Консорциум микроорганизмов для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов и способ повышения продуктивности растений Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A01N63/22 

Группа изобретений относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии и представляет собой штаммы бактерий и их консорциум для стимуляции роста растений и их защиты от фитопатогенных грибов, а также способ повышения продуктивности растений с использованием заявляемого консорциума. Изобретения могут быть использованы в производстве биологических препаратов для защиты от фитопатогенных грибов сельскохозяйственных культур, в сельскохозяйственном производстве и для применения в личных подсобных хозяйствах при выращивании растений.

Одной из наиболее важных мировых проблем остается обеспечение населения продуктами сельскохозяйственного производства. Поэтому повышение урожайности сельскохозяйственных культур и создание эффективных и экологичных способов борьбы с фитопатогенными микроорганизмами является актуальной задачей.

Многие фитопатогенные грибы оказывают существенный ущерб урожаю сельскохозяйственных культур. В большинстве случаев для защиты растений от болезней, вызываемых грибами, используются химические фунгициды, которые оказывают негативные последствия на экологию и приводят к развитию у фитопатогенов устойчивости к ним.

В настоящее время для борьбы с фитопатогенами используют биологические препараты на основе различных микроорганизмов. В качестве микроорганизмов широко используют бактерии родов Bacillus и Pseudomonas, которые являются частью микрофлоры растений.

Известен штамм Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР, отличающийся высокой биологической активностью в отношении подавления фитопатогенов картофеля и рекомендованный для использования в период хранения клубней (RU 2538157C1, 10.01.2015). Однако данный штамм не обладает ростостимулирующей активностью.

Заявлен штамм Bacillus subtilis BZR 517 (RU 2552146 C1, 10.06.2015), показавший высокую активность в подавлении различных фитопатогенов растений. Вместе с тем не приведены сведения о его ростостимулирующей активности в отношении растений.

Описан штамм Bacillus subtilis BZR 336g (RU 2553518 C1, 20.06.20150), выделенный из ризопланы озимой пшеницы, отличающейся высокой активностью в отношении различных фитопатогенных грибов и обладающий ростостимулирующей активностью.

Предложен штамм бактерии Bacillus subtilis ubsp. subtilis, выделенный из ризосферы разнотравья целины - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней (RU2764695 C1, 19.01.2022).

Штамм бактерии Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 и биопрепарат, созданный на основе этого штамма (Фитоспорин) (RU 2721966 C2, 25.05.2020) показал высокую эффективность при использовании на сельскохозяйственных культурах (Давлетшин, Ф.М. Эффективность биофунгицида Фитоспорин-М, Ж на яровой пшенице при прямом посеве / Ф.М. Давлетшин, Р.Г. Гильманов, Х.М. Сафин, Д.С. Аюпов // Достижения науки и техники АПК. - 2014. - № 2. - С. 39-40).

Все представленные штаммы рода Bacillus не являются эндофитными бактериями и не обладают способностью к азотфиксации.

Авторами патента (RU 2648163 С1, 22.03.2018) предложен штамм Bacillus mojavensis Lhv-97, обладающий широким спектром действия против патогенных грибов и бактерий, в том числе против штаммов рода Candida, устойчивых к флуконазолу.

В патенте (RU 2737208 С1, 26.11.2020) описан штамм Bacillus mojavensis PS17, обладающий фунгицидной и бактерицидной активностью и выделенный из ризосферной почвы.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является отсутствие всестороннего влияния на урожайность сельскохозяйственных культур.

Ризосферные бактерии благоприятно воздействуют на рост растений (стимулирующие рост растений ризобактерии). К таким бактериям относятся бактерии вида Pseudomonas. Представители рода Pseudomonas хорошо известны в качестве препаратов для защиты растений от фитопатогенных грибов. Данные бактерии способствуют росту растений на различных стадиях от посева (всхожести), до сбора урожая (созревания).

Предложен штамм бактерии Pseudomonas fluorescens BS1506 (RU 2646160 С2, 01.03.2018) для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий, а также стимуляции роста растений. Штамм выделен из ризосферы диких злаков. Штамм способен подавлять развитие фитопатогенных грибов и бактерий за счет продукции гетероциклических антибиотиков феназин-1-карбоновой кислоты и феназин-1-карбоксамида и стимулировать рост растений за счет повышения биодоступности фосфатов.

Предложен также состав для борьбы с патогеном растений (RU 2736295 С2, 13.11.2020) живой штамм Pseudomonas chlororaphis NRRL No. B-50897, где патоген растений представляет собой гриб. Изобретение обеспечивает эффективную защиту растений от патогенов и стимулирование роста растений, повышает конкурентоспособность средства биоконтроля с другими микробными штаммами и грибами. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия.

Известен штамм бактерии Pseudomonas species В-696, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium sumbucinum, и препарат на его основе, используемый для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов (RU 2130261 С1, 20.05.1999). Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Microdochium nivale, Fusarium semitectum, Fusarium solani.

В патенте (RU 2550268, 10.05.2015) описано применение штамма Pseudomonas azotoformans F30A или его надосадочной жидкости для увеличения прорастания семян, всхожести растений и/или роста растений.

В патенте (RU 2149552 C1, 27.05.2000) предложен консорциум микроорганизмов, который состоит из штаммов, обладающих исключительно антагонистическими по отношению к грибам свойствами. Однако, согласно литературным данным Pseudomonas chlororaphis (Srinivasa N. et al. Morphological and biochemical characterization of antagonist Pseudomonas isolates // Int J Agric Sci. - 2015. - Vol. 9. - Р. 14-23), который входит в состав консорциума в виде штамма Pseudomonas chlororaphis ВКПМ В-7542, является потенциальным колонизатором. В патенте не приведены данные по колонизирующим свойствам данного штамма. При этом недостатком консорциума микроорганизмов по вышеуказанному патенту является отсутствие в составе штаммов с хорошими колонизирующими свойствами.

В состав консорциума микроорганизмов в соответствии с патентом (RU 2795906 C1, 15.05.2023) входят Bacillus simplex 948 R-1TS ВКПМ В-12245 и Bacillus megaterium 312 TS ВКПМ В-12244, которые являются потенциальными антагонистами фитопатогенных грибов, а также способны продуцировать фитогормоны и повышать урожайность растений. Однако консорциум микроорганизмов имеет свой недостаток, который заключается в отсутствии в составе хороших корневых колонизаторов, которые могли бы повысить эффективность биопрепарата. Отсутствуют в описании патента и исследования на совместимость штаммов в консорциуме микроорганизмов.

Ближайший к заявляемому консорциум микроорганизмов описан в патенте (RU 2595405 С1, 27.08.2016), в состав которого входят следующие штаммы: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008. Недостаток вышеуказанного консорциума микроорганизмов состоит в том, что в его состав входят потенциальные патогены Serratia plymuthica и Rahnella aquatilis, являющиеся возбудителями инфекций и гнойно-воспалительных заболеваний различной локации у человека. Кроме того, отсутствуют сведения на совместимость штаммов консорциума и данные о безопасности его применения в отношении растений, животных и человека, а также окружающей среды.

Технической проблемой, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, является расширение арсенала как средств, обладающих биологической защитой от фитопатогенных грибов и стимулирующих рост растений, так и способов, повышающих продуктивность сельскохозяйственных растений.

Техническим результатом являются новые продукты, расширяющие ассортимент средств, регулирующих рост растений и защищающих их от грибковых заболеваний, за счет наличия не только различной ферментативной активности, но и способности к азотфиксации, продуцированию индол-3-уксусной кислоты, хороших колонизирующих свойств и антагонистической активности в отношении фитопатогенов.

Указанная техническая проблема решается и технический результат достигается заявляемыми объектами:

1. Штаммом бактерии Bacillus mojavensis АОП29 для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов;

2. Штаммом бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 для стимуляции роста растений;

3. Штаммом бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 для стимуляции роста растений;

4. Штаммом бактерии Pseudomonas migulae КОП88 для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов;

5. Консорциумом микроорганизмов для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов, состоящий из штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88, и Pseudomonas azotoformans КОП35, в равных объемных соотношениях с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл;

6. Способом повышения продуктивности растений, характеризующийся тем, что семена растений обрабатывают консорциумом микроорганизмов, состоящим из штаммов бактерии Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88, и Pseudomonas azotoformans КОП35, в равных объемных соотношениях с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл.

Штаммы бактерий выделяют из филлопланы, ризосферы и почвы из-под вегетирующих растений озимой мягкой пшеницы сорта Универсиада (патент РФ на селекционное достижение №9591, опубл. 05.04.2018 г). Отбор образцов озимой пшеницы и почвы проведен в фазе трубкования озимой пшеницы на территории Республики Татарстан в окрестностях села Большие Кабаны 55°62'13.62" широты 49°32'68.39" долготы 3 июня 2022 г. Посевы из образцов листьев, корней и почвы из-под вегетирующих растений озимой пшеницы представлены на фиг. 1.

Видовую принадлежность определяют с помощью метода определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК с последующим сравнением нуклеотидной идентичности с последовательностями, депонированными в международной базе данных GenBank (LaneD. J. 16S/23 SrRNA sequencing. // Nucleicacid techniquesin bacterial systematics. - 1991. - Р.115-175; Altschul, S. F. Basiclocalalignmentsearchtool. / Altschul, S.F., W.Gish, W. Miller, E.W. Myers, D. J. Lipman //JMolBiol. - 1990. - V. 215. - P.403-410). Результаты сиквенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК представлены в таблице 1.

Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29

Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29 получают следующим образом: к испытуемому образцу филлопланы из озимой пшеницы приливают фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в соотношении 1:9, перемешивают с помощью вортекса в течение 1 минуты. К полученным смывам бактериальных суспензий добавляют глицерин до 50%, содержимое пробирок перемешивают и хранят при температуре -80°С до проведения дальнейшего анализа. Смыв с образца через серию разведений высевают на неселективную среду King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ) с антибиотиком нистатином (32 мкг/мл). Посевы инкубируют при температуре +30°С в течении суток. После инкубации из чашек отбирают колонии, идентифицированные в дальнейшем как Bacillus mojavensis.

Штамм Bacillus mojavensis АОП29 наиболее близок к виду Bacillus mojavensis strain D50 (идентичность 99,72%, метод 16S рРНК, таблица 1).

Штамм Bacillus mojavensis АОП29 депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM119 (справка о депонировании штамма №311/11 от 28.11.2023 г.).

Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29 характеризуется следующими признаками.

Видовое название штамма - Bacillus mojavensis.

Родословная штамма

Штамм Bacillus mojavensis АОП29 был выделен из филлопланы озимой пшеницы сорта Универсиада в фазе трубкования.

Культурально-морфологические особенности штамма. Штамм Bacillus mojavensis АОП29 культивируют на среде LB при 30°C в течение 24 ч. Поверхность колоний непрозрачная, бежевая с образованием складок. Штамм Bacillus mojavensis АОП29 является грамположительной бактерией, клетки короткие и палочковидные, размером около 0,7-0,9 × 1,8-3,0 мкм.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29 является факультативным аэробом с сапрофитным типом питания.

