Способ получения и применения биологически активной добавки на основе протеогликанов и гликозаминогликанов Российский патент 2020 года по МПК A23L33/10 A23L33/17 A23J3/04 

Классы МПК: A23L 1/30 содержащие добавки

A23L 1/305 аминокислоты, пептиды или белки

A23L 1/302 витамины

A23L 1/304 неорганические соли, минералы, микроэлементы

A23J 1/10 из волос, перьев, рога, шкур, кож, костей и т.п.

A23L 2/52 - введение ингредиентов (введение консервантов A23L 2/44).

C12N 1/18 - хлебопекарные дрожжи; пивные дрожжи.

Изобретение относится к производству биологически активных добавок на основе протеогликанов и гликозаминогликанов, которые могут быть использованы в качестве биодаптивных высокомолекулярных производных глюкуроновой кислоты для лечебной коррекции ее дефицита, а также повышения эффективности лечения при патологических состояниях сопровождающихся интоксикацией различной этиологии.

Несмотря на большое количество разработанных биологически активных добавок (БАД), выпуск целого ряда которых освоен промышленностью, проблема поиска новых источников сырья для производства БАД остается актуальной. Наиболее эффективными можно считать БАД природного происхождения, обладающие широким спектром действия: антирадикальным, антиперекисным, мембрано-стабилизирующим, радиопротекторным, иммунокоррегирующим и соответственно содержащие в своем составе витамины антиоксидантного ряда, биогенные макро- и микроэлементы, некоторые регуляторы физиологических функций отдельных органов и систем организма. Важно отметить, что моча человека и млекопитающих широко использовалась многими народами с давних времен. Имеются сведения о применении мочи для пищевых целей в средние века в Европе для производства пива, сыроварении. Известно применение мочи в лечебных целях, в частности, при заболеваниях кожи, суставов, сосудов.

За счет содержания широкого набора биологических веществ, включающих антиоксиданты, различные витамины, микроэлементы, углеводы, липиды и др., БАД природного происхождения можно считать наиболее эффективными. Одним из путей решения проблемы, связанной с негативным влиянием на живой организм различных факторов внешней среды является алиментарная коррекция питания с применением БАД.

Анализ литературных источников свидетельствует о том, что сырьем для получения биодаптивных БАД могут служить биологические жидкости парнокопытных и человека. По нашему мнению, наиболее перспективными по биологическому составу и адаптивности являются моча парнокопытных, преимущественно самцов. В определенной степени это связано с удобствами получения сырья в объемах и качестве, необходимом для обеспечения потребности производства. Этот вид исходного сырья является уникальным по своему составу - содержит полноценные по аминокислотному составу и близким по иммунобиологическим свойствам к человеческим: белки, протеогликаны и гликозаминогликаны, целый комплекс макро- и микроэлементов, углеводов, и др.

Актуальность направления несомненна, поскольку разработка соответствующей технологии позволяет решить сразу несколько задач, а именно: создание ресурсосберегающих технологий и комплексного использования сырья, получения биоадаптивных БАД с программируемым спектром действия, безопасным для применения, существенным вкладом в решение проблемы охраны окружающей среды.

БАД предназначены для оптимизации рациона питания. Согласно определению, БАД не являются лекарствами. При заболеваниях используются только как дополнение к основной терапии. При этом они должны применяться под контролем врача для предотвращения неблагоприятных последствий (9).

БАД способны активизировать иммунную систему человека, стимулировать общий обмен веществ, улучшить деятельность сердечнососудистой системы. Они широко применяются при различных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, печени, нервной системы, в комплексной терапии онкологических заболеваний, особенно для купирования осложнений после химиолучевой терапии, и многих других состояний, требующих восстановления или поддержания гомеостаза организма на физиологическом уровне (8, 12, 17, 20)

При анализе известных по этой тематике данных литературы и патентных источников обращено внимание на следующие близкие аналоги, и выделенный прототип.

