СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 G01N33/53 

Описание патента на изобретение RU2736224C2

Изобретение относится к области биологии и медицины и связано с разработкой способа выделения геномной ДНК из образцов биологического материала. Способ может быть использован при выполнении молекулярно-генетических исследований наследственных и мультифакторных заболеваний, в том числе при пренатальных исследованиях, генной дактилоскопии, исследованиях акушерских и гинекологических патологий и др. Способ применим для различного типа биологического материала, в том числе образцов цельной венозной и капиллярной крови, лейкоцитарной пленки, амниотической жидкости, ворсин плаценты, луковиц волос, сухих пятен цельной крови. Способ позволяет выделять ДНК из биологических образцов с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты выделяемой ДНК.

Анализ патентной и специальной литературы показал, что в настоящее время стандартными способами выделения ДНК является методы, основанные на использовании лизоцима, додецилсульфата натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК этанолом или изопропанолом [Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218, Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1885 p]. Основными недостатками указанных методов являются количество времени, затрачиваемое на проведение экстракции ДНК (2 дня), и многостадийность. Учитывая то, что многие клинические исследования, в частности пренатальные исследования, должны выполняться в кратчайшие сроки, сокращение длительности процесса является лимитирующим условием их использования. Другим недостатком указанных методов является невозможность или сложность стандартизации процесса для использования различных по качеству и количеству образцов, поступающих на исследования. Кроме того, недостатком данных методов является токсичность и дороговизна используемых реактивов.

Известны способы, в том числе и коммерческие наборы (DIAtom™ DNA Prep100) для выделения ДНК, на основе обратимой сорбции молекул ДНК на поверхности сорбента в присутствие хаотропной соли [Vogelstein В, Gillespie D. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 76, 615-619; Thompson J.D, Cuddy K.K., Hainess D.S., Gillespie D. 1990. Nucl. Acids Res., v. 18,1074]. Однако, в состав данных наборов входят йодистый натрий, перхлорат натрия и соли гуанидина, которые могут содержаться в остаточных концентрациях в конечном продукте выделения и могут снижать выход ДНК, а также ингибировать активность ряда ферментов, что ограничивает сферу их практического применения.

Известны способы выделения ДНК и коммерческие наборы (Dynabeads® DNA, Dynal; MagneSil, Promega; GenoPrep™ NA magnetic beads, Qiagen), основанные на использовании магнитной сепарации. Для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте. Основным недостатками данных методом является высокая стоимость реактивов и многостадийность.

Наиболее близким техническим решением является коммерческий набор «Экспресс-ДНК-Био» (Группа компаний «Алкор-био»), который так же, как и предлагаемый способ выделения, основан на термальном лизисе и последующем осаждении нерастворимых компонентов. Набор позволяет экспресс выделение ДНК из цельной крови и биоптатов. Однако, данный набор имеет ограниченную область применения и заявлено его применение для выделения ДНК, которая может быть использована только при постановке ПЦР в реальном времени. Кроме того, недостатком является стоимость набора и низкий выход ДНК.

Целью изобретения является повышение эффективности, снижение трудоемкости и длительности процесса выделения геномной ДНК для клинических исследований, а также удешевление способа.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований, включающем обработку биологических образцов лизирующим буфером, инкубирование, центрифугирование, инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование при 13,4 тыс об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0.75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS.

Выделяемая предлагаемым способом ДНК может быть использована в клинических молекулярно-генетических исследованиях, выполняемых с использованием методов ПЦР-ПДРФ анализа, аллель-специфичной ПЦР, мультиплексной лигазной реакции (МЛПА), ПЦР в реальном времени, КФ-ПЦР, прямого секвенирования по Сэнгеру. Предлагаемый способ позволяет осуществлять эффективный лизис клеточных и ядерных мембран, экстракцию ДНК и одновременное ее осаждение. Данный способ не использует токсичные реагенты и абсолютно безопасен для оператора.

Способ выделения заключается в добавлении к предварительно подготовленному образцу биологического материала лизирующего буфера, последующей инкубации образца при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечению времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Нерастворимые компоненты осаждаются на дно пробирки. Надоосадочную жидкость (супернатант) переносят в чистый эппендорф. Отобранный супернатант является конечным продуктом - раствором, содержащим выделенный образец ДНК, и далее его используют по назначению, в том числе для постановки реакции амплификации. Хранить образец выделенной ДНК данным методом следует при +4°С.

Экспериментальным путем было подтверждено, что при условии использования рекомендуемых объемов биологического образца для выделения ДНК концентрация полученных растворов ДНК составляет 30-60 нг/мкл; коэффициент А260/А280 находится в пределах 1,7-1,9, что свидетельствует о высокой чистоте образцов. Измерение концентрации ДНК выполнялось при помощи флуориметра Qubit (Thermo Fischer Scientific, USA), степень ее чистоты определялись спектрофотометрическим методом с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). Экспериментально было показано, что хранение образцов ДНК, выделенных данным способом, при температуре +4°С в течение 3 лет не влияет на качество ДНК.

Использование данного способа позволяет легко стандартизировать процесс без использования дополнительных исследований (спектрофотометрия, флуориметрия и т.д.), которые усложняют процесс и увеличивают время анализа, что часто является неприемлемым для клинических исследований.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образцом.

