ПОЛНОСТЬЮ ПРОТОЧНЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2023 года по МПК C07K1/16 C07K1/18 C07K1/34 C07K1/36 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к способу полностью проточной очистки для мелкомасштабной и крупномасштабной очистки белков, в частности, моноклональных антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Очистка антител может быть одним из самых дорогостоящих аспектов биопродукции. Моноклональные антитела (mAb) обычно очищают с использованием трехстадийной хроматографии на трех смолах, используя по меньшей мере определенную буферную систему на каждой стадии. Этот традиционный способ очистки включает стадию улавливания, за которой следует стадия промежуточной очистки, и завершается «полирующей» стадией и обычно занимает от 3 до 5 рабочих дней (включая хранение и открытые фазы). В таких традиционных способах эти три стадии выполняются в виде последовательности отдельных единичных операций, которые не могут работать в непрерывном режиме, поскольку между каждой стадией необходимы регуляция pH, молярности и концентрации белка. Соответственно, традиционные способы очистки обычно требуют множества различных буферов, а также множества единиц хранения между каждой прерванной стадией и несколькими системами. Таким образом, эти традиционные способы подвержены загрязнению, техническим сбоям и человеческим ошибкам. Кроме того, поскольку необходим перерыв между каждой стадией для концентрирования элюата, регуляции pH и проводимости и хранения элюата перед следующей стадией, и, поскольку стадия не может начаться до завершения предыдущей, такие традиционные способы очистки являются особенно длительными и дорогостоящими.

Высокая стоимость традиционных способов также объясняется общим использованием матрицы протеина А в качестве первой стадии очистки. Действительно, исторически сложилось так, что наиболее селективную смолу обычно добавляют на ранней стадии процесса, как в случае с протеином А, чтобы удалить как можно больше примесей. Однако даже если протеин А является наиболее селективной средой для очистки моноклональных антител, в процессе все еще остаются загрязнители. Эта стадия также является самой дорогой из всего процесса, в том числе потому, что она используется в качестве первой стадии при контакте с большим количеством загрязняющих веществ. Кроме того, оставшиеся загрязнители очень трудно удалить, чтобы обеспечить соответствие фармацевтическим спецификациям.

С увеличением титров клеточных культур и увеличением объемов клеточных культур, используемых для производства, последующая переработка рассматривается как узкое место в отрасли. Это особенно актуально для производства моноклональных антител, где акцент сместился с объема партии в сторону возможностей последующей обработки. Кроме того, исследования на ранней доклинической и клинической фазах требуют большего количества антител, которые могут вырабатываться быстрее. Следовательно, в промышленности существует потребность в более дешевом процессе, который может осуществляться в непрерывном режиме, для очистки белков, в частности для очистки антител, а также в сокращении времени, необходимого для получения партий, с учетом рисков загрязнения, технических сбоев и человеческих ошибок, а также требований к масштабированию процесса.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения нашли новый способ очистки белков, в частности, антител, причем указанный способ включает только три стадии в непрерывном полностью проточном режиме, ни одна из этих стадий не включает протеин А, и преимущественно с использованием только одного буфера, при этом с возможностью получать высокие выходы очищенных антител с отличной степенью чистоты. Таким образом, очищенные белки подходят для медицинского применения. Соответственно, способ можно использовать для очистки белков для клинических испытаний и/или для производства фармацевтической композиции, содержащей белок. Кроме того, этот способ не требует какой-либо межстадийной регуляции и, таким образом, может выполняться в закрытой системе от сбора белков, которые необходимо очистить, до конечного продукта.

Вкратце, этот метод состоит только из трех последовательных стадий, причем более дешевая технология, направленная на удаление большого количества загрязняющих веществ, используется в качестве первой стадии, технологии, используемые для второй и третьей стадии, становятся все более и более селективными, чтобы удалить оставшиеся небольшие количества загрязняющих веществ и, следовательно, используется в меньших объемах по сравнению с их использованием в традиционных процессах.

Таким образом, способ по изобретению включает в непрерывном режиме: одну стадию фильтрации, включающую использование по меньшей мере одного хелатирующего агента, стадию обмена, включающую использование по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны, и «полирующую» стадию, включающую использование комбинации мембранных адсорберов, в которых два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны по механизму действия. Способ согласно изобретению схематически изображен на Фигуре 1. Эти три стадии очистки преимущественно осуществляют в этом конкретном порядке. Кроме того, было обнаружено, что только один буфер, а именно буфер, используемый для стадии обмена, должен использоваться в течение всего процесса. Другими словами, уравновешивающий буфер, необязательно используемый на «полирующей» стадии, преимущественно идентичен буферу, используемому на стадии обмена. Этот буфер преимущественно включает бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту, например, в комбинации с NaCl, уксусной кислотой и водой. В частности, можно использовать только один буфер для всего процесса, обеспечивая совместимость между всеми стадиями и позволяя экономить на производстве и контроле качества в цепочке поставок и уменьшая потребности в хранении.

Способ по изобретению дополнительно позволяет отменить открытые фазы (то есть стадии, на которых система очистки открывается для выполнения ручной операции, такой как подготовка хроматографической колонки для нового буфера, разбавление образца или регуляция его pH), тем самым снижая риск загрязнения и предоставляя возможность работать в менее классифицированной окружающей среде. Кроме того, поскольку способ по изобретению преимущественно не включает использование какой-либо колонки и в основном использует мембранные адсорберы, которые являются одноразовыми и готовыми к использованию, нет необходимости в хранении или проверке повторного использования, не требуется подготовка или упаковка колонки, а также связанных элементов управления, отсутствует проверка чистоты и используется ограниченное оборудование. Таким образом, время технологического цикла сокращается, требования к масштабированию процесса сводятся к минимуму, и это позволяет сократить расходы на эксплуатацию и хранение. Следовательно, способ по изобретению позволяет как быстрое рентабельное производство партий, так и сокращение времени работы систем очистки. Таким образом, он подходит для масштабирования и очистки рекомбинантных белков от лабораторного до промышленного.

Для двух разных антител был разработан и реализован специальный протокол. В этом протоколе отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце первой стадии фильтрации, пропускается непосредственно через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану, т.е. без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление, а ретентат, полученный в конце стадии обмена, также проходит непосредственно через комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, то есть без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление. Преимущество этого протокола состоит в том, что он чрезвычайно быстрый (несколько часов), приводит к высокому выходу (более 70%), чистоте, совместимой со стандартами фармацевтической промышленности, и позволяет уменьшить количество используемых буферов и хранений. Более того, этот способ имеет то преимущество, что он чрезвычайно гибок и экономичен, поскольку он не включает использование матрицы протеина А, который обычно является наиболее дорогостоящим элементом традиционных процессов. Кроме того, он может быть полностью автоматизирован, работать в непрерывном режиме и не содержать открытой фазы. Более того, он был успешно выполнен для двух разных антител.