Растет штамм Bacillus mojavensis АОП29 при рН 6,0-8,0 при температуре от +20° до +40°С, на питательных средах King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ), LB (триптон - 10 г/л, хлорид натрия - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ), PDA (картофельный бульон - 1 л, декстроза - 20 г/л, агар - 18 г/л).

Хранение штамма Bacillus mojavensis АОП29 возможно в эппендорфе либо в криопробирках в смеси ФСБ и глицерина (до 50% от общего объема) при -80°С.

Бактерии штамма Bacillus mojavensis АОП29 обладают целлюлазной, амилазной, протеазной ферментативной активностью; азотфиксирующей способностью и продуцируют индол-3-уксусную кислоту. Проявляет антагонистическую активность против фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Alternaria alternata. Согласно литературным данным (Bacon, C.W., and Hinton, D.M. «Endophyticand biological control potential of Bacillus mojavensis and relatedspecies» Biological Control 23.3 (2002): 274-284.), что штамм Bacillus mojavensis АОП29 не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности и по каким-либо другим причинам.

Данный штамм Bacillus mojavensis АОП29способен использовать D-фруктозу, D-целлобиозу, сахарозу, α-D-глюкозу, желатин, L-молочную и лимонную кислоты в качестве источника углерода.

Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9

Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 получают, приливая к испытуемому образцу ризосферной почвы озимой пшеницы ФСБ в соотношении 1:9, перемешивают с помощью вортекса в течение 1 минуты. К полученным смывам бактериальных суспензий добавляют глицерин до 50%, пробирки перемешивают и хранят при температуре -80°С до проведения дальнейшего анализа. Смыв с образца через серию разведений высевают на неселективную среду King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ) с антибиотиком нистатином (32 мкг/мл). Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре +30°С в течении суток. После инкубации из чашек отбирают колонии, идентифицированные в дальнейшем как Stenotrophomonas rhizophila.

Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 наиболее близок к виду Stenotrophomonas rhizophila strain D81_CV1R (идентичность 98,61%, метод 16S рРНК, таблица 1).

Штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером под регистрационным номером MGMM118 (справка о депонировании штамма №310/11 от 28.11.2023).

Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 характеризуется следующими признаками.

Видовое название штамма - Stenotrophomonas rhizophila.

Родословная штамма

Штамм бактерий Stenotrophomonas rhizophila АОП9 был выделен из ризосферной почвы озимой пшеницы сорта Универсиада в фазе трубкования.

Культурально-морфологические особенности штамма. Растет штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 в виде светло-желтых полуматовых слегка выпуклых круглых колоний с ровным краем при 30°C через 2 суток на среде KingB. Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophilia АОП9 является грамотрицательной бактерией, клетки которой представляют собой морфологически тонкие, однородные, прямые или изогнутые палочки 0,45-0,65 × 0,92-1,55 мкм.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 представляет собой аэробную бактерию с хемоорганотрофной формой получения энергии.

Растет штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 при рН 6,0-8,0 при температуре от +22° до +35°С, на питательных средах King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ), LB (триптон - 10 г/л, хлорид натрия - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ), PDA (картофельный бульон - 1 л, декстроза - 20 г/л, агар - 18 г/л).

Хранение штамма Stenotrophomonas rhizophila АОП9 возможно в эппендорфе либо в криопробирках в смеси ФСБ и глицерина (до 50% от общего объема) при -80°С.

Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 обладает рядом ферментативной активностью: амилазная, целлюлозная, протеазная, а также данный штамм способен фиксировать атмосферный азот и продуцировать индол-3-уксусную кислоту. Штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности и по каким-либо другим причинам.

Данный штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 способен утилизировать следующие органические соединения: D-глюкозу, D-фруктозу, D-лактозу, D-мальтозу и D-целлобиозу.

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 получают, приливая к испытуемому образцу ризосферной почвы озимой пшеницы приливают ФСБ в соотношении 1:9, перемешивают с помощью вортекса в течение 1 минуты. К полученным смывам бактериальных суспензий добавляют глицерин до 50%, пробирки перемешивают и хранят при температуре -80°С до проведения дальнейшего анализа. Смыв с образца озимой пшеницы через серию разведений высевают на неселективную среду King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ) с антибиотиком нистатином (32 мкг/мл). Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре +30°С в течении суток. После инкубации из чашек отбирают колонии, идентифицированные в дальнейшем как Pseudomonas azotoformans.

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 наиболее близок к виду Pseudomonas azotoformans strain P45A (идентичность 99,86%, метода 16S рРНК, таблица 1).

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM120 (справка о депонировании штамма №312/11 от 28.11.2023 г.).

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 характеризуется следующими признаками.

Видовое название штамма - Pseudomonas azotoformans.

Родословная штамма

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 был выделен из ризосферной почвы озимой пшеницы сорта Универсиада в фазе трубкования.

Культурально-морфологические особенности штамма. Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 растет в виде грязно-белых глянцевых выпуклых круглых колоний с ровным краем при 30°C через 24 часа на среде KingB, является грамотрицательной бактерией. Клетки имеют форму палочек 0,5-1,0 × 1,5-5,0 мкм.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Pseudomonas azotoformans КОП35 является аэробной бактерией.

Растет штамм Pseudomonas azotoformans КОП35 при рН 6,0-8,0 при температуре от +20°С до +30°С на питательных средах King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ), LB (триптон - 10 г/л, хлорид натрия - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ), PDA (картофельный бульон - 1 л, декстроза - 20 г/л, агар - 18 г/л).

Хранение штамма Pseudomonas azotoformans КОП35 возможно в эппендорфе либо в криопробирках в смеси ФСБ и глицерина (до 50% от общего объема) при -80°С.

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 обладает протеолитической и фитазной активностью, а также способен фиксировать атмосферный азот и активно продуцирует индол-3-уксусную кислоту (79,00 мкг/мл), что является самой высокой зарегистрированной концентрацией среди штаммов. Pseudomonas azotoformans КОП35 является наиболее эффективным колонизатором корней озимой пшеницы по сравнению с хорошо известным колонизатором корней Pseudomonas putida PCL1760 (Afordoanyi D.M. et al. Genomic Features of Pseudomonas putida PCL1760: A Biocontrol Agent Acting via Competition for Nutrient and Niche //Applied Microbiology. - 2022. - Vol. 2. - №. 4. - Р. 749-765). Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности и по каким-либо другим причинам.

Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 способен утилизировать следующие субстраты: α-D-глюкозу, D-маннозу, D-фруктозу, D-фукозу, D-галактозу, D-маннит, L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислота, L-глутаминовая кислота, L-пироглутаминовая кислота, L-серин, D-глюконовая кислоту, муциевую кислоту, хинную кислоту, D-сахарную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, α-кетоглутаровую кислоту, L-яблочную кислоту, γ-аминомасляную кислоту, β-гидрокси-d, L-масляную кислоту, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, и N-ацетил-D-глюкозамин.

Штамм бактерии Pseudomonas migulae КОП88

Штамм бактерии Pseudomonas migulae КОП88 получают, приливая к испытуемому образцу почвы из-под вегетирующих растений озимой пшеницы приливают ФСБ в соотношении 1:9, перемешивают с помощью вортекса в течение 1 минуты. К полученным смывам бактериальных суспензий добавляют глицерин до 50%, пробирки перемешивают и хранят при температуре -80°С до проведения дальнейшего анализа. Смыв с образца через серию разведений высевают на неселективную среду King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ) с антибиотиком нистатином (32 мкг/мл). Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре +30°С в течение суток. После инкубации из чашек отбирают колонии, идентифицированные в дальнейшем как Pseudomonas migulae.

Штамм бактерии Pseudomonas migulae КОП88, наиболее близок к виду Pseudomonas migulae strain KBL8 (идентичность 99,88%, метод 16S рРНК, таблица 1).

Штамм бактерии Pseudomonas migulae КОП88 депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM121 (справка о депонировании штамма №313/11 от 28.11.2023 г.).

Штамм бактерии Pseudomonas migulae КОП88 характеризуется следующими признаками.

Видовое название штамма - Pseudomonas migulae.

Родословная штамма

Штамм Pseudomonas migulae КОП88 был выделен из почвы из-под вегетирующих растений озимой пшеницы сорта Универсиада в фазе трубкования.

Культурально-морфологические особенности штамма. Штамм Pseudomonas migulae КОП88 растет в виде розоватых гладких слегка выпуклых глянцевых круглых колоний с ровным краем при 30°C через 2 суток на среде KingB. Штамм является грамотрицательной бактерией. Клетки палочковидные размером 0,5-1,0 × 1,5-5,0 мкм

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Pseudomonas migulae КОП88 является аэробным хемоорганотрофом.

Растет штамм Pseudomonas migulae КОП88 при рН 6,0-8,0 при температуре от +20 до +35°С на питательных средах King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ), LB (триптон - 10 г/л, хлорид натрия - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ), PDA (картофельный бульон - 1 л, декстроза - 20 г/л, агар - 18 г/л).

Хранение штамма Pseudomonas migulae КОП88 возможно в эппендорфе либо в криопробирках в смеси ФСБ и глицерина (до 50% от общего объема).

Бактерии штамма Pseudomonas migulae КОП88 проявляют фитазную активность и способность к фиксации атмосферного азота. При этом данный штамм способен продуцировать ИУК в присутствии L-триптофана в количестве 63,00 мкг/мл. При условии, что данный штамм не способен эффективно колонизировать корни озимой пшеницы, он проявил антагонистическую активность в отношении Fusarium oxysporum и умеренную активность в отношении Alternaria alternata.

Штамма Pseudomonas migulae КОП88 не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности и по каким-либо другим причинам.

Штамм Pseudomonas migulae КОП88 использует в качестве источника углерода сахарозу, α-D-глюкозу, D-маннозу, 1% лактат натрия, миоинозитол, D-аспарагиновую кислоту, тролеандомицин, пектин, D-глюконовую кислоту, муциевую кислоту, хининовую кислоту, D-сахариновую кислоту, ρ-гидроксифенилуксусную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, α-кето-глутаровую кислоту, L-яблочную кислоту, теллурит калия, γ-аминомасляную кислоту, β-гидрокси-D, L-масляную кислоту, пропионовую кислоту и уксусную кислоту.

Ферментативную активность штаммов определяют следующими методами:

Амилазную активность заявляемых штаммов (способность бактерий к гидролизу крахмала) определяют качественным методом (Nimisha P., Moksha S., Gangawane A. K. Amylase activity of starch degrading bacteria isolated from soil //International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. - 2019. - Vol. 8. - №. 4. - P. 659-671), путём инокулирования бактериальной суспензии штамма на амилазную питательную среду. Наблюдают образование зон просветления при окраске среды раствором Люголя, как представлено на фиг. 2. Таким образом амилазная активность продемонстрирована у штаммов Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9.

