше и 133 или меньше, более предпочтительно 103 или больше и 133 или меньше, 106 или больше и 133 или меньше, или 110 или больше и 133 или меньше.

[0084]

Давление появления пузырьков 1,30 МПа или меньше означает, что присутствуют поры, имеющие большой размер, что является нежелательным, потому что ухудшение свойств удаления вирусов наблюдается при условиях, включающих (1) стадию уменьшения уровня давления, (2) стадию временного прерывания фильтрации для повторного создания давления (стартстопный режим), или (3) стадию временного прерывания фильтрации после фильтрации препарата для промывки буфером (пост–промывки), в частности при использовании мембраны для удаления вирусов. Давление появления пузырьков 1,80 МПа или больше означает, что присутствуют поры, имеющие малый размер, что является нежелательным, потому что скорость проникновения чистой воды уменьшается.

[0085]

Скорость проникновения чистой воды, измеренная в мембране 10 для удаления вирусов, составляет 30 л/м²/час/0,1 МПа или больше и 80 л/м²/час/0,1 МПа или меньше, 30 л/м²/час/0,1 МПа или больше и 60 л/м²/час/0,1 МПа или меньше, или 30 л/м²/час/0,1 МПа или больше и 55 л/м²/час/0,1 МПа или меньше.

[0086]

Мембрана для удаления вирусов может стерилизоваться паром перед использованием. Содержащая белок жидкость, подвергнутая предварительной фильтрации предварительным фильтром, фильтруется мембраной для удаления вирусов, и таким образом вирусы, имеющиеся в содержащей белок жидкости, удаляются. Частицы и мультимеры белков, оставшиеся в содержащей белок жидкости, также удаляются.

[0087]

Способ фильтрации может не включать в себя других стадий между стадией предварительной фильтрации предварительным фильтром и стадией удаления вирусов. Таким образом, соответствующие стадии могут выполняться в периодическом режиме. Стадия предварительной фильтрации и стадия удаления вирусов могут также выполняться последовательным образом. В том случае, когда стадия предварительной фильтрации и стадия удаления вирусов выполняются последовательным образом, образование мультимеров белков с течением времени имеет тенденцию к снижению, что приводит к повышению эффективности фильтрации мембраной для удаления вирусов.

[0088]

Мембрана для удаления вирусов, имеющая вышеописанные характеристики, производится, например, с помощью описываемого ниже способа.

[0089]

Термопластическая смола для использования в качестве материала мембраны для удаления вирусов представляет собой, например, термопластическую смолу, обладающую кристалличностью, для использования в обычных процессах прессования, экструдирования, литья под давлением, раздувания и формования с раздувом. Например, могут использоваться полиолефиновые смолы, такие как полиэтиленовая смола, полипропиленовая смола и поли–4–метил–1–пентеновая смола, полиэфирные смолы, такие как смола полиэтилентерефталата, смола полибутилентерефталата, смола полиэтилентеренафталата, смола полибутиленнафталата и смола полициклогексилендиметилентерефталата, полиамидные смолы, такие как нейлон 6, нейлон 66, нейлон 610, нейлон 612, нейлон 11, нейлон 12 и нейлон 46, фторкаучуки, такие как смола поливинилиденфторида, смола этилен/тетрафторэтилена и смола политетрафторэтилена, полифениленэфирная смола и полиацетальная смола.

[0090]

Из вышеупомянутых термопластических смол полиолефиновая смола и фторкаучук являются предпочтительными благодаря их сбалансированным термостойкости и формуемости, и в частности смола поливинилиденфторида является предпочтительной. Смола поливинилиденфторида здесь относится к фторкаучуку, который имеет блок винилиденфторида в основной цепи, и обычно обозначается аббревиатурой «PVDF». В качестве такой смолы поливинилиденфторида может использоваться гомополимер винилиденфторида (VDF) или сополимер одного или более мономеров, выбираемых из группы мономеров, состоящей из гексафторпропилена (HFP), пентафторпропилена (PFP), тетрафторэтилена (TFE), хлортрифторэтилена (CTFE) и перфторметилвинилового эфира (PFMVE) с винилиденфторидом (VDF). Гомополимер и сополимер могут также использоваться в виде их смеси. В этом варианте осуществления предпочтительно использовать смолу поливинилиденфторида, включающую 30 мас.% или больше и 100 мас.% или меньше гомополимера, потому что микропористая мембрана при этом имеет улучшенную кристалличность, и соответственно высокую прочность, и еще более предпочтительно использовать только гомополимер.

[0091]

Средняя молекулярная масса термопластической смолы для использования в этом варианте осуществления предпочтительно составляет 50000 или больше и 5000000 или меньше, более предпочтительно 100000 или больше и 2000000 или меньше, и еще более предпочтительно 150000 или больше и 1000000 или меньше. В то время как средняя молекулярная масса относится к средневесовой молекулярной массе, полученной с помощью гель–проникающей хроматографии (GPC), обычно трудно выполнить точное измерение с помощью GPC смолы, имеющей среднюю молекулярную массу больше чем 1000000, и таким образом средневязкостная молекулярная масса, получаемая способом измерения вязкости, может быть принята в качестве альтернативы. Средневесовая молекулярная масса меньше чем 50000 является нежелательной, поскольку вызывает уменьшение натяжения расплава при формовании из расплава, что приводит к ухудшению формуемости или снижению механической прочности мембраны. Средневесовая молекулярная масса больше чем 5000000 является нежелательной, поскольку затрудняет равномерное перемешивание в расплаве.

[0092]

Концентрация полимера в термопластической смоле для использования в этом варианте осуществления в композиции, включающей в себя термопластическую смолу и пластификатор, предпочтительно составляет 20 мас.% или больше и 90 мас.% или меньше, более предпочтительно 30 мас.% или больше и 80 мас.% или меньше, и наиболее предпочтительно 35 мас.% или больше и 70 мас.% или меньше. Концентрация полимера меньше чем 20 мас.% приводит к следующим недостаткам: ухудшается способность к образованию мембраны, и не достигается достаточная механическая прочность. В дополнение к этому, получаемая в результате микропористая мембрана имеет большой размер пор для мембраны для удаления вирусов, делая способность к удалению вирусов недостаточной. Концентрация полимера больше чем 90 мас.% приводит к тому, что получаемая микропористая мембрана имеет слишком малый размер пор и низкую пористость, приводя тем самым к уменьшению скорости фильтрации и непригодности для практического применения.

[0093]

В качестве пластификатора в этом варианте осуществления используется нелетучий растворитель, который при смешивании с термопластической смолой в композиции для производства микропористой мембраны может формировать однородный раствор при температуре не ниже, чем температура плавления кристаллов смолы. Нелетучий растворитель здесь относится к растворителю, имеющему температуру кипения 250,0°C или выше при атмосферном давлении. Пластификатор может обычно иметь форму жидкости или твердого вещества при обычной температуре 20,0°C. Пластификатор так называемой системы разделения твердой и жидкой фаз, который имеет термически индуцируемую точку разделения твердой и жидкой фаз при температуре не ниже обычной температуры при охлаждении однородного раствора с термопластической смолой, предпочтительно используется с точки зрения производства мембраны для использования в удалении вирусов, которая имеет малый размер пор и однородный слой плотной структуры. Некоторые из пластификаторов имеют термически индуцируемую точку разделения жидких фаз при температуре не ниже обычной температуры при охлаждении однородного раствора с термопластической смолой, и в том случае, когда используется пластификатор системы разделения жидких фаз, получаемая микропористая мембрана обычно имеет большой размер пор. Используемый пластификатор может быть одиночным веществом или смесью множества веществ.

[0094]

В способе для измерения термически индуцируемой точки разделения твердой и жидкой фаз термически индуцируемая точка разделения твердой и жидкой фаз может быть определена путем использования в качестве образца композиции, включающей термопластическую смолу и пластификатор, и имеющей предопределенную концентрацию, заранее мешенной в расплаве, и измерения экзотермической пиковой температуры смолы с помощью термического анализа (DSC). В способе для измерения температуры кристаллизации смолы температура кристаллизации может быть определена путем использования в качестве образца смолы, заранее мешенной в расплаве, и аналогичного проведения термического анализа.

[0095]

Пластификатор, предпочтительно используемый для производства мембраны для удаления вирусов, которая имеет малый размер пор и однородный слой плотной структуры, включает в себя пластификатор, раскрытый в международном патентном документе WO 01/28667. Такой пластификатор имеет константу понижения точки разделения фаз композиции, определяемую следующим уравнением (4), равную 0,0°C или больше и 40,0°C или меньше, предпочтительно 1,0°C или больше и 35,0°C или меньше, и еще более предпочтительно 5,0°C или больше и 30,0°C или меньше. Константа понижения точки разделения фаз больше чем 40,0°C является нежелательной из–за того, что она приводит к уменьшению однородности размера пор и прочности.

α=100 × (Tc₀ – Tc)/(100–C) (4)

где α представляет константу понижения температуры разделения фаз (°C), Tc₀ представляет температуру кристаллизации (°C) термопластической смолы, Tc представляет термически индуцируемую точку разделения твердой и жидкой фаз композиции (°C), и C представляет концентрацию (мас.%) термопластической смолы в композиции.

[0096]

Например, в том случае, когда смола поливинилиденфторида выбирается в качестве термопластической смолы, особенно предпочтительными являются дициклогексилфталат (DCHP), диамилфталат (DAP), трифенилфосфат (TPP), дифенилкрезилфосфат (CDP), трикрезилфосфат (TCP) и т.п.

[0097]

В этом варианте осуществления первый способ для равномерного растворения композиции, включающей термопластическую смолу и пластификатор, включает в себя загрузку смолы в устройство непрерывного мешения смолы, такое как экструдер, и введение пластификатора в любом соотношении при одновременном нагревании и плавлении смолы для шнекового мешения с тем, чтобы обеспечить однородный раствор. Загружаемая смола может иметь любую форму из порошка, гранул и таблеток. В том случае, когда однородное растворение достигается с помощью такого способа, пластификатор предпочтительно имеет форму жидкости при обычной температуре. В качестве экструдера может использоваться одношнековый экструдер, двухшнековый экструдер с противоположными направлениями вращения шнеков, двухшнековый экструдер с одинаковыми направлениями вращения шнеков и т.п.

