Штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30 для стимуляции роста, снижения развития болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к средству для стимуляции роста, защиты растений от фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Эндофитные непатогенные бактерии живут в симбиозе с растением-хозяином, не повреждая макроорганизм, и поэтому являются группой микроорганизмов, перспективных для выделения агентов биологической защиты и фитостимуляции, которые могут быть использованы в качестве биологических препаратов для растениеводства [Фасхутдинова, Е.Р. Перспективы использования эндофитных и экстремофильных микроорганизмов в борьбе с фитопатогенами сельскохозяйственных культур / Е.Р. Фасхутдинова, Ю.В. Голубцова, О.А. Неверова // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. - 2023. - Т. 24, №5. - С.720-738]. Эти микроорганизмы могут стимулировать рост растений, препятствовать развитию фитопатогенов, увеличивать устойчивость растений к засухе и другим абиогенным стрессам, а также увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур [Коренская, А. Геномный анализ штаммов-эндофитов рода Bacillus: поиск генов, участвующих в осуществлении антифунгальной активности и взаимодействии с растением / А. Коренская, C. Ben, L. Gentzbitte // Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов: Сборник тезисов II Всероссийской школы-конференции, Санкт-Петербург, 26-27 июня 2023 года. - Москва: Издательство «Перо», 2023. - С.54-55; Сорокань, А.В. Эндофитные бактерии Bacillus subtilis 26Д снижают пораженность растений картофеля фитофторозом, стимулируя транскрипционную активность жасмонат-зависимых генов / А.В. Сорокань, Г.Ф. Бурханова, И.В. Максимов // Биомика. - 2020. - Т. 12, №3. - С.398-403]. Эндофитные микроорганизмы могут быть выделены из тканей растений на разных стадиях его развития, при этом многие эндофитные бактерии оказывают положительное влияние на растение-хозяина [Наумович, Н.И. Влияние эндофитных бактерий на рост и развитие растений / Н.И. Наумович, И.В. Шавейко, З.М. Алещенкова // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: Сборник научных трудов. Том 8. - Минск: Республиканское унитарное предприятие «Издательский дом «Белорусская наука», - 2016. - С.211-226]. Представители рода Bacillus хорошо известны в качестве агентов биологической защиты растений. Дополнительным преимуществом этой группы микроорганизмов является возможность формирования эндоспор, что позволяет использовать более дешевые способы высушивания биомассы, а также увеличивает сроки хранения биопрепаратов без потери активности биологического агента в них. Способность к формированию спор также является свойством бактерий рода Bacillus, способствующих их эндофитному поддержанию в растении-хозяине. Эндофитные представители бацилл обладают ценными свойствами для использования на культурных растениях [Fritze, D. Taxonomy of the genus bacillus and related genera: the aerobic endospore-forming bacteria / D. Fritze // Phytopathology. - 2004. V. 94(11). - P. 1245-1248]. Одним из недавно классифицированных видов рода Bacillus является вид Bacillus velezensis, представители которого часто используются для создания биопрепаратов [Rabbee, M.F. Bacillus velezensis: A Valuable Member of Bioactive Molecules within Plant Microbiomes. M.F. Rabbee, M.S. Ali, J. Choi, B.S. Hwang, S.C. Jeong, K.H. Baek //Molecules. - 2019. - V. 24(6). - P. 1046].

Известен штамм В. subtilis Б 93 ВИЗР, отличающийся высокой биологической активностью в отношении подавления фитопатогенов картофеля и рекомендованный для использования в период хранения клубней [RU2538157 C1, 10.01.2015]. Однако, данный штамм не обладает ростостимулирующей активностью.

Заявлен штамм В. subtilis BZR 517 [RU2552146 C1, 10.06.2015], показавший высокую активность в подавлении различных фитопатогенов растений. Вместе с тем, не приведены сведения о его ростостимулирующей активности в отношении растений.

Описан штамм В. subtilis BZR 336g [RU2553518 C1, 20.06.2015], выделенный из ризопланы озимой пшеницы, отличающейся высокой активностью в отношении различных фитопатогенных грибов и обладающий ростостимулирующей активностью.

Предложены штамм бактерий Bacillus subtilis subsp.subtilis, выделенный из ризосферы разнотравья целины - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней [RU2764695 C1, 19.01.2022].