Таким образом, изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:

(a) стадию фильтрации, включающую:

пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;

(b) стадию обмена, включающую:

пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена,

извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

(c) «полирующую» стадию, включающую:

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

В изобретении также предлагается способ очистки белка из раствора, включающий:

(a) стадию фильтрации, включающую:

пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;

(b) стадию обмена, включающую:

пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена, причем указанный только один буфер идентичен уравновешивающему буферу, используемому на «полирующей» стадии (с);

извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

(c) «полирующую» стадию, включающую:

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером,

извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

В частности, изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:

(a) стадию фильтрации, включающую:

(i) пропускание раствора через по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

(ii) извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента,

(b) стадию обмена, включающую:

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена,

(ii) извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

и

(c) «полирующую» стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через комбинацию мембранных адсорберов, при этом указанный уравновешивающий буфер идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

(ii) пропускание ретентата, полученного на стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме,

(iii) извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

В одном варианте осуществления изобретения только один буфер используется на протяжении осуществления всего метода очистки. В конкретном варианте осуществления один буфер включает Tris, Tris-HCl, Бис Tris, фосфат и/или лимонную кислоту. В другом варианте осуществления один буфер содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно соли.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента стадии фильтрации выбирается из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента. В более конкретном варианте осуществления комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля и свободной анионообменной смолы. В другом конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию более чем двух различных матриц хелатирующего агента, то есть трех, четырех, пяти или более чем пяти.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму. В конкретном варианте осуществления отфильтрованный белковый раствор концентрируется на стадии обмена.

В одном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию двух мембранных адсорберов или комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, например трех, четырех или по меньшей мере четырех мембранных адсорберов.

В одном варианте осуществления мембранные адсорберы комбинации мембранных адсорберов выбраны из группы, состоящей из катионообменного мембранного адсорбера, анионообменного мембранного адсорбера, мультимодального мембранного адсорбера, мембранного адсорбера с гидрофобным взаимодействием и их комбинаций. В конкретном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.

В одном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, выбранных из группы, состоящей из катионообменных мембранных адсорберов, анионообменных мембранных адсорберов, мультимодальных мембранных адсорберов и мембранных адсорберов с гидрофобным взаимодействием.

В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию нанофильтрации после стадии (с) и, необязательно, стадию конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации после стадии нанофильтрации. В другом варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию инактивации при низком pH после стадии (c), после стадии нанофильтрации и/или после стадии конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации. В одном варианте осуществления изобретения способ включает перед стадией (а) стадию культивирования клеток в жидкой культуральной среде, предпочтительно в биореакторе, для получения жидкой культуральной среды, содержащей белок. Культивируемые клетки могут быть клетками млекопитающих, бактериями или дрожжами. В предпочтительном варианте осуществления культивируемые клетки могут быть клеточными линиями млекопитающих (например, клетками Vero, клетками CHO, клетками 3T3, клетками COS, клетками HEK293 и т.д., включая различные подтипы этих клеточных линий), а также первичными или созданными культурами клеток млекопитающих (например, полученные из лимфобластов, фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.д.).

В одном варианте осуществления изобретения очищаемый белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

Таким образом, изобретение также относится к интегрированному способу получения очищенного белка из жидкой культуральной среды.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) бис-Tris, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью лимонной кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄).

Изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану и комбинацию мембранных адсорберов, причем два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и один буфер, содержащий Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащий или состоящий из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl. В некоторых вариантах осуществления набор используется для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.

Изобретение также относится к набору, включающему по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану и комбинацию мембранных адсорберов, причем два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и инструкции по приготовлению одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящий из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl. В некоторых вариантах осуществления набор используется для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.

В настоящем описании также представлены выделенные белки, фармацевтические агенты и фармацевтические композиции, полученные любым из описанных в настоящем документе способов.

Эти и другие особенности и преимущества раскрытого способа очистки будут более понятны из следующего подробного описания вместе с прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется ее изложением, а не конкретным обсуждением признаков и преимуществ, изложенных в описании.

В контексте изобретения термины «содержащий», «имеющий», «включающий» следует толковать как неограниченные термины (т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь этим»), если не указано иное. Кроме того, термин «содержащий» включает «состоящий» (например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительное, например, X+Y).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Желая упростить процессы очистки белков и удешевить их, авторы изобретения разработали новый способ очистки, который является непрерывным, полностью проточным и не включает стадию хроматографии с протеином А.

Изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:

(a) стадию фильтрации, включающую:

пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;

(b) стадию обмена, включающую:

пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена,

извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

(c) «полирующую» стадию, включающую:

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

На стадии обмена (b) выражение «пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена» означает, что указанный фильтрованный белковый раствор и один буфер прпускаются через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану.

В конкретном варианте осуществления способ изобретения включает:

(a) стадию фильтрации, включающую:

(i) пропускание раствора через по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

(ii) извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента,

(b) стадию обмена, включающую:

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного на стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера,

(ii) извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

и

(c) «полирующую» стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через комбинацию мембранных адсорберов, при этом указанный уравновешивающий буфер идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

(ii) пропускание ретентата, полученного на стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме,

(iii) извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов,

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

Как указано выше, вышеуказанный способ изобретения включает только три стадии, ни одна из которых не является стадией хроматографии с протеином А. Несмотря на то, что способ согласно изобретению включает только три стадии и не содержит стадии хроматографии с протеином А, он позволяет получать очищенные белки, которые подходят для фармацевтических целей и, в частности, для введения людям.

В дополнение к отсутствию участия человека в процессе очистки (и, как следствие, сокращению общего времени, необходимого для завершения процесса очистки), раскрытый способ снижает количество буферов, используемых для очистки, а отсутствие стадии хроматографии с протеином А снижает затраты. Раскрытый способ очистки также упрощает очистку mAb, улучшает общий выход и уменьшает сырье, возможности для хранения, стоимость товаров и время процесса в дополнение к возможности очистки множества mAb.

В отличие от обычных способов очистки белков, как указано выше, в способе, описанном в настоящем документе, используется один уникальный буфер, этот уникальный буфер используется на стадии обмена и для уравновешивания мембранных адсорберов на полирующей стадии.

Используемый в настоящем описании термин «буферы согласно изобретению» относится к буферам, содержащим бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту. Бис-Tris, Tris или Tris-HCl представляют собой соединения, хорошо известные специалистам в данной области:

название IUPAC: 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол, а номер CAS 6976-37-0 для Bis Tris,

2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол и номер CAS 77-86-1 для Trisа, и

2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол гидрохлорид и номер CAS 1185-53-1 для Tris-HCl.

Такой буфер согласно изобретению может соответствовать буферу обмена и уравновешивающему буферу.

Более конкретно, такой буфер согласно изобретению может содержать или состоять из различных концентраций одних и тех же химических веществ (одним из них является бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонная кислота). В конкретном варианте осуществления буфер включает бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту. В конкретном варианте осуществления буфер включает или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты и (iii) воды. В более конкретном варианте осуществления буфер содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) NaCl и (iv) воды. Другими словами, такой буфер включает или состоит из различных концентраций (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) NaCl и (iv) воды.