[0098]

Второй способ для равномерного растворения композиции, включающей термопластическую смолу и пластификатор, включает в себя использование мешалки, такой как мешалка Henschel, для предварительного смешивания смолы и пластификатора с тем, чтобы их диспергировать, и загрузку получаемой композиции в устройство непрерывного мешения смолы, такое как экструдер для мешения в расплаве, чтобы обеспечить тем самым однородный раствор. Загружаемая композиция может иметь форму густой суспензии в том случае, когда пластификатор имеет форму жидкости при обычной температуре, или может иметь форму порошка или гранул в том случае, когда пластификатор является твердым при обычной температуре.

[0099]

Третий способ для равномерного растворения композиции, включающей термопластическую смолу и пластификатор, использует устройство для простого мешения смолы, такое как смеситель Brabender или мельница, или выполняет мешение расплава внутри другого сосуда для мешения периодического действия. Этот способ включает в себя периодическую стадию и имеет преимущества простоты и высокой гибкости.

[0100]

В этом варианте осуществления композиция, включающая термопластическую смолу и пластификатор, нагревается до температуры не ниже, чем точка плавления кристаллов термопластической смолы, и равномерно растворяется, затем экструдируется в форме плоской мембраны или полого волокна через выпускное отверстие Т–образной экструзионной головки, кольцевой экструзионной головки, кольцевой фильеры и т.п., а затем охлаждается и отверждается для того, чтобы формовать мембрану (стадия (a)). На стадии (a) формования мембраны охлаждением и отверждением формируется слой плотной структуры, а также формируется слой грубой структуры, смежный с поверхностью мембраны.

[0101]

В этом варианте осуществления, в то время как композиция, которая включает в себя термопластическую смолу и пластификатор и равномерно нагревается для растворения, выпускается через выпускное отверстие и принимается как мембрана через часть воздушного зазора с некоторой скоростью приемки так, чтобы отношение вытягивания, определяемое следующим уравнением (5), было равно 1,0 или больше и 12,0 или меньше, одна поверхность мембраны контактирует с нелетучей жидкостью при температуре 100,0°C или выше, которая может частично растворять термопластическую смолу, а другая поверхность мембраны охлаждается, чтобы тем самым сформировать слой грубой структуры и слой плотной структуры в мембране.

Отношение вытягивания = (скорость приемки мембраны) / (скорость выпуска композиции в выпускном отверстии) (5)

[0102]

Отношение вытягивания предпочтительно составляет 1,5 или больше и 9,0 или меньше, более предпочтительно 1,5 или больше и 7,0 или меньше. Отношение вытягивания меньше чем 1,0 приводит к тому, что натяжение не воздействует на мембрану, что приводит к ухудшению формуемости, а отношению вытягивания больше чем 12,0 приводит к растяжению мембраны, что затрудняет формирование слоя грубой структуры, имеющего достаточную толщину. Скорость выпуска композиции в выпускном отверстии в уравнении (5) определяется следующим уравнением (6).

Скорость выпуска композиции в выпускном отверстии = (объем композиции, выпускаемой за единицу времени) / (площадь выпускного отверстия) (6)

[0103]

Предпочтительный диапазон скорости выпуска составляет 1 м/мин или больше и 60 м/мин или меньше, более предпочтительно 3 м/мин или больше и 40 м/мин или меньше. Скорость выпуска меньше чем 1 м/мин имеет тенденцию не только вызывать ухудшение производительности, но и вызывать проблему увеличения изменений выпускаемого количества. С другой стороны, скорость выпуска больше чем 60 м/мин может вызвать образование турбулентного потока в выпускном отверстии благодаря большому выпускаемому количеству, что приводит к неустойчивому состоянию выпуска.

[0104]

Скорость приемки может быть установлена в зависимости от скорости выпуска, и предпочтительно составляет 1 м/мин или больше и 200 м/мин или меньше, более предпочтительно 3 м/мин или больше и 150 м/мин или меньше. Скорость приемки меньше чем 1 м/мин имеет тенденцию к ухудшению производительности и формуемости. Скорость приемки больше чем 200 м/мин приводит к тому, что время охлаждения сокращается, а натяжение, приложенное к мембране, увеличивается, что легко приводит к разрушению мембраны.

[0105]

Предпочтительным способом для формирования слоя грубой структуры является способ, включающий экструдирование композиции, включающей в себя термопластическую смолу и пластификатор, в форме плоской мембраны или мембраны в виде полого волокна через отверстие экструдирования с тем, чтобы сформировать неотвержденную мембрану, и контактирование одной поверхности неотвержденной мембраны с нелетучей жидкостью, которая может частично растворять термопластическую смолу. В таком случае нелетучая жидкость диффундирует в мембрану, и термопластическая смола частично растворяется, чтобы тем самым сформировать слой грубой структуры. Жидкость, которая может частично растворять термопластическую смолу, является здесь жидкостью, которая может формировать однородный раствор при условии температуры 100,0°C или выше при смешивании в концентрации 50 мас.% с термопластической смолой, предпочтительно жидкость, которая может формировать однородный раствор при температуре 100,0°C или выше и 250,0°C или ниже, и еще более предпочтительно жидкость, которая может формировать однородный раствор при температуре 120,0°C или выше и 200,0°C или ниже. В том случае, когда в качестве контактирующей жидкости используется жидкость, которая обеспечивает однородное растворение при температуре меньше чем 100,0°C, раствор композиции, включающей в себя термопластическую смолу и пластификатор, не охлаждается и не затвердевает, что приводит к следующему недостатку: ухудшается формуемость, образуется чрезмерно толстый слой грубой структуры, или размер пор становится слишком большим. Жидкость, которая не может формировать однородный раствор при температуре меньше чем 250,0°C, меньше растворяет термопластическую смолу, что затрудняет формирование достаточно толстого слоя грубой структуры. Нелетучая жидкость здесь является жидкостью, имеющей температуру кипения выше чем 250,0°C при 1 атм (101325 Па).

[0106]

Например, в том случае, когда смола поливинилиденфторида выбирается в качестве термопластической смолы, могут подходящим образом использоваться сложные эфиры фталевой кислоты, сложные эфиры адипиновой кислоты и сложные эфиры себациновой кислоты, имеющие цепь сложного эфира из 7 или менее атомов углерода, сложные эфиры фосфорной кислоты и сложные эфиры лимонной кислоты, имеющие цепь сложного эфира из 8 или менее атомов углерода, и т.п., и в частности могут подходящим образом использоваться дигептилфталат, дибутилфталат, диэтилфталат, диметилфталат, дибутиладипат, дибутилсебацинат, три(2–этилгексил)фосфат, трибутилфосфат, трибутилацетилцитрат и т.п.

[0107]

Однако пластификатор, имеющий циклическую структуру, такую как фенильная группа, крезильная группа или циклогексильная группа в сложноэфирной цепи, а именно дициклогексилфталат (DCHP), диамилфталат (DAP), трифенилфосфат (TPP), дифенилкрезилфосфат (CDP), трикрезилфосфат (TCP) и т.п., не является предпочтительным из–за его низкой способности формировать слой грубой структуры.

[0108]

Температура контактирующей жидкости, используемой для введения слоя грубой структуры, составляет 100,0°C или выше, предпочтительно 120,0°C или выше, то есть не превышает температуры однородного раствора термопластической смолы и пластификатора, и еще более предпочтительно составляет 130,0°C или выше, то есть не превышает значения (температура однородного раствора термопластической смолы и пластификатора – 10,0°C). Температура контактирующей жидкости ниже чем 100,0°C хуже растворяет термопластическую смолу, и таким образом затрудняет формирование достаточно толстого слоя грубой структуры. Температура контактирующей жидкости выше температуры однородного раствора термопластической смолы и пластификатора ухудшает формуемость.

[0109]

Кроме того, в случае мембраны в виде полого волокна передача тепла может происходить при прохождении контактирующей жидкости через кольцевую фильеру, создавая тем самым вариации температуры в кольцевой фильере, что приводит к неоднородной мембранной структуре в направлении окружности полого волокна. Например, в том случае, когда контактирующая жидкость при низкой температуре вводится с боковой стороны кольцевой фильеры, температура кольцевой фильеры снижается на части, где вводится контактирующая жидкость, и размер пор той части мембраны, сформированной из композиции, включающей в себя термопластическую смолу и пластификатор, которая проходит через такую часть при относительно низкой температуре, уменьшается, увеличивая тем самым неравномерность структуры мембраны в направлении ее окружности. Для того, чтобы получить однородную мембранную структуру в направлении окружности полого волокна, предпочтительно достичь равномерной температуры фильеры, и для достижения этого предпочтительно (1) вводить контактирующую жидкость от верхней части кольцевой фильеры для достижения равномерного влияния температуры контактирующей жидкости в круговом направлении полого волокна и/или (2) уменьшить разность между температурой кольцевой фильеры и температурой контактирующей жидкости непосредственно перед введением в кольцевую фильеру, чтобы уменьшить теплообмен между кольцевой фильерой и контактирующей жидкостью. В пункте (2) разность между температурой кольцевой фильеры и температурой контактирующей жидкости непосредственно перед введением в кольцевую фильеру предпочтительно составляет 80,0°C или меньше. Разность в температуре более 80,0°C может привести к образованию неоднородной мембранной структуры в направлении окружности, что приведет к утечке вируса и к увеличению общего количества вирусов, загружаемых в мембрану для удаления вирусов.

[0110]

Для того уменьшить разность между температурой кольцевой фильеры и температурой контактирующей жидкости, используются различные методы, такие как метод использования температурной модуляции вблизи фильеры и метод снижения температуры композиции, включающей в себя смолу и пластификатор, и способ управления температурой контактирующей жидкости при ее введении в фильеру при высокой температуре является предпочтительным.