Штамм бактерии Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 и биопрепарат, созданный на основе этого штамма (Фитоспорин) [RU2721966 C2, 25.05.2020] показал высокую эффективность при использовании на сельскохозяйственных культурах [Давлетшин, Ф.М. Эффективность биофунгицида Фитоспорин-М,Ж на яровой пшенице при прямом посеве / Ф.М. Давлетшин, Р.Г. Гильманов, Х.М. Сафин, Д.С.Аюпов // Достижения науки и техники АПК. - 2014. - №2. - С.39-40].

Все представленные штаммы рода Bacillus не являются эндофитными бактериями и не обладают способностью к азотфиксации.

Техническая проблема, решаемая изобретением, состоит в расширении арсенала штаммов, обладающих одновременно высокой ростостимулирующей активностью, подавляющих развитие фитопатогенных грибов и оказывающих положительное влияние на повышение урожайности сельскохозяйственных культур, что обуславливает возможность их использования их в качестве биологического агента в составе биопрепаратов для растениеводства. Технический результат изобретения состоит в реализации указанного назначения.

Техническая проблема решается, и технический результат достигается новым штаммом эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30, стимулирующим рост и повышающим урожайность сельскохозяйственных культур, обладающим фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов растений, что открывает перспективы его использования в качестве биопрепарата.

Заявляемый штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30 является азотофиксатором, продуцентом фитогормона ауксина, что обуславливает его росторегулирующие свойства в отношении растений, повышение урожайности сельскохозяйственных культур. Также штамм является продуцентом экзогенных ферментов (протеаз, амилаз, целлюлаз), проявляет антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов.

Новый штамм выделен из филлопланы мягкой озимой пшеницы сорта Универсиада, созданного в Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства - обособленном структурном подразделении ФГБУН «Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук» (ФИЦ КазНЦ РАН), охраняемого патентом РФ на селекционное достижение №9591 от 05.04.2018, правообладатель и оригинатор ФИЦ КазНЦ РАН. Штамм депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером RCAM06747.

Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов, положительное влияние на продуктивность растений, отсутствие патогенности к теплокровным животным и совместимость с другими микроорганизмами.

Видовую принадлежность определяли с помощью метода определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК с последующим сравнением нуклеотидной идентичности с последовательностями, депонированными в международной базе данных GenBank [Altschul, S. F. Basic local alignment search tool. / Altschul, S.F., W.Gish, W. Miller, E.W. Myers, D. J. Lipman //J Mol Biol. - 1990. - V. 215. - P/403-410]. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК заявляемого штамма Bacillus velezensis MGMM30 показала 99,81% идентичности с таковой штамма Bacillus velezensis LMG 22478T [Ruiz-García, C. Bacillus velezensis sp.nov., a surfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga, southern Spain. / Ruiz-García C, V. Béjar, F. Martínez-Checa, I. Llamas, E. Quesada // Int J Syst Evol Microbiol. - 2005. - V. 55. - P. 191-195].

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами. Клетки подвижные, размером 0,61-0,70 х 1,59-2,04 мкм.

На среде Lysogeny broth (LB; 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л хлорида натрия) через 2 суток при 30°C образуют белые с шероховатой поверхностью колонии.

Штамм Bacillus velezensis MGMM30 растет в температурных пределах от 15 до 35°С, оптимум роста - 24-30°С.Рост культуры бактерий наблюдается в средах с диапазоном рН 6,2-8,6; оптимальные для роста значения рН - 7,0-7,3.

Штамм хорошо растет на среде Кинг Б [King, E. O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E.O. King, M. K. Ward, D.E. Raney // J. Lab. Clin. Med. - 1954. - V. 44. - P. 301-307], среде LB, сусло-агаре (солодовый экстракт 15,0 г/л; пептон 0,75 г/л; мальтоза 12,75 г/л; декстрин 2,75 г/л; глицерин 2,35 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4 г/л; хлорид аммония 1,0 г/л; агар-агар 20,0 г/л. Штамм является прототрофом, поскольку может расти в минеральной сукцинатной среде [Meyer, J.M. The Fluorescent Pigment of Pseudomonas fluorescens: Biosynthesis, Purification and Physicochemical Properties / J.M. Meyer, M.A. Abdallah // J. Gen. Microbiol. - 1978. - V. 107. - P. 319-328], состоящей из минеральных солей и сукцината в качестве источника углерода.

Штамм хранится при 4-6°C в пробирках с полужидким агаром в минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 2 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,3) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечению 2-х суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года. Штамм также может быть заморожен в фосфатно-солевом буфере (рН 7.0) с добавлением 30% глицерина для хранения в течение 5 лет.

