Штамм хитинолитического актиномицета Streptomyces baarnensis для защиты растений от фитопатогенных грибов и стимуляции роста растений Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, касается штамма актиномицета Streptomyces baarnensis assi-23TB нового генотипа, отличающегося от генотипов ближайших представителей рода Streptomyces. Заявляемый штамм содержит кластеры генов биосинтеза, связанные с образованием антибактериальных, антифунгальных, противоопухолевых антибиотиков, фитогормона зеатина, хитиназ семейств 18 и 19, гены адаптации к высоким и низким температурам окружающей среды. Предлагаемый штамм может быть использован для получения на его основе антифунгального препарата.

Стрептомицеты известны как богатый источник вторичных метаболитов, имеющих фармацевтическую, сельскохозяйственную и биотехнологическую ценность. В настоящее время увеличивается количество патогенных микроорганизмов, устойчивых к существующим антибиотикам. За последние несколько десятилетий Streptomyces тщательно исследовались на предмет их способности продуцировать разнообразные биоактивные вторичные метаболиты. Секвенирование генома выявляет способность кодирования вторичных метаболитов, значительно превышающую возможности обнаружения активности антибиотиков в стандартных лабораторных условиях [van Wezel GP, McDowall KJ. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Natural Product Reports. 2011 Jul; 28(7): 1311-1333]. Недавние достижения в исследованиях бактерий Streptomyces во многом были поддержаны усовершенствованиями в высокопроизводительной технологии секвенирования генома. С помощью геномики были предсказаны многочисленные кластеры генов биосинтеза вторичных метаболитов, что увеличило их геномный потенциал для открытия новых биологически активных соединений.

Хитинолитические Streptomyces обладают противогрибковой активностью в отношении фитопатогенных грибов. Хитиназа-19 (GH-19) в последние десятилетия привлекла к себе большое внимание из-за возможности ее использования для биоконтроля фитопатогенов, таких как насекомые и грибы [Deepthi Kumaradasan Sreelatha, Sajna Salim et al. The whole-genome shotgun sequence of a chitinolytic actinomycete, Streptomyces californicus TBG-201, and the in-silico studies of its chitinase-19 genes, 20 March 2023, PREPRINT (Version 1) Research Square].

Выращивание сельскохозяйственных культур имеет решающее значение для существования человека, поскольку оно удовлетворяет его потребности в питательных веществах. Сельскохозяйственные культуры и другие растения всегда подвергаются высокому риску заражения фитопатогенами, особенно патогенными грибами. Хотя растения обладают хорошо развитой защитной системой, она может быть нарушена при атаке патогенов. Хитиназы могут усиливать защитную систему растений, поскольку они воздействуют на хитин, основной компонент клеточной стенки патогенных грибов, и делают грибы неактивными без какого-либо негативного воздействия на растения. Наряду с укреплением защитных механизмов растений, хитиназы также улучшают рост растений и урожайность. Хитиназы бактерий в сочетании с продуцируемыми бактериями вторичными метаболитами с антимикробной активностью могут стать многообещающим инструментом для повышения устойчивости растений к грибковым заболеваниям [Kumar, М., Brar, A. et al. Chitinases -Potential Candidates for Enhanced Plant Resistance towards Fungal Pathogens. Agriculture 2018, 8, 88].