[0111]

В том случае, когда слой грубой структуры вводится только на одной поверхности микропористой мембраны, для охлаждения другой поверхности, соответствующей слою плотной структуры, может использоваться обычный способ. Таким образом, мембрана может охлаждаться путем контакта с проводником тепла. В качестве проводника тепла могут использоваться металл, вода, воздух или сам пластификатор. В частности, может использоваться способ, который включает в себя экструдирование однородного раствора, включающего в себя термопластическую смолу и пластификатор, в форме листа через Т–образную экструзионную головку и т.п., контакт этого листа с металлическим валком для охлаждения с тем, чтобы сформировать слой плотной структуры, и контактирование той поверхности мембраны, которая не контактирует с валком, с нелетучей жидкостью, которая может частично растворять термопластическую смолу, чтобы тем самым сформировать слой грубой структуры. Также может использоваться способ, который включает в себя экструдирование однородного раствора смолы и пластификатора в форме цилиндрического или полого волокна через кольцевую экструзионную головку, кольцевую фильеру и т.п., позволяя жидкости, которая может частично растворять термопластическую смолу, проходить через внутреннюю часть цилиндрического или полого волокна, формируя тем самым слой грубой структуры на внутренней поверхности, и контактирование внешней стороны с охлаждающей средой, такой как вода, для формирования слоя плотной структуры.

[0112]

Для того, чтобы сформировать однородный слой плотной структуры с малым размером пор в способе для производства микропористой мембраны согласно этому варианту осуществления, скорость охлаждения при охлаждении и отверждении предпочтительно является в достаточной степени высокой. Скорость охлаждения предпочтительно составляет 50,0°C/мин или больше, более предпочтительно 100,0°C/мин или больше и 1,0 × 10⁵°C/мин или меньше, и более предпочтительно 200,0°C/мин или больше и 2,0 × 10⁴°C/мин или меньше. Способ контактирования с металлическим охлаждающим валком или водой подходящим образом используется в качестве конкретного способа, и в частности способ контактирования с водой является предпочтительным, поскольку он способен обеспечить быстрое охлаждение путем испарения воды.

[0113]

Температура среды для охлаждения и отверждения в целом не определяется, и предпочтительно является низкой в зависимости от молекулярной массы полимера. Например, в случае контактирования с водой температура воды составляет 50,0°C или ниже, более предпочтительно 40,0°C или ниже, и еще более предпочтительно 30,0°C или ниже. Более низкая температура среды для контакта имеет тенденцию приводить к более высокому давлению появления пузырьков формируемой мембраны, и таким образом является предпочтительной, потому что высокие свойства удаления вирусов могут поддерживаться даже в случае (1) уменьшения уровня давления (скорости потока), (3) временного прерывания фильтрации для повторного создания давления (стартстопный режим), или (2) временного прерывания фильтрации после фильтрации препарата для промывки буфером (пост–промывки), в частности при использовании мембраны для удаления вирусов.

[0114]

В способе производства в соответствии с этим вариантом осуществления композиция, включающая в себя термопластическую смолу и пластификатор и равномерно нагретая для растворения, предпочтительно проходит через воздушный зазор после выпуска через выпускное отверстие, но до охлаждения и отверждения. Поверхностный слой выпущенного раствора полимера охлаждается, и часть пластификатора газифицируется в воздушном зазоре, чтобы тем самым сформировать самый плотный слой на части поверхностного слоя. Длина воздушного зазора предпочтительно составляет 10 мм или больше и 300 мм или меньше, и еще более предпочтительно 30 мм или больше и 200 мм или меньше.

[0115]

Когда длина воздушного зазора находится в вышеуказанном диапазоне, меньший воздушный зазор обеспечивает плотный слой большей толщины, и больший воздушный зазор обеспечивает плотный слой большей толщины. Если эта длина находится в вышеуказанном диапазоне, может быть произведена мембрана, имеющая высокую способность к удалению вирусов и высокую эффективность фильтрации.

[0116]

Кроме того, в способе производства согласно этому варианту осуществления часть высвобождения газа может быть предусмотрена в части воздушного зазора для удаления газифицируемого пластификатора, но здесь необходимо обратить внимание на поток воздуха, направленный против выпускаемой композиции. В том случае, когда есть изменение в потоке воздуха, соприкасающегося с выпускаемой композицией, это может привести к изменению температуры композиции и, следовательно, к локальному изменению структуры. Например, в том случае, когда выпускаемая композиция имеет форму полого волокна, часть, противоположная части высвобождения газа, охлаждается сильнее благодаря потоку воздуха при высвобождении газа из боковой части композиции, легко обеспечивая тем самым более плотную структуру, что приводит к вариации структуры в круговом направлении. Соответственно, часть высвобождения газа предпочтительно обеспечивается так, чтобы сделать однородным поток воздуха относительно выпускаемой композиции. В частности, предпочтительно используется направленное вверх или направленное вниз высвобождение газа, чтобы поток воздуха был параллельным выпускаемой композиции.

[0117]

В случае бокового высвобождения газа скорость воздуха, касающегося композиции, предпочтительно составляет 10 м/с или меньше, предпочтительно 7 м/с, 5 м/с, 3 м/с или меньше, и более предпочтительно 1 м/с или меньше.

[0118]

На стадии (b) удаления существенной части пластификатора из сформированной мембраны для удаления пластификатора используется экстракционный растворитель. Экстракционный растворитель предпочтительно служит в качестве слабого растворителя для термопластической смолы и хорошего растворителя для пластификатора, и предпочтительно имеет температуру кипения ниже температуры плавления микропористой мембраны. Примеры такого экстракционного растворителя включают в себя углеводороды, такие как гексан и циклогексан, галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид и 1,1,1–трихлорэтан, спирты, такие как этанол и изопропанол, эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, кетоны, такие как ацетон и 2–бутанон, или воду.

[0119]

В одном варианте осуществления первый способ для удаления пластификатора из мембраны выполняется путем погружения микропористой мембраны, нарезанной на предопределенный размер, в сосуд с экстракционным растворителем, достаточной промывки микропористой мембраны, а затем сушки растворителя воздухом или горячим воздухом. При этом предпочтительно выполнять операцию погружения и промывки несколько раз, потому что это уменьшает количество пластификатора, остающегося в микропористой мембране. В дополнение к этому, предпочтительно удерживать конец микропористой мембраны для предотвращения усадки микропористой мембраны во время последующих операция погружения, промывки и сушки.

[0120]

Второй способ для удаления пластификатора из мембраны выполняется путем непрерывной подачи микропористой мембраны в резервуар, заполненный экстракционным растворителем, погружения микропористой мембраны в этот резервуар на время, достаточное для удаления пластификатора, и последующей сушки растворителя. При этом для повышения эффективности экстракции предпочтительно применять известную процедуру, такую как многоступенчатый способ для разделения внутренности резервуара, чтобы последовательно подавать микропористую мембрану в соответствующие резервуары с разностью концентраций, или способ противотока для подачи экстракционного растворителя в направлении, противоположном направлению подачи микропористой мембраны, чтобы обеспечить градиент концентраций. Как в первом, так и во втором способе важно по существу удалить пластификатор из микропористой мембраны. Существенное удаление относится к удалению пластификатора из микропористой мембраны до такой степени, чтобы разделительная функция мембраны не ухудшалась, и количество пластификатора, остающегося в микропористой мембране, предпочтительно составляет 1 мас.% или меньше, и еще более предпочтительно 100 м.ч. на миллион или меньше. Количество пластификатора, остающегося в микропористой мембране, может быть количественно определено газовой хроматографией, жидкостной хроматографией и т.п. В дополнение к этому, предпочтительно нагревать экстракционный растворитель до температуры ниже, чем температура кипения растворителя, предпочтительно до температуры в диапазоне (температура кипения–5,0°C) или ниже, потому что это может вызвать усиление диффузии пластификатора и растворителя, приводя к повышению эффективности экстракции.

[0121]

Микропористая мембрана, сделанная из гидрофобной смолы, обладающей превосходной физической прочностью, является превосходной по сравнению с микропористой мембраной, изготовленной из гидрофильной смолы, такой как целлюлоза, с точки зрения способности выдерживать высокое фильтрующее давление, но вызывает адсорбцию белков и т.п., что приводит к загрязнению, закупорке и т.п. мембраны, и соответственно к быстрому уменьшению скорости фильтрации. Следовательно, в том случае, когда используется микропористая мембрана, сделанная из гидрофобной смолы, гидрофильность придается мембране для того, чтобы предотвратить окклюзию благодаря адсорбции белков и т.п. В способе производства в соответствии с одним вариантом осуществления предпочтительно вводить гидрофильные функциональные группы на поверхность пор гидрофобной мембраны методом графт–полимеризации для снижения адсорбционных свойств белков и т.п. Причина этого заключается в том, что способ графт–полимеризации может равномерно гидрофилизировать не только большие поры, но также и малые поры, и может одинаково гидрофилизировать не только внутреннюю поверхность мембраны, но также и ее наружную поверхность без вариаций по сравнению с другими способами (например, способом смешивания гидрофильного полимера и способом покрытия гидрофильным полимером).

[0122]

В дополнение к этому, графт–полимеризация является предпочтительной, потому что гидрофильность придается химическими связями, и поэтому элюирование в обрабатываемую жидкость может быть уменьшено по сравнению с другими способами. Способ прививочной или графт–полимеризации означает реакцию, в которой радикалы образуются в полимерной микропористой мембране с помощью такой процедуры, как ионизирующая радиация или химическая реакция, и радикалы действуют как исходные точки для прививочной полимеризации мономеров в мембране.

[0123]

В этом варианте осуществления может использоваться любая процедура для того, чтобы создать радикалы в полимерной микропористой мембране, но облучение ионизирующей радиацией является предпочтительным для равномерного создания радикалов во всей мембране. Что касается типа ионизирующей радиации, можно использовать γ–излучение, электронные лучи, β–излучение, нейтронные лучи и т.п., и электронные лучи или γ–излучение являются наиболее предпочтительными при реализации в промышленном масштабе. Ионизирующая радиация получается с помощью радиоизотопа, такого как кобальт 60, стронций 90 или цезий 137, или с помощью рентгеновского оборудования, ускорителя электронов, устройства облучения ультрафиолетовым светом и т.п.