Оценку способности штамма фиксировать атмосферный азот проводили путем инокулирования бактериальной суспензии штамма на питательную среду Дженсена (Jensen's Medium). Затем чашки инкубировали при 30°C в течение 2-5 дней. Рост и развитие штамма на поверхности среды рассматривались как способность фиксировать атмосферный азот на среде Дженсена. Проведенные эксперименты подтвердили способность Bacillus velezensis MGMM30 к азотфиксации, т.к. данный штамм хорошо рос и развивался на среде Дженсена.

Оценку протеазной и целлюлазной активности проводили путем инокулирования бактериальной суспензии штамма на минимальную сукцинатную среду с добавлением соответственно 1% сухого молока, полисорбата 80 и карбоксиметилцеллюлозы натрия. Липазную активность определяли путем инокулирования бактериальной суспензии штамма на липазную питательную среду (сукцинатная среда+2% tween-20), хитиназную активность - на хитиназную питательную среду (сукцинатная среда+1% хитин). Амилазную активность определяли путем инокулирования бактериальной суспензии штамма на амилазную питательную среду (АМ). Затем чашки инкубировали при 30°C в течение 2-10 дней. После инкубации для выявления целлюлозной и амилазной активности чашки прокрашивали 0,2% раствором Конго красного и 0,5% (0,1н) калий йодистого раствора соответственно. Через 5 минут чашки промывали 0,5% раствором KCl. О целлюлазной, хитиназной и амилазной активности судили по появлению непрокрашиваемых зон (просветлений) около бактериальных колоний. Липазная активность проявлялась в виде белых кристаллов, возникающих под колонией в агаре. Проведенные исследования показали, что штамм Bacillus velezensis MGMM30 обладает протеазной, липазной, амилазной, хитиназной, целлюлозной активностью.

Индолилуксусная кислота (ИУК) является стимулятором роста растений. Количество ИУК, продуцируемой Bacillus velezensis MGMM30, определяли спектрометрическим методом, в соответствии с Гордоном и Вебером [Gordon, S. A. Colorimetric estimation of indoleacetic acid / S. A.Gordon, R. P. Weber // Plant Physiol. - 1951. - V. 26. - P. 192-195], и сравнивали с количеством ИУК, продуцируемой штаммами сравнения. Результаты оценки, представленные в таблице 1, показали, что штамм Bacillus velezensis MGMM30 синтезирует ИУК в количествах, больших, чем штаммы ризосферных микроорганизмов, которые используются в качестве биопрепаратов. Это свидетельствует о превосходных фитостимулирующих свойствах штамма Bacillus velezensis MGMM30.

Антагонистическую активность штамма Bacillus velezensis MGMM30 по отношению к бактериальным фитопатогенам исследовали конфронтационным методом в чашках Петри с питательной средой LB. В качестве модельного бактериального патогена при исследовании антагонизма по отношению к бактериям использовали штамм Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 [X.F. Xin, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants / Xin X.F., He S.Y. // Annu Rev Phytopathol. - 2013. - V. 51. - P. 473-498]. В результате исследований было показано, что штамм Bacillus velezensis MGMM30 подавляет рост фитопатогенной бактерии, тогда как штамм Pseudomonas putida PCL1760, известный отсутствием каких-либо токсичных метаболитов, не влиял на рост Pseudomonas syringae DC3000.

Антагонистическую активность штамма Bacillus velezensis MGMM30 в отношении фитопатогенных грибов также проводили с использованием конфронтационного метода. Результаты представлены в таблице 2. Результаты показали, что штамм Bacillus velezensis MGMM30 обладает высокой антагонистической активностью в отношении изучаемых фитопатогенных грибов.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение заявляемого штамма

К одному грамму листьев озимой пшеницы сорта Универсиада, отобранных на стадии флагового листа, приливали 10 мл стерильного фосфатного буфера (рН 7.0) и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 10 минут.Суспензию клеток прогревали до 95°С в течение 10 минут, для удаления неспорулирующих форм микроорганизмов. Прогретую суспензию использовали для получения серийных разведений, которые рассевали на чашки Петри с агаризованной средой LB. Полученные колонии пересевали на индикаторные среды для выявления синтеза экзоферментов: амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы, а также на среду Йенсена для выявления штаммов, способных к фиксации атмосферного азота. Штамм, обозначенный MGMM30, выделял все обозначенные ферменты и мог усваивать атмосферный азот.Штамм MGMM30 был идентифицирован как Bacillus velezensis на основе сравнения последовательности вариабельных фрагментов гена 16S рРНК в базах данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) и Ribosomal Database Project II (http://rdp.cme.msu.edu/).