Среди возбудителей болезней, вызывающих явные и скрытые потери зерна, наиболее опасны микроскопические грибы и выделяемые ими микотоксины. Последние существенно влияют на безопасность зерна, продуктов его переработки и хлеба. Особую опасность грибная инфекция причиняет человеческому организму. Микологические инфекции по сравнению с бактериальными и вирусными становятся более агрессивными, многие виды микроскопических грибов вызывают микозы, аллергические заболевания, микотоксикозы у человека [Юсупова, Галина Георгиевна. Обеспечение микробиологической безопасности зерновых культур в технологиях производства муки и хлебобулочных изделий: диссертация... доктора сельскохозяйственных наук: 05.18.01 / Красноярск, 2010. - 348 с: ил. РГБ ОД, 71 11-6/12]. Группа полевых грибов представлена видами родов Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Botrytis, Verticillium и др. К группе плесеней хранения относятся виды родов Aspergillus, Penicillium, Scopulariopsis, микромицеты порядка Mucorales. Основные грибы хранения: Penicillium cyclopium, P. chrysogenum, P. viridicatum, Aspergillus tonophilus, A. niger, A. ochraceus, A. flavus [Жукова, Марина Викторовна. Микроскопические грибы, развивающиеся на семенах пшеницы и кукурузы а период хранения: диссертация... кандидата биологических наук: 06.01.11. - Ленинград, 1985. -205 с; Треножникова Л. П., Балгимбаева А. С.и др. / Антифунгальная активность против патогенов зерновых культур и изучение антибиотика штамма Streptomyces sp.К-541, выделенного из экстремальных экосистем Казахстана// Сельскохозяйственная биология. -2018. - Т. 53, № 1. - С. 96-102].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является штамм Streptomyces baarnensis assi-23TB для стимуляции роста растений и защиты растений от фитопатогенных грибов, расширения ассортимента штаммов Streptomyces, используемых в разработке новых средств биоконтроля в сельском хозяйстве и растениеводстве.

Указанный технический результат изобретения достигается выделением штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB нового генотипа, отличающегося от генотипов ближайших представителей рода Streptomyces и содержащего 36 кластеров генов образования антибактериальных, антифунгальных, противоопухолевых антибиотиков, фитогормона зеатина, хитиназ семейств 18 и 19, кластеры генов адаптации к холодовому и тепловому шоку.

Заявляемый штамм Streptomyces baarnensis assi-23TB нового генотипа депонирован в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Ас-2228, дата депонирования 19 марта 2024 г.

Полно геномное секвенирование штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB проводили на приборе DNBSeq G-400 (Shenzhen, Китай) в режиме парноконцевого секвенирования длиной 150 п. н. с генерацией не менее 1 Гб (гигабаза или 1⋅10⁹ нуклеотидных оснований). Сборка генома производилась с помощью программы SPAdes ver. 3.15.5.

Полученная сборка генома была загружена в базу NCBI (The National Center for Biotechnology Information) под номером проекта PRJNA1076093 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1076093). Версия проекта имеет номер доступа (accession number) JBAJJN010000000. По результатам сборки генома штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB было получено 233 контига, общей длиной 8488540 п. н.о. (пар нуклеотидных оснований), значение параметра N50 - 76128 п.н.о. Глубина считывания достигала 48,0Х, эффективность прочтения целевых последовательностей - 99.84%, контаминация - 0,48%. С помощью программного пакета NCBI PGAP в геноме было предсказано 7514 белок-кодирующих генов. GC-контент (GC-состав) -для сборки генома Streptomyces baarnensis assi-23TB составляет 68,13%. Аннотация генома добавлена NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP).

Секвенирование генома штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB выявило факторы, связанные с адаптацией к низким и высоким температурам окружающей среды (cold shock protein of CSP family, heat shock protein GrpE, heat-inducible transcription repressor HrcA, heat shock protein 60 kDa family chaperone GroEL). Поиск функциональных генов, кодирующих хитиназы семейств 18 и 19, проводили в международной базе данных NCBI на основе автоматически аннотированного полного генома штамм Streptomyces baarnensis assi-23TB. Аннотированные гены были проверены вручную для выявления генов, участвующих в деградации хитина. Гены, кодирующие белки, связанные с расщеплением хитина в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB, представлены в таблице 1.

Характеристика заявляемого штамма.

Вид Streptomyces baarnensis входит в род Streptomyces, относится к семейству Streptomycetaceae, порядку Kitasatosporales, классу Actinomycetes, типу Actinomycetota, домену - Bacteria.