[0124]

Доза облучения ионизирующей радиации предпочтительно составляет 1 кГрэй или больше и 1000 кГрэй или меньше, более предпочтительно 2 кГрэй или больше и 500 кГрэй или меньше, и наиболее предпочтительно 5 кГрэй или больше и 200 кГрэй или меньше. Доза облучения меньше чем 1 кГрэй не дает равномерного образования радикалов, а доза облучения больше чем 1000 кГрэй может привести к уменьшению прочности мембраны.

[0125]

Способ прививочной полимеризации путем облучения ионизирующей радиацией обычно грубо классифицируется на способ предварительного облучения, включающий создание радикалов в мембране, а затем приведение радикалов в контакт с реакционноспособным соединением, и способ одновременного облучения, включающий создание радикалов в мембране в таком состоянии, когда мембрана контактирует с реакционноспособным соединением. В этом варианте осуществления может быть применен любой способ, и способ предварительного облучения является более предпочтительным, потому что он образует меньше олигомеров.

[0126]

В этом варианте осуществления используются имеющие одну винильную группу гидрофильные виниловые мономеры в качестве реакционноспособных соединений, и в случае необходимости сшивающие агенты, и они контактируют с полимерной микропористой мембраной, в которой созданы радикалы. Контактный способ может выполняться как в газовой, так и в жидкой фазе, но предпочтительно осуществлять такой контакт в жидкой фазе, которая обеспечивает равномерное протекание прививочных реакций. Для того, чтобы позволить прививочным реакциям протекать еще более равномерно, в том случае, когда гидрофильные виниловые мономеры, имеющие одну винильную группу, заранее растворяются в растворителе, а затем используются сшивающие агенты, гидрофильный виниловый мономер и сшивающий агент предпочтительно заранее растворяются в растворителе, а затем контактируют с полимерной микропористой мембраной.

[0127]

Как было описано выше, в способе для производства гидрофильной микропористой мембраны согласно этому варианту осуществления гидрофильные виниловые мономеры, имеющие одну винильную группу, полимеризуются прививкой в полимерной микропористой мембране для того, чтобы придать гидрофильность поверхностям пор, уменьшая адсорбцию физиологически активных веществ, таких как белки. Гидрофильный виниловый мономер, имеющий одну винильную группу в этом варианте осуществления, является мономером, имеющим одну винильную группу, который равномерно растворяется при смешивании в концентрации 1 об.% с чистой водой при 25,0°C и атмосферном давлении. Примеры гидрофильного винилового мономера включают в себя виниловые мономеры, имеющие гидроксильную группу или функциональную группу, служащую ее прекурсором, такие как гидроксипропилакрилат и гидроксибутилакрилат, виниловые мономеры, имеющие амидную связь, такие как винилпирролидон, виниловые мономеры, имеющие аминогруппу, такие как акриламид, виниловые мономеры, имеющие цепь полиэтиленгликоля, такие как моноакрилат полиэтиленгликоля, виниловые мономеры, имеющие анионообменную группу, такие как триэтиламмонийметилметакрилат, а также виниловые мономеры, имеющие катионообменную группу, такие как сульфопропилметакрилат.

[0128]

В этом варианте осуществления из вышеупомянутых гидрофильных виниловых мономеров предпочтительно используется виниловый мономер, имеющий по меньшей мере одну гидроксильную группу или функциональную группу, служащую ее прекурсором, поскольку он приводит к уменьшению угла смачивания мембраны. Более предпочтительно используются сложные эфиры акриловой кислоты или метакриловой кислоты и многоатомного спирта, такие как гидроксипропилакрилат и 2–гидроксиэтилметакрилат, спирты, имеющие ненасыщенную связь, такие как аллиловый спирт, и енольные сложные эфиры, такие как винилацетат и винилпропионат, и наиболее предпочтительно используются сложные эфиры акриловой кислоты или метакриловой кислоты и многоатомного спирта, такие как гидроксипропилакрилат и 2–гидроксиэтилметакрилат. Гидрофильная микропористая мембрана, получаемая путем прививки гидроксипропилакрилата, может достигать низкого угла смачивания и достаточной способности к проникновению глобулина.

[0129]

Растворитель, который растворяет гидрофильные виниловые мономеры, имеющие одну винильную группу, и сшивающие агенты, используемые в случае необходимости, особенно не ограничивается, при условии, что он может равномерно их растворять. Примеры такого растворителя включают в себя спирты, такие как этанол, изопропанол и трет–бутанол, эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, кетоны, такие как ацетон и 2–бутанон, воду, или их смеси.

[0130]

При растворении гидрофильных виниловых мономеров, имеющих одну винильную группу, и сшивающих агентов, используемых в случае необходимости, концентрация предпочтительно составляет от 3 об.% до 30 об.%, более предпочтительно от 3 об.% до 20 об.%, и наиболее предпочтительно от 3 об.% до 15 об.%. Концентрация 3 об.% или более является предпочтительной из–за придания достаточной гидрофильности. Концентрация больше чем 30 об.% является нежелательной, потому что слой гидрофилизации может залить поры, и способность к проникновению ухудшится.

[0131]

Количество реакционной жидкости, в которой гидрофильные виниловые мономеры, имеющие одну винильную группу, и сшивающие агенты, используемые в случае необходимости, растворены в растворителе, используемом при прививочной полимеризации, предпочтительно составляет 1 × 10^–5 м³ или больше и 1 × 10^–3 м³ или меньше на 1 г полимерной микропористой мембраны. Количество реакционной жидкости 1 × 10^–5 м³ или больше и 1 × 10^–3 м³ или меньше обеспечивает мембрану с достаточной однородностью. Температура реакции при графт–полимеризации обычно составляет 20,0°C или больше и 80,0°C или меньше, но особо не ограничивается.

[0132]

В этом варианте осуществления слой гидрофилизации, подходящий для гидрофобной микропористой мембраны, вводится для того, чтобы реализовать высокую проницаемость для белков. Следовательно, его отношение прививки к прививаемой гидрофобной микропористой мембране предпочтительно составляет 3% или больше и 50% или меньше, еще более предпочтительно 4% или больше и 40% или меньше, и наиболее предпочтительно 6% или больше и 30% или меньше. Отношение прививки менее 3% приводит к недостаточной гидрофильности мембраны, и соответственно к быстрому уменьшению скорости фильтрации одновременно с адсорбцией белков. Отношение прививки более 50% приводит к попаданию слоя гидрофилизации в относительно малые поры, что приводит к недостаточной скорости фильтрации. Отношение прививки здесь означает значение, определяемое следующим уравнением (7).

Отношение прививки (%) =100 × {(масса мембраны после прививки – масса мембраны до прививки) / масса мембраны до прививки} (7)

[0133]

[Производственные примеры 1–11]

(Производство мембраны для удаления вирусов)

Порошок, полученный, полученный путем перемешивания и смешивания композиции, включающей 49 мас.% смолы поливинилиденфторида (KF#1300 производства компании Kureha Corporation) и 51 мас.% дициклогексилфталата (производства компании Hokko Chemicals Co., Ltd.) при помощи мешалки Henschel при комнатной температуре, был загружен через бункер, вымешен в расплаве при 210,0°C с помощью двухшнекового экструдера (диаметр 26 мм, L/D=50) для равномерного растворения, после чего экструдировался в форме полого волокна со скоростью выпуска 4,2 г/мин через фильеру с температурой 225,0°C, которая включала в себя кольцевое отверстие, имеющее внутренний диаметр 0,8 мм и наружный диаметр 1,05 мм, затем волокно проходило через воздушный зазор, после чего охлаждалось и отверждалось в водяной бане, температура которой поддерживалась равной температуре коагуляционной ванны, представленной на Фиг. 5, и сматывалось в виде мотка со скоростью 50 м/мин. Здесь дибутилфталату (производства компании Daihachi Chemical Industry Co., Ltd.) в качестве агента создания полости давалась возможность течь во внутренность полого волокна со скоростью 7,1 г/мин. В Производственных примерах 1–11 дибутилфталат вводился сбоку фильеры, и температура непосредственно перед введением в фильеру и температура при выпуске из фильеры представлены на Фиг. 5. Скорость воздуха, касающегося полого волокна сбоку в воздушном зазоре, составляла 2,7 м/с. После этого дициклогексилфталат и дибутилфталат были удалены экстракцией 2–пропанолом (производства компании Tokuyama Corporation), затем оставшийся 2–пропанол был замещен водой, и после этого термическая обработка при 125,0°C была выполнена при помощи устройства стерилизации паром высокого давления в состоянии погружения в воду в течение 4 час. После этого оставшаяся вода была замещена 2–пропанолом, а затем была выполнена вакуумная сушка при 60,0°C, и таким образом была получена микропористая мембрана в виде полого волокна. Процесс от экстракции до сушки выполнялся с фиксацией мембраны в состоянии постоянной длины для того, чтобы предотвратить усадку.

[0134]

Затем микропористая мембрана была подвергнута гидрофилизационной обработке с помощью способа прививки. Использовалась реакционная жидкость, которая была получена путем растворения гидроксипропилакрилата (производства компании Osaka Organic Chemical Industry Ltd.) в водном 25 об.% растворе 3–бутанола (х.ч., Junsei Chemical Co., Ltd.) так, чтобы концентрация составляла 8 об.%, и подвергания полученного раствора барботированию азотом в течение 20 мин при температуре, поддерживаемой равной 45,0°C. Сначала микропористая мембрана была облучена дозой по меньшей мере 25 кГрэй γ–лучей с использованием Co60 в качестве источника излучения при охлаждении твердой углекислотой при –60,0°C или ниже в атмосфере азота. Мембрана после облучения была оставлена стоять под пониженным давлением 13,4 Па или меньше на 15 мин, после чего введена в контакт с реакционной жидкостью при 45,0°C и оставлена стоять на 1 час. После этого мембрана была промыта 2–пропанолом и подвергнута вакуумной сушке при 60,0°C, чтобы тем самым обеспечить микропористую мембрану. Было подтверждено, что вода спонтанно проникала в поры при контакте полученной мембраны с водой. Результаты оценки характеристик полученной мембраны представлены на Фиг. 5.