Пример 2. Оценка ростостимулирующей способности штамма Bacillus velezensis MGMM30

Для определения фитостимулирующих свойств Bacillus velezensis MGMM30 было проведено определение количеств продуцируемой ИУК заявляемым штаммом и нескольких ризосферных бактерий, которые также используются для фитостимуляции и защиты растений.

Для этого штамм Bacillus velezensis MGMM30 и другие штаммы культивировали на среде LB с добавлением 1% L-триптофана в качестве предшественника при температуре 29±1°C при постоянном перемешивании (180 об/мин) в течение 3 дней. После инкубирования бактериальную культуру центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут при 4°C и фильтровали (с использованием мембранного фильтра 0,45 мкм). Далее 1 мл полученной суспензии смешивали с реактивом Сальковского [0,5 М хлорида железа (FeCl₃) и 35%-ной хлорной кислоты (HClO₄)] в соотношении 1 к 2. Смесь инкубировали при отсутствии света и комнатной температуре в течение 30 мин, затем измеряли оптическую плотность при 530 нм. Концентрацию ИУК оценивали по стандартной кривой ИУК (0-1000 мкг/мл). Один мл стерильного среды LB с 1% L-триптофана, смешанного (в соотношении 1 к 2) с реактивом Сальковского, использовали в качестве бланка. Показатели количества продуцируемой штаммами ИУК, мкг/мл, представлены в таблице 1. Данные иллюстрируют, что количество продуцируемой заявляемым штаммом Bacillus velezensis MGMM30 (241,74±5,49) превышает в 3,6-40,2 раз количества УИК, продуцируемой штаммами сравнения: Bacillus mojavensis PS17 - 6,01±0,07, Pseudoarthrobacter sp.I9L5 - 34,31±2,16, Bacillus licheniformis MGMM24 - 67,75±5,08, Bacillus velezensis MGMM74 - 22,55±1,87.

Пример 3. Оценка антагонистической активности штамма Bacillus velezensis MGMM30

Антагонистическую активность штамма Bacillus velezensis MGMM30 в отношении фитопатогенных грибов проводили с использованием конфронтационного метода. На чашки Петри с питательной средой Сабуро выращивали фитопатогенные грибы рода Fusarium: Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium graminnearum и Fusarium culmorum. Грибы высевали, помещая их ровно по центру чашки Петри. По краям вокруг колонии гриба высевали Bacillus velezensis MGMM30. После этого чашки Петри инкубировали в течение 5 суток при t=28°С.Через 5 суток определяли проявление у штамма антагонизма к грибам, визуально, по способности бактерий ограничивать рост гриба, а также с измерением зоны подавления роста колонии. Опыт проводили в трех повторах, средние значения ингибирования и стандартное отклонение высчитывали на основании трех измерений. Результаты, приведенные в таблице 2, показали, что штамм Bacillus velezensis MGMM30 обладает высокой антагонистической активностью в отношении исследованных фитопатогенных грибов, поскольку зона подавления роста колоний фитопатогенов заявляемым штаммом, мм, составляет в отношении: Fusarium oxysporum ZUM2407 - 7,2±1,2, Fusarium oxysporum SC70104 - 3,2±0,5, Fusarium oxysporum SC70157 - 3,1±0,2, Fusarium oxysporum SC70159 - 3,5±0,1, Fusarium sambucinum SC70134 - 1,1±0,2, Fusarium sambucinum SC70160 - 3,2±0,3, Fusarium sporotrichioides SC70115 - 2,0±0,1, Fusarium sporotrichioides SC70124 - 1,5±0,2, Fusarium graminnearum F-877 - 6,2±0,1, Fusarium culmorum 30 - 5,1±0,5.

Пример 4. Оценка защитного эффекта штамма Bacillus velezensis MGMM30 в модельной системе: ячмень (растение-хозяин) и Fusarium culmorum 30 (фитопатоген).

Объектами исследования являлись ячмень (Hordeum vulgare L.) сорта «Белогорский», фитопатогенный гриб Fusarium culmorum 30 и штамм Bacillus velezensis MGMM30.

Для приготовления инокулюма Fusarium culmorum 30 выращивали на агаризованной среде Чапека (сахароза - 30,0; NaNO₃ - 2,0; K₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄*7H₂O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO₄ - 0,01; CuSO₄*5 H₂O - 0,05; агар микробиологический - 20, г/л) при температуре 24°C в суховоздушном термостате в течение 14 дней. Макроконидии смывали стерильной водой, осаждали центрифугированием 10 минут при температуре 4°C, 4000 об/мин, ресуспендировали в стерильной воде и доводили до концентрации 2.5×105/мл.

