ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOMYCES RESISTOMYCIFICUS RECB-31B ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ, СТИМУЛЯЦИИ ИХ РОСТА И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/01 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к производству биологических препаратов для защиты растений от фитопатогенных грибов и может быть использовано для создания биопрепаратов для повышения урожайности и качества урожая сельскохозяйственных культур.

Для защиты сельскохозяйственных культур от болезней активно используются биологические препараты [1]. В основе таких препаратов лежат определенные штаммы микроорганизмов, обладающие способностью подавлять рост и развития фитопатогенных грибов [2]. Среди микроорганизмов, потенциальных биологических агентов для создания биопрепаратов против болезней растений, особое внимание заслуживают бактерии актиномицеты, отличающиеся способностью производить различные антибиотики и физиологически активные вещества [3]. В связи с этим, поиску эффективных штаммов актиномицетов потенциальных биоагентов биопестицидов относится к перспективным направлениям в биологической защите растений.

Известен штамм актиномицета Streptomyces spp., который является биологическим агентом препарата Микостоп, используемого для контроля корневых гнилей растений [4]. Известен штамм Streptomyces felleus-8 ВИЗР [5] в составе биопрепарата Алирин С для защиты растений от болезней. Однако они обладает низкой эффективностью и более узким спектром действия в отношении других групп микозов растений.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм актиномицета Streptomyces chrysomallus р-21 [6], подавляющий рост фитопатогенных грибов и оказывающий стимулирующее влияние на растения. Однако этот штамм имеет недостаточную биологическую эффективность в отношении ряда фитопатогенных грибов.

Задачей изобретения является выявление штамма актиномицета, пригодного для получения биологического препарата с фунгицидной активностью, стимулирующего рост, повышающего урожайность и качество сельскохозяйственных культур для разработки новых средств биологической защиты растений от болезней.

Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов, повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур. Новый штамм выделен из ризосферы ячменя, произраставшего в Апастовском районе Республики Татарстан Российской Федерации и депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2122.

Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов, положительное влияние на продуктивность растений и качество, отсутствие патогенности к теплокровным животным и совместимость с другими микроорганизмами. Идентификация штамма проведена по определителю Гаузе [7]. Видовая принадлежность определялась с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК а также амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для Streptomyces resistomycificus в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетикав НИЦ.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Для определения морфологических особенностей культуру выращивали при t (25±2)С, цвет определяли по шкале Бондарцева (Бондарцев А.С., Шкала цветов. - М.: АН СССР, 1954, 27 с).

Морфологические признаки Цепочки спор прямые, волнистые, споры гладкие. На агаре Чапека и среде Гаузе с крахмалом - воздушный мицелий белый, субстратный мицелий бежево-серый, РП нет. Меланоидных пигментов не образует. Генетические особенности не выявлены.

Streptomyces resistomycificus RECB-31B является аэробной, хемооргано-гетеротрофной бактерией, не нуждающейся в факторах роста. Растет в диапазоне температур от 10 до 37°С с оптимальным диапазоном 28-32°С, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5, при концентрации хлорида натрия до 5%.

Хорошо усваивает глюкозу, маннит; слабо усваивает арабинозу, ксилозу; не усваивает рамнозу, сахарозу, рафинозу, i-инозит, деградирует целлюлозу и крахмал.

Штамм хранится при 4-6°С в пробирках с полужидким агаром в минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 2 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечению 2-х суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года.

Штамм хорошо растет на МПА, КингБ, среде LB, сусло-агаре (состав: концентрат сусла пивного неохмеленного, разбавленный дистиллированной водой до общей концентрации Сахаров 10% (10° Баллинга), рН 7,0-7,2 с добавлением 2,0% агар-агара), среде Громыко, среде Гаузе №2 (состав: триптон - 2,5 г; пептон - 5,0 г; NaCl - 5,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 20 г; вода водопроводная - 1000 мл; рН - 7,0-7,4) и минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 10 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2). Ферментация осуществляется на смеси равных объемов мясо-пептонного бульона и 6°Б неохмеленного пивного сусла (рН 6,9-7,2) при 30°С до 95% спорообразования. Количество КОЕ составляет не менее 5×10⁹ в 1 мл.

Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Казанском Федеральном университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Более подробно сущность описываемого изобретения раскрывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Исследование антагонистической активности штамма Streptomyces resistomycificus RECB-31B

Для выявления антагонизма изучаемого штамма к фитопатогенным микроорганизмам использовали конфронтационный метод. В центр чашек Петри со средой КингБ выкладывали блок с мицелием тестируемого гриба, на расстоянии 2-3 см уколом высевали штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31В, в качестве негативного контроля использовали штамм Pseudomonas putida PCL1760, который высевался также уколом, который не выделяет какие-либо антагонистические вещества, подавляющие развитие микромицетов (фиг.1-6). Чашки Петри помещали на 48-72 часа в термостаты при температуре 25°С для того, чтобы микромицеты и бактерии могли развиваться. Наблюдения проводили на 2-5 сутки в зависимости от скорости роста фитопатогена. Этот способ определения антагонистической активности принято считать качественным где о наличии или отсутствии антагонистических свойств определяется по площади зон подавления роста тест-объектов.

Результаты определения антагонистической активности штамма Streptomyces resistomycificus RECB-31B представлены на фиг.1-6. На котором в качестве вариантов указаны: 1) - штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B, 2) Pseudomonas putida PCL1760. В качестве тест культуры микромицетов использованы: фиг. 1 - Trichoderma asperellum RECB-74F, фиг. 2 -Aspergillus niger, фиг. 3 - Fusarium equisety, фиг. 4 - Penicillum sp., фиг. 5 - Fusarium sporotrichoides, фиг. 6 - Fusarium oxysporum ZUM2407.

Согласно представленной информации, штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B является антагонистом и обладает широким спектром активности; все использованные в исследовании микромицеты проявили, в разной степени, чувствительность к антагонистичному штамму.

Пример 2. Совместимость с полезными микроорганизмами.

Проведено исследование совместимости штамма Streptomyces resistomycificus RECB-31B с полезными бактериями Pseudomonas fluorescens RECB-14B, Bacillus mojavensis RECB-50B Pseudomonas fluorescens RECB-44B, Bacillus mojavensis RECB-50B, Trichoderma asperellum RECB-74F на богатой и минимальной средах. В результате конфронтационных тестов было показано, что из указанного списка полезных микроорганизмов штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B подавляет рост штамма Trichoderma asperellum RECB-74B. Это указывает на возможность применения этого микроорганизма с другими биопрепаратами на основе бацилл и псевдомонад, что дает возможность получения комбинированных биопрепаратов с различными биоагентами с использованием полученного штамма Streptomyces resistomycificus RECB-3IB.

Пример 3. Лабораторная оценка эффективности обработки семян Streptomyces resistomycificus RECB-31В в отношении фитопатогенных грибов Объект исследований - семена яровой пшеницы сорта Йолдыз.

Семена обрабатывались биопрепаратом на основе Streptomyces resistomycificus RECB-31В. Производства биопрепарата проводилось на лабораторной качалке Irmova 40R (Eppendorf) при температуре 37°С, время инкубации - 17 часов при ротации 180 об/мин. Среда для получения препаратов - жидкая питательная среда LB, Лурия бульон. Титр не менее 2,5*109 КОЭ/л. В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был зарегистрированный биологический препарат Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens штамм АР-33 норма расхода - 0,5 л/т.В дальнейшем проводилась фитоэкспертиза обработанных и контрольных семян с использованием метода рулонов по ГОСТ 12044-93. «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями». Для анализа методом рулонов отбиралось по 50 семян, для посева на питательные среды - 25 семян. Повторность четырехкратная. Микроскопические признаки патогенов определялись с помощью микроскопа Микромед-2 с цифровой камерой DCM 300.

Снижение заражения семян патогенами отмечалось при применении Streptomyces resistomycificus RECB-31В с нормой 1,5 л/т. В отношении гель-минтоспориозной инфекции (Bipolaris spp.) выделялся Streptomyces resistomycificus RECB-31B (0,5 л/т), но его активность была на уровне стандартного биофунгицида Ризоплан.

Пример 4. Лабораторная оценка влияния обработки семян Streptomyces resistomycificus RECB-31В на рост и развития растений.