[0135]

В Производственных примерах 1–11 разность между входной температурой и выходной температурой агента создания полости, длина воздушного зазора и температура коагуляционной ванны соответствовали показанным на Фиг. 5. Только в Производственном примере 6 дибутилфталат вводился через центр фильеры. Что касается других условий производства мембраны, одинаковые условия использовались в Производственных примерах 1–11.

[0136]

(Физические свойства мембраны для удаления вирусов)

(1) Наружный диаметр и внутренний диаметр полого волокна и толщина мембраны

Наружный диаметр и внутренний диаметр полого волокна микропористой мембраны определялись путем фотографирования разорванного вертикального сечения мембраны с помощью стереоскопического микроскопа (SCOPEMAN 503 производства компании Moritex Corporation) при увеличении 210х. Толщина мембраны вычислялась как 1/2 разности между наружным диаметром и внутренним диаметром полого волокна. Результаты показаны на Фиг. 5.

[0137]

(2) Давление появления пузырьков

Давление появления пузырьков (Па) определялось способом в соответствии со стандартом ASTM F316–86. В качестве тестовой жидкости для погружения мембраны использовался гидрофторэфир, имеющий поверхностное натяжение 13,6 мН/м (Novec (зарегистрированная торговая марка) 7200 производства компании 3M). Давление появления пузырьков определялось как давление, при котором после того, как одна мембрана в виде полого волокна, имеющая расчетную длину 8 см, была установлена в устройство измерения давления появления пузырьков, давление вблизи от полой части постепенно увеличивалось, и скорость потока проникающего через мембрану газа достигла 2,4E–3 л/мин. Результаты показаны на Фиг. 5.

[0138]

(3) Скорость проникновения чистой воды

Измерялось количество проникшей чистой воды при непроточной фильтрации с постоянным давлением при температуре 25,0°C, и скорость проникновения чистой воды определялась согласно следующему уравнению (8) из площади мембраны, давления фильтрации (0,1 МПа) и времени фильтрации. Результаты показаны на Фиг. 5.

Скорость проникновения чистой воды (л/м²/час/0,1 МПа) = количество проникшей воды / (площадь мембраны × время фильтрации) (8)

[0139]

(Оценка мембраны для удаления вирусов с использованием коллоидов золота)

(1) Приготовление раствора коллоида золота

Были закуплены соответствующие растворы, включающие коллоиды золота, имеющие размеры частиц 10, 15, 20 и 30 нм (производства компании Cytodiagnostics Inc.). Затем каждый из растворов коллоида золота был разбавлен дистиллированной водой для инъекций, полиоксиэтиленнафтиловым эфиром (1,59 об.%) и поли(4–стиролсульфонатом натрия) (0,20 об.%) так, чтобы коэффициент поглощения света на максимальной длине волны поглощения коллоидов золота каждого из этих растворов, измеренный с помощью УФ–видимого спектрофотометра (UVmini–1240, производства компании Shimadzu Corporation), составлял 0,25.

[0140]

(2) Фильтрация раствора коллоида золота

40 мл каждого из подготовленных растворов коллоида золота фильтровалось под давлением 196 кПа с помощью мембраны для удаления вирусов, произведенной в Производственных примерах. Площадь поверхности фильтрации мембраны для удаления вирусов составляла 0,001 м².

[0141]

(3) Измерение коэффициента удаления коллоидов золота мембраной для удаления вирусов

Для каждого из растворов коллоида золота коэффициент «A» поглощения света раствором до фильтрации и коэффициент «B» поглощения света фильтрата на максимальной длине волны поглощения коллоидов золота измерялись с использованием УФ–видимого спектрофотометра (UVmini–1240, производства компании Shimadzu Corporation), и вычислялся логарифмический коэффициент удаления (LRV) коллоидов золота мембраной для удаления вирусов в соответствии с Производственными примерами, определяемый следующим выражением (9). Результаты показаны на Фиг. 5.

LRV=log₁₀ (A/B) (9)

[0142]

(4) Измерение однородности зоны захвата коллоидов золота

Образец (толщина: 8 мкм) вырезался из мембраны для удаления вирусов в соответствии с каждым из Производственных примеров после фильтрации каждого из растворов коллоида золота, и профиль яркости в каждой из 16 точек, окрашенных коллоидами золота в поперечном сечении этого образца, измерялся с помощью оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). Затем измеренный профиль яркости вычитался из константы (255). После этого строился график с толщиной мембраны (в процентах) по горизонтальной оси и вариацией яркости по вертикальной оси, и вычислялась площадь спектра вариации яркости, представленного этим графиком. Кроме того, значение, получаемое путем деления стандартного отклонения площади спектра вариации яркости в 16 точках на среднее значение площади спектра вариации яркости в этих 16 точках, вычислялось в качестве значения, указывающего коэффициент вариации количества коллоидов золота, захваченных в зоне захвата коллоида золота в мембране для удаления вирусов в соответствии с Производственными примерами. Результаты для потока, содержащего только коллоиды золота с диаметром 20 нм, показаны на Фиг. 5. Соответственно, было установлено, что однородность количества коллоидов золота, захваченных в зоне захвата коллоида золота мембраны для удаления вирусов в соответствии с Производственными примерами, была высокой. В дополнение к этому, в Производственных примерах при уменьшении разности между входной температурой и выходной температурой агента создания полости до и после контакта с однородным раствором термопластической смолы и пластификатора однородность количества захваченных коллоидов золота в зоне захвата коллоида золота имела тенденцию к увеличению, и когда агент создания полости загружался через центр фильеры, однородность количества захваченных коллоидов золота в зоне захвата коллоида золота имела тенденцию к увеличению.

[0143]

(5) Измерение толщины зоны захвата коллоидов золота

Образец (толщина: 8 мкм) вырезался из мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, которая использовалась для фильтрации соответствующих растворов коллоидов золота, имеющих диаметры 20 и 30 нм. Профиль яркости в каждой из 16 точек, окрашенных коллоидами золота в поперечном сечении образца во влажном состоянии, измерялся с помощью оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). Первое расстояние «a» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой к первичной поверхности, измерялось в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «b» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой ко вторичной поверхности, измерялось в направлении толщины.

[0144]

Затем значение «A» (= a/c (в процентах)), получаемое путем деления первого расстояния «a» на толщину «c» мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «A» в 16 точках вычислялось как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «B» (= b/c (в процентах)), получаемое путем деления второго расстояния «b» на толщину «c» мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «B» в 16 точках вычислялось как второй достигаемый уровень.

[0145]

Кроме того, как представлено следующим уравнением (10), значение, получаемое путем умножения разности между средним значением B₂₀ второго достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и средним значением A₃₀ первого достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, на среднее значение C_AVE среднего значения C₂₀ толщины влажной мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и среднего значения C₃₀ толщины влажной мембраны для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм, вычислялось как толщина «T» зоны захвата коллоидов золота мембраны для удаления вирусов. Толщина «T» зоны захвата коллоида золота также выражается как толщина «T» плотного слоя мембраны для удаления вирусов. Результаты показаны на Фиг. 5.

T= (B₂₀ – A₃₀) × C_AVE (10)

[0146]

В вышеупомянутом способе по меньшей мере две мембраны для удаления вирусов: мембрана для удаления вирусов, использованная для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 20 нм, и мембрана для удаления вирусов, использованная для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 30 нм; использовались для измерения толщины плотного слоя. Однако только одна мембрана для удаления вирусов также может использоваться для измерения толщины плотного слоя. В этом случае, одна мембрана для удаления вирусов используется для фильтрации раствора коллоидов золота, имеющих оба диаметра – 20 нм и 30 нм. Альтернативно одна мембрана для удаления вирусов используется для фильтрации раствора коллоида золота с диаметром 20 нм, а затем для фильтрации раствора коллоида золота с диаметром 30 нм.

[0147]

После этого образец вырезался из мембраны для удаления вирусов, с помощью которой фильтровался каждый из растворов коллоида золота с диаметрами 20 нм и 30 нм, и профиль яркости в каждой из 16 точек, окрашенных коллоидами золота в поперечном сечении этого образца, измерялся с помощью оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). В настоящем документе первое расстояние «a₁» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая являлась самой близкой к первичной поверхности, измерялось в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «b₁» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части на зоне захвата коллоида золота, которая являлась самой близкой ко вторичной поверхности, измерялось в направлении толщины.

[0148]

Затем значение «A₁» (= a₁/c₁ (в процентах)), получаемое путем деления первого расстояния «a₁» на толщину «c» влажной мембраны для удаления вирусов, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «A₁» для 16 точек вычислялось как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «B₁» (= b₁/c₁ (в процентах)), получаемое путем деления второго расстояния «b₁» на толщину «c» мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «B₁» в 16 точках вычислялось как второй достигаемый уровень.

[0149]

Кроме того, как представлено следующим уравнением (11), значение, получаемое путем умножения разности между средним значением «B₁» второго достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов и средним значением «A₁» первого достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов на среднее значение «C» толщины влажной мембраны для удаления вирусов, вычислялось как толщина «T» зоны захвата коллоида золота мембраны для удаления вирусов. Было подтверждено, что нет никаких значительных различий между толщиной «T», вычисленной по уравнению (10), и толщиной «T», вычисленной по уравнению (11).

T= (B₁ – A₁) × C (11)

[0150]

(6) Измерение толщины самого плотного слоя

Образец (толщина: 8 мкм) вырезался из мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, которая использовалась для фильтрации раствора коллоидов золота, имеющих диаметр 15 нм. Профиль яркости в каждой из 16 точек, окрашенных коллоидами золота в поперечном сечении образца во влажном состоянии, измерялся с помощью оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). Первое расстояние «d» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой к первичной поверхности, измерялось в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «е» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой ко вторичной поверхности, измерялось в направлении толщины.

[0151]

Затем значение «D» (= d/f (в процентах)), получаемое путем деления первого расстояния «d» на толщину «f» мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «D» в 16 точках вычислялось как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «E» (= e/f (в процентах)), получаемое путем деления второго расстояния «e» на толщину «f» мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «E» в 16 точках вычислялось как второй достигаемый уровень.