Пример 1. Выделение ДНК из образца амниотической жидкости (при сроках беременности 16-25 недель).

Образец амниотической жидкости объемом 4 мл. центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 2. Выделение ДНК из образца ворсины плаценты.

Образец плаценты объемом до 2 мм2 помещают в 100 мкл лизирующего буфера и инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. При анализе образцов большего размера следует увеличить объем лизирующего буфера. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 3. Выделение ДНК из образца цельной венозной или капиллярной крови.

Предварительно, образец цельной венозной крови следует центрифугировать в течение 5 минут при 1,5 тыс. об/мин для получения лейковзвеси. Затем 100 мкл надоосадочной жидкости переносят в чистый эппендорф и центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек с целью осаждения клеток крови. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют лизирующий буфер и осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 4. Выделение ДНК из сухого пятна цельной крови.

Предварительно, фильтровальную бумагу с сухим пятном цельной крови размером 0,2-0,5 см2 мелко нарезают и помещают в пробирку. Для первичной отмывки образца к нему добавляют 1,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и оставляют на 15-20 мин при комнатной температуре. Затем жидкость тщательно удаляют и добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Образец инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Изобретение решает задачу упрощения, стандартизации и удешевления процесса, а также сокращения времени экстракции ДНК до 15 минут. Изобретение также позволяет значительно уменьшить количество образца, используемого для выделения ДНК.

Похожие патенты RU2736224C2

название год авторы номер документа
Способ экстракции нуклеиновых кислот из ногтевых пластин 2020
  • Домонова Эльвира Алексеевна
  • Сильвейстрова Ольга Юрьевна
  • Шипулина Ольга Юрьевна
RU2751244C1
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ РАЗМОРОЖЕННОЙ КРОВИ 2018
  • Мальцева Нина Васильевна
  • Смирнова Анна Шамильевна
  • Колбаско Анатолий Владимирович
  • Онищенко Александр Леонидович
  • Рублевская Алина Сергеевна
RU2679907C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК MYCOPLASMA HOMINIS ИЗ ОБРАЗЦОВ КРОВИ 2013
  • Герасимова Наталья Авенировна
  • Евстигнеева Наталья Петровна
RU2533238C1
Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления 2016
  • Жигалева Ольга Николаевна
  • Шестюк Василий Михайлович
RU2628695C1
ТЕСТ-ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА Helicobacter pylori ГКПМ-Оболенск В-7215 ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ Helicobacter pylori В ОБРАЗЦАХ БИОПТАТОВ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ИЛИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ 2015
  • Жебрун Анатолий Борисович
  • Сварваль Алена Владимировна
  • Ферман Раиса Семеновна
RU2595422C1
СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ДНК, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ, ИЗ СУХИХ ПЯТЕН КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ 2017
  • Дерябина Светлана Степановна
  • Тузанкина Ирина Александровна
RU2645089C1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ГЕСТОЗА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ 2010
  • Глотов Андрей Сергеевич
  • Вашукова Елена Сергеевна
  • Бикмуллина Дина Рустемовна
  • Зайнулина Марина Сабировна
  • Баранов Владислав Сергеевич
  • Айламазян Эдуард Карпович
RU2431842C1
Среда и устройство для сбора, хранения и транспортировки биологических образцов, а также их применение для стабилизации внеклеточных нуклеиновых кислот 2022
  • Гра Ольга Алексеевна
  • Гра Дмитрий Вадимович
  • Селезнев Виктор Васильевич
RU2798013C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ/ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2006
  • Новикова Надежда Алексеевна
  • Голицына Людмила Николаевна
  • Епифанова Наталия Владимировна
  • Федорова Оксана Федоровна
  • Луковникова Любовь Борисовна
RU2313792C1
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ ОВЕЦ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ - ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 2009
  • Сальников Николай Игоревич
  • Малоголовкин Александр Сергеевич
  • Цыбанов Содном Жамьянович
  • Колбасов Денис Владимирович
  • Гузалова Анна Григорьевна
RU2416647C1

Реферат патента 2020 года СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, применимый для различного типа биологического материала, в том числе образцов цельной венозной и капиллярной крови, лейкоцитарной пленки, амниотической жидкости, ворсин плаценты, луковиц волос, сухих пятен цельной крови, включающий обработку биологических образцов лизирующим буфером, при этом инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование - при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0,75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS. Способ позволяет выделять ДНК из биологических образцов с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты выделяемой ДНК в способе экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований. 4 пр.

Формула изобретения RU 2 736 224 C2

Способ экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований, включающий обработку биологических образцов лизирующим буфером, инкубирование, центрифугирование, отличающийся тем, что инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование - при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0,75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2736224C2

Группа компаний Алкорбио, Молекулярно-генетическая диагностика, Санкт-Петербург, 2017, коммерческий набор "Экспресс-ДНК-Био" с
Прибор для нагревания перетягиваемых бандажей подвижного состава 1917
  • Колоницкий Е.А.
SU15A1
MARMUR
J.A., Procedure for the Isolation of Deoxiribonucleic Acid from Microorganisms J
Mol
Biol

RU 2 736 224 C2

Авторы

Иващенко Татьяна Эдуардовна

Насыхова Юлия Алмазовна

Тарасенко Ольга Александровна

Даты

2020-11-12Публикация

2018-12-28Подача