Для оценки влияния обработки семян изучаемым штаммом Streptomyces resistomycificus RECB-31В (в нормах 1,5 и 2,0 л/т) в качестве объекта исследований выступали семена ярового рапса сорта Ратник. Контролем служил биофунгицид Ризоплан. После обработки биопрепаратами семена закладывались во влажные камеры (на основе чашек Петри). По истечении 7 дней определялись биометрические параметры растений и зараженность семян альтернариозом (табл. 2).

Результаты оценки показали, что использование Streptomyces resistomycificus RECB-31В оказало положительное влияние на лабораторную всхожесть, длину корня и длину ростка ярового рапса.

Пример 5. Оценка эффективности обработки семян ярового ячменя Streptomyces resistomycificus RECB-31В в полевых условиях

Объект исследований - яровой ячмень Раушан. Семена обрабатывались биопрепаратом на основе Streptomyces resistomycificus RECB-31В с нормами 0,5 л/т, 1,0 л/т, 1,5 л/т. В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был зарегистрированный биологический препарат Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens штамм АР-33 с нормой расхода - 0,5 л/т. Расход рабочей жидкости - 10 л/т.

Обработка семян, оказала влияние на развитие болезней, в частности на корневые гнили (табл. 3).

Результаты оценки показали, что применение Streptomyces resistomycificus RECB-31В во всех нормах расхода снижает развитие корневых гнилей в сравнении с контролем. В отношении показателей для стандартного биофунгицида Ризоплан, наиболее выраженное преимущество показали варианты со Streptomyces resistomycificus RECB-31В с нормой расхода 1,5 л/т и 0,5 л/т.

Данные по урожайности (табл. 4), показали, что применение Streptomyces resistomycificus RECB-31В способствует достоверному росту продуктивности ярового ячменя. Применение данного штамма в нормах 1,0 и 1,5 л/т по своему влиянию на урожайность ярового ячменя значительно превосходят показатели для стандартного биофунгицида Ризоплана.

Пример 6. Оценка эффективности обработки семян ярового рапса Streptomyces resistomycificus RECB-31В в полевых условиях

Объект исследований - яровой рапс сорт Гедемин. Семена обрабатывались биопрепаратом на основе Streptomyces resistomycificus RECB-31В с нормами 1,0 л/т, 1,5 л/т, 2,0 л/т. В качестве контроля выступал вариант без обработки. Стандартом был зарегистрированный биологический препарат Ризоплан на основе Pseudomonas fluorescens штамм АР-33 с нормой расхода - 1,0 л/т. Расход рабочей жидкости - 20 л/т.

Исследуемый штамм оказал влияние на рост и развитие растений ярового рапса (табл. 5). Результаты оценки показали, что по влиянию на рост и развитие, а также на биологическую урожайность Streptomyces resistomycificus RECB-31В, во всех изучаемых нормах расхода превосходит показатели как контроля, так и Ризоплана.

Аналогичное влияние применение Streptomyces resistomycificus RECB-31В было и на значения фактической урожайности, масличности и сбора масла с 1 га (табл. 6).

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста сельскохозяйственных растений и защита их от фитопатогенов, следствием чего является повышение их урожайности. Он достигается тем, что в качестве средства для обработки семян растений используется штамм бактерии Streptomyces resistomycificus RECB-31В, обладающий комплексом полезных свойств, таких как способность подавлять рост фитопатогенных грибов и защищать растения от инфекционных болезней, стимулировать рост проростков,

Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по соглашению №14.610.21.0017 от 03 октября 2017 г., уникальный идентификатор проекта RFMEFI61017X0017.

Список использованной литературы

1. Минаева О.М., Акимова Е.Е., Зюбанова Т.И., Терещенко Н.Н., Биопрепараты для защиты растений: оценка качества и эффективности: учеб. пособие – Томск: Издательский дом Томского государственного университета, 2018,-130 с.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии. Изобретение представляет собой штамм Streptomyces resistomycificus RECB-31B, выделенный из ризосферы ярового ячменя, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2122. Штамм имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов, повышает урожайность и улучшает качество сельскохозяйственных культур. Штамм нетоксичен для животных, обладает ростостимулирующей активностью и может быть использован для создания на его основе биопрепаратов для защиты растений от микозов болезней. 6 ил., 6 табл., 6 пр.

Штамм бактерий Streptomyces resistomycificus RECB-31B, обладающий фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов, обладающий ростостимулирующим эффектом, повышающий урожайность и качество сельскохозяйственных культур, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2122.