Целлюлазную активность штаммов проводят по модифицированной методике (Islam F., Roy N. Screening, purification and characterization of cellulase from cellulase producing bacteria in molasses //BMC research notes. - 2018. - Vol. 11. - №. 1. - P. 1-6) и идентифицируют методом детекции зон желтого цвета вокруг колонии после окрашивания конго красным. Целлюлазную активность наблюдают только у штаммов батерии Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophilia АОП9 (фиг.3).

Протеолитическую активность штаммов проводят по модифицированной методике (Sharma A. K. et al. Isolation and screening of extracellular protease enzyme from bacterial and fungal isolates of soil //Int J Sci Res Environ Sci. - 2015. - Vol. 3. - №. 9. - P. 334-340) и наблюдают с зонами просветления, которые образуются в результате гидролиза казеина в среде для штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9. Для штамма Pseudomonas migulae КОП88 подобная зона просветления отсутствует, что свидетельствует о том, что данный штамм не имеет протеолитической активности (фиг. 4).

Внеклеточную фитазную активность штаммов определяют по методу, описанному в (Singh, NandKumar, Dharmendra Kumar Joshi, and Raj Kishor Gupta. "Isolation of phytase producing bacteria and optimization of phytase production parameters." Jundishapur Journal of Microbiology - 2013, V 6.5) по образованию зон просветления вокруг штаммов. На фиг. 5 показаны штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88, проявляющие фитазную активность. Непрозрачная зона вокруг штаммов Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9 свидетельствует о неспособности штаммов солюбилизировать фосфаты.

Определение способности к фиксации атмосферного азота в аэробных условиях у штаммов проводят общеизвестным методом (Zebua, A.C., H. Guchi, and M. Sembiring. "Isolation of non-symbiotic Nitrogen-fixing bacteria on andisol land affected by Sinabung eruption." IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. Vol. 454. No. 1. IOP Publishing, 2020) на среде Йенсена. Как видно на фиг. 6, все заявляемые штаммы Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 способны фиксировать атмосферный азот.

Подвижность штаммов определяют методом in vitro по методике (HaD. G., KuchmaS. L., O’TooleG. A. Plate-based assay for swimming motility in Pseudomonas aeruginosa //Pseudomonas methods and protocols. - 2014. - P. 59-65) с использованием модифицированной среды MSM. Как видно на фиг. 7 штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88, обладают подвижностью, они проросли по всей толще среды, а штамм Bacillus mojavensis АОП29 - только по месту укола, что говорит о его неспособности передвигаться.

Определение антагонистической активности штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 против фитопатогенных грибов Alternaria alternata и Fusarium oxysporum проводят по методике (Fan, Ze-Yan, et al. «Diversity, distribution, and antagonistic activities of rhizobacteria of Panax notoginseng» Journal of ginseng research - 2016, T. 40.2, Р. 97-104). В ходе проверки антагонистических свойств наблюдают, что у штамма бактерии Bacillus mojavensis АОП29 наблюдают ингибирование фитопатогенов Alternaria alternata и Fusarium oxysporum (фиг. 8Аи 8Б). Тогда как штамм Pseudomonas migulae КОП88 ингибирует рост Alternaria alternata, и замедлять рост Fusarium oxysporum.

Колонизирующую способность определяют in planta по методике, описанной в (Validov, Shamil. Biocontrol of tomato foot and root rot by Pseudomonas bacteria in stonewool. Diss. Leiden University, 2007) на штаммах Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88. В качестве контроля (К - контроль) применяют известный штамм колонизатор - Pseudomonas putida PCL1760. Результаты микробиологического анализа представлены в таблице 2. Испытуемые штаммы и положительный контроль образовывают 28 колоний, из которых 67,86% колоний (19) приходится на штамм Pseudomonas azotoformans КОП35 и 32,14% колоний (9) на штамм Pseudomonas putida PCL1760 (К). Таким образом, штамм Pseudomonas azotoformans КОП35 превосходит хорошо известного колонизатора Pseudomonas putida PCL1760 (К). Остальные штаммы не проявили колонизирующих способностей.

Количество продукции индол-3-уксусной кислоты (ИУК) определяют колориметрическим методом по Gordon S.A. и Weber R.P (Gordon, S.A., and Weber R.P. «Colorimetrices timationo findoleacetic acid» Plant physiology, - 1951, Т. 26.1 Р. 192). Анализ на определение количества продукции ИУК показал, что штаммы Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 демонстрируют высокие концентрации ИУК. Так штамм Pseudomonas migulae КОП88, который не является колонизатором на растениях, является хорошим продуцентом ИУК (63,00 мкг/мл). Наилучший колонизатор штамм Pseudomonas azotoformans КОП35, показал высокую концентрацию ИУК - 79,75 мкг/мл (табл. 3). Оставшиеся штаммы демонстрируют умеренную концентрацию ИУК - 19,9 мкг/мл штамм Bacillus mojavensis АОП29, и 27,9 мкг/мл штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9.

Фитотоксичность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют по модифицированной методике, описанной в статье (Mañas P., De las Heras J. Phytotoxicity test applied to sewage sludge using Lactuca sativa L. and Lepidium sativum L. seeds //International Journal of Environmental Science and Technology. - 2018. - Vol. 15. - P. 273-280) на проросших семенах кресс-салата. Заявляемые штаммы на проростках кресс-салата показывают умеренную фитотоксичность в пределах 93-95%, по сравнению с контролем 97,3%, что отражено в таблице 4. Наибольшую ингибирующую активность проявляют штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 со значением фитотоксичности - 92%, и штамм Bacillus mojavensis АОП29 - 93,3%, штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 проявляют одинаковую фитотоксичность со значением - 94,7%. Это свидетельствует о безопасности штаммов по отношению к растениям, поскольку кресс-салат считается наиболее чувствительным растением для данного испытания.

Цитотоксичность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют по методике оценки целостности плазматической мембраны культуры клеток (Иксанова, А.Г., О.В. Бондарь, и К.В. Балакин. «Методы исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов». Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по курсу «Методы скрининга физиологически активных веществ». Казань: Казанский университет, - 2016, 40), которую рассчитывают по окраске образцов 0,4% трипановым синим. Данные по жизнеспособности клеток представлены в таблице 5. По данным, указанные в таблице 5, можно сделать вывод, что оценка целостности плазматической мембраны между контролем и испытуемыми штаммами незначительна. Так, для контрольного образца (среда выращивания LB) количество жизнеспособных клеток составило от 98,17±0,296% до 98,30±0,150%. Для штаммов Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 количество жизнеспособных клеток составило от 98,55±0,370% до 98,83±0,290%. Небольшие отличия выявлены у штамма Bacillus mojavensis АОП29, у которого наибольшее количество жизнеспособных клеток от 99,08±0,108% до 98,10±0,360% даже по сравнению с контрольным образцом. Полученные данные говорят об отсутствии цитотоксического действия на плазматическую мембрану штаммов.

Цитотоксичность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 также определяют методом МТТ-тестирования (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток) по методике (Иксанова, А.Г., О.В. Бондарь, и К.В. Балакин. «Методы исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов». Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по курсу «Методы скрининга физиологически активных веществ». Казань: Казанский университет, - 2016, 40). Результаты оценки жизнеспособных клеток на основе оценки МТТ-редуктазной активности штаммов представлены в таблице 6. Для штамма Stenotrophomonas rhizophila АОП9 средний процент жизнеспособных клеток составил от 101,66±2,892% до 107,93±4,453%, для штамма Pseudomonas migulae КОП88 - от 101,28±5,176% до 107,93±4,453%, для штамма Pseudomonas azotoformans КОП35 - от 98,96±2,855% до 105,14±5,382%, и для штамма Bacillus mojavensis АОП29 - от 103,90±5,367% до 107,08±1,931% (табл. 6). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии цитотоксического действия штаммов.

Таким образом, показано, что предлагаемые бактериальные штаммы обладают ферментативной активностью (амилазная, целлюлазная, протеазная, фитазная), азотофиксирующей активностью, способностью продуцировать индол-3-уксусной кислоту и антагонистической активностью против фитопатогенов отдельных штаммов, необходимых для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. Сводные данные представлены в таблице 7.

Консорциум микроорганизмов

Штаммы бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae, входящих в заявляемый консорциум, совместимы, что подтверждено тестом на совместимость (Xu X. M. et al. Combined use of biocontrol agents to manage plant diseases in theory and practice // Phytopathology. - 2011. - Vol. 101. - №. 9. - Р. 1024-1031). Для этого штаммы бактерий высеивают на среду LB, King B, и PDA линиями перпендикулярно друг другу и инкубируют при 30°С в течение 2 суток. О несовместимости штаммов судят по зонам подавления роста в местах пересечения линий посевов. На фиг. 10 продемонстрированы опыты на совместимость указанных штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 в разных средах LB (фиг. 10А) KingB (фиг. 10Б) и PDA (фиг. 10В). Тест на совместимость не выявил ингибирования роста в местах их контакта друг с другом, что свидетельствует о совместимсти заявляемых штаммов Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88, Pseudomonas azotoformans КОП35и Bacillus mojavensis АОП29, позволяет выращивать их совместно и обуславливает эффективность заявляемого консорциума.

Консорциум получают следующим образом. Вышеуказанные штаммы Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 выращивают в жидкой среде LB. Полученную бактериальную суспензию через серию разведений наносят на агаризованную среду LB при помощи шпателя Дригальского, и инкубируют 24 часа при 30°С. Концентрацию каждого штамма доводят до 10⁷ КОЕ/мл с помощью жидкой среды LB. Полученные бактериальные суспензий штаммов смешивают в равных соотношениях. Получают заявляемый консорциум с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл. Внешний вид консорциума микроорганизмов - жидкая бактериальная культура. Мутно-желтого цвета, имеет специфический запах. Хранят консорциум микроорганизмов в течении 3 месяцев в 0,3 % растворе хлорида натрия при температуре +3-5°С.

Созданный микробный консорциум обладает ростостимулирующими свойствами. Консорциум микроорганизмов состоит из противогрибковых антагонистов Bacillus mojavensis АОП29 и Pseudomonas migulae КОП88 в отношении Fusarium oxysporum и Alternaria alternata. Также в состав консорциума микроорганизмов входит штамм, который является хорошим колонизатором корней растений Pseudomonas azotoformans КОП35. При этом, все бактериальные штаммы заявляемого консорциума микроорганизмов не должны препятствовать росту друг друга (совместимость) и растения-хозяина. Полученный консорциум микроорганизмов можно использовать для защиты от фитопатогенных грибов и стимуляции роста сельскохозяйственных растений.

Проверку заявляемых штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 в качестве стимулятора роста растений проводят на озимой пшенице сорта Универсиада в составе консорциума микроорганизмов, проверку биоконтрольной способности проводят на томатах в минеральной вате против Fusarium oxysporum Forl ZUM2407 в составе консорциума микроорганизмов.