Культурально-морфологические признаки штамма. Streptomyces baarnensis assi-23TB аэроб, окраска по Граму - положительная, через 8-10 суток культивирования образует типичные полностью спорулирующие колонии. Форма колонии - круглая, выпуклая в центре, с неровными краями, размер 4-7 мм. Цепочки спор прямые, споры гладкие. Размеры спор изолята по данным сканирующей электронной микроскопии: 0,8-0,9 х 0,7-0,8 мкм (длина х толщина); ветвящиеся спороносные гифы воздушного мицелия, поверхность спор преимущественно гладкая (фиг. 1). Субстратный мицелий бежево-кремовый на агаре с хитином, бледно-буровато-бежевый на агаре Гаузе 1, буровато-бежевый на агаре КАА (крахмалоаммиачной среде). Воздушный мицелий тонкий, серый. На среде с хитином образует растворимые пигменты. С возрастом появляются темно-серые бугорки. Физиолого-биохимические признаки штамма. Потребляет α-D-лактозу, D-маннозу, L-аланин, L-гистидин, D-глюконовую кислоту, глюкуронамид, D-сахарную кислоту, D-молочную кислоту, L-яблочную кислоту, ацетоуксусную кислоту. Не усваивает D-аспарагиновую кислоту, хинную кислоту, хлорид тетразолия синего. Способен к росту в присутствии 1% NaCl, 1% лактата натрия. Чувствителен к антибиотикам: рифамицину, ванкомицину (5 мкг). Не чувствителен к азтреонаму, налидиксовой кислоте, тобрамицину, ампициллину. Гидролизует хитин, желатину и твин-40. Обладает антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенным грибам, в том числе к Fusarium graminearum.

Штамм хранят под слоем вазелинового масла, рост на среде с хитином состава (г/л): коллоидный хитин - 4,0, KH₂PO₄ - 0,3, K₂HPO₄ - 0,7, MgSO₄-7H₂O - 0,5, FeSO₄-7H₂O - 0,01, ZnSO₄-7H₂O - 0,01, MnCl₂-4H₂O - 0,01, агар - 20,0, pH 8; температура хранения: 4°С; срок хранения: 1 год. Для длительного хранения используют стандартные методы лиофилизации и криоконсервации. Штамм не является генетически модифицированным.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг. 1. Изображение штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Фиг. 2. А. Показана диаграмма Венна количества общих и уникальных кластеров протеинов в геномах Streptomyces baarnensis assi-23TB и ближайших родственных штаммов.

Б. Количество кластеров (cluster count) и белков (protein count) указывают на количество категорий функций ортологичных генов и общее количество ортологичных генов в этих категориях соответственно. Овалы зеленого цвета под названиями штаммов обозначают ортологичные кластеры генов, присутствующие в каждом штамме.

Фиг. 3. Отображено филогеномное древо эволюционного расхождения пяти штаммов Streptomyces. Информация о расширении семейств генов (фиолетового цвета) и сокращении (синего цвета) указана на древе.

Фиг. 4. Влияние предпосевной обработки семян пшеницы 15-суточной КЖ штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB Ас-2228 на массу растений и зараженность проростков инфекцией Fusarium graminearum.

А - масса, Б - зараженность.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1

Штамм хитинолитического актиномицета Streptomyces baarnensis assi-23TB выделен из серой горно-лесной почвы Белорецкого района Республики Башкортостан. Образцы почв отбирали на глубине 0-10 см под подстилкой. Почву предварительно обогащали хитином (0,6% от массы почвы) и прединкубировали при влажности 60% от массы почвы и при температуре 27°С в течение недели. Использовали очищенный хитин фирмы Sigma-Aldrich, после чего производили высев из почвы и выделяли чистую культуру актиномицета.

Выделение культуры осуществляли на питательной селективной среде с хитином, в которой в качестве единственного источника углерода и азота был хитин [Терегулова Г. А., Манучарова И. А. и др./ Антимикробная активность специализированных метаболитов почвенных стрептомицетов-хитинолитиков //Вестник Московского университета. Серия 17: Почвоведение. -2024. - № 1. -С. 51-60].