Буфер обмена может, например, содержать или состоять из 5-40 мМ (например, 20 мМ) бис-Tris и от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 5-40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 5-40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5), с помощью лимонной кислоты.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 15-150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄).

Такие обменные буферы особенно подходят для использования на стадии обмена, в частности, с кассетами TFF, но также подходят для уравновешивания мембранных адсорберов, в частности уравновешивания комбинации катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.

Преимущества вышеупомянутых буферных составов включают способность продукта mAb проходить через три стадии способа, в частности стадию обмена и «полирующую» стадию, с большей совместимостью, минимизируя нежелательные взаимодействия, ограничивая падение pH и проводимости и способствуя повышению выхода по сравнению с традиционными методами очистки. Использование такого буферного состава позволяет реализовать метод без какого-либо промежуточного хранения между тремя стадиями (a), (b) и (c).

Соответственно, в конкретном варианте осуществления способ не содержит какого-либо промежуточного хранения между тремя стадиями (а), (b) и (с).

При повторном использовании мембранных адсорберов полирующей стадии необязательно можно использовать дезинфицирующий буфер. Такой дезинфицирующий буфер может содержать или состоять, по меньшей мере, из NaOH, более предпочтительно от 0,05 Н до 1 Н (например, 0,5 Н) NaOH.

Используемые в настоящем описании термины «полипептид» или «белок» относятся к:

1) молекулам, имеющим последовательность нативных белков, то есть к а) белкам, продуцируемым природными и специфически нерекомбинантными клетками, или b) генно-инженерным или рекомбинантным клеткам, или

2) молекулам, отличающимся от последовательности нативных белков делециями, добавлениями и/или заменами одной или более аминокислот и/или по меньшей мере одной посттрансляционной модификацией (например, гликозилированием).

Молекулы, упомянутые в пункте 1) выше, можно назвать нативными белками.

Молекулы, упомянутые в пункте 2) выше, не являются природными белками.

В определенных аспектах очищаемый белок представляет собой антитело.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Связывающие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, однодоменные антитела, такие как антитела VHH (нанотела) и одноцепочечные антитела. Термин «тяжелая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену.

Термин «тяжелая цепь», используемый в настоящем описании, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, VH, и три домена константной области, CH1, CH2 и CH3. Домен VH находится на аминоконце полипептида, а домен CH3 находится на карбоксильном конце.

Используемый в настоящем описании термин «легкая цепь» охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, VL, и домен константной области, CL. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится на аминоконце полипептида. Используемый в настоящем описании термин «легкая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену.

Встречающиеся в природе структурные единицы антитела обычно содержат тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну полноразмерную легкую цепь (обычно с молекулярной массой примерно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно с молекулярной массой примерно 50 кДа - 70 кДа). Аминоконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область из примерно 100-110 или более аминокислот, которая обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно определяет константную область, отвечающую за эффекторную функцию. Легкие цепи человека обычно классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи обычно классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая, помимо прочего, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая, помимо прочего, IgM1 и IgM2. IgA аналогично подразделяется на подклассы, включая, помимо прочего, IgA1 и IgA2. В полноразмерных легких и тяжелых цепях, как правило, вариабельные и константные области соединены областью «J» из примерно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область «D» из примерно 10 дополнительных аминокислот.

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи обычно образуют антигенсвязывающий сайт. Вариабельные области обычно обладают одинаковой общей структурой относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или CDR. CDR из двух цепей каждой пары обычно выравниваются по каркасным областям, что может способствовать связыванию со специфическим эпитопом. От N-конца до C-конца вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Присвоение аминокислот к каждому домену обычно соответствует определениям Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Биспецифическое или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных сайта связывания.

Фрагмент F(ab) состоит из одной легкой цепи, а также CH1 и вариабельной области одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы F (ab) не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент F(ab') содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит больше константной области между доменами CH1 и CH2, так что межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями с образованием F(ab')2 молекулы. Область Fv включает вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей, но не имеет константных областей. Одноцепочечные антитела - это молекулы Fv, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены гибким линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область. Под бивалентным антителом, отличным от «полиспецифического» или «многофункционального» антитела, в некоторых вариантах осуществления понимаются сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.

Моноклональные антитела (mAb), которые могут быть очищены описанным способом, могут быть получены различными способами, включая традиционную методологию моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток, хорошо известную в данной области. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе могут быть использованы другие методы получения моноклональных антител, например вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов. Моноклональное антитело может, например, соответствовать мышиному, химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу.

Неограничивающие примеры антител, которые могут быть очищены способом по изобретению, также включают: панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алимуромабатол, альтумомабатол, алтумомабатол , атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, бициромаб, канакинумаб, цетуксимаб, даклизумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этанерцепт, голимумаб, инфликсимаб, натализумаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб , ритуксимаб, тоцилизумаб, трастузумаб, дупилумаб, сарилумаб или фрезолимумаб.

В определенных аспектах очищаемый белок представляет собой фермент.

Неограничивающие примеры ферментов, которые можно очистить способом по изобретению, включают кислую α-глюкозидазу, α-L-идуронидазу, идуронатсульфатазу, гепаран N-сульфатазу, галактозо-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкуронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу (α-галактозидазу B), кислую липазу, лизосомную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу, галактозилцерамидазу, α-галактозидазу А, кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A или гексозаминидазу B.

Другие неограничивающие примеры белков, которые могут быть очищены способом по настоящему изобретению, включают человеческий эритропоэтин, фактор некроза опухоли (например, TNF-α, TNF-β или TNF-K), интерферон альфа или интерферон бета.

Раствор, содержащий очищаемый белок, может быть культуральной средой, предпочтительно осветленной культуральной средой. Раствор, содержащий очищаемый белок, представляет собой, например, культуральную среду, полученную в перфузионном биореакторе или биореакторе периодического действия с подпиткой.

Примеры перфузионных биореакторов или биореакторов периодического действия с подпиткой раскрыты в патентных заявках US 2014/255994, US 2015/232505, US 2015/183821 и US 2017/218012, а также международной заявке WO2014/137903 (полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки).

Термин «осветленная культуральная среда» означает жидкую культуральную среду, полученную из культуры клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей, которая практически не содержит (например, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 99%) клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей.

В конкретном варианте осуществления первая стадия фильтрации способа по изобретению может быть интегрирована в стадию осветления, используемую для получения осветленной культуральной среды во время выделения культуры клеток, указанная стадия фильтрации, таким образом, становится частью стадии осветления.

Выражение «извлечение белка» в контексте настоящего описания относится к сбору белка после применения раскрытого метода очистки.

В контексте изобретения выражение «хелатирующий агент» относится к любому типу сорбирующей среды в виде частиц или иммобилизованного лиганда, такого как активированный уголь, диатомитовая земля, гранулированная смола, которая в процессе очистки действует как абсорбент для отделения молекулы загрязняющих веществ, присутствующие в смеси, от целевой молекулы, подлежащей очистке. Выражение «матрица хелатирующего агента» не включает матрицу Протеина А.