Штамм Bacillus velezensis MGMM30 выращивали в течение ночи на среде LS (гидролизат казеина - 10,0; соевая мука - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; NaCl - 5,0; L-Цистеина гидрохлорид - 0,30, г/л) при температуре 28°С на качалке (SI - 300R, Южная Корея), режим 180 об/мин. Клетки каждой из бактерий центрифугировали 10 минут при скорости 8000 об/мин и температуре 40°С, супернатант сливали, клетки ресуспендировали в охлажденной стерильной дистиллированной воде. Концентрацию бактериальных клеток определяли по оптической плотности (ОП) при 600 нм (OD600) на спектрофотометре Ultrospec II («LKB biochrom», Швеция) и доводили до ОП, соответствующей концентрации 10⁸ в мл.

Ячмень (Hordeum vulgare L.) сорта «Белогорский», восприимчивый к фузариозной корневой гнили, был получен из коллекции ФИЦ Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова. Семена ячменя стерилизовали 30 секунд в 96% этаноле, трижды промывали стерильной водой, и на 30 мин заливали 0.1% раствором AgNO₃. Затем семена однократно погружали в 0.85% раствор NaCl и многократно промывали стерильной водой, после чего раскладывали в стерильные чашки Петри.

Инокуляцию проводили погружением семян в суспензию Bacillus velezensis MGMM30 с титром около 10⁸ клеток/мл в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы (Saba Klava, Россия) на 15 минут.После инокуляции для удаления излишка влаги семена помещали на стерильную фильтровальную бумагу. Обработанные семена переносили в подготовленные в соответствии с вариантом стерильные чашки Петри.

В качестве субстрата для выращивания растений использовали стерильный вермикулит марки М-150, содержащий окись магния (14-23%), закись железа (1-3%), окись железа (5-17%), окись алюминия (10-13%), двуокись кремния (37-42%), и 8-18% связанной воды. Для проведения опыта был использован вермикулит мелкой фракции (0,5-1 мм), обладающий высокой влагоемкостью, что позволило обеспечить растениям оптимальный водный режим и аэрацию.

Сухой вермикулит стерилизовали автоклавированием (132°С, 2 атм. 20 минут). Для его увлажнения использовали раствор минеральных солей (Са(NO₃)₂∙4H₂O - 1.18 г/л, KNO₃ - 0.5 г/л, KH₂PO₄ - 0.136 г/л, MgSO₄*7H2O - 0.48 г/л). В вариантах с инфекционной нагрузкой в вермикулит вместе с питательным раствором вносили суспензию макроконидий Fusarium culmorum 30 (2,5×10⁵ кл/мл, что соответствует 10⁵ кл/г сухого вермикулита), в контрольном варианте - только питательный раствор.

Вермикулит тщательно перемешивали и помещали в сосуды (объем сосуда 0,5 л, повторность шестикратная). В каждый сосуд высевали по 6 зерен ячменя стерильных или обработанных бактериями согласно вариантам опыта:

1. Контроль (стерильный вермикулит), посев стерильных семян,

2. Вермикулит+Fusarium culmorum 30, посев стерильных семян,

3. Вермикулит+Fusarium culmorum 30, посев семян, инокулированных Bacillus velezensis MGMM30.

Растения выращивали при температурном режиме 22°С день/20°С ночь и режиме освещения 16 ч день/8 ч ночь в течение 19 суток. Влажность вермикулита поддерживали на уровне 60% полной влагоемкости ежедневным поливом сосудов по весу. В течении вегетации учитывали биометрические показатели: всхожесть, появление второго и третьего листа ячменя. После извлечения растений на 19 сутки корни аккуратно отделяли от вермикулита, погружали в воду для окончательного удаления частиц субстрата и просматривали под лупой (×8) для определения симптомов гнили. Болезнь внешне проявляется в виде побурения корней, подземного междоузлия, основания стебля, влагалища нижних листьев, полного отмирания кончиков корней. Учет поражения корневой и прикорневой гнилью проводили по методике Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений по следующей шкале:

0 - здоровое растение;

1 - на основании стебля или его подземной части видны бурые штрихи, на первичных и вторичных корнях видны отдельные участки бурого цвета (зоны некроза), поражение не более 10%;

2 - основание стебля слегка бурое, отдельные корни или значительные участки их бурые, наблюдается отмирание кончиков корней, поражение от 10 до 30%;

3 - на основании стебля или его подземной части видны бурые пятна, охватывающие более половины органа, большая часть корней поражена, поражение от 30 до 70%;

4 - основание стебля или его подземной части темное с перехватом, большая часть корней поражена или отмерла, поражение от 70 до 100% или гибель растения.

