СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 G01N33/53 

Изобретение относится к области биологии и медицины и связано с разработкой способа выделения геномной ДНК из образцов биологического материала. Способ может быть использован при выполнении молекулярно-генетических исследований наследственных и мультифакторных заболеваний, в том числе при пренатальных исследованиях, генной дактилоскопии, исследованиях акушерских и гинекологических патологий и др. Способ применим для различного типа биологического материала, в том числе образцов цельной венозной и капиллярной крови, лейкоцитарной пленки, амниотической жидкости, ворсин плаценты, луковиц волос, сухих пятен цельной крови. Способ позволяет выделять ДНК из биологических образцов с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты выделяемой ДНК.

Анализ патентной и специальной литературы показал, что в настоящее время стандартными способами выделения ДНК является методы, основанные на использовании лизоцима, додецилсульфата натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК этанолом или изопропанолом [Marmur. J.A. J. Mol. Biol. 1961. 3: 208-218, Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1885 p]. Основными недостатками указанных методов являются количество времени, затрачиваемое на проведение экстракции ДНК (2 дня), и многостадийность. Учитывая то, что многие клинические исследования, в частности пренатальные исследования, должны выполняться в кратчайшие сроки, сокращение длительности процесса является лимитирующим условием их использования. Другим недостатком указанных методов является невозможность или сложность стандартизации процесса для использования различных по качеству и количеству образцов, поступающих на исследования. Кроме того, недостатком данных методов является токсичность и дороговизна используемых реактивов.

Известны способы, в том числе и коммерческие наборы (DIAtom™ DNA Prep100) для выделения ДНК, на основе обратимой сорбции молекул ДНК на поверхности сорбента в присутствие хаотропной соли [Vogelstein В, Gillespie D. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 76, 615-619; Thompson J.D, Cuddy K.K., Hainess D.S., Gillespie D. 1990. Nucl. Acids Res., v. 18,1074]. Однако, в состав данных наборов входят йодистый натрий, перхлорат натрия и соли гуанидина, которые могут содержаться в остаточных концентрациях в конечном продукте выделения и могут снижать выход ДНК, а также ингибировать активность ряда ферментов, что ограничивает сферу их практического применения.

Известны способы выделения ДНК и коммерческие наборы (Dynabeads® DNA, Dynal; MagneSil, Promega; GenoPrep™ NA magnetic beads, Qiagen), основанные на использовании магнитной сепарации. Для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте. Основным недостатками данных методом является высокая стоимость реактивов и многостадийность.

Наиболее близким техническим решением является коммерческий набор «Экспресс-ДНК-Био» (Группа компаний «Алкор-био»), который так же, как и предлагаемый способ выделения, основан на термальном лизисе и последующем осаждении нерастворимых компонентов. Набор позволяет экспресс выделение ДНК из цельной крови и биоптатов. Однако, данный набор имеет ограниченную область применения и заявлено его применение для выделения ДНК, которая может быть использована только при постановке ПЦР в реальном времени. Кроме того, недостатком является стоимость набора и низкий выход ДНК.

Целью изобретения является повышение эффективности, снижение трудоемкости и длительности процесса выделения геномной ДНК для клинических исследований, а также удешевление способа.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований, включающем обработку биологических образцов лизирующим буфером, инкубирование, центрифугирование, инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование при 13,4 тыс об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0.75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS.

Выделяемая предлагаемым способом ДНК может быть использована в клинических молекулярно-генетических исследованиях, выполняемых с использованием методов ПЦР-ПДРФ анализа, аллель-специфичной ПЦР, мультиплексной лигазной реакции (МЛПА), ПЦР в реальном времени, КФ-ПЦР, прямого секвенирования по Сэнгеру. Предлагаемый способ позволяет осуществлять эффективный лизис клеточных и ядерных мембран, экстракцию ДНК и одновременное ее осаждение. Данный способ не использует токсичные реагенты и абсолютно безопасен для оператора.