[0152]

Кроме того, как представлено следующим уравнением (12), значение, получаемое путем умножения разности между средним значением «E» второго достигаемого уровня и средним значением «D» первого достигаемого уровня в мембране для удаления вирусов, использованной для фильтрации коллоидов золота, имеющих диаметр 15 нм, на среднее значение «F» толщины мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, использованной для фильтрации, вычислялось как толщина «T» зоны захвата коллоида золота с размером 15 нм (самого плотного слоя) мембраны для удаления вирусов.

T= (E – D) × F (12)

[0153]

(7) Измерение свойства зависимости размера частиц зоны захвата коллоида золота мембраны для удаления вирусов

Образец (толщина: 8 мкм) вырезался из мембраны для удаления вирусов, с помощью которой фильтровались растворы коллоида золота с диаметрами 15 нм, 20 нм и 30 нм. Профиль яркости в каждой из 16 точек, окрашенных коллоидами золота в поперечном сечении образца, измерялся с помощью оптического микроскопа (Biozero, BZ8100, производства компании Keyence Corporation). Первое расстояние «a» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой к первичной поверхности, измерялось в направлении толщины. В дополнение к этому, второе расстояние «b» от первичной поверхности мембраны для удаления вирусов до той части, где были захвачены коллоиды золота, и которая была самой близкой ко вторичной поверхности, измерялось в направлении толщины.

[0154]

Затем значение A (%), получаемое путем деления первого расстояния «a» на толщину «c» влажной мембраны для удаления вирусов, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «A» (%) для 16 точек вычислялось как первый достигаемый уровень. В дополнение к этому, значение «В» (%), получаемое путем деления второго расстояния «b» на толщину «c» влажной мембраны для удаления вирусов, вычислялось в каждой из 16 точек, и среднее значение «B» (%) для 16 точек вычислялось как второй достигаемый уровень. Среднее значение первого достигаемого уровня и среднее значение второго достигаемого уровня для каждого из соответствующих коллоидов золота, имеющих диаметры 15 нм, 20 нм и 30 нм, представлены на Фиг. 5. На Фиг. 5, числовые значения слева представляют средние значения первого достигаемого уровня, а числовые значения справа представляют средние значения второго достигаемого уровня. Положение захвата каждого из соответствующих коллоидов золота, имеющих диаметры 30 нм, 20 нм и 15 нм, последовательно измерялось относительно коллоидов золота, захваченных мембраной, а коллоиды золота, не захваченные мембраной, не измерялись.

[0155]

(Способность к удалению вирусов мембраны для удаления вирусов)

(1) Подготовка содержащего вирус раствора белка

Поликлональные антитела (человеческий IgG) (Venoglobulin–IH производства компании Benesis Corporation) использовались для обеспечения раствора антител, который был разбавлен водой для инъекций (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) так, чтобы концентрация антител составляла 10 мг/мл. Концентрация соли была доведена до 0,1 моль/л при помощи водного раствора NaCl с концентрацией 1 моль/л. Кроме того, значение pH было доведено до 4,0 при помощи 0,1 моль/л HCl или 0,1 моль/л NaOH для того, чтобы обеспечить белковый раствор. К полученному белковому раствору был добавлен свиной парвовирус (PPV; производства Японской ассоциации ветеринарных биопрепаратов) в концентрации 1,0 об.% и хорошо перемешан, чтобы обеспечить содержащий вирус белковый раствор.

[0156]

(2–1) Фильтрация (нормальная) содержащего вирус белкового раствора

Произведенная мембрана для удаления вирусов, имеющая площадь мембраны 0,001 м², использовалась при давлении фильтрации 196 кПа для того, чтобы выполнить фильтрацию с одним закрытым концом содержащего вирус раствора белка до тех пор, пока количество фильтрации не достигнет 150 л/м².

[0157]

(2–2) Фильтрация (способность к захвату) содержащего вирус белкового раствора

Произведенная мембрана для удаления вирусов, имеющая площадь 0,001 м², использовалась при давлении фильтрации 196 кПа для того, чтобы выполнить непроточную фильтрацию содержащего вирус белкового раствора. Давление фильтрации измерялось манометром, расположенным вблизи от емкости с питающим раствором. Фильтрат отбирался в количестве 15 л/м², и фильтрация выполнялась до тех пор, пока количество загруженных вирусов не достигало самое большее 14,0 (Log₁₀(TCID₅₀/м²)).

[0158]

(3) Измерение коэффициента удаления вирусов

Были приготовлены и культивированы клетки PK–13 (ATCC № CRL–6489), полученные из American Type Culture Collection (ATCC). В дополнение к этому был подготовлен смешанный раствор 3 об.% бычьей сыворотки (производства компании Upstate), нагретой в водяной бане при 56°C в течение 30 мин и инактивированной, и D–MEM (производства компании Invitrogen Corporation, с высоким содержанием глюкозы), содержащий 1 об.% пенициллина/стрептомицина (+10000 ед./мл пенициллина, +10000 мкг/мл стрептомицина, производства компании Invitrogen Corporation). В дальнейшем эта смешанная жидкость упоминается как «3 об.% FBS/D–MEM». Затем клетки PK–13 были разбавлены 3 об.% FBS/D–MEM для того, чтобы приготовить разбавленную клеточную суспензию, имеющую концентрацию клеток 2,0 ×10⁵ (клеток/мл). Затем были подготовлены десять 96–луночных пластин для клеточной культуры с круглым дном (производства компании Falcon Corporation), и разбавленная клеточная суспензия была помещена во все лунки по 100 мкл.

[0159]

Каждый из фильтрата содержащего вирус раствора белка, разбавленных растворов фильтрата с разбавлениями 10, 10², 10³, 10⁴ и 10⁵, и разбавленных нефильтрованных растворов содержащего вирус раствора белка с разбавлениями 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ и 10⁷ порциями по 100 мкл был перенесен в каждые восемь лунок каждой из пластин для культивирования клеток, в которые была перенесена разбавленная клеточная суспензия. После этого каждая из пластин для культивирования клеток была помещена в термостат с температурой 37,0°C и 5%–ой атмосферой диоксида углерода, и клетки культивировались в течение 10 дней.

[0160]

Клетки, культивированные в течение 10 дней, были подвергнуты измерению инфекционной дозы для 50% культуры ткани (TCID50) при помощи способа адсорбции эритроцитов (см. публикацию Experimental Study of Viruses, General, edited by National Institute of Infectious Diseases, p. 173), описанного ниже. Сначала консервированная куриная кровь (производства компании Nippon Bio–Test Laboratories Inc.) была пятикратно разбавлена PBS (–) (производства компании Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.; приготовленным способом, описанным в инструкции, прилагающейся к продукту), а затем центрифугировалась со скоростью 2500 об/мин при 4,0°C в течение 5 мин для осаждения эритроцитов. После этого надосадочная жидкость была удалена аспирацией, и полученный содержащий эритроциты осадок был снова разбавлен в 200 раз PBS (–).

[0161]

Затем разбавленный PBS (–) раствор осадка эритроцитов был помещен порциями по 100 мкл во все лунки пластин для клеточной культуры, и они были оставлены стоять на два часа. После этого наличие адсорбции эритроцитов к поверхности культивируемой клеточной ткани было подтверждено визуально, и лунки, в которых адсорбция была подтверждена, были подсчитаны как лунки с вирусной инфекцией, а те лунки, где адсорбция не была подтверждена, был подсчитаны как лунки без вирусной инфекции. Кроме того, степень вирусной инфекции была подтверждена для каждой лунки, в которую были перенесены фильтрат содержащего вирус раствора белка, разбавленные растворы фильтрата и разбавленные растворы содержащего вирус нефильтрованного раствора белка, log₁₀(TCID₅₀/мл) был вычислен как титр инфекционности в соответствии со способом Рида–Менча (см. публикацию Experimental Study of Viruses, General, edited by National Institute of Infectious Diseases, p. 479–480), и логарифмический коэффициент удаления (LRV) вирусов был рассчитан с использованием следующих уравнений (13) и (14). Результаты показаны на Фиг. 5.

LRV=log₁₀ (C₀/C_F) (13)

Здесь C₀ означает титр инфекционности содержащего вирус нефильтрованного раствора белка (содержащего вирус раствора белка) перед фильтрацией с помощью мембраны для удаления вирусов, а C_F означает титр инфекционности фильтрата после фильтрации с помощью мембраны для удаления вирусов.

LRV процесса, включающего сброс давления (остановку и запуск):

LRV=log₁₀(C₀×150/(C_F100×100+C_F50×50)) (14)

В этом уравнении C₀ представляет титр инфекционности содержащего вирус нефильтрованного белкового раствора (содержащего вирус белкового раствора) до его фильтрации мембраной для удаления вирусов, C_F100 представляет титр инфекционности пула фильтрата (100 мл/0,001 м²) мембраной для удаления вирусов перед сбросом давления, и C_F50 представляет титр инфекционности пула фильтрата, оставленного стоять на 3 час в мембране для удаления вирусов после сброса давления и отфильтрованного (50 мл/0,001 м²) после повторного поднятия давления.

[0162]

(4) Вычисление максимальной способности к захвату

Максимальная способность к захвату мембраны для удаления вирусов вычислялась из количества фильтрации (= максимальная пропускная способность фильтрации), при которой было получено значение, превышающее предел чувствительности при измерении коэффициента удаления вирусов, в соответствии со следующим уравнением (15).

Максимальная способность к захвату (Log₁₀(TCID₅₀/м²))

= титр инфекционности содержащего вирус нефильтрованного белкового раствора (Log₁₀((TCID₅₀/мл)×максимальная способность к фильтрации (л/м²) × 1000)) (15)

[0163]

Максимальная способность к захвату, равная 10,0 в степени 11,5 или больше является предпочтительной, потому что коэффициент удаления вирусов не уменьшается, даже если количество вирусов, загружаемых в мембрану для удаления вирусов, увеличивается. Кроме того, максимальная способность к захвату, равная 10,0 в степени 12 или больше, 12,5 или больше, или 13,0 или больше, является еще более предпочтительной.

[0164]

Как показано на Фиг. 5, максимальная способность к захвату увеличивается в соответствии с увеличением однородности и толщины плотного слоя.