Известный способ получения биологически активного пищевого полуфабриката (16) включает культивирование микроорганизмов, выращенных на растительном сырье. В качестве источника микроорганизмов используют спонтанные микробные ценозы винодельческого сырья, из которых при культивировании выделяют дрожжи сахаромицеты. При этом культивирование проводят в аэробных условиях при 20-40°С в течение 12-48 ч, а затем отбирают полученные при культивировании дрожжи сахаромицеты с размером клеток (1,5-3,0)×(3,0-6,0) мкм, образующие на винодельческом сырье не более 4-5% спирта. Затем их переносят на нейтральные питательные субстраты с содержанием сухих веществ 5-60% для выращивания до накопления не менее 2-3 млрд. клеток/мл или 2-3 млрд. клеток/г, а затем выращенные культуры используют в качестве пищевого полуфабриката. Из полученного пищевого полуфабриката готовят жидкие или сухие дрожжевые закваски или же его стерилизуют и сушат. В другом из вариантов пищевой полуфабрикат дополнительно ферментируют с помощью бактериальных культур с пробиотическими свойствами. Пищевой биологически активный продукт производят из пищевого полуфабриката, полученного по любому из вариантов способа.

Недостатком данного способа является многоэтапность и сложность технологического процесса получения БАД, необходимость двухкратного культивирования дрожжевого продукта. Изготовленный БАД не является биоадаптивным, поскольку получен из продуктов микробной переработки.

Известна биологически активная добавка к пище (7), изготовленная в в виде таблеток и капсул, содержащая следующие компоненты: гидролизат коллагена пищевой "Колламин-80", сырье для БАД "Акулий хрящ-сырье", жировой компонент "Делиос S", мальтодекстрин "Глюсидекс 19", фруктоза кристаллическая, стеарат магния. Данная добавка представляет собой комплекс из гидролизата коллагена, экстракта акульего хряща, жирового компонента витаминов, наполнителей: фруктозы кристаллической и стеарата магния. Недостатком данной БАД является то, что используются продукты глубокой переработки сырья - гидролизаты. При этом, само сырье выделяется из тканей животных, состав веществ которых существенно отличается от тканей человека. Все эти особенности значительно уменьшают биологическую активность и безопасность применения у человека.

Известно биологически активное вещество (4), которое представляет собой белковый гидролизат, полученный путем кислотного гидролиза и последующей нейтрализации пептидосодержащего животного сырья, выбранного из ряда: туши животных или рыб, альбумин, кровь животных или рыб, мясо животных или рыб, протеиносодержащиеся отходы при производстве продукции из животных или рыб, фильтрации с получением гидролизата и осадка, с последующей сушкой гидролизата, при этом готовый продукт содержит пептиды а также содержит натрий, хром, никель, кобальт, селен, кальций, калий, серу, фосфор, хлор, железо, цинк, медь, марганец.

Полученное биологически активное вещество используется при производстве биологически активной добавки к пище, фармацевтического препарата, биологически активной добавки для кормления животных, ветеринарного препарата, удобрения, активатора микробиологических процессов, перорального питания, парфюмерно-косметического средства, гигиенического средства, молочного продукта, кондитерского изделия, хлебобулочного изделия, масло-жирового продукта, соуса, алкогольного напитка, безалкогольного напитка, рыбного продукта, мясного продукта, макаронных изделий, жевательной резинки, пива.

Недостатком этого вещества в качестве БАД можно отнести его относительную биологическую совместимость, поскольку оно получено из тканей животных и рыб, а также то, что процесс его получения требует глубокой переработки - гидролиза. Что существенно уменьшает биологическую активность конечного продукта.