Для определения интенсивности развития болезни использовали формулу R=Σab/NK

где R - развитие болезни (баллы или проценты); Σ (а b) - сумма произведений числа больных растений (а) на соответствующий балл или процент поражения (b); N - число учитываемых растений в пробе (больных и здоровых), К - наивысший балл поражения.

Учет корневой гнили показал, что обработка семян ячменя исследуемым штаммом Bacillus velezensis MGMM30 привела к снижению интенсивности корневой гнили, вызванной действием Fusarium culmorum 30 примерно в три раза, что продемонстрировано на фигуре: интенсивность поражения растений, в баллах, составила в контроле 0,01; в случае стерильного вермикулита, обработанного минеральным раствором с добавлением спор Fusarium culmorum 30-2,37±0,12; в варианте со стерильным вермикулитом, обработанным минеральным раствором с добавлением спор Fusarium culmorum 30, с семенами ячменя, обработанными клетками штамма Bacillus velezensis MGMM30-0,78±0,17.

Пример 4. Оценка влияния обработки семян яровой пшеницы штаммом Bacillus velezensis MGMM30 в полевых условиях.

Исследования проводились на опытных полях ООО «Агросервис» в Пензенской области, РФ, в 2022. Объектом исследования выступал сорт яровой пшеницы Радуга.

В качестве экспериментального варианта выступал биопрепарат на основе изучаемого штамма Bacillus velezensis MGMM30. Производство биопрепарата проводилось на лабораторной качалке Sinnova 40R (Eppendorf) при температуре 37°С, время инкубации - 17 часов при ротации 180 об/мин. Среда для получения препаратов - жидкая питательная среда LB, Лурия бульон. Титр не менее 2,0*10⁹ КОЭ/л. Семена яровой пшеницы обрабатывались непосредственно при посеве с расходом рабочей жидкости 10 л/т семян. Биопрепарат на основе изучаемого штамма применялся в нормах 1,0 и 1,5 л/т.В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был известный биопрепарат Фитоспорин М с нормой расхода также 10 л/т.Погодные условия 2022 года были благоприятными по увлажнению и температуре для формирования урожая яровой пшеницы. Агротехника возделывания яровой пшеницы была согласно зональным рекомендациям. Показатели урожайности яровой пшеницы сорта Радуга при обработке семян биопепаратом на основе изучаемого штамма Bacillus velezensis MGMM30 в сравнении с контролем и препаратом сравнения приведены в таблице 3.

Заявляемый штамм Bacillus velezensis MGMM30 оказал достоверное положительное влияние на рост урожайности яровой пшеницы в сравнении со стандартным препаратом Фитоспорин М: повысил валовой сбор, т - 1042 в контроле, 1037 для Фитоспорин М, 1035 для штамма Bacillus velezensis; урожайность зерна, ц/га - 40,07, 44,12 и 49,28 соответственно; прибавка урожая, %, составила в случае препарата Фитоспорин М 10,01, для штамма Bacillus velezensis - 22,98.

Таким образом, предложен новый штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30, стимулирующий рост и повышающий урожайность сельскохозяйственных культур, обладающий фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов растений, что открывает перспективы его использования в качестве биопрепарата.

Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы от 18 октября 2021 г.№2021-1930-ФП5-0010/4, проект «Генетическая технология конструирования искусственных консорциумов микроорганизмов для создания биопрепаратов в растениеводстве» Соглашение №075-15-2021-1395 от «25» октября 2021 г.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к средству для стимуляции роста, защиты растений от фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур, и представляет собой штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30, являющийся азотофиксатором, продуцентом фитогормона ауксина и экзогенных ферментов, проявляющий антагонистическую активность в отношении фитопатогенных бактерий и грибов. Штамм депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером RCAM06747. Штамм оказывает положительное влияние на ростовые процессы растений, обладает антагонистической активностью против фитопатогенных бактерий и грибов, повышает урожайность сельскохозяйственных культур и может быть использован для создания на его основе биопрепаратов для использования в растениеводстве. 1 ил., 3 табл., 5 пр.

Штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» под регистрационным номером RCAM06747, для стимуляции роста, защиты растений от фитопатогенных грибов и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.