[0165]

(Производство содержащей мультимер жидкости)

Препарат иммуноглобулина человека (веноглобулин IH 5% для внутривенного введения из донорской крови производства Japan Blood Products Organization) использовался для приготовления раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 2% и концентрацию хлористого натрия 100 ммоль/л. Этот раствор имел значение pH 4,5. Значение pH этого раствора было уменьшено до 2,5 водным раствором хлористого натрия с концентрацией 1 моль/л и комнатной температурой, затем раствор был оставлен стоять на 1 час, после чего значение pH было увеличено до 4,5 водным раствором гидроксида натрия с концентрацией 1 моль/л, и раствор был оставлен стоять еще на 24 час, тем самым частично преобразуя глобулины в мультимеры. В настоящем Примере частицы образовывались с помощью pH–обработки в суровых условиях для того, чтобы денатурировать белки. Этот содержащий мультимер раствор упоминается в дальнейшем как раствор A.

[0166]

Средний диаметр частиц в растворе A был измерен с помощью способа динамического светорассеяния, и составил 74,3 нм. Для измерения использовался прибор ZetaSizer Nano производства компании Malvern Panalytical. Результаты показаны на Фиг. 6. Количество света в измерении (условие ослабления излучаемого света), а также расстояние от источника света и полное время измерения (накопленное число и время измерения накопленного числа) были установлены с использованием функции автоматической настройки устройства, и температура измерения и угол измерения составили 25,0°C и 173°, соответственно.

[0167]

Раствор A был подвергнут гель–проникающей хроматографии, и на основе отношения площади пика в полученном графике было найдено, что он включает в себя 16,5% мономеров, 5,6% димеров и 77,8% тримеров или мультимеров более высокого порядка. Настоящий Пример соответствовал модельному эксперименту, в котором содержащий мультимер раствор был приготовлен и добавлен к белковому раствору, и таким образом измерение среднего диаметра для образца, фракционируемого гель–проникающей хроматографией, не выполнялось. Такой способ гель–проникающей хроматографии был выполнен с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа (Prominence, Shimadzu Corporation) и колонки (TSK gel G3000SWXL, Tosoh Corporation, молекулярная масса предела исключения: 500000 Дальтон). Подвижная фаза включала в себя 0,3 моль/л фосфатного буфера, имеющего значение pH 6,9, 0,2 моль/л аргинина–HCl, и 0,1 моль/л NaCl. Один пример результатов измерения представлен на Фиг. 7. Пик (1) на Фиг. 7 представляет тримеры или мультимеры глобулина более высокого порядка, пик (2) представляет димеры глобулина, и пик (3) представляет мономеры. Соответствующие проценты мономеров и мультимеров были вычислены по площади пика на хроматограмме, обеспечивая тем самым относительную площадь. Соответствующие концентрации мономеров, мультимеров и т.п. в последующих Примерах также представлены тем же самым образом с использованием относительной площади (%). Температура измерения была равна 25°C, время измерения было равно 20 мин, а скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Такие условия были также использованы тем же самым образом для анализа соответствующих процентов следующих мономеров и мультимеров. В следующих Примерах эксперимент выполнялся после того, как частицы в растворе A, имеющие средний диаметр меньше чем 100 нм и относительную площадь, вычисленную по площади пика относительно тримеров или мультимеров более высокого порядка, были подтверждены при помощи белкового раствора A, где белки в растворе главным образом включали в себя тримеры или мультимеры более высокого порядка, и подлежащий обработке раствор затем готовился так, чтобы содержание тримеров или мультимеров белков более высокого порядка, имеющих средний диаметр меньше чем 100 нм, в обрабатываемом растворе каждого из Примеров составляло 0,25 г на 1 м² мембраны для удаления вирусов.

[0168]

(Пример 1)

Препарат иммуноглобулина человека (веноглобулин IH 5% для внутривенного введения из донорской крови производства Japan Blood Products Organization) использовался для приготовления 25 мл раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 30 мг/мл, концентрацию хлористого натрия 50 ммоль/л и значение pH 5,3, и раствор A был добавлен к этому раствору так, чтобы в нем содержалось 0,3 мг мультимеров.

[0169]

Все количество приготовленного раствора фильтровалось при постоянном давлении 0,2 бар с помощью прибора Durapore (Merck KGaA), имеющего мембрану с площадью 10 см², включающую поливинилиденфторид (PVDF) и имеющую размер пор 0,1 мкм, подготовленную в качестве предварительного фильтра. Полученный фильтрат фильтровался при постоянном давлении 3 бар с помощью мембраны для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, имеющей площадь 3 см², и время, потребовавшееся для фильтрации общего количества 25 мл приготовленного раствора, составило 65 мин, как представлено на Фиг. 8. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0170]

(Сравнительный пример 1)

Тот же самый раствор, что и приготовленный в Примере 1, фильтровался напрямую с помощью мембраны для удаления вирусов без использования предварительного фильтра при постоянном давлении 3 бар, и только приблизительно 9,6 мл раствора получилось отфильтровать даже через 3 час, как показано на Фиг. 8. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит 4900 час или больше. Количество мультимеров на мембране для удаления вирусов составило 1 г на 1 м². Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0171]

(Пример 2)

Тот же самый способ, что и в Примере 1, был выполнен для того, чтобы приготовить 25 мл раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 30 мг/мл, концентрацию хлористого натрия 50 ммоль/л и значение pH 5,3, и раствор A был добавлен к раствору так, чтобы в нем содержалось 1,03 мг мультимеров.

[0172]

Подготовленным предварительным фильтром был Virosart Max (Sartorius Stedim Japan K. К.), который содержал трехслойную мембрану с площадью 5 см², включающую полиамид и имеющую размер пор 0,1 мкм, и фильтрация выполнялась при постоянном давлении 0,2 бар. Были приготовлены два предварительных фильтра, и первый фильтр был снова соединен со вторым фильтром в момент времени, когда было отфильтровано 12,5 мл обрабатываемой жидкости, что соответствует половине общего количества жидкости. Полученный фильтрат фильтровался при постоянном давлении 3 бар с помощью мембраны для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, имеющей площадь 3 см², и время, потребовавшееся для фильтрации общего количества 25 мл приготовленного раствора, составило 128 мин, как представлено на Фиг. 10. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0173]

(Сравнительный пример 2)

Тот же самый раствор, что и приготовленный в Примере 2, фильтровался напрямую с помощью мембраны для удаления вирусов без использования предварительного фильтра при постоянном давлении 3 бар, и только приблизительно 7,7 мл раствора получилось отфильтровать даже через 3 час, как показано на Фиг. 10. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит 150000 час или больше. Количество мультимеров на мембране для удаления вирусов составило 3,4 г на 1 м². Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0174]

(Пример 3)

Тот же самый способ, что и в Примере 1, был выполнен для того, чтобы приготовить 25 мл раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 30 мг/мл, концентрацию хлористого натрия 50 ммоль/л и значение pH 5,3, и раствор A был добавлен к раствору так, чтобы в нем содержалось 0,15 мг мультимеров. Подготовленным предварительным фильтром был Supor (Pall Corporation), который содержал мембрану с площадью 5,8 см², включающую полиэфирсульфон и имеющую размер пор 0,2 мкм, и фильтрация выполнялась при постоянном давлении 0,2 бар. Были приготовлены два предварительных фильтра, и первый фильтр был снова соединен со вторым фильтром в момент времени, когда было отфильтровано 12,5 мл обрабатываемой жидкости, что соответствует половине общего количества жидкости. Полученный фильтрат фильтровался при постоянном давлении 3 бар с помощью мембраны для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, имеющей площадь 3 см², и время, потребовавшееся для фильтрации общего количества 25 мл приготовленного раствора, составило 180 мин, как представлено на Фиг. 11. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0175]

(Сравнительный пример 3)

Тот же самый раствор, что и приготовленный в Примере 3, фильтровался напрямую с помощью мембраны для удаления вирусов без использования предварительного фильтра при постоянном давлении 3 бар, и только приблизительно 15,9 мл раствора получилось отфильтровать даже через 3 час, как показано на Фиг. 11. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит 1850 час или больше. Количество мультимеров на мембране для удаления вирусов составило 0,5 г на 1 м². Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0176]

(Пример 4)

Тот же самый способ, что и в Примере 1, был выполнен для того, чтобы приготовить 25 мл раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 30 мг/мл, концентрацию хлористого натрия 50 ммоль/л и значение pH 5,3, и раствор A был добавлен к раствору так, чтобы в нем содержалось 0,3 мг мультимеров.

[0177]

Подготовленный предварительный фильтр был мембранным шприцевым фильтром NY (Corning), который содержал мембрану с площадью 4,8 см², включающую нейлон и имеющую размер пор 0,2 мкм, и фильтрация выполнялась при постоянном давлении 0,2 бар. Были приготовлены два предварительных фильтра, и первый фильтр был снова соединен со вторым фильтром в момент времени, когда было отфильтровано 12,5 мл обрабатываемой жидкости, что соответствует половине общего количества жидкости. Полученный фильтрат фильтровался при постоянном давлении 3 бар с помощью мембраны для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, имеющей площадь 3 см², и 17,2 мл фильтрата удалось отфильтровать за 3 час, как представлено на Фиг. 12. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит приблизительно 47 час. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0178]

(Сравнительный пример 4)

Тот же самый раствор, что и приготовленный в Примере 4, фильтровался напрямую с помощью мембраны для удаления вирусов без использования предварительного фильтра при постоянном давлении 3 бар, и только приблизительно 9,6 мл раствора получилось отфильтровать даже через 3 час, как показано на Фиг. 12. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит 4900 час или больше. Количество мультимеров на мембране для удаления вирусов составило 1 г на 1 м². Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 9.

[0179]

(Пример 5)

Тот же самый способ, что и в Примере 1, был выполнен для того, чтобы приготовить 25 мл раствора, имеющего окончательную концентрацию глобулина 30 мг/мл, концентрацию хлористого натрия 50 ммоль/л и значение pH 5,3, и раствор A был добавлен к раствору так, чтобы в нем содержалось 1,03 мг мультимеров.