Также указанная техническая проблема решается, и технический результат достигается способом повышения продуктивности растений, характеризующийся тем, что семена растений обрабатывают консорциумом микроорганизмов, состоящим из штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88, и Pseudomonas azotoformans КОП35, в равных объемных соотношениях с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл.

Обработку семян растений заявляемым консорциумом микроорганизмов осуществляют в количестве 1-5 л чистого консорциума, разведенного в 10 л дистиллированной воды, на 1 т семян (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов по состоянию на 24 октября 2023 г. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации URL: https://mcx.gov.ru/upload/iblock/cf7/x38g3mekkqvokqhmfjivjdp8mpluw3mr.zip (Дата обращения: 24.11.2023)). Для равномерного распределения консорциума по всей биомассе семян используют шнековый протравитель семян.

Проверку ростостимулирующих свойств консорциума микроорганизмов проводят общеизвестными методами (Валидов, Ш.З. Биоконтроль корневой гнили томатов бактериями рода Pseudomonas в искусственном субстрате: дис. док. наук. Защищена 06.12.2007 / Лейденский ун-т, 2007. - 115 л.). Способ повышения продуктивности растений консорциума микроорганизмов определяют на растениях томата следующим методом. В бактериальную суспензию доводят до 1×10⁷ КОЕ/мл 1% раствором карбоксиметилцеллюлозы (конечный объем 5 мл), помещают семена томатов выдерживают в течение 15 минут. Затем семена сушат и высаживают в минеральную вату с жидкой минеральной средой ПРР с содержанием томатного фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl ZUM2407) с концентрацией спор 10⁴ КОЕ/мл.

В качестве отрицательного контроля необработанные семена томатов выдерживают в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы, и пропитывают в минеральной вате со средой ПРР со спорами фитопатогенного гриба Forl ZUM2407(отрицательный контроль) и без спор гриба (положительный контроль).

Результаты способа повышения продуктивности растений томата в отношении возбудителя корневой гнили томата Forl ZUM2407 показывают, что эффективность консорциума микроорганизмов по DI% составила 30,15% по сравнению с отрицательным контролем 66,78% (табл. 8). Положительный эффект в отношении всхожести семян томатов также был высоким по сравнению с отрицательным контролем и составил 90,00% и 80,00% соответственно. Увеличение всхожести по сравнению с контролем (где 100% это общее количество посаженых семян) составила 11,43%. Это свидетельствует о хорошей фунгицидной активности заявляемого консорциума микроорганизмов в отношении фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum.

Ростостимулирующие свойства консорциума микроорганизмов проводят на семенах озимой пшеницы Универсиада. В качестве контроля используют семена озимой пшеницы, необработанные консорциумом микроорганизмов. Результаты определения ростостимулирующих свойств заявляемого консорциума микроорганизмов приведены в таблице 9. Фотоизображение растений, выращенных в климатической камере после 14 дней (фиг. 11А) и фотоизображение биометрических измерении длины растении (фиг. 11Б). Параметры биометрических показателей растений озимой пшеницы, обработанные заявляемым консорциумом микроорганизмов выше, чем в контрольных экспериментах, особенно по длине побегов на 38,3% (от 10,7 см в контроле до 14,8 см в опыте), длине корней на 24,1% (от 11,2 см в контроле до 13,9 см в образце) и всхожести на 3,0% (от 87% в контроле до 90% в образце). Наглядно данные характеристики наблюдаются и на фиг. 11, где представлены изображения биометрических измерении длины растении (фиг. 11Б).

Статистический анализ проводят с использованием пакета статистических программ OriginLab pro SR1 b9.5.1.195. Достоверная разница между группами проанализирована с использованием одностороннего ANOVA и апостериорного теста Тьюки на достоверно значимую разницу при p <0,05.

При реализации изобретения используют следующие реактивы и оборудование:

- dNTP, концентрация 100 мМ (Евроген, Российская Федерация);

- L-аспарагин моногидрат, чистота 99,0% (PanReac Applichem, Испания);

- L-триптофан, 100% (PanReac Applichem, Испания);

- Taq-полимераза (Евроген, Российская Федерация);

- Агар микробиологический (ДиаМ, Российская Федерация);

- Агароза (ДиаМ, Российская Федерация);

- Буфер для Taq-полимеразы (Евроген, Россия);

- Гидроксид натрия, 98-100,5% (PanReac Applichem, Испания);

- Гипохлорид натрия, 5% (PanReac Applichem, Испания);

- Глицерин, 99-101% (PanReac Applichem, Испания);

- Глюкоза моногидрат, 98,5-100,5% (PanReac Applichem, Испания);

- Аквадистиллятор (дистиллятор) лабораторный Liston A 1104 (AlmaMed, Российская Федерация);

- Додецилсульфат натрия (SDS), 85% (PanReac Applichem, Испания);

- Железоаммонийные квасцы 12-водн., для аналитики ACS, ISO (PanReac Applichem, Испания);

- Изопропанол, 99,8% (PanReac Applichem, Испания);

- Изотонический раствор (DPBS) (Gibco (Thermo Scientific), США);

- Карбоксиметилцеллюлаза натривая соль, 98% (PanReac Applichem, Испания);

- Карбоксиметилцеллюлоза, 99% (Look chemical, КНР);

- Карбонат кальция, 99-100% (PanReac Applichem, Испания);

- Конго красный, для аналитики (PanReac Applichem, Испания);

- Крахмал, чда (ЛенРеактив, Российская Федерация);

- Молибдат натрия 2-водн, для аналитики (PanReac Applichem, Испания);

- Нистатин, 85% (Sisco Research Laboratories, Индия);

- Нитратаммония, 99% (PanReacApplichem, Испания);

- Пептон дрожжевой (ДиаМ, Российская Федерация);

- Раствор Люголя 0,33% иода (PanReac Applichem, Испания);

- Сахароза, 90% (ДиаМ, Российская Федерация);

- Серная кислота, 95% (PanReac Applichem, Испания);

- Соляная кислота, 37% (PanReac Applichem, Испания);

- Сульфат аммония, для аналитики (PanReac Applichem, Испания);

- Сульфат железа семиводный, 99,5% (PanReac Applichem, Испания);

- Сульфат магния семиводный, 99% (PanReac Applichem, Испания);

- Сульфат марганца 1-водн., для аналитики (PanReac Applichem, Испания);

- Сухое обезжиренное молоко (Central Drug House, Индия);

- Твин 80, pharma grade (ДиаМ, Российская Федерация);

- Трипановый синий, 0,4% (Sigma aldrich, США);

- Триптон казеиновый (ДиаМ, Российская Федерация);

- Фенол, 99,4% (Компонент-Реактив, Российская Федерация);

- Фитат натрия, 90% (Sigma aldrich, США);

- Фосфат калия двузамещенный безводный, 98% (PanReac Applichem, Испания);

- Фосфат калия однозамещенный, 98% (PanReac Applichem, Испания);

- Фосфатно-солевой буфер (ДиаМ, Российская Федерация);

- Хлорид калия, 99% (PanReac Applichem, Испания);

- Хлорид кальция двуводный, 99% (PanReac Applichem, Испания);

- Хлорид натрия, 99% (PanReac Applichem, Испания);

- Хлороформ, 99,9% (Компонент-Реактив, Российская Федерация);

- Этанол, 95% (БИОМЕДХИМ-ФАРМ, Российская Федерация);

Оборудование и материалы:

- 6-луночный планшет (NEST, Китайская Народная Республика);

- CO₂-инкубатор S-Bt Smart Biotherm (Binder, Германия);

- Вортекс MX-E (DLab, Китайская Народная Республика);

- ДНК-амплификатор Veriti (Thermo Scientific, США);

- Дозаторы механические 1-канальные Sartorius Proline объемом 100-1000 мкл, 20-200 мкл, 0,5-10 мкл (Sartorius, Германия);

- Дозаторы механические 8-канальные Sartorius Proline объемом 5-50 мкл, 10-100 мкл (Sartorius, Германия);

- Камера Горяева 4-сеточная, исполнение 3 (ДиаМ, Российская Федерация);

- Культура НЕК 293 (Human Embryonic Kidney 293);

- Культуральные планшеты (Corning, США);

- Ламинарный бокс БМБ-II-Ламинар-С-1,5 (класс II тип А2) (Lamsystems, Российская Федерация);

- Микроскоп стерео SZM-45 (Biobase, Китайская Народная Республика);

- Морозильник низкотемпературный МНТ-80 (Фарм-инвест, Российская Федерация);

- Набор Gel Extraction Kit (Евроген, Российская Федерация);

- Набор для анализа роста клеток MilliporeSigma™ Chemicon™ MTT (Sigma aldrich, США);

- Наконечники на 1000 мкл, 200 мкл, 10 мкл (Corning, США);

- Оптический микроскоп MF23 (MShot, Российская Федерация);

- Петля микробиологическая Biologix, Китайская Народная Республика);

- Планшеты для ПЦР (Nest, Китайская Народная Республика);

- Пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл (Sovtech, Российская Федерация);

- Пробирки типа Falcon объемом 50 мл (Nest, Китайская Народная Республика);

- Система гель-документирования Gel Doc XR+ (Bio-rad, США);

- Спектрофотометр Spectro StarNano (BMG Labtech, Германия);

- Спиртовка микробиологическая (ДиаМ, Российская Федерация);

- Стерилизатор паровой ВКа-75 Р ПЗ (AlmaMed, Российская Федерация);

- Термостат лабораторный суховоздушный ТВ-80 (АО ГРПЗ филиал Касимовский приборный завод, Российская Федерация);

- Фильтровальная бумага (ДиаМ, Российская Федерация);

- Фильтры шприцевые 0,22 нм (Sartorius, Германия);

- Чашки Петри стерильные d=90мм (Перинт, Российская Федерация);

- Шейкер-инкубатор ZQZY-78ES Zhichu (Zhichu, Китайская Народная Республика);

- Шпатель микробиологический (ДиаМ, Российская Федерация);

- Шприцы стерильные 10 мл (ДиаМ, Российская Федерация);

- Электрофорезная горизонтальная камера с источником питания (Bio-rad, США).

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение штаммов

Пример 1А. Выделение штамма бактерии Bacillus mojavensis АОП29

К 1 г листьев озимой пшеницы сорта Универсиада, отобранных на стадии трубкования листа, приливают 9 мл (в соотношении 1:9) стерильного фосфатного буфера (рН 7,0) и интенсивно встряхивают на вортексе в течение 1 минуты. Смыв используют для получения серийных разведений до 10^-3, которые рассевают на чашки Петри на неселективную среду King В (пептон - 10 г/л, глицерин - 10 г/л, агар микробиологический - 18 г/л, сульфат магния - 12,5 мМ, фосфат калия двузамещенный - 8,6 мМ) с антибиотиком нистатином (32 мкг/мл). Посевы инкубируют при температуре +30°С в течении суток. После инкубации из чашек отбирают колонии штамма бактерии Bacillus mojavensis АОП29, которые представлены на фиг. 1 (А). Поверхность колоний непрозрачная, бежевая с образованием складок. Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29 является грамположительной бактерией, клетки короткие и палочковидные, размером около 0,7-0,9 × 1,8-3,0 мкм.