В некоторых вариантах осуществления способа изобретения по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой сорбирующую среду в виде частиц.

По меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента может быть в форме колонок, фильтров или может быть добавлена в виде порошка в очищаемый продукт. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, используемую в контексте изобретения, добавляют в виде порошка в очищаемый продукт.

В конкретных вариантах осуществления раскрытого способа по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой фильтр с активированным углем. В других конкретных вариантах осуществления раскрытого способа по меньшей мере один хелатирующий агент представляет собой смолу.

По меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента, в частности, фильтр с активированным углем или смоляная среда, взаимодействует с загрязняющими веществами, что приводит к высокой эффективности удаления примесей. Другим преимуществом использования матрицы хелатирующего агента, в частности, использования активированного угля или смолы, является низкая аффинность к моноклональным антителам.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента стадии фильтрации выбирается из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента. В более конкретном варианте осуществления комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля, в частности, фильтров с активированным углем, и свободной анионообменной смолы.

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа фильтр с активированным углем представляет собой фильтр с активированным углем Zeta Plus 35SP (выпускается 3М), Zeta Plus 53SP (выпускается 3М), Millistak CR40 (выпускается Millipore) или Zeta Plus 55SP (выпускается 3М).

В другом конкретном варианте осуществления описанного способа свободная анионообменная смола представляет собой NH2-750F (выпускается Tosoh) или Emphaze AEX (выпускается 3M). Характеристики смолы NH2-750F приведены ниже.

Размер пор (средний) > 100 нм Размер частиц (средний) 45 мкм (F-класс) Номинальное давление 0,3 МПа стабильность pH 2-13 Срок годности 10 лет (ориентировочно)

В контексте изобретения выражение «диафильтрация» относится к методике, в которой используются ультрафильтрационные мембраны для полного удаления, замены или снижения концентрации солей или растворителей из растворов.

Используемый в настоящем описании термин «ультрафильтрация» или «УФ» относится к методике фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора в зависимости от размера частиц и размера пор в УФ-мембране.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму.

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой готовый к обработке половолоконный картридж 30 кДа (выпускается GE).

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой встроенную диафильтрацию Cadence (выпускается Pall).

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одной диафильтрационной мембране на стадии обмена предшествует или за ней следует встроенный концентратор Cadence (выпускается Pall).

В другом конкретном варианте осуществления описанного способа по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой кассету Pellicon (выпускается Millipore) или кассету Sartocon (выпускается Sartorius).

Стадия обмена преимущественно позволяет очищать и концентрировать отфильтрованный белковый раствор. Под выражением «концентрирование отфильтрованного белкового раствора» в настоящем описании подразумевается, что концентрация белка в частично очищенном ретентате увеличивается по сравнению с его концентрацией в отфильтрованном белковом растворе.

В контексте изобретения «мембранный адсорбер» относится к плоскому листу полимера, в частности акрилового полимера, или волокна или нетканого материала, несущего функциональные группы, такие как аффинные группы и ионообменные группы. Одно из различий между смолой и мембраной заключается в распределении потока: за счет диффузии смолы и за счет конвекции в мембранах.

Комбинация мембранных адсорберов, используемых на полирующей стадии, включает использование по меньшей мере двух видов мембранных адсорберов, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия.

В контексте изобретения выражение «мембранные абсорберы, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия» означает, что используемые мембранные адсорберы имеют противоположные или различные механизмы действия, такие как катионообменные и анионообменные взаимодействия, мультимодальные и анионообменные взаимодействия, катионообменные и гидрофобные взаимодействия или анионообменные и гидрофобные взаимодействия и действуют как единственная интегрированная стадия, т.е. когда они процессируются вместе, как если бы это была единственная стадия фильтрации.

Действительно, авторы изобретения показали, что использование такой комбинации мембранных адсорберов позволяет улавливать примеси, сводя к минимуму адсорбцию интересующего продукта.

В предпочтительном варианте осуществления, где используются более двух мембранных адсорберов в комбинации мембранных адсорберов «полирующей» стадии, то есть по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер для суммарно трех, четырех или более четырех мембранных адсорберов, указанный по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер представляет собой мембрану, имеющую другой механизм действия по сравнению с двумя мембранными адсорберами, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; суммарно эти более чем два мембранных адсорбера все еще рассматривается как единая интегрированная стадия.

В качестве неограничивающего примера указанный по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер имеет гидрофобные взаимодействия или мультимодальные взаимодействия, если два мембранных адсорбера, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия, обладают катионообменным и анионообменным взаимодействиями, соответственно.

В контексте изобретения мембранные адсорберы, в частности, объединены в единую интегрированную стадию. Таким образом, количество стадий и буферов резко сокращается. Корректировки и манипуляции также удаляются, что глобально упрощает процесс. В частности, отсутствуют стадии элюирования, регуляции или хранения между одним мембранным адсорбером из комбинации мембранных адсорберов и другим(другими) мембранным(и) адсорбером(ами) такой комбинации мембранных адсорберов.

В конкретных вариантах осуществления конкретная комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии и условия работы (в частности, pH, проводимость и/или буфер) определяются в соответствии с физико-химическими свойствами очищаемого белка (например, pI, молекулярная масса, …).

Как будет понятно квалифицированному специалисту, оптимальные условия «полирующей» стадии должны позволить получить максимальный выход интересующего белка, то есть должны обеспечивать наименьшее взаимодействие интересующего белка с комбинацией мембранных адсорберов, в то же время позволяя максимально удаление загрязняющих веществ, то есть при максимально возможном взаимодействии загрязняющих веществ с комбинацией мембранных адсорберов без какой-либо регуляции или стадии элюирования между мембранными адсорберами из комбинации мембранных адсорберов.

Пример определения оптимальной комбинации двух мембранных адсорберов для полирующей стадии показан на Фигуре 3. В этом примере наилучшие характеристики очистки достигаются при использовании комбинации мембранных адсорберов Sartobind S и Sartobind STIC с более высоким очищением от загрязняющих веществ (более низким HCP и HMW) при максимальном выходе антител. На этой Фигуре также показано влияние загрузки на выход и удаление загрязняющих веществ.

В контексте изобретения, чтобы определить эти оптимальные условия, мембранные адсорберы из комбинации мембранных адсорберов следует рассматривать как единый объект или единственную интегрированную стадию, то есть где они процессируются вместе, как если бы это была единственная стадия фильтрации. Например, в случае двух мембранных адсорберов, тогда как традиционный способ определения оптимальных условий при использовании двух мембранных адсорберов включает определение наилучших условий на первом мембранном адсорбере, затем определение наилучших условий на втором мембранном адсорбере и затем регуляция продукта (например, регуляция pH, регуляция проводимости или регуляция буфера) между обоими наилучшими условиями, в контексте изобретения два мембранных адсорбера рассматриваются только как один, и следует определить компромисс в отношении стратегии разделения двух мембранных адсорберов, позволяющей добиться хорошей очистки.