Для культивирования хитинолитического актиномицета Streptomyces baarnensis assi-23TB использовали твердые питательные среды с хитином, Гаузе 1, КАА следующего состава:

1. среда с хитином (г/л): коллоидный хитин - 4,0, КН₂РО₄ - 0,3, К₂НРО₄ - 0,7, MgSO₄-7H₂O - 0,5, FeSO₄-7H₂O - 0,01, ZnSO₄-7H₂O - 0,01, MnCl₂-4H₂O - 0,01, агар - 20,0; pH 8;

2. минеральный агар Гаузе 1 (г/л): крахмал растворимый - 20,0, K₂HPO₄ - 0,5, MgSO₄ - 0,5, NaCl - 0,5, KNO₃ - 1,0, FeSO₄ - 0,01, агар - 20,0; pH 7,2 - 7,4;

3. КАА (г/л): крахмал растворимый - 10,0, (NH₄)₂SO₄ - 2,0, K₂HPO₄ - 1,0, MgSO₄-7H₂O - 1,0, NaCl - 1,0, СаСО₃ - 3,0, агар - 15,0; рН 7,2 - 7,4.

Среды стерилизовали при 1 ати 20-30 мин. В среды после стерилизации добавляли для подавления роста грибов нистатин (50,0 мкг/мл); для ограничения роста бактерий налидиксовую кислоту (10,0 мкг/мл), тобрамицин (10,0 мкг/мл), ампициллин (10,0 мкг/мл); для стимуляции роста актиномицета тиамин (4,0 мкг/мл) [Зенова Г. М. Почвенные актиномицеты: Учебное пособие. - М. Изд-во МГУ, 1992. - 78 с; Нетрусов А. И., Егоров М. А. и др., 2005. Практикум по микробиологии. М.: Издательский центр «Академия», - 608 с. ISBN 5-7695-1809-Х].

Пример 2

Собранный геном Streptomyces baarnensis assi-23TB был проанализирован на платформе комплексного анализа генома PATPIC и аннотирован с помощью RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology) [Wattam AR, Davis JJ et al. 2017. Improvements to PATRIC, the all-bacterial Bioinformatics Database and Analysis Resource Center. Nucleic Acids Res 45:D535-D542; Brettin T, Davis JJ et al. 2015. RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes. Sci Rep 5:8365]. Геному Streptomyces baarnensis assi-23TB на платформе PATRIC был присвоен уникальный идентификатор 66872.10. Филогенетическое древо Streptomyces baarnensis assi-23TB было построено на основе полной последовательности генома штамма. Кроме штамма Streptomyces baarnensis NRRL B-2842 из базы данных NCBI с номером доступа JNZV01000000, близкими родственниками штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB оказались S. globisporus С-1027, S. griseus subsp.griseus NBRC 13350, S. roseosporus NRRL 15998.

Для изучения различий между штаммами Streptomyces baarnensis assi-23TB Ac-2228 и ближайшими родственными штаммами был проведен анализ состава ортологичных кластеров генов с помощью платформы OrthoVenn3 [Sun J, Lu F et al. OrthoVenn3: an integrated platform for exploring and visualizing orthologous data across genomes. Nucleic Acids Res. 2023 Jul 5; 51(W1):W397-W403]. Ортологичные гены - сходные по степени гомологии гены в геномах разных организмов, происходящие от общего предкового гена и передающиеся при вертикальном наследовании [Равин Н. В. Геном прокариот. Равин Н. В., Шестаков С. В. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. - Т. 17, № 4-2. - С. 972-984]. В общей сложности 4575 кластеров были общими для пяти штаммов Streptomyces, включенных в анализ. В штаммах Streptomyces baarnensis assi-23TB и Streptomyces baarnensis NRRL B-2842 было обнаружено в общей сложности 6814 и 6799 ортологичных кластеров генов соответственно, 535 кластеров были общими для двух штаммов. 18 кластеров из Streptomyces baarnensis assi-23TB и 16 кластеров из Streptomyces baarnensis NRRL В-2842 были уникальными. S. baarnensis assi-23TB и S. griseus subsp.griseus NBRC 13350 имели 61 общий кластер, S. baarnensis assi-23TB и S. globisporus C-1027 имели 52 общих кластера, S. baarnensis assi-23TB и S. roseosporus NRRL 15998 имели 37 общих кластера. 33 кластера из S. griseus subsp.griseus NBRC 13350, 19 кластеров из S. globisporus C-1027 и 19 кластеров из S. roseosporus NRRL 15998 были уникальными (фиг. 2).