Известен способ получения БАД из пищевых дрожжей (15), который состоит в том, что пивные, пекарские или винные промывают водой при температуре от 5 до 15°С и соотношении 1:(3,5-4,5). После первого этапа промывки, дрожжи обрабатывают 0,8-1,2%-ным раствором поваренной соли для удаления горечи. Обработку ведут в течение 1,0-1,5 ч при постоянном перемешивании. После этого осуществляют еще два этапа промывки, аналогично первому. Автолиз ведут в течение 11-16 ч при 45-60°С. В таком режиме автолизат накапливает максимально возможное количество аминокислот, низших пептидов, витаминов и пр. при их минимальном разрушении и денатурации. Контроль процесса автолиза ведут по значению аминного азота, которое должно составлять 2,2-3,8% Полученный автолизат разделяют путем сепарирования на фугат автолизата и концентрат клеточных оболочек. Концентрат клеточных оболочек в дальнейшем обрабатывают путем дополнительного сепарирования с одновременной промывкой водой при 50-80°С, взятой в количестве 55-65% от объема концентрата клеточных оболочек, а полученный при этом фугат и фугат автолизата основного сепарирования упаривают при остаточном давлении 0,01-0,02 МПа и температуре 50-60°С. Полученные таким образом два вида биологически активных добавок сушат на вакуум-вальцевых сушилках при 50-60°С до влагосодержания не выше 8%. За счет щадящего режима автолиза, концентрирования и сушки, получают биологически активные продукты с высокими показателями.

Основным недостатком данного способа является то, что пищевые дрожжи не являются естественным метаболитом кишечника человека и биоадаптивным продуктом, и их применение в качестве сырья для получения БАД этой группы несет риск изменения состава и жизнедеятельности естественной бактериальной среды кишечника, что при длительном применении может иметь негативные последствия. Помимо этого предлагаемый авторами патента технологический процесс получения БАД требует проведения многочисленных этапов, длительностью не менее 30 часов, сложного технического и лабораторного обеспечения контроля параметров температуры, давления, биохимических показателей, применения энергозатратного, разнообразного, дорогостоящего оборудования: автоклавы, сепараторы, вакуумные вальцевые сушилки, что существенно сказывается на экономической эффективности и себестоимости конечного продукта.

Известна биологически активная добавка (6), изготовленная в виде порошка, содержащая следующие компоненты: гидролизат коллагена, желатин, фруктовый порошок, лимонную кислоту, декстрозу, аспартам К, ацесульфам К, мальтодекстрин, растительное масло и ароматизаторы. Данная добавка представляет собой комплекс из гидролизата коллагена, желатина, солей калия, ароматизаторов и стабилизаторов. Коллагеновые белки представлены в виде гидролизата и денатурированного коллагена - желатина. К существенным недостаткам данной БАД относится то, что в ее составе нет нативных биологически активных веществ, поскольку основные действующие вещества представлены в виде гидролизата и денатурированных продуктов, эффективность которых незначительна.

Известен способ получения БАД на основе денатурированных коллагеновых белков (5), который может быт использован как функциональная БАД к пище для укрепления соединительных тканей. БАД включает следующие компоненты: денатурированные коллагеновые белки кожи или хряща, или связок, или сухожилий, или их смесь, витамины С, В6, РР, кальция карбонат, железа сульфат, меди цитрат, магния цитрат, тиосульфат натрия, ламинарии слоевища, топинамбура лист или корень, или их смесь и наполнитель. Состав БАД различается в зависимости от возраста и физических особенностей человека. Изобретение позволяет получить функционально-активные биодобавки к пище, которые устраняют соединительнотканную недостаточность у разных категорий людей и стимулируют восстановление соединительных тканей после болезней, травм и больших физических нагрузок. К существенным недостаткам данной БАД относится то, что в ее составе нет нативных биологически активных веществ, поскольку основные действующие вещества представлены в виде гидролизата и денатурированных продуктов, эффективность которых незначительна.