Пример 1Б. Выделение штамма бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9 осуществляют в условиях примера 1А, однако фосфатный буфер добавляют к образцу ризосферной почвы из-под вегетирующих растений озимой пшеницы. Смыв разводят до 10^-6, и рассевают на чашки Петри на неселективную среду King В. После инкубации отбирают колонии штамма бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9, которые представлены на фиг. 1 (Б). Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophilia АОП9 выделен в виде светло-желтых полуматовых слегка выпуклых круглых колоний с ровным краем, является грамотрицательной бактерией, клетки которой представляют собой морфологически тонкие, однородные, прямые или изогнутые палочки 0,45-0,65 × 0,92-1,55 мкм.

Пример 1В. Выделение штамма бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 осуществляют в условиях примера 1Б. После инкубации отбирают колонии штамма бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35, которые представлены на фиг. 1 (Б) в виде грязно-белых глянцевых выпуклых круглых колоний с ровным краем, является грамотрицательной бактерией. Клетки палочковидные размером 0,5-1,0 × 1,5-5,0 мкм.

Пример 1Г. Выделение штамма бактерии Pseudomonas migulae КОП88 осуществляют в условиях примера 1Б, однако фосфатный буфер добавляют к образцу почвы из-под вегетирующих растений озимой пшеницы. После инкубации отбирают колонии штамма бактерии Pseudomonas migulae КОП88, которые представлены на фиг. 1 (В) в виде розоватых гладких слегка выпуклых глянцевых круглых колоний с ровным краем, является грамотрицательной бактерией. Клетки палочковидные размером 0,5-1,0 × 1,5-5,0 мкм.

После получения необходимой биомассы бактерий бактериальные колонии штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88, ресуспендируют в ФСБ, добавляют глицерин в соотношении 1:1 и убирают на криохранение (-80°С).

В иллюстрирующих материалах штаммы обозначены шифрами, где АОП29 - для штамма бактерии Bacillus mojavensis АОП29, АОП9 - для штамма бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9, КОП35 - для штамма бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35, и КОП88 - для штамма бактерии Pseudomonas migulae КОП88.

Проводят видовую идентификацию штаммов.

Видовую идентификацию штаммов бактерии Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88, проводят общеизвестным методом 16S рРНК секвенирования.

Геномную ДНК штаммов выделяют стандартным методом из биомассы испытуемых штаммов (Gautam, Akash. "Phenol-Chloroform DNA Isolation Method." DNA and RNA Isolation Techniques for Non-Experts. Cham: Springer International Publishing, - 2022. 33-39). Далее проводят амплификацию фрагмента гена 16S рРНК c использованием стандартных праймеров 27F (5’-gagtttgatcctggctcag-3’) и 1492R(5’-taccttgttacgactt-3’).

Программа ПЦР для амплификации:

1) Начальная денатурация ДНК - 94°C, 4 мин.

2) Амплификация - 35 циклов:

а) денатурация ДНК - 95°C, 45 сек,

b) отжиг праймеров - 55°C, 45 сек,

с) синтез ДНК - 72°C, 2 мин.

3) Конечная элонгация - 72°C, 3 мин.

4) Хранение - 12°C.

Полученные ПЦР-продукты очищают из агарозного геля с использованием набора Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) и проводят секвенирование по Сэнгеру (секвенирование проводят в компании «Евроген»).

Консенсусная последовательность хроматографий прямого и обратного сиквенса получают с использованием программы Clone Manager Professional 9.5 и загружают в базу данных NCBI для набора нуклеотидных бластов (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC).=blasthome). Результаты идентификации методом 16S рДНК представлены в описании и в таблице 1. С помощью анализа 16S рДНК (идентичность с существующими аналогами) определяют видовую принадлежность исследуемых штаммов.

Штамм Bacillus mojavensis АОП29 на 99,72% совпал со штаммом Bacillus mojavensis strain D50;

штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 на 98,61% совпал со штаммом Stenotrophomonas rhizophila strain D81_CV1R;

штамм Pseudomonas azotoformans КОП35 на 99.86% совпал со штаммом Pseudomonas azotoformans strain P45A

штамм Pseudomonas migulae КОП88 на 99,88% совпал со штаммом Pseudomonas migulae strain KBL8.

Пример 2. Определение амилазной активностей штаммов

Амилазную активность штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas azotoformans КОП35, Pseudomonas migulae КОП88 определяют модифицированным методом (качественный анализ) на основании способности данного штамма к гидролизу крахмала путём инокулирования бактериальной суспензии штамма на амилазную питательную среду (АМ). Для этого используют среду следующего состава: пептон - 0,5 г/л, хлорид калия - 0,1 г/л, сульфат магния семиводный - 0,5 г/л, сульфат аммония - 0,1 г/л, крахмал - 20 г/л, агар - 16 г/л. Отмеряют 20-25 мл среды и наливают в чашку Петри с диаметром 90 мм, капают бактериальную суспензию разных штаммов по 5 мкл и выдерживают 3 суток при +30°С. Гидролиз крахмала в указанной среде детектируют по образованию зон просветления при окраске среды раствором Люголя (PanReacApplichem, Испания).

Амилазная активность штаммов указана на фиг. 2. В штаммах бактерий Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9 наблюдают амилазную активность. Разложение крахмала α-амилазой Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9 основано на гидролизе α-1,4-гликозидных связей крахмальных связей, с которыми граммовый йод (раствор I₂KI или йод Люголя) вступает в реакцию с образованием фиолетового цвета (Lal A., Cheeptham N. Starch agar protocol // American Society for Microbiology. - 2012. - Р. 1-9).

Также на фиг. 2 видно, что штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 не способны к разложению крахмала (отсутствует реакция).

Пример 3. Определение целлюлолитической активности штаммов

Целлюлолитическую активность штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 идентифицируют модифицированным методом (качественный анализ) путем высева по 5 мкл каждого штамма на чашку Петри c модифицированной базальной средой (без аминокислот) (BM) с добавлением карбоксиметилцеллюлозы натриевой соли (20-25 мл на чашку) (фосфат калия двузамещенный - 5,8 г/л, фосфат калия однозамещенный - 3 г/л, сульфат аммония - 1 г/л, сульфат магния семиводный - 12,5 мМ, карбоксиметилцеллюлоза натриевой соли - 10 г/л, агар - 18 г/л). Чашки выдерживают 3 суток при +30°С. Целлюлолитическую активность идентифицируют методом детекции зон желтого цвета вокруг колонии после окрашивания конго красным. Это обусловлено взаимодействием конго красного с интактными β-(1-4)-D-глюканами карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), используемой в качестве источника углерода в среде (Gopinath S. C. B., Hilda A., Anbu P. Extracellular enzymatic activity profiles in fungi isolated from oil-rich environments // Mycoscience. - 2005. - Vol. 46. - №. 2. - Р. 119-126.). На чашке с посевами на (фиг. 3) только штаммы Stenotrophomonas rhizophilia АОП9 и Bacillus mojavensis АОП29 демонстрируют целлюлолитическую активность, которая проявилась зоной желтого цвета вокруг колоний штаммов. Штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 не обладают целлюлолитической активностью, так как вокруг колоний штаммов окраска не изменилась.

Пример 4. Определение протеолитической активности штаммов

Для определения протеолитической активности (качественный анализ) штаммы бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 5 мкл каждого высевают на чашку Петри c модифицированной средой по 25 мл на 1 чашку (BM) с добавлением молочного белка (фосфат калия двузамещенный - 5,8 г/л, фосфат калия однозамещенный - 3 г/л, сульфат аммония - 1 г/л, сульфат магния семиводный - 12,5 мМ, сухое обезжиренное молоко - 10 г/л, агар - 18 г/л), выдерживают в течении суток при +30°С. Вокруг колоний штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 наблюдают зоны просветления, образуемые в результате гидролиза казеина в среде, что говорит о наличии протеиназной активности (рис.4). При этом, в отношении штамма Pseudomonas migulae КОП88 наблюдают отсутствие зоны просветления, что свидетельствует о том, что данный штамм не имеет протеолитической активности.

Пример 5. Определение фитазной активности штаммов

Фитазную активность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют общеизвестным методом. Для этого штаммы по 5 мкл каждого высевают на чашку Петри со средой (20-25 мл на чашку) для скрининга фитазы (PSM), которую готовят из (глюкоза - 20 г/л, фитат натрия - 5 г/л, нитрат аммония - 5 г/л, сульфат магния семиводный - 0,5 г/л, хлорид калия - 0,5 г/л, сульфат железа семиводный - 0,01 г/л, сульфат марганца четырехводный - 1 г/л, агар - 18г/л, хлорид кальция - 2 г/л, доводили рН до 6,3). выдерживают в течении 1-2 суток. в при +30°С. Штаммы, проявляющие активность, образовывали зону просветления вокруг колоний.

Штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88, проявляющие фитазную активность, образовывают зону просветления вокруг колоний (фиг.5). Наличие фитазной активности является одной из характеристик хороших колонизаторов. В то время как Bacillus mojavensis АОП29 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9 не способны солюбилизировать фосфаты, о чем свидетельствует непрозрачная зона вокруг штаммов.

Пример 6. Определение азотофиксирующей способности штаммов

Способность к фиксации атмосферного азота штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют следующим образом. Для этого штаммы по 5 мкл каждого высевают на чашки Петри на среду Йенсена (сахароза - 20 г/л, фосфат калия двузамещенный - 1 г/л, сульфат магния - 0,5 г/л, хлорид натрия - 0,5 г/л, сульфат железа - 0,1 г/л, молибдат натрия - 0,005 г/л, карбонат кальция - 2 г/л, агар - 18 г/л), и инкубируют в течение 5 суток при температуре 30°С. Штаммы, растущие в среде Йенсена, способны фиксировать атмосферный азот. На фиг. 6 представлено, что штаммы Bacillusmojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88, способны фиксировать атмосферный, что подтверждается белыми зонами роста. Среда Йенсена, как безазотистая среда является селективной средой, где азот как необходимый элемент молекулярных структур живых организмов берется из атмосферы (Jensen H.L. Nitrogen fixation in leguminous plants. II. Is symbiotic nitrogen fixation influenced by Azotobacter // Proc. Linn. Soc. NSW. - 1942. - Vol. 67. - Р. 205-212).