Как правило, при определении оптимизированного буфера, который будет использоваться для очистки данного белка, стадия обмена может быть выполнена с нейтральным буфером, а pH и проводимость раствора, содержащего ретентат, могут быть отрегулированы вручную, чтобы определить оптимальные условия очистки на «полирующей» стадии. Когда оптимальные условия определены, процесс может быть выполнен снова с использованием соответствующего буфера для стадии обмена, который будет соответствовать уравновешивающему буферу, используемому на полирующей стадии.

Пример определения оптимальных буферов (таких как проводимость или pH буфера) в соответствии с комбинацией двух мембранных адсорберов, используемых на полирующей стадии, и pI интересующего белка проиллюстрирован на Фигуре 4. В этом примере условия pH и проводимости, позволяющие получить благоприятную очистку (соответствующую уровню HCP, составляющему от 50 до 500 нг/мл), соответствуют черным областям каждого графика.

В контексте изобретения один буфер, используемый для уравновешивания по меньшей мере двух мембранных адсорберов, является таким же, как буфер, используемый на стадии обмена. Это позволяет очищать белок напрямую, чтобы максимизировать выход при сохранении большей части загрязняющих веществ.

В конкретных вариантах осуществления полирующая стадия оптимизируется изменением pH и проводимости буфера, используемого для кондиционирования белка во время стадии обмена.

В конкретных вариантах осуществления «полирующая» стадия включает использование матрицы катионообменного мембранного адсорбера в сочетании с матрицей анионообменного мембранного адсорбера. В других вариантах осуществления «полирующая» стадия включает использование мультимодальной (смешанной) матрицы мембранного адсорбера в сочетании с матрицей анионообменного мембранного адсорбера.

Комбинация матриц мембранных адсорберов, в частности, комбинация катионообменных мембранных адсорберов и анионообменных мембранных адсорберов, функционирует посредством взаимодействия между мембранным адсорбером и загрязняющими веществами, что приводит к высокоэффективному удалению примесей. Взаимодействие с загрязняющими веществами обусловлено несколькими механизмами: ионным, гидрофобным, ван-дер-ваальсовым и взаимодействиями водородных связей.

В конкретных вариантах осуществления катионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind S (Sartorius), мембранный адсорбер HD-C (Natrix). В конкретных вариантах осуществления катионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind S (Sartorius). В конкретных вариантах осуществления анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind STIC (Sartorius), мембранный адсорбер Sartobind Q (Sartorius) или мембранный адсорбер HD-Q (Natrix). В конкретных вариантах осуществления анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind STIC (Sartorius) или мембранный адсорбер Sartobind Q (Sartorius). В других вариантах осуществления мультимодальный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер HD-Sb (Natrix). В других вариантах осуществления мембранный адсорбер с гидрофобным взаимодействием представляет собой мембранный адсорбер Sartobind Phenyl (Sartorius).

В конкретном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Sartobind STIC (Sartorius).

Основное преимущество использования мембранных адсорберов, а не колонок на «полирующей» стадии способа по изобретению, кратко изложено ниже:

- при сопоставимых масштабах мембранные адсорберы можно использовать при скорости потока в 10 раз выше, чем у колонки, тем самым резко сокращая продолжительность процесса. Например, колонка на 5 мл, заполненная смолой, будет использоваться при скорости потока 1 мл/мин, тогда как соответствующий 5-миллилитровый мембранный адсорбер будет использоваться при минимальной скорости потока 10 мл/мин. Соответственно, когда классический процесс, использующий две хроматографические полирующие стадии, выполняется за 2 часа 30 минут с использованием двух колонок, заполненных смолой, он может быть завершен менее чем за 15 минут с использованием мембранных адсорберов.

- даже если они многоразовые, мембранные адсорберы представляют собой устройства одноразового использования, которые, таким образом, можно выбросить после партии, и его не нужно хранить в течение длительного времени. Поэтому нет необходимости проверять их, чтобы гарантировать долгосрочную стабильность.

- использование мембранных адсорберов дешевле, поскольку позволяет избежать затрат на колонку, набивки колонки и хранения колонки.

В конкретном варианте осуществления, когда комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Startobind STIC (Sartorius), один буфер имеет pH и проводимость в диапазонах, указанных на черных областях верхних панелей Фигуры 4.

В другом конкретном варианте осуществления, когда комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Startobind Q (Sartorius), один буфер имеет pH и проводимость в диапазонах, указанных на черных областях нижних панелей Фигуры 4.

Способ очистки согласно изобретению является способом полностью проточной очистки.

Под «способом полностью проточной очистки» здесь подразумевается, что все различные стадии очистки данного способа подразумевают связывание примесей только при пропускании интересующего белка через стадии очистки.

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению не включает регуляцию pH отфильтрованного белкового раствора в конце стадии фильтрации и/или ретентата в конце стадии обмена.

В конкретном варианте осуществления отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце стадии фильтрации, непосредственно пропускают через диафильтрационную мембрану. Более конкретно, тогда между двумя стадиями не проводят никакой обработки (такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление). В таком способе диафильтрационная мембрана может, например, соответствовать готовому к обработке половолоконному модулю 30 кДа или встроенному модулю диафильтрации Cadence, которому предшествует или за которым, например, следует встроенный концентратор Cadence. Кроме того, в конкретном варианте осуществления ретентат, полученный в конце стадии обмена, непосредственно пропускают через комбинацию мембранных адсорберов «полирующей» стадии. Более конкретно, тогда между двумя стадиями не проводят никакой обработки (такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление). В таком способе диафильтрационная мембрана может, например, соответствовать готовому к обработке половолоконному модулю 30 кДа, и/или комбинация мембранных адсорберов может, например, соответствовать комбинации мембранного адсорбера Sartobind S и мембранного адсорбера Sartobind STIC.

В таком способе полностью отсутствуют межстадийные обработки, требующие ручного вмешательства и открытия системы очистки (например, разбавление, регуляция проводимости и регуляция pH).

Таким образом, способ по настоящему изобретению может быть реализован в гибкой автоматизированной хроматографической системе, включающей несколько насосов и датчиков с соединительными и переключающими клапанами для работы последовательно или непрерывно 3 стадий очистки.

Неограничивающим примером многооперационной системы является многоколоночная хроматографическая система MCCS с соответствующей адаптацией.

Способ согласно изобретению может выполняться в непрерывном режиме. Другими словами, способ по изобретению может быть непрерывным способом очистки белка из раствора.

Термин «непрерывный способ» или «способ в непрерывном режиме» означает способ, при котором происходит непрерывная подача текучей среды через по меньшей мере часть системы.

Под термином «текучая среда» здесь подразумевается любая жидкость, такая как раствор, содержащий очищаемый белок, буфер или раствор с низким или кислым pH для инактивации вирусов.

В конкретном варианте осуществления на первую, вторую и третью стадии очистки непрерывно подается текучая среда.

Термин «интегрированный процесс» означает процесс, который выполняется с использованием структурных элементов, которые функционируют совместно для достижения определенного результата (например, получение очищенного белка из жидкой культуральной среды).