Для построения временного филогенетического древа использовался Ultrametric tree на платформе OrthoVenn3 с помощью метода максимального правдоподобия. Оценка расширения или сокращения семейств генов в результате эволюционного расхождения штаммов была проведена с помощью CAFÉ5 [Mendes, F. К., Vanderpool, D., Fulton, В. & Hahn, М. W. CAFE 5 models variation in evolutionary rates among gene families. Bioinformatics 36, 5516-5518 2020]. Семейства генов с сокращениями и расширениями были аннотированы по GO (онтологии генов) на платформе OrthoVenn3 [Ashburner М, Ball СА et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000,25: 25-29]. Streptomyces baarnensis assi-23TB имеет близкое родство со штаммом Streptomyces baarnensis NRRL B-2842. Время эволюционного расхождения этих штаммов оценивается примерно в 0,085 миллиона лет назад. Проведенный анализ обогащения по онтологии генов (GO) на платформе Orthoenn3 выявил, что в результате расхождения штаммов в геноме штамма Streptomyces baarnensis assi-23ТВ оказалось 99 сократившихся семейств генов и 68 расширенных (фиг. 3). Расширенные семейства генов связаны в том числе с образованием вторичных метаболитов, биосинтезом антибиотиков, биосинтезом антибиотика феназина (таблица 2). Номера идентификации и описание GO приведены в базе данных AmiGO 2 (https://amigo.geneontology.org/amigo/landing).

Таким образом, предложенный нами штамм является штаммом нового генотипа, отличающимся от генотипов ближайших родственных штаммов и может быть использован для микробиологических и молекулярно-генетических исследований.

Пример 3

Поиск генных кластеров биосинтеза специализированных метаболитов в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB проводили с помощью Интернет-сервиса antiSMASH (antibiotics & Secondary Metabolite Analysis Shell) версии bacterial version 7.0 [Kai Blin, Simon Shaw et al. antiSMASH 7.0: new and improved predictions for detection, regulation, chemical structures, and visualization. Nucleic Acids Research. 2023]. Значение параметра точности предсказаний (ʺdetection strictnessʺ) выбирали ʺstrictʺ.

В геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB ВКПМ Ac-2228, культивированного на среде с хитином, было предсказано 36 кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов. Восемь кластеров генов биосинтеза специализированных метаболитов имеют полное сходство с имеющимися в базе данных antiSMASH 7.0 кластерами генов биосинтеза антибактериальных и антифунгальных антибиотиков, сидерофоров и меланина: keywimysin, alkylresorcinol, naringenin, desferrioxamin В, 10-epi-HSAF/10-epi-3-deOH-HSAF/10-epi-maltophilin/10-epi-xanthobaccin C/l0-epi-hydroxymaltophilin/10-epi-FI-2, ectoine, geosmin, melanin. Некоторые кластеры генов в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB кодируют вторичные метаболиты, которые имеют низкое сходство с известными соединениями (менее 40%) и являются потенциально новыми биологически активными соединениями. Полученные данные демонстрируют высокий биотехнологический потенциал заявляемого штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB ВКПМ Ас-2228 как продуцента вторичных метаболитов с антибактериальной, антифунгальной и противоопухолевой активностью.