Пример 7. Определение подвижности штаммов

Анализ подвижности штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют in vitro модифицированы методом (качественный анализ). Для этого используют модифицированную среду MSM (minimal salt medium - минимальная питательная среда), которая включает в себя глюкозу - 10 г/л, L-аспарагин - 0,5 г/л, фосфат калия двузамещенный - 0,5 г/л, сульфат магния семиводный - 0,2 г/л, сульфат железа семиводный - 0,01 г/л, агар - 3 г/л. Отмеряют 20-25 мл среды и наливают в чашку Петри. В толщу агара уколом вносят 2 мкл суспензии бактерий каждого штамма и инкубируют 24 часа при +30°C.

На фиг. 7 представлены штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88, обладающие подвижностью, которые проросли по всей толще среды, а штамм Bacillus mojavensis АОП29 - только по месту укола, что говорит о его неспособности передвигаться (фиг. 7). Как видно из фиг. 7 штамм бактерий Pseudomonas migulae КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 имеют одинаковую оценку подвижности (+++), что является высоким показателем, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 имеет среднюю подвижность (++), а Bacillus mojavensis АОП29 имел низкую подвижность (+).

Пример 8. Определение антагонистической активности штаммов против фитопатогенных грибов

Антагонистическую активность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 против фитопатогенных грибов Alternaria alternata и Fusarium oxysporum определяют общеизвестным методом (качественный анализ) В чашку Петри со средой 25 мл PDA (Potato Dextrose Agar -картофельно-декстрозный агар) (картофельный бульон - 1 л, декстроза - 20 г/л, агар - 20 г/л) в равноудаленном расстоянии друг от друга вносят 3 мкл суспензии штаммов бактерий и 2 мкл суспензии фитопатогенного гриба в шахматном порядке и выдерживают в течение 5 суток при температуре +30°С. Антагонистическую активность судят по зонам подавления роста фитопатогенов. На фиг. 8 наглядно продемонстрированы антагонистический отклик штаммов на микромицет Alternaria alternata (фиг.8А) и Fusarium oxysporum (фиг. 8Б).

В ходе проверки антагонистической активности штаммов, наблюдают, что для штамма Bacillus mojavensis АОП29 наблюдают ингибирование фитопатогенов Alternaria alternata (фиг. 8А) и Fusarium oxysporum (фиг. 8Б). Штамм Pseudomonas migulae КОП88 способен ингибировать Alternaria alternata, но не Fusarium oxysporum хотя и отнесен к категории колонизаторов, как отмечено в Srinivasa et al., (Srinivasa N. et al. Morphological and biochemical characterization of antagonist Pseudomonas isolates // Int J Agric Sci. - 2015. - Vol. 9. - Р. 14-23.) о штаммах Pseudomonas, ингибирующих Alternaria solani. Для штаммов Pseudomonas azotoformans КОП35 и Stenotrophomonas rhizophila АОП9 не наблюдают антагонистической активности.

Пример 9. Определение колонизирующей способности штаммов in planta

Колонизирующую способность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 in planta определяют общеизвестным методом (качественный анализ). В качестве экспериментальной модельной системы растительно-микробного взаимодействия используют гнобиотическую систему с кварцевым песком. Семена томатов сорта Белый налив 1 г поверхностно стерилизуют и выдерживают в 50 мл 70%-ом процентном этиловом спирте в течение 10 минут. Затем замачивают на 20 минут в 50 мл смеси (10 мл 5%-ого раствора гипохлорида натрия, 0,5 мл 10%-ого SDS, 39,5 мл dH₂O) оставляют на качалке при 180 об/мин. Далее стерилизующий раствор сливают и семена промывают в стерильной дистиллированной воде до отсутствия характерного запаха гипохлорида натрия. Для проверки отсутствия эпифитных бактерий, часть стерильных семян томата раскладывают на чашки Петри со средой King В и инкубируют в течении суток при температуре +30°С, а остальные семена раскладывают в чашку Петри с агаризованной средой ПРР и инкубируют при температуре +5°С в течении 24 часов для синхронизации цикла роста семян. Затем семена выдерживают при комнатной температуре до начала прорастания.

Готовят смесь суспензий микроорганизмов: каждую из культур микроорганизмов доводят до значения оптической плотности ОП₅₉₅=0,1 (не менее 1×10⁶), в стерильной пробирке смешивают 4 штамма бактерий (Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88) в равном соотношении по 200 мкл из числа, отобранных по результатам теста на подвижность, а также применяют известный штамм колонизатор - штамм Pseudomonas putida PCL1760 в качестве контроля.

При этом количественное определение колонизаторов на корнях растений томатов проводят общеизвестным методом ПЦР-фингерпринтинга (ВОХ-ПЦР). Отобранные штаммы после колонизации in planta подготавливают раннее упомянутым способом (ВОХ-ПЦР анализ штаммов). В качестве контрольных образцов используют штаммы, входящие в состав испытуемой группы.

Для проведения ПЦР-типирования выделенных штаммов используют праймеры BOXA1R (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) (Kumar, A. Sampath, et al. «Documentation of virulence and races of Xanthomonas citri pv. malvacearum in India and its correlation with genetic diversity revealed by repetitive elements (REP, ERIC, and BOX) and ISSR marker.» 3 Biotech 8 (2018): 1-12.; Khosravi, Houshang, and Hossein Kari Dolatabad. «Identification and molecular characterization of Azotobacter chroococcum and Azotobacter salinestris using ARDRA, REP, ERIC, and BOX» Molecular Biology Reports 47.1 (2020): 307-316). Программа проведения BOX-ПЦР типирования: 95°С - 3 мин, (95°С - 20 сек, 53°С - 1 мин, 65°С - 8 мин, 34 цикла), 65°С - 18 мин, хранение - при 12°С.

Микробиологический анализ показал (Afordoanyi D.M. et al. Genomic Features of Pseudomonas putida PCL1760: A Biocontrol Agent Acting via Competition for Nutrient and Niche //Applied Microbiology. - 2022. - Vol. 2. - №. 4. - Р. 749-765), что инокулированные штаммы бактерий и положительный контроль образовывают 28 колоний, из них 67,86% колоний Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas putida PCL1760 (К) было 32,14% (таблица 2). По итогам полученных данных можно сделать вывод, что Pseudomonas azotoformans КОП35 превосходит хорошо известного колонизатора Pseudomonas putida PCL1760 (К). Остальные штаммы не проявили колонизирующих способностей.

Пример 10. Определение количества продукции индол-3-уксусной кислоты (ИУК)

Количество индол-3-уксусной кислоты (ИУК) определяют колориметрическим методом. Для этого каждый штамм выращивают в среде Luria-Bertani (Lysogeny broth (LB)) с добавлением 0,1% от общего L-триптофана в качестве предшественника ИУК при 28 ± 1°С при постоянном встряхивании (180 об/мин) в течение 3 суток. После инкубации культуры бактерий центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. По 1 мл каждого супернатанта смешивают с реактивом Сальковского (1:4) (0,1 г железоаммонийных квасцов растворяют в 100 мл 50%-й серной кислоты). Смесь инкубируют в темном месте при 28 ± 1°С в течение 30 мин, затем измеряют оптическую плотность при 530 нм. Концентрацию продуцируемой ИУК оценивают по стандартной кривой ИУК (0-1000 мкг/мл). В качестве холостого опыта используют 1 миллилитр стерильного LB, смешанного с реактивом Сальковского.

Данные, представленные в таблице 3, демонстрируют, что штаммы проявляют относительно высокие концентрации ИУК. Так штамм Pseudomonas migulae КОП88, который не является колонизатором на растениях, является хорошим продуцентом ИУК (63,00 мкг/мл). Наилучший колонизатор штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35 показал высокую концентрацию ИУК - 79,75 мкг/мл. Оставшиеся штаммы проявляют умеренную концентрацию ИУК - 19,9 мкг/мл штамм Bacillus mojavensis АОП29, и 27,9 мкг/мл штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9.

Пример 11. Определение фитотоксичности штаммов

Фитотоксичность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют модифицированным методом на семенах (25 шт.) кресс-салата сорт Забава (агрохолдинг «Поиск», 2022 г). Выращенную за ночь культуру штаммов (10 мл) в среде LB, доводят, до 10³ КОЕ/мл (средняя концентрация консорциума (биопрепарата) при внесении на растения согласно Государственному каталогу пестицидов и агрохимикатов по состоянию на 24 октября 2023 г. // Министерство сельского хозяйства Российской Федерации URL: https://mcx.gov.ru/upload/iblock/cf7/x38g3mekkqvokqhmfjivjdp8mpluw3mr.zip (Дата обращения: 24.11.2023)) пропускают через фильтр 0,22 нм, чтобы избавиться от клеток. Готовой жидкостью (5 мл) пропитывают фильтровальную бумагу в стерильных чашках Петри, содержащих 25 семян кресс-салата. Проращивают 3 суток и считают количество семян, которые взошли. Контрольный образец готовят аналогичным способом, вместо культуральной жидкости используют стерильную воду.

Заявляемые штаммы на проростках кресс-салата показывают умеренную, в пределах 93-95%, фитотоксичность по сравнению с контролем - 97,3%, что отражено в таблице 4. При этом наибольшую ингибирующую активность проявляют штамм Stenotrophomonas rhizophila АОП9 со значением фитотоксичности - 92%, и штамм Bacillus mojavensis АОП29 - 93,3%, штаммы Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 проявляют одинаковую фитотоксичность со значением - 94,7% (табл. 4). Это свидетельствует о безопасности штаммов по отношению к растениям, поскольку кресс-салат считается наиболее чувствительным растением для данного испытания.

Пример 12. Определение цитотокичности штаммов

Цитотоксичность штаммов Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 определяют методом (качественный анализ) по оценке целостности плазматической мембраны и методом МТТ-тестирования (колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток).

Цитотоксичность штаммов определяют следующим образом: в 6-луночные планшеты с культурой НЕК 293 (Human Embryonic Kidney 293) (клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека) вносят по 500 мкл штаммов, полученных из осадков и супернатантов испытуемых штаммов бактерий, выращенных в жидкой среде LB при 30°С в течении 3 суток. Культуры клеток со штаммами инкубируют 72 часа в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, с ежедневной оценкой их состояния при помощи светового микроскопа.

После инкубации определяют жизнеспособность клеток с помощью окрашивания в 0,4% растворе трипанового синего, приготовленного в изотоническом фосфатно-солевом буфере (DPBS), раствор вносят по 0,3 мл в каждую лунку планшета.

Планшеты инкубируют с красителем 5 минут при 37°С, после чего подсчитывают количество окрашенных в синий цвет клеток (мертвых) и общее количество клеточных элементов в поле зрения с прикрепленной культурой непосредственно на стекле.