[0180]

Подготовленным предварительным фильтром был Durapore (Merck KGaA), имеющий мембрану с площадью 10 см², включающую поливинилиденфторид (PVDF) и имеющую размер пор 0,1 мкм. Предварительный фильтр был присоединен выше по течению перед мембраной для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, и имеющей площадь 3 см², и фильтрация выполнялась при постоянном давлении на мембрану для удаления вирусов, равном 3 бар. Таким образом было найдено, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл приготовленного раствора составляет 84 мин, как представлено на Фиг. 13. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 14.

[0181]

(Пример 6)

Предварительный фильтр, приготовленный для того же самого раствора, что и в Примере 5, включал в себя два Virosart Max (Sartorius Stedim Japan K. К.), соединенных последовательно и содержащих трехслойные мембраны с площадью 5 см², включающие полиамид и имеющие размер пор 0,1 мкм. Предварительный фильтр был присоединен выше по течению перед мембраной для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Производственном примере 5, и имеющей площадь 3 см², и фильтрация выполнялась при постоянном давлении на мембрану для удаления вирусов, равном 3 бар. Таким образом было найдено, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл приготовленного раствора составляет 340 мин, как представлено на Фиг. 13. Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 14.

[0182]

(Сравнительный пример 5)

Тот же самый раствор, что и в Примере 5, фильтровался без использования предварительного фильтра перед мембраной для удаления вирусов, произведенной в тех же самых условиях, что и в Примере 5, имеющей площадь 3 см², при постоянном давлении на мембрану для удаления вирусов, равном 3 бар, и только приблизительно 9,6 мл раствора удалось отфильтровать за 6 час, как представлено на Фиг. 13. Из такой кривой можно ожидать, что фактическое время для фильтрации общего количества 25 мл раствора составит 150000 час или больше. Количество мультимеров на мембране для удаления вирусов составило 3,4 г на 1 м². Результаты, полученные путем преобразования каждого результата настоящего испытания в общее количество, подлежащее фильтрации, на единицу площади мембраны, представлены на Фиг. 14.

[0183]

(Способность к удалению вирусов мембраны для удаления вирусов в присутствии мультимера)

(1) Приготовление содержащего мультимеры и вирусы белкового раствора

Поликлональные антитела (человеческий IgG) (Venoglobulin–IH производства компании Benesis Corporation) использовались для обеспечения 300 мл раствора антител, который был разбавлен водой для инъекций (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) так, чтобы концентрация антител составляла 30 мг/мл. Концентрация соли была доведена до 0,1 моль/л при помощи водного раствора NaCl с концентрацией 1 моль/л. Кроме того, значение pH было доведено до 4,0 при помощи 0,1 моль/л HCl или 0,1 моль/л NaOH для того, чтобы обеспечить белковый раствор. Раствор A был добавлен к получаемому белковому раствору так, чтобы белковый раствор содержал 0,1125 мг мультимеров, и свиной парвовирус (PPV; производства Японской ассоциации ветеринарных биопрепаратов) был дополнительно добавлен в концентрации 3,0 об.% и хорошо перемешан, чтобы обеспечить содержащий мультимеры и вирусы белковый раствор.

[0184]

(Пример 7)

Содержащий мультимеры и вирусы белковый раствор был подвергнут непроточной фильтрации при давлении фильтрации 196 кПа с помощью Virosart Max (Sartorius Stedim Japan K. К.) в качестве предварительного фильтра, соединенного с произведенной мембраной для удаления вирусов, имеющей площадь 0,0003 м². Никаких вирусов не было обнаружено в фильтрате, полученном после фильтрации полного количества раствора.

[0185]

(Сравнительный пример 6)

Тот же самый раствор, что и в Примере 1, был подвергнут непроточной фильтрации без использования предварительного фильтра, но быстрое уменьшение скорости фильтрации стало наблюдаться после фильтрации приблизительно 60 мл раствора, и остальную часть фильтрации было трудно выполнить, поэтому фильтрация была прервана после фильтрации приблизительно 80 мл раствора. Вирусы были обнаружены в фильтрате, полученном до момента прерывания, и мембрана для удаления вирусов не смогла полностью удалить вирусы. Если бы было отфильтровано полное количество раствора, то мембрана для удаления вирусов содержала бы 0,375 г мультимеров на 1 м².

СПИСОК ССЫЛОЧНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

[0186]

1 – первичная поверхность

2 – вторичная поверхность

10 – мембрана для удаления вирусов.

Изобретение относится к способу для фильтрации содержащей белок жидкости. Способ фильтрации жидкости, содержащей белок в концентрации от 20 мг/мл до 100 мг/мл, включающий: стадию предварительной фильтрации содержащей белок жидкости с помощью предварительного фильтра, имеющего размер пор 0,08 мкм – 0,25 мкм и содержащего гидрофобную смолу, и стадию удаления вирусов после стадии предварительной фильтрации путем фильтрования содержащей белок жидкости мембраной для удаления вирусов, содержащей синтетический полимер, причем содержащая белок жидкость до выполнения стадии предварительной фильтрации содержит 0,25 г или больше тримера или мультимера белков, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм на 1 м² мембраны для удаления вирусов. Технический результат - повышение эффективности уменьшения количества вирусов без денатурации полезных белков. 24 з.п. ф-лы, 13 пр., 14 ил.

1. Способ фильтрации жидкости, содержащей белок в концентрации от 20 мг/мл до 100 мг/мл, включающий:

стадию предварительной фильтрации содержащей белок жидкости с помощью предварительного фильтра, имеющего размер пор 0,08 мкм – 0,25 мкм и содержащего гидрофобную смолу, и

стадию удаления вирусов после стадии предварительной фильтрации путем фильтрования содержащей белок жидкости мембраной для удаления вирусов, содержащей синтетический полимер,

причем содержащая белок жидкость до выполнения стадии предварительной фильтрации содержит 0,25 г или больше тримера или мультимера белков, имеющего средний диаметр меньше чем 100 нм, на 1 м² мембраны для удаления вирусов.

2. Способ по п. 1, в котором предварительный фильтр содержит материал, выбранный из группы, состоящей из полиамидной смолы, смолы на основе полисульфона и фторкаучука.

3. Способ по п. 2, в котором предварительный фильтр содержит полиэфирсульфон или поливинилиденфторид.

4. Способ по любому из пп. 1–3, в котором содержащая белок жидкость до выполнения стадии предварительной фильтрации дополнительно содержит частицы, которые представляют собой мультимеры белков, и которые имеют средний диаметр 100 нм или больше.

5. Способ по любому из пп. 1–3, дополнительно содержащий стадию диафильтрации содержащей белок жидкости перед стадией предварительной фильтрации.

6. Способ по любому из пп. 1–3, дополнительно содержащий стадию ультрафильтрации содержащей белок жидкости перед стадией предварительной фильтрации.

7. Способ по п. 5, не содержащий дополнительно стадию ультрафильтрации и стадию диафильтрации после стадии диафильтрации.

8. Способ по любому из пп. 1–3, дополнительно содержащий стадию фильтрации с тангенциальным потоком при помощи устройства фильтрации с тангенциальным потоком перед стадией предварительной фильтрации.

9. Способ по любому из пп. 1–3, дополнительно содержащий стадию перемешивания содержащей белок жидкости в течение 2 ч или более перед стадией предварительной фильтрации.

10. Способ по любому из пп. 1–3, не содержащий никаких других стадий между стадией предварительной фильтрации и стадией удаления вирусов.

11. Способ по любому из пп. 1–3, в котором стадия предварительной фильтрации и стадия удаления вирусов выполняются последовательно.

12. Способ по любому из пп. 1–3, в котором предварительный фильтр является листовым фильтром.

13. Способ по любому из пп. 1–3, в котором предварительный фильтр содержит многослойную мембрану.

14. Способ по любому из пп. 1–3, в котором предварительный фильтр содержит многослойную мембрану, в которой каждый слой отличается по размеру пор фильтра.

15. Способ по любому из пп. 1–3, в котором вязкость содержащей белок жидкости, отфильтрованной предварительным фильтром, является более низкой, чем вязкость содержащей белок жидкости перед фильтрацией предварительным фильтром.

16. Способ по любому из пп. 1–3, в котором белок содержит антитело.

17. Способ по любому из пп. 1–3, в котором белок содержит моноклональное антитело.

18. Способ по любому из пп. 1–3, в котором мембрана для удаления вирусов содержит фторкаучук.

19. Способ по п. 18, в котором мембрана для удаления вирусов содержит поливинилиденфторид.

20. Способ по любому из пп. 1–3, в котором логарифмический коэффициент удаления (LRV) парвовируса мембраной для удаления вирусов составляет 4,0 или больше.

21. Способ по любому из пп. 1–3, в котором мембрана для удаления вирусов содержит:

первичную поверхность, к которой подается содержащая белок жидкость, отфильтрованная предварительным фильтром, и

вторичную поверхность, из которой вытекает жидкость, прошедшая через мембрану для удаления вирусов,

причем, в том случае, когда раствор, содержащий коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм, проходит через первичную поверхность в мембрану для удаления вирусов для захвата коллоидов золота для измерения яркости в поперечном сечении мембраны для удаления вирусов, значение, получаемое путем деления стандартного отклонения значения площади спектра вариации в яркости на среднее значение площади спектра вариации в яркости, составляет 0,01 или больше и 1,50 или меньше,

при этом толщина зоны, где захватываются коллоиды золота, имеющие диаметр 20 нм или больше и 30 нм или меньше, в поперечном сечении мембраны для удаления вирусов во влажном состоянии, составляет 10 мкм или больше и 30 мкм или меньше.

22. Способ по любому из пп. 1–3, в котором содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации имеет значение рН 4,0 или больше и 8,0 или меньше.

23. Способ по любому из пп. 1–3, в котором содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации имеет ионную силу 0 ммоль/л или больше и 300 ммоль/л или меньше.

24. Способ по любому из пп. 1–3, в котором содержащая белок жидкость перед выполнением стадии предварительной фильтрации содержит добавку, содержащую по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из сахара и основной аминокислоты.

25. Способ по любому из пп. 1–3, в котором предварительный фильтр является стерилизуемым на месте.