Предсказанные кластеры генов вторичных метаболитов с антимикробной активностью представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Генные кластеры биосинтеза вторичных метаболитов штамма

Streptomyces baarnensis assi-23TB ВКПМ Ас-2228, культивированного на среде с хитином

Пример 4

Погруженное культивирование Streptomyces baarnensis assi-23TB проводили на среде с хитином в колбах Эрленмейера объемом 200 мл со 100 мл культуральной среды на качалках Environmental Shaker ES-20 со скоростью 180 об/мин. В жидкие среды с хитином инокулировали по 1 см агаровой среды с хитином с поверхностным ростом стрептомицета. Состав жидкой среды с хитином (г/л) был следующим: коллоидный хитин - 4,0, KH₂PO₄ - 0,3, К₂НРО₄- 0,7, MgSO₄-7H₂O - 0,5, FeSO₄-7H₂O - 0,01, ZnSO₄-7H₂O - 0,01, MnCl₂-4H₂O-0,01;pH8.

На четвертые и десятые сутки полученные культуральные жидкости (КЖ) отбирали в объеме 95 мл для исследования антибиотической активности, инокулюм в количестве 5 мл вносили в колбы для культивирования в 100 мл свежей среды. На 15 сутки отбирали пробы по 100 мл для определения антибиотической активности методом перпендикулярных штрихов. Степень антибиотической активности определяли по размеру зоны ингибирования роста грибных тест-культур Helminthosporium sativum, Botrytis byssoidea, Fusarium graminearum, F. poae, F. culmorum 9258, F. oxysporum, F. sporotrichioides 35108 из Коллекции микроорганизмов кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова и Коллекции микроорганизмов и клеточных культур Башкирского государственного аграрного университета. Зоны подавления роста тест-микроорганизмов измеряли вручную с точностью ±1 мм. Каждый тест проводили в трехкратной повторности. Антибиотическую активность Streptomyces baarnensis assi-23TB определяли в динамике на 4, 10, 15 сутки роста; после осаждения мицелия вносили по 0,5 мл КЖ в бороздки, проделанные в агаризованной среде № 1 Гаузе; тест-культуры засевали перпендикулярно бороздкам. Через 24 часа определяли антибиотическую активность по размеру зоны, на которой отсутствует рост тест-организма. Предложенный нами штамм проявлял антифунгальную активность в отношении всех тестируемых патогенных грибов (таблица 4).

Самая высокая активность КЖ штамма проявлялась на 15 сутки против патогенов Fusarium graminearum u F. oxysporum [Терегулова Г.А., Манучарова . А. и др./ Антимикробная активность специализированных метаболитов почвенных стрептомицетов-хитинолитиков // Вестник Московского университета. Серия 17: Почвоведение. -2024. -№ 1. - С. 51-60].

Таблица 4.

Антифунгальная активность культуральной жидкости штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB

Пример 5

Комплексный вид Fusarium graminearum Schwabe относится к числу основных фитопатогенных грибов, вызывающих фузариоз колоса зерновых культур, в частности, такой важной сельскохозяйственной культуры, как пшеница во всех регионах ее выращивания [Соколова, Г. Д. Механизмы устойчивости к фунгицидам фитопатогенного гриба Fusarium graminearum I Г. Д. Соколова, А. П. Глинушкин // Микология и фитопатология. - 2020. - Т. 54, № 6. - С. 391-403].

Активность 15-суточной КЖ штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB оценивали на семенах пшеницы мягкой яровой сорта Архат. В модельных лабораторных опытах проводили предпосевную обработку семян пшеницы и оценивали ее влияние на всхожесть, массу ста растений и зараженность патогенным грибом Fusarium graminearum. Семена пшеницы обеззараживали 0,1% раствором AgNO₃, затем замачивали в течение трех часов в 15-суточных КЖ Streptomyces baarnensis assi-23TB; в контрольных вариантах - в стерильной дистиллированной воде. Семена подсушивали на воздухе три часа, после чего заражали пятисуточной суспензией спор гриба F. graminearum (6⋅10⁶ спор/г). Обработанные семена помещали по 100 штук в стерильные лотки со слоем фильтровальной бумаги, увлажненной стерильной водой. Семена проращивали при температуре 20°С в термостате в течение семи дней. Повторность опыта четырехкратная. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Statistica 10.0 (StatSoft Inc.). В качестве погрешностей экспериментов указаны значения стандартной ошибки и доверительного интервала среднего.