Кроме того, способ согласно изобретению может выполняться в замкнутой системе от первой стадии способа до последней. Другими словами, способ согласно изобретению предпочтительно имеет функционально закрытый путь потока. В частности, три стадии очистки и необязательная стадия(и) фильтрации (например, стадия нанофильтрации и/или стадия конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации) могут выполняться в закрытой системе. В конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению раствор, содержащий белки, пропускают по частям через три стадии очистки, причем каждый проход части раствора соответствует циклу. Белки, извлеченные в конце каждого цикла, затем собираются и объединяются. В таком способе мембранный адсорбер стадии очистки используется несколько раз и необязательно дезинфицируется с использованием, например, дезинфицирующего буфера, как определено выше, что позволяет уменьшить объем устройств мембранных адсорберов и необходимый буфер. Например, последовательность от 3 до 50 циклов (например, от 3 до 30 циклов, от 5 до 25 циклов, от 10 до 20 циклов или 15 циклов) может выполняться непрерывно. Более конкретно, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 циклов могут выполняться в непрерывном режиме с последующей дезинфекцией мембранных адсорберов (например, с использованием дезинфицирующего буфера). Это может повторяться, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз, как показано на Фигуре 2.

Раскрытый в настоящем описании способ можно использовать для извлечения очищенных белков. Используемый в настоящем описании термин «очищенный» относится к чистоте, которая позволяет эффективно использовать белок in vitro, ex vivo или in vivo. Чтобы белок можно было использовать в приложениях in vitro, ex vivo или in vivo, он должен быть практически свободен от загрязняющих веществ, других белков и/или химикатов, которые могут помешать использованию этого белка в таких применениях или которые, по меньшей мере, были бы нежелательными для включения с интересующим белком. Такие применения включают приготовление терапевтических композиций, введение белка в терапевтической композиции и другие способы, раскрытые в настоящем описании. Предпочтительно, «очищенный» белок, как упоминается в настоящем описании, представляет собой белок, который может быть получен любым способом (т.е. путем прямой очистки из природного источника, рекомбинантно или синтетически) и который был очищен от других белковых компонентов, так что белок составляет, по меньшей мере, примерно 70% масс/масс от общего белка в данной композиции, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80% или, по меньшей мере, примерно 85%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 91%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 92%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 93%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 94%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 96%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно 97%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% масс/масс от суммарного белка в данной композиции.

В конкретном варианте осуществления способ изобретения включает:

(a) стадию фильтрации, включающую:

(i) пропускание раствора через по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме,

(ii) извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента,

(b) стадию обмена, включающую:

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного на стадии (а), и одного буфера через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану,

(ii) извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

и

(c) «полирующую» стадию, включающую:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через комбинацию мембранных адсорберов, при этом указанный уравновешивающий буфер идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

(ii) пропускание ретентата, полученного на стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме,

(iii) извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов,

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

при этом один буфер содержит или состоит из:

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) бис-Tris и от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты,

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты,

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью лимонной кислоты, или

- от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄) .

Способ очистки белка из раствора может включать, по меньшей мере, дополнительную стадию конечной фильтрации после «полирующей» стадии, такую как стадия нанофильтрации, стадия ультрафильтрации и/или стадия диафильтрации. При очистке рекомбинантных белков для фармацевтических целей полирующая стадия обычно сопровождается дополнительными стадиями конечной фильтрации. Следовательно, способ изобретения может дополнительно включать стадию нанофильтрации после стадии (с). После стадии нанофильтрации могут быть дополнительно проведены стадии ультрафильтрации и диафильтрации. Используемый в настоящем описании термин «ультрафильтрация» или «УФ» относится к методике фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора в зависимости от размера частиц и размера пор в УФ-мембране. Используемый в настоящем описании термин «нанофильтрация» относится к фильтрации раствора через нанофильтр, который используется для удаления, например, вирусных частиц. Используемый в настоящем описании термин «диафильтрация» относится к методике, в которой используются ультрафильтрационные мембраны для полного удаления, замены или снижения концентрации солей или растворителей из растворов.

Способ по настоящему изобретению может также дополнительно включать по меньшей мере одну стадию инактивации вируса. Указанная по меньшей мере одна стадия инактивации вирусов может быть выполнена на любом этапе способа по изобретению, например, перед стадией (а), после стадии (а), после стадии (b), после стадии (с), после стадии нанофильтрации и/или после стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации. Такая стадия инактивации вирусов обычно может быть стадией инактивации при низком или кислом pH. Используемый в настоящем описании термин «инактивация при низком или кислом pH» относится к методике вирусной инактивации с использованием кислого pH для денатурации вирусов, в частности, оболочечных вирусов Обычно стадию инактивации при низком или кислом pH проводят путем инкубации извлеченных белков при pH от примерно 3 до 5 (например, от примерно 3,5 до примерно 4,5, от примерно 3,5 до примерно 4,25, от примерно 3,5 до примерно 4, например 4) в течение периода по меньшей мере 15 минут (например, периода от 15 минут до 1 часа, периода от примерно 30 минут до 2 часов или периода от примерно 45 минут до 2 часов). Например, стадия инактивации при низком или кислом pH выполняется путем инкубации выделенных белков при pH 4 в течение, например, от 30 минут до 2 часов.

Способ по настоящему изобретению может также включать перед стадией (а) стадию предоставления жидкой культуральной среды, содержащей очищаемый белок, которая была очищена для удаления клеток и по существу не содержит клеток, при этом указанная жидкая культуральная среда подается по меньшей мере на одну матрицу хелатирующего агента.

Например, способ очистки белка из раствора по настоящему изобретению может включать:

(пре-а) стадию предоставления жидкой культуральной среды, содержащей очищаемый белок, которая была очищена для удаления клеток и по существу не содержит клеток,

(a) стадию фильтрации, включающую:

- пропускание указанной жидкой культуральной среды стадии (пре-a) по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме;

- извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;

(b) стадию обмена, включающую:

- пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена;

- извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны; и

(c) «полирующую» стадию, включающую:

- пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизма действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для замены на стадии (b);

- извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

Наконец, очищенный белок может быть включен в композицию, подходящую для хранения, и/или в фармацевтическую композицию, в частности, подходящую для введения животным и/или людям.