По данным, указанные в таблице 5, можно сделать вывод, что оценка целостности плазматической мембраны между контролем и испытуемыми штаммами незначительна. Так, для контрольного образца (среда выращивания LB) количество жизнеспособных клеток было от 98,17±0,296% до 98,30±0,150%. Для штаммов Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 количество жизнеспособных клеток составило от 98,55±0,370% до 98,83±0,290%. Небольшие отличия выявлены у штамма Bacillus mojavensis АОП29, у которого наибольшее количество жизнеспособных клеток от 99,08±0,108% до 98,10±0,360% даже по сравнению с контрольным образцом. Полученные данные говорят об отсутствие цитотоксического действия на плазматическую мембрану штаммов.

Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста

МТТ-тест ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium) - колориметрический метод анализа для оценки жизнеспособности клеток, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ преобразовывать водорастворимый 3(3,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который кристаллизуется в цитоплазме клетки. Затем формазан растворяют органическим растворителем (изопропанол), появляется фиолетовое окрашивание. По изменению оптической плотности раствора судят о количестве живых клеток.

В два 96-луночных плоскодонных планшета для культивирования клеток с посеянной культурой НЕК 293 вносят испытуемые штаммы 100 мкл. В лунки - A, B, C, D из супернатанта, в лунки - E, F, G, H из осадков.

Схема внесения испытуемых образцов

Культуры клеток, с внесенными испытуемыми штаммами, инкубируют 72 часа в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, с ежедневной оценкой их состояния при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа. По истечении трех суток проводят МТТ-тест с помощью набора для анализа роста клеток MilliporeSigma™ Chemicon™ MTT.

Из планшета восьмиканальным дозатором удаляют культуральную среду, вносят в каждую лунку по 100 мкл новой среды и по 10 мкл раствора AB (MTT). Перемешивают, аккуратно постукивая по стенке планшета. Инкубируют экспериментальную культуру с красителем при 37°C в СО₂-инкубаторе в течение 3 часов для расщепления МТТ. По истечении этого времени формазан МТТ, образовавшийся в лунках, содержащих живые клетки, появляются в виде черных нечетких кристаллов на дне лунок планшетов.

Из лунок удаляют раствор МТТ. Затем для разрушения клеточных мембран в каждую лунку с культурами клеток добавляют 100 мкл изопропанола с 0,04 Н HCl. Тщательно перемешивают путем повторного пипетирования многоканальным дозатором. Соляная кислота преобразует феноловый красный цвет в среде для культивирования тканей в желтый цвет, который не мешают измерению формазана МТТ. Изопропанол растворяет формазан с образованием однородного синего раствора, пригодного для измерения абсорбции. Через 15 минут инкубации культур с изопропанолом измеряют оптическую плотность на планшетном спектрофотометре при 570 нм и 630 нм длинах волн.

Расчет результатов производят по формуле:

Е =А570-А630,

где Е - оптическая плотность, А570 - значение при длине волны 570 нм, А630 - значение при длине волны 630 нм.

Затем рассчитывают количество жизнеспособных клеток (Nж,%) по следующей формуле:

Nж = Е опыта / Е контроля*100%

Согласно международному стандарту ГОСТ ИСО 10993-5:2009 процент жизнеспособности клеток выше 80% считается показателем, говорящем об отсутствии цитотоксического действия штаммов на клетки; в пределах 80-60% слабая; 60-40% умеренная и ниже 40% сильная цитотоксичность. Результаты оценки жизнеспособных клеток на основе оценки МТТ-редуктазной активности штаммов представлены в таблице 6. Для штамма Stenotrophomonas rhizophila АОП9 средний процент жизнеспособных клеток составил от 101,66±2,892 до 107,93±4,453%, для штамма Pseudomonas migulae КОП88 - от 101,28±5,176 до 107,93±4,453%, для штамма Pseudomonas azotoformans КОП35- от 98,96±2,855 до 105,14±5,382% и для штамма Bacillus mojavensis АОП29 - от 103,90±5,367 до 107,08±1,931% (табл. 6). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии цитотоксического действия штаммов.

Пример 13. Способ получения консорциума

Вышеуказанные штаммы Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas azotoformans КОП35 и Pseudomonas migulae КОП88 выращивают в течение 12 часов в жидкой среде LB (натрия хлорид - 10,0 г/л, триптон - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л). Полученную бактериальную культуру через серию разведений наносят на среду LB (натрия хлорид - 10,0 г/л, триптон - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, агар бактериологический - 18 г/л), размазывая по поверхности при помощи шпателя Дригальского, и инкубируют 24 часа при 30°С. Титр КОЕ в исходной культуре определяют по среднему числу колоний с учетом степени разведения. Концентрацию каждого штамма доводят до 1×10⁷ КОЕ/мл с помощью жидкой среды LB. Полученные бактериальные суспензий штаммов по 5 мл смешивают в равных объемных пропорциях. Получают заявляемый консорциум с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл. Внешний вид консорциума микроорганизмов - жидкая бактериальная культура мутно-желтого цвета, имеет специфический запах. Хранят консорциум микроорганизмов в течении 3 месяцев в 0,3 % растворе хлорида натрия при температуре +3-5°С.

Пример 14. Биоконтрольная эффективность консорциума микроорганизмов в отношении фитопатогена in planta

Эффективность консорциума микроорганизмов в отношении фитопатогена проверяют на растениях томата. Для этогов суспензию в количестве 3,75 мл (при ОП₅₉₅=1,3) добавляют 1% раствор карбоксиметилцеллюлозы (до 10 мл), перемешивают и получают биологический препарат. Раствор карбоксиметилцеллюлозы нужен для лучшей адгезии штаммов консорциума микроорганизмов на семенах.

Семена томатов сорта Белый налив, 2022 года урожая в количестве 72 штук, помещают в заявляемый консорциум микроорганизмов до полного погружения и выдерживают в течение 15 минут.

Обработанные консорциумом микроорганизмов семена (72 шт.), сушат при комнатной температуре, высаживают в минеральную вату и увлажняют жидкой минеральной средой ПРР (1,25 мМ Ca(NO₃)₂, 1,25 мМ KNO₃, 0,50 мМ MgSO₄, 0,25 мМ KH₂PO₄ и раствор микроэлементов в количестве 10% от общего объема (0,75 мг/л KI, 3,0 мг/л H₃BO₃, 10,0 мг/л MnSO×H₂O, 2,0 мг/л, ZnSO₄×5H₂O, 0,25 мг/л Na₂MoO₄×2 H₂O, 0,025 мг/л CuSO₄×5H₂O, 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O). 500 мл ПРР с содержанием томатного фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl ZUM2407), с концентрацией спор 1×10⁴ КОЕ/мл. Концентрацию спор оценивают с помощью камеры Горяева на оптическом микроскопе (Mshot MF23, Китай).

В качестве отрицательного контроля необработанные семена томатов (72 шт.), выдерживают в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы, сушат и высаживают в минеральную вату, пропитанную минеральной средой ПРР со спорами фитопатогенного гриба Forl ZUM2407.

В качестве положительного контроля используют необработанные семена томата (72 шт.), выдержанные в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы, сушат и высаживают на минеральной вате со средой ПРР без спор фитопатогенного гриба Forl ZUM2407.

Контрольные и опытные растения выращивают в течение 14 суток в закрытой климатической камере при температуре 25°С и влажности 70%.

После 14 суток у растений томата оценивают уровень поражения, где 0 - здоровое растение, 1 - начальная стадия поражения (темные точки на корнях), 2 - темные пятна на корнях, 3 - большая часть корня поражена, 4 - мертвое растение. Результаты эффективности биоконтроля полученного консорциума микроорганизмов представлены в таблице 8.

Всего для статистической жизнеспособности эксперимента сохраняют по 65 семян растений в каждой группе. Способность консорциума микроорганизмов к биоконтролю in planta против Forl ZUM2407 определяют с помощью визуальной оценки интенсивности развития болезни (disease index) (DI) следующим образом:

DI = (n0 × 0 + n1 × 1 + n2 × 2 + n3 × 3 + n4 × 4)/ (n0 + n1 + n2 + n3 + n4),

где n0, n1, n2, n3 и n4 - количество растения с индексами 0, 1, 2, 3 и 4 соответственно.

Эффективность применения консорциума микроорганизмов в отношении возбудителя корневой гнили томата Forl ZUM2407 демонстрируют, что DI% составила 30,15% по сравнению с отрицательным контролем 66,78% (табл. 8). Положительный эффект в отношении всхожести семян томатов консорциума микроорганизмов также был высоким по сравнению с отрицательным контролем и составил 90,00% и 80,00% соответственно. Увеличение всхожести по сравнению с контролем (где 100% это общее количество посаженых семян) составила 11,43 %. Это свидетельствует о хорошей биоконтролирующей способности консорциума микроорганизмов.

Пример 15. Ростостимулирующие свойства консорциума микроорганизмов

К бактериальной суспензии в количестве 3,75 мл (при ОП₅₉₅=1,3) добавляют 1% раствор карбоксиметилцеллюлозы (до 10 мл) количество клеток доводят до 1×10⁷ КОЕ/мл. В консорциум микроорганизмов добавляют семена (20 шт.) озимой мягкой пшеницы Универсиада (2022 год) до полного погружения и выдерживают в течение 15 минут. Семена высушивают при комнатной температуре и высаживают в грунт, имеющий следующий состав: торф, комплексное удобрение, известняковые материалы, рыхлители - 5%. Массовая доля питательных веществ (мг/100 г): общий азот (NH₄+NO₃) - 50-150; фосфор (P₂O) - 100-250; калий (K₂O) - 150-300. Кислотность pH - 5,5-6,5. Органическое вещество, не менее - 70%. Грунт с обработанными семенами поливают дистиллированной водой. В качестве контроля используют семена озимой пшеницы, необработанные заявляемым консорциумом микроорганизмов. Растения выращивают в течение двух недель в закрытой климатической камере при температуре 25°С, влажности 70%, при 16 часовом световом дне (ночью температура 20°С, влажность 50%).

После двух недель выращивания озимой пшеницы с консорциумом микроорганизмов и без, в коммерческом грунте, растения осторожно извлекают из грунта вместе с корневой системой и снимают биометрические показатели растений (длина, количество, сухая масса корней и побегов). Результаты представлены в таблице 9. Фотоизображение растений представлены на фиг. 11, выращенных в климатической камере после 14 дней (фиг.11А) и фотоизображение биометрических измерении длины растении (фиг.11Б).

Параметры биометрических показателей растений озимой пшеницы, которые были обработаны заявляемым консорциумом микроорганизмов выше, чем в контрольных экспериментах, особенно по длине побегов на 38,3% (от 10,7 см в контроле до 14,8 см в опыте), длине корней на 24,1% (от 11,2 см в контроле до 13,9 см в образце) и всхожести на 3,0% (от 87% в контроле до 90% в образце). Данные характеристики наглядно представлены на фиг. 11, где представлены изображения биометрических измерении длины растении (фиг.11Б). Показатели по массе также превышают в опытном образце по сравнению с контролем. Так масса побегов увеличилась на 6,7% (от 0,103 г в контроле до 0,11 г образце), а масса корней на 100% (от 0,02 г в контроле до 0,04 г в образце).