Наши исследования показали, что в результате предпосевной обработки семян пшеницы энергия прорастания и всхожесть растений увеличились на 0,3%. При этом масса ста растений на седьмые сутки роста была выше на 15% по сравнению с контрольным вариантом. Зараженность проростков фузариозной инфекцией была ниже на 13%, чем в контроле (фиг. 4).

Увеличение массы семян в опытном варианте может быть вызвано влиянием фитогормона зеатина. Кластер генов биосинтеза зеатина аннотирован в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB на платформе PATRIC (tRNA dimethylallyltransferase, EC Number 2.5.1.75, номер идентификации Pathway ID 908).

Цитокинины представляют собой большую группу растительных гормонов, которые влияют на различные процессы в ходе роста и развития растений. Зеатин и его производные относятся к изопреноидным цитокининам. Изопреноидные цитокинины играют важную роль в регуляции роста и развития растений [Kubiasová К, Mik V et al. Design, synthesis and perception of fluorescently labeled isoprenoid cytokinins. Phytochemistry. 2018 Jun; 150:1-11]. Сигналы цитокининов в растениях способны замедлять старение листьев, стимулировать ветвление и рост побегов и корней. Кроме того, цитокинины передают сигналы о доступности неорганического азота корням, прорастанию семян и реакции на патогены [Silvia Gajdošová, Lukáš Spíchal et al. Distribution, biological activities, metabolism, and the conceivable function of cis-zeatin-type cytokinins in plants, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 8, May 2011, Pages 2827-2840].

Снижение зараженности семян в опытном варианте может быть вызвано комбинированным антифунгальным действием хитиназ семейств G18 и G19, гены которых обнаружены в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB (таблица 1), и вторичного метаболита 10-epi-HSAF/10-epi-3-deOH-HSAF710-epi-maltophilin/10-epi-xanthobaccin С/10-epi-hydroxymaltophilin/10-epi-FI-2, генный кластер биосинтеза которого предсказан в геноме Streptomyces baarnensis assi-23TB на платформе antiSMASH 7.0 (таблица 3). Heat-stable antifungal factor - термостабильный противогрибковый фактор, относящийся к полициклическим тетраматным макролактамам (PTMs). Он проявляет широкий спектр противогрибковой активности и используется в качестве противогрибкового средства для борьбы с болезнями растений [Liu, W.; Zhang et al. Genome Mining of Marine-Derived Streptomyces sp. SCSIO 40010 Leads to Cytotoxic New Poly cyclic Tetramate Macrolactams. Mar. Drugs 2019, 77, 663]. Результаты нашего исследования указывают на высокий биотехнологический потенциал нового штамма Streptomyces baarnensis assi-23TB в качестве инокулянта для семян, способствующего прорастанию, увеличению массы, первоначальному развитию проростков и их защите от грибного фитопатогена Fusarium graminearum.

Изобретение относится к области биотехнологии, касается нового штамма хитинолитического актиномицета Streptomyces baarnensis assi-23TB. Заявляемый штамм Streptomyces baarnensis assi-23TB депонирован в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Ас-2228, дата депонирования 19 марта 2024 г. Изобретение может быть использовано для стимуляции роста растений и защиты растений от фитопатогенных грибов, для микробиологических, молекулярно-генетических исследований и расширения ассортимента штаммов Streptomyces, используемых при разработке новых средств биоконтроля в сельском хозяйстве и растениеводстве. 4 ил., 4 табл., 5 пр.

Штамм хитинолитического актиномицета Streptomyces baarnensis, депонированный в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Ас-2228, для защиты растений от фитопатогенных грибов и стимуляции роста растений.