Одним из многочисленных преимуществ описанного способа является то, что он позволяет получать хорошие выходы белка высокой степени чистоты. Очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, может, например, иметь чистоту по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. , 99,2%, 99,5% или 99,9%. Более конкретно, одно из многочисленных преимуществ раскрытого способа состоит в том, что он позволяет получать растворы белка высокой степени чистоты, содержащего пониженные количества загрязняющей ДНК, высокомолекулярных (HMW) соединений (которые соответствуют белковым агрегатам) и/или белки клетки-хозяина (HCP). Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, может, например, демонстрировать количество загрязняющей ДНК менее 0,4 частей на миллиард, менее 0,3 частей на миллиард, менее 0,2 частей на миллиард или менее 0,1 частей на миллиард. Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, также может, например, демонстрировать концентрацию HMW-соединений, составляющую менее чем 0,6%, менее чем 0,5%, менее чем 0,4%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% или менее чем 0,1%. Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, также может, например, демонстрировать концентрацию HCP менее чем 500 нг/мл, менее чем 100 нг/мл, менее чем 90 нг/мл, менее чем 85 нг/мл, менее чем 80 нг/мл, менее чем 75 нг/мл или менее чем 70 нг/мл. Кроме того, способ по настоящему изобретению позволяет извлекать очищенный белок с выходом по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Изобретение также относится к набору, включающему или состоящему из:

(a) по меньшей мере, одной матрицы хелатирующего агента, по меньшей мере, одной диафильтрационной мембраны и комбинации мембранных адсорберов, где два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и

(b) одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящего из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl; и/или инструкции по приготовлению одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящего из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже фигурами и примерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 показана схема, представляющая трехстадийный полностью проточный способ согласно изобретению.

На Фигуре 2 показана схема, представляющая непрерывную версию трехстадийного полностью проточного способа по изобретению, используемого в Примере 4.

На Фигуре 3 показаны гистограммы, представляющие сравнение выхода (%), HMW (%) и HCP (нг/мл), полученных с 4 комбинациями мембранных адсорберов (HD-C+HD-Q; HD-Sb+HD-Q; Sartobind. S+Q; Sartobind S+STIC) в зависимости от емкости (мг/мл) мембран.

На Фигуре 4 показан график зоны наилучшего восприятия для двух комбинаций мембранных адсорберов (верхняя панель: Sartobind S+STIC; нижняя панель: Sartobind S+Q) и 3 мкл очищаемого белка (6; 7,5 и 9) в зависимости от pH и проводимости (мСм/см) уравновешивающего буфера. Условия pH и проводимости, позволяющие получить благоприятную очистку (соответствующую уровню HCP, составляющему от 50 до 500 нг/мл), соответствуют черным областям каждого графика.

На Фигуре 5 представлена частичная хроматограмма очистки (УФ 280 нм) на мембране во время непрерывного технологического эксперимента в лабораторных условиях.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Способ по изобретению в лабораторном масштабе

Способ по изобретению использовали для периодической очистки в лабораторном масштабе гуманизированного моноклонального антитела mAb1.

Этот эксперимент показывает результаты удаления примесей, полученные в лабораторном масштабе после трех стадий. Целью было удалить агрегаты (HMW) и белок клеток-хозяев (HCP) ниже 1% для HMW и 500 нг/мл для HCP.

Авторам изобретения удалось использовать 2 различных хелатирующих агента, одну стадию обмена и пару мембран (Sartobind S и STIC или Sartobind S и Q).

Стадия Условия (pH/проводимость) HMW (%) HCP (нг/мл) Стадия фильтрации Сбор массы Исходный материал 5,6 822 039 NH₂-750F смола Добавляли в массу и перемешивали 2 519 516 Активированный уголь CA1 Добавляли в массу и перемешивали 1,9 179 002 Активированный уголь CA2 Добавляли в массу и перемешивали 2 143 765 Стадия обмена UF/DF 30 кДа концентрация 2,2 474 742 UF/DF 30 кДа диафильтрация 2,7 488 279 Фильтрация 0,2 µм - - «Полирующая» стадия Sartobind S+Q мембраны pH 8,5-3мС/см 0 1582 Sartobind S+STIC мембраны pH 8,5-3 мС/см 0 348 Sartobind S+Q мембраны pH 7,5-3 мС/см 0 2023 Sartobind S+STIC мембраны pH 7,5-3 мС/см 0 604 Sartobind S+Q мембраны pH 6,5-3мС/см 0 7968 Sartobind S+STIC мембраны pH 6,5-3 мС/см 0 656 Sartobind S+Q мембраны pH 8,5-12 мС/см 0,8 11591 Sartobind S+STIC мембраны pH 8,5-12 мС/см 0 3297 Sartobind S+Q мембраны pH 7,5-12 мС/см 2,4 34727 Sartobind S+STIC мембраны pH 7,5-12 мС/см 0 3639 Sartobind S+Q мембраны pH 6,5-12 мС/см 3 63484 Sartobind S+STIC мембраны pH 6,5-12 мС/см 0 5589

Пример 2: Способ по изобретению в лабораторном масштабе

Способ по настоящему изобретению использовали для периодического процесса очистки гуманизированного моноклонального антитела mAb2 в лабораторном масштабе.

Этот эксперимент показывает результаты удаления примесей, полученные в лабораторном масштабе после трех стадий. Целью было удалить агрегаты (HMW) и белки клеток-хозяев (HCP) ниже 1% для HMW и 500 нг/мл для HCP. Авторам изобретения удалось использовать 2 вида хелатирующих агентов, одну стадию обмена и пару мембран (Sartobind S и STIC или Sartobind S и Q). Наилучший результат достигается с парой Sartobind S+STIC при условиях нагрузки, установленных на уровне pH 8,5 и 3 мС/см.

Стадия Условия (pH/проводимость) HMW (%) HCP (нг/мл) Стадия фильтрации Сбор массы Исходный материал 8,8 644 359 NH₂-750F смола Добавляли в массу и перемешивали 2 320 476 Активированный уголь CA1 Добавляли в массу и перемешивали 1,6 73 281 Активированный уголь CA2 Добавляли в массу и перемешивали 0,5 43 153 Стадия обмена UF/DF 50 кДа концентрация UF/DF 50 кДа концентрация Фильтрация 0,2 µм 0,7 333 573 «Полирующая» стадия Sartobind S+Q мембраны pH 8,5-3мС/см 0,1 882 Sartobind S+STIC мембраны pH 8,5-3 мС/см 0,2 182 Sartobind S+Q мембраны pH 7,5-3 мС/см 0,1 743 Sartobind S+STIC мембраны pH 7,5-3 мС/см 0 262 Sartobind S+Q мембраны pH 6,5-3 мС/см 0 5522 Sartobind S+STIC мембраны pH 6,5-3 мС/см 0 1117 Sartobind S+Q мембраны pH 8,5-12 мС/см 0,6 11 001 Sartobind S+STIC мембраны pH 8,5-12 мС/см 0 2710 Sartobind S+Q мембраны pH 7,5-12 мС/см 0,6 12 961 Sartobind S+STIC мембраны pH 7,5-12 мС/см 0,1 6463 Sartobind S+Q мембраны pH 6,5-12 мС/см 0,6 63553 Sartobind S+STIC мембраны pH 6,5-12 мС/см 0,2 -

Пример 3: Способ согласно изобретению в полупромышленном масштабе

Способ по настоящему изобретению использовали для процесса периодической очистки mAb1 в полупромышленном масштабе.

Тот же процесс, что и описанный в Примере 2, был увеличен до полупромышленного масштаба. Цель состояла в том, чтобы очистить 10 г с помощью трех стадий, за которыми следовала стадия нанофильтрации.