Способ выделения заключается в добавлении к предварительно подготовленному образцу биологического материала лизирующего буфера, последующей инкубации образца при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечению времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Нерастворимые компоненты осаждаются на дно пробирки. Надоосадочную жидкость (супернатант) переносят в чистый эппендорф. Отобранный супернатант является конечным продуктом - раствором, содержащим выделенный образец ДНК, и далее его используют по назначению, в том числе для постановки реакции амплификации. Хранить образец выделенной ДНК данным методом следует при +4°С.

Экспериментальным путем было подтверждено, что при условии использования рекомендуемых объемов биологического образца для выделения ДНК концентрация полученных растворов ДНК составляет 30-60 нг/мкл; коэффициент А260/А280 находится в пределах 1,7-1,9, что свидетельствует о высокой чистоте образцов. Измерение концентрации ДНК выполнялось при помощи флуориметра Qubit (Thermo Fischer Scientific, USA), степень ее чистоты определялись спектрофотометрическим методом с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). Экспериментально было показано, что хранение образцов ДНК, выделенных данным способом, при температуре +4°С в течение 3 лет не влияет на качество ДНК.

Использование данного способа позволяет легко стандартизировать процесс без использования дополнительных исследований (спектрофотометрия, флуориметрия и т.д.), которые усложняют процесс и увеличивают время анализа, что часто является неприемлемым для клинических исследований.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образцом.

Пример 1. Выделение ДНК из образца амниотической жидкости (при сроках беременности 16-25 недель).

Образец амниотической жидкости объемом 4 мл. центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 2. Выделение ДНК из образца ворсины плаценты.

Образец плаценты объемом до 2 мм² помещают в 100 мкл лизирующего буфера и инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. При анализе образцов большего размера следует увеличить объем лизирующего буфера. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 3. Выделение ДНК из образца цельной венозной или капиллярной крови.

Предварительно, образец цельной венозной крови следует центрифугировать в течение 5 минут при 1,5 тыс. об/мин для получения лейковзвеси. Затем 100 мкл надоосадочной жидкости переносят в чистый эппендорф и центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек с целью осаждения клеток крови. Надоосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют лизирующий буфер и осадок ресуспендируют. Суспензию инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени суспензию центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Пример 4. Выделение ДНК из сухого пятна цельной крови.

Предварительно, фильтровальную бумагу с сухим пятном цельной крови размером 0,2-0,5 см² мелко нарезают и помещают в пробирку. Для первичной отмывки образца к нему добавляют 1,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и оставляют на 15-20 мин при комнатной температуре. Затем жидкость тщательно удаляют и добавляют 100 мкл лизирующего буфера. Образец инкубируют при температуре 98°С в течение 15 минут. По истечении времени образец центрифугируют при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек. Надоосадочную жидкость переносят в чистый эппендорф и далее используют при постановке ПЦР.

Изобретение решает задачу упрощения, стандартизации и удешевления процесса, а также сокращения времени экстракции ДНК до 15 минут. Изобретение также позволяет значительно уменьшить количество образца, используемого для выделения ДНК.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, применимый для различного типа биологического материала, в том числе образцов цельной венозной и капиллярной крови, лейкоцитарной пленки, амниотической жидкости, ворсин плаценты, луковиц волос, сухих пятен цельной крови, включающий обработку биологических образцов лизирующим буфером, при этом инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование - при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0,75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS. Способ позволяет выделять ДНК из биологических образцов с высокой концентрацией и высокой степенью чистоты выделяемой ДНК в способе экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований. 4 пр.

Способ экспресс-выделения геномной ДНК для клинических исследований, включающий обработку биологических образцов лизирующим буфером, инкубирование, центрифугирование, отличающийся тем, что инкубирование производят при температуре 98°С в течение 15 мин, центрифугирование - при 13,4 тыс. об/мин в течение 75 сек, а в лизирующий буфер включают 0,75 мМ ЭДТА (рН=8), 35 мкМ SDS.