Статистический анализ проводят с использованием пакета статистических программ OriginLab pro SR1 b9.5.1.195. Достоверная разница между группами проанализирована с использованием одностороннего ANOVA и апостериорного теста Тьюки на достоверно значимую разницу при p <0,05.

По результатам апостериорного теста Тьюки (методика проведения анализа описана выше) полученные данные по длине корня (р≤0,03), длине побега (p≤0,00001) сухой массе побега (р≤0,02) и корней (р≤0,045) были достоверны.

Таком образом, заявлены новые штаммы бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulae КОП88, и Pseudomonas azotoformans КОП35 и их консорциум, обладающие способностью к азотфиксации, продуцированию индол-3-уксусной кислоты, различной ферментативной активностью, антагонистической активностью в отношении фитопатогенов грибов и хорошей колонизирующей способностью оздоровлению сельскохозяйственных растений.

Заявляемый консорциум проявляет эффективность в отношении возбудителя корневой гнили томата Forl ZUM2407, которая составила DI% 30,15%. Положительный эффект в отношении всхожести семян томатов также был высоким - 90,00%. Эффективность всхожести составила 11,43%. Это свидетельствует о хорошей биоконтролирующей активности консорциума микроорганизмов, что обуславливает перспективность его применения в сельском хозяйстве.

Заявленный способ, расширяющий арсенал способов повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, оказывает положительное влияние на биометрические показатели растений, которые выше, чем в контрольных экспериментах, особенно по длине побегов на 38,3%, по длине корней на 24,1% и всхожести на 3,0%.

Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы от 18.10.2021 г. № 2021-1930-ФП5-0010/4, проект «Генетическая технология конструирования искусственных консорциумов микроорганизмов для создания биопрепаратов в растениеводстве», Соглашение № 075-15-2021-1395 от 25.10.2021 г.

Таблица 1

Идентификация штаммов бактерий методом 16 SрДНК

№п/п Наименование вида в соответствии с базой данных NCBI Наименование штамма Идентичность, % 1 Bacillus mojavensis strain D50 АОП29 99,72% 2 Stenotrophomonas rhizophila strain D81_CV1R АОП9 98,61% 3 Pseudomonas azotoformans strain P45A КОП35 99.86% 4 Pseudomonas migulae strain KBL8 КОП88 99,88%

Таблица 2

Доминирующие колонизаторы по методу BOX-ПЦР

№п/п Наименование вида Название штамма Количество колоний Соотношение в % 1 Bacillus mojavensis АОП29 0 0,00 2 Stenotrophomonas rhizophila АОП9 0 0,00 3 Pseudomonas azotoformans КОП35 19 67,86 4 Pseudomonas migulae КОП88 0 0,00 К Pseudomonas putida PCL1760 9 32,14 Всего колоний 28 100,00

Таблица 3

Результаты определения количества продукции ИУК

№ п/п Наименование вида Наименование штамма Количество ИУК, мкг/мл 1 Bacillus mojavensis АОП29 19,875±0,9382 2 Stenotrophomonas rhizophila АОП9 27,910±0,2500 3 Pseudomonas azotoformans КОП35 79,750±4,1264 4 Pseudomonas migulae КОП88 63,000±0,5570

Таблица 4

Оценка фитотоксичности штаммов

№п/п Наименование вида Наименование штамма Количество проросших семян из 25, шт. % 1 Дистиллированная вода (контроль) К 25 97,3±1,15 23 25 2 Bacillus mojavensis АОП29 23 93,3±1,53 22 25 3 Stenotrophomonas rhizophila АОП9 23 92,0±0,00 23 23 4 Pseudomonas azotoformans КОП35 24 94,7±0,58 23 24 5 Pseudomonas migulae КОП88 23 94,7±1,15 25 23

Таблица 5

Определение жизнеспособности клеток (окраска 0,4% трипановым синим)

№ п/п Наименование штамма Испытуемые штаммы Количество жизнеспособных клеток, % Средний процент в группе 1 Интактная культура клеток (планшет 1) 97,87 98,17±0,296 2 (планшет 2) 98,06 3 (планшет 3) 98,57 4 (планшет 4) 98,43 98,30±0,150 5 (планшет 5) 98,09 6 (планшет 6) 98,38 7 КОП 88 (планшет 1) 98,87 98,55±0,370 8 (планшет 2) 98,02 9 (планшет 3) 98,76 10 (планшет 4) 98,75 98,62±0,450 11 (планшет 5) 97,92 12 (планшет 6) 98, 67 13 АОП 9 (планшет 1) 98,92 98,83±0,290 14 (планшет 2) 99,13 15 (планшет 3) 98,44 16 (планшет 4) 98,77 98,56±0,158 17 (планшет 5) 98,52 18 (планшет 6) 98,39

Продолжение таблицы 5

19 АОП 29 (планшет 1) 99,11 99,08±0,108 20 (планшет 2) 99,20 21 (планшет 3) 98,94 22 (планшет 4) 97,59 98,10±0,360 23 (планшет 5) 98,41 24 (планшет 6) 98,29 25 КОП 35 (планшет 1) 98,59 98,77±0,137 26 (планшет 2) 98,81 27 (планшет 3) 98,92 28 (планшет 4) 99,08 98,55±0,120 29 (планшет 5) 99,25 30 (планшет 6) 98, 92

Таблица 6

МТТ-редуктазная активность штаммов

Наименование испытуемой группы штаммов Средний процент жизнеспособных клеток АОП 29 (100 мл) супернатант 105,09±3,188 АОП 29 (50 мл) супернатант 106,95±5,956 АОП 29 (25 мл) супернатант 103,95±3,425 АОП 9 (100 мл) супернатант 104,75±5,800 АОП 9 (50 мл) супернатант 106,45±6,997 АОП 9 (25 мл) супернатант 105,04±4,390 КОП 35 (100 мл) супернатант 100,64±5,208 КОП 35 (50 мл) супернатант 102,41±4,878 КОП 35 (25 мл) супернатант 98,96±2,855 КОП 88 (100 мл) супернатант 107,93±4,453 КОП 88 (50 мл) супернатант 106,31±5,402 КОП 88 (25 мл) супернатант 103,98±5,986 АОП 29 (100 мл) осадок 104,99±2,286 АОП 29 (50 мл) осадок 107,08±1,931 АОП 29 (25 мл) осадок 103,90±5,367 АОП 9 (100 мл) осадок 101,66±2,892 АОП 9 (50 мл) осадок 103,10±3,795 АОП 9 (25 мл) осадок 103,48±3,978 КОП 35 (100 мл) осадок 102,35±4,039 КОП 35 (50 мл) осадок 105,14±5,382 КОП 35 (25 мл) осадок 101,66±3,554 КОП 88(100 мл) осадок 102,66±4,150 КОП 88 (50 мл) осадок 102,88±4,486 КОП 88 (25 мл) осадок 101,28±5,176

Таблица 7

Сводные данные по ферментативной активности заявляемых штаммов

Наименование вида Наименование штамма Амилаза Целлюлаза Фитаза Протеаза Фиксация азота ИУК, мкг/мл F. oxysporum A. alternata Bacillus mojavensis АОП29 + + - + + 19,875±0,9382 + + Stenotrophomonas rhizophila АОП9 + + - + + 27,910±0,2500 - - Pseudomonas azotoformans КОП35 - - + + + 79,750±4,1264 - - Pseudomonas migulae КОП88 - - + - + 63,000±0,5570 + +

Таблица 8

Данные по эффективности биоконтроля консорциума микроорганизмов

Параметры Положительный контроль (без Forl ZUMM2407) Отрицательный контроль (с Forl ZUMM2407) Консорциум ОП + Forl ZUM2407 Всхожесть (%) 94,57 80,00 90,00 DI (%) 0,00 66,78 30,15 Эффективность Всхожести (%) 0,00 0,00 11,43

Таблица 9

Данные ростостимулирующих свойств консорциума микроорганизмов

Контроль Опыт Всхожесть 87% ± 0,45 % Всхожесть 90 ± 0,53 %^* Масса побегов, г 0,103±0,013 Масса побегов, г 0,11±0,013^* Масса корней, г 0,02±0,004 Масса корней, г 0,04±0,006^* Длина побега, см 10,7±1,07 Длина побега, см 14,8±1,3^* Длина корней, см 11,2±1,2 Длина корней, см 13,9±1,04^*

Группа изобретений относится к области биотехнологии и представляет собой штаммы бактерий и их консорциум для стимуляции роста растений и их защиты от фитопатогенных грибов, а также способ повышения продуктивности растений с использованием заявляемого консорциума. Штаммы бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Pseudomonas azotoformans КОП35, Stenotrophomonas rhizophila АОП9 и Pseudomonas migulae КОП88 выделены из филлопланы, ризосферы и почвы из-под вегетирующих растений озимой мягкой пшеницы сорта Универсиада в фазе трубкования. Таким образом, заявлены новые штаммы бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulае КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 и их консорциум, обладающие способностью к азотфиксации, продуцированию индол-3-уксусной кислоты, различной ферментативной активностью, антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и высокой колонизирующей способностью оздоровления сельскохозяйственных растений. Заявляемый консорциум проявляет эффективность в отношении возбудителя корневой гнили томата Fusarium oxysporum Forl ZUM2407, которая составила DI% 30,15%. Положительный эффект в отношении всхожести семян томатов также был высоким – 90,00%. Эффективность всхожести составила 11,43%. Это свидетельствует о хорошей биоконтролирующей активности консорциума микроорганизмов, что обуславливает перспективность его применения в сельском хозяйстве. Заявленный способ, расширяющий арсенал способов повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, оказывает положительное влияние на биометрические показатели растений, которые выше, чем в контрольных экспериментах, особенно по длине побегов на 38,3%, по длине корней на 24,1% и всхожести на 3,0%. 6 н.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл.

1. Штамм бактерии Bacillus mojavensis АОП29, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM119, для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов.

2. Штамм бактерии Stenotrophomonas rhizophila АОП9, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM118, для стимуляции роста растений.

3. Штамм бактерии Pseudomonas azotoformans КОП35, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM120, для стимуляции роста растений.

4. Штамм бактерии Pseudomonas migulае КОП88, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером MGMM121, для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов.

5. Консорциум микроорганизмов для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенных грибов, характеризующийся тем, что состоит из штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulае КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 в равных объемных соотношениях с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл.

6. Способ повышения продуктивности растений, характеризующийся тем, что семена растений обрабатывают консорциумом микроорганизмов, состоящим из штаммов бактерий Bacillus mojavensis АОП29, Stenotrophomonas rhizophila АОП9, Pseudomonas migulае КОП88 и Pseudomonas azotoformans КОП35 в равных объемных соотношениях с титром каждого штамма бактерий не менее 1×10⁷ КОЕ/мл.