8 л осветленного супернатанта клеточной культуры очищали с помощью трех стадий способа по настоящему изобретению и нанофильтрации. 8 л были последовательно помещены в смеситель на 20 л: 250 мл смолы Tosoh NH2-750F, затем перемешивали 13 мин, 160 г активированного угля (марки Norit SA2), затем перемешивали 14 минут и 30 г активированного угля (марки Norit SA2), затем перемешивали 10 мин.

Продукт фильтровали (фильтр Filtrox) перед началом стадии обмена. После фильтрации извлекали примерно 9 л продукта (продукт выталкивали из фильтра с помощью 1 л стерильной воды). UF/DF выполняли с использованием полого волокна (790 см² - 50 кД - Spectrumlabs) на GE Uniflux. Буфер, используемый для диафильтрации продукта через полое волокно, представлял собой 20 мМ Bis Tris Q.S. до буфера уксусной кислоты pH 7,2.

Было получено 2,64 кг с концентрацией 6,9 г/л (18,2 г моноклонального антитела). Затем 2 л (14 г) выделенного продукта пропускали через два мембранных адсорбера: 75 мл Sartobind S 200 мл Sartobind Q. Две мембраны последовательно соединяли и использовали в проточном режиме с использованием GE AktaProcess.

Наконец, продукт подвергали нанофильтрации через предварительный фильтр (XOHC - Millipore) и фильтр Viresolve Pro (Millipore) для получения конечного качества.

В приведенной ниже таблице показано сравнение традиционного способа и способа согласно изобретению.

Традиционный способ Способ по изобретению Сравнение способов Стадии Протеин A+смешанный режим+AEX смолы Хелатирующие агенты+стадия обмена + «полирующая» стадия Количество колонок 3 0 Количество буферов 7 (за исключением дезинфицирующих буферов) 1 (за исключением дезинфицирующих буферов) Продолжительность 13 ч 8 ч 30 Выход 80% 70% Конечное качество HMW (%) 0,4 0,1 HCP (нг/мл) 100 70 ДНК (частей на миллион) <1 <1

Пример 4: Полностью непрерывный процесс согласно изобретению в лабораторном масштабе

Способ по настоящему изобретению использовали для процесса периодической очистки гуманизированного моноклонального антитела mAb1 в лабораторном масштабе в непрерывном режиме.

Целью эксперимента было очистить mAb1 из осветленного массового сбора с использованием непрерывного режима, что означает отсутствие прерывания, хранения или регуляции между каждой стадией. Авторам изобретения удалось использовать фильтрацию на хелатирующем агенте (иммобилизованный AEX, активированный уголь CA), одну стадию обмена (прямоточная диафильтрация) и пару мембран (Sartobind S и STIC).

3 л осветленного супернатанта клеточной культуры очищали с помощью трех стадий способа по изобретению. Продукт фильтровали через иммобилизованный анионообменник (Emphaze AEX BV120), а затем через фильтр с активированным углем (Millipore CR40 270 см²). Затем продукт поступал непосредственно в прямоточную диафильтрационную мембрану (0,2 м²) для концентрирования и диафильтрации (стадия обмена). Буфер, используемый для диафильтрации продукта, представлял собой 20 мМ Bis Tris, 20 мМ NaCl Q.S. до буфера уксусной кислоты pH 7,5.

Диафильтрованный продукт, извлеченный непосредственно со стороны ретентата, пропускали через промежуточный буферный мешок для компенсации разницы потоков на следующей стадии. Затем продукт пропускали через два полирующих мембранных адсорбера; 1 мл Sartobind S и 1 мл Sartobind STIC. Две мембраны были соединены последовательно и использованы в проточном режиме с использованием GE Akta Pure. Каждая единичная стадия напрямую связана с другой или через буферный мешок и обрабатывается непрерывно.

Множество циклов очистки было выполнено на мембранных адсорберах для обработки всего объема продукта, как показано на Фигуре 5 (экстракт из 50 циклов очистки на мембранах). В конце процесса весь пул продукта был восстановлен через стерильный фильтр. 40 мг mAb очищали каждые 5 минут, что приводило к продуктивности 240 г mAb1 на литр мембраны в час (240 г/л/час).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлен способ очистки белка, включающий в непрерывном режиме: одну стадию фильтрации, включающую применение по меньшей мере одного хелатирующего агента, стадию обмена, характеризующуюся применением диафильтрационной мембраны и «полирующую» стадию, включающую применение комбинации мембранных адсорберов, где два мембранных адсорбера указанной комбинации ортогональны с точки зрения механизма действия. Также раскрыт набор, пригодный для очистки белка из раствора. Изобретение позволяет получить новый способ очистки белков, преимущественно с использованием только одного буфера, с возможностью получения высокого выхода очищенных молекул с отличной степенью чистоты, что дает возможность использовать данные молекулы в медицинских целях. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Способ очистки белка из раствора, включающий:

(a) стадию фильтрации, включающую:

- пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме, где указанная матрица хелатирующего агента выбрана из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима,

- извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;

(b) стадию обмена, включающую:

- пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена,

- извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;

(c) полирующую стадию, включающую:

- пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),

- извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.

2. Способ по п. 1, где отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце стадии (а), пропускают непосредственно через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление.

3. Способ по п. 1 или 2, где ретентат, полученный в конце стадии (b), пропускают непосредственно через указанную комбинацию мембранных адсорберов без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где способ не содержит промежуточного хранения между тремя стадиями (а), (b) и (с).

5. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает функционально закрытую поточную линию.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где для всего способа очистки используется только один буфер.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где один буфер содержит Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно соли.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента.

9. Способ по п. 8, где комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля и свободной анионообменной смолы.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF).

11. Способ по любому из пп. 1-10, где по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где отфильтрованный белковый раствор концентрируют на стадии обмена.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где комбинация мембранных адсорберов на «полирующей» стадии представляет собой комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, выбранных из группы, состоящей из катионообменных мембранных адсорберов, анионообменных мембранных адсорберов, мультимодальных мембранных адсорберов и мембранных адсорберов гидрофобного взаимодействия.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где комбинация мембранных адсорберов на полирующей стадии представляет собой комбинацию катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.

15. Способ по любому из пп. 1-14, дополнительно включающий стадию нанофильтрации после стадии (с).

16. Способ по п. 15, дополнительно включающий стадию конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации после стадии нанофильтрации.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где белок представляет собой моноклональное антитело.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где один буфер содержит:

- от 5 до 40 мМ бис-Tris, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью уксусной кислоты,

- от 5 до 40 мМ Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью уксусной кислоты,

- от 5 до 40 мМ Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью лимонной кислоты, или

- от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄.

19. Способ по любому из пп. 1-18, дополнительно включающий стадию включения выделенного очищенного белка в фармацевтическую композицию.

20. Набор, пригодный для очистки белка из раствора в соответствии со способом по любому из пп. 1-19, содержащий или состоящий из:

(a) по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента, по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны и комбинации мембранных адсорберов, где два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия, и где указанная матрица хелатирующего агента выбрана из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима; и

(b) одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис Tris, фосфат и/или лимонную кислоту.