Наиболее близким по совокупным признакам к предполагаемому изобретению является патент (RU 2240123) «Экзогенные биологически активные конъюгирующие вещества» Автор Н.Ш. Кайшева (19), который прият нами как прототип. Описанное изобретение касается применения полиуронидных кислот или их солей в качестве средств заместительной терапии заболеваний, связанных с нарушением метаболических процессов, в частности реакций конъюгации с глюкуроновой кислотой (почечная кома, печеночно-клеточная недостаточность, гепатиты, желтухи и др.). Предлагаемые средства применимы для пероральной заместительной терапии и получены из растительного сырья. Они содержат уроновые кислоты, в том числе полигалактуроновую кислоту со степенью этерификации 40,4% (свекловичный пектин) или производную натриевых солей полиманнуроновой и полигулуроновой кислот (альгинат натрия). По данным автора средства способствуют эффективной защите больных с нарушением метаболических процессов.

Недостатками указанного способа является низкая биосовместимость препарата, обусловленная использованием исходного растительного сырья. Немаловажным недостатком предлагаемых указанных препаратов представляется то, что их основными активными коньюгирующими компонентами являются полигалактуроновая кислота или производные натриевых солей полиманнуроновой и полигулуроновой кислот, которые присущи только растительным продуктам и в организме человека встречаются в следовых количествах. В силу этого, реальное участие этих веществ в процессах детоксикации, конкретно конъюгации в организме человека ограниченно и несущественно, поскольку в этих реакциях основная и доминирующая роль принадлежит глюкуроновой кислоте и (или) ее производным. К отмеченному следует добавить и то, что ферментные системы, ответственные за реакции конъюгации с уроновыми кислотами растительного происхождения, в организме человека отсутствуют, и прохождение этих реакций в организме человека определяется ограниченной возможностью его ферментных систем к побочным, неспецифическим, реакциям с субстратами растительного происхождения.

В настоящее время авторами предлагаемого изобретения из доступных источников информации не выявлен способ получения биосовместимых высокомолекулярных производных D-глюкуроновой кислоты, а также препараты пригодные для перорального применения с целью повышения эффективности детоксикации при проведении основного патогенетического лечения, конкретно реакции коньюгации, а именно, гликозаминогликаны и протеогликаны из биологической жидкости организма млекопитающих и человека, необходимых для реализации предлагаемого изобретения.

С этих позиций нами остановлен выбор на применении в качестве конъюгирующих веществ уже полученных ранее нами препаратов гликозаминогликанов и протеогликанов «Способ получения протеогликана» патент №2621311 от 09.12.2015. Автор Б.И. Асатуров) (2). Этот способ и препарат имеет целый ряд преимуществ перед существующими по следующим признакам, а именно:

1. Препарат состоит из протеогликанов и глюкозаминогликанови полностью биосовместим, поскольку получен из биологической жидкости организма парнокопытных или человека.

2. Глюкуроновая кислота, входящая в состав гликозаминогликанов и протеогликанов в этом препарате, находится в восстановленном (активном) состоянии, поскольку на заключительном этапе применяемого способа выделения, подвергается щелочному гидролизу с разрушением эфирной связи с ранее присоединенным метаболитом, и последующим процессом нейтрализации кислотой, который приводит к восстановлению карбоксильной группы и полной растворимости соединения.

3. Препарат не обладает кумулятивным эффектом, быстро выводится с мочой, неиммуногенен и не вызывает токсических реакций (при испытании на лабораторных животных) и тем самым, может быть применен для заявляемых целей, в том числе и при оценке результатов, без опасности возникновения побочных эффектов.

4. Предлагаемый способ получения протеогликанов и гликозаминогликанов успешно апробирован в опытно-промышленном масштабе с использованием загрузок реагентов в количестве несколько сотен грамм.

Сущность способа получения биоадаптивного БАД на основе протеогликана и гликозаминогликана предусматривает использование сырья, полученного из биологической жидкости парнокопытных или человека, конкретно мочи. Сырье для этого препарата содержит высокомолекулярные производные глюкуроновой кислоты - гликозаминогликаны и протеогликаны, которые находятся в коньюгированном с эндогенными метаболитами состоянии. Технологический процесс обработки сырья по этому способу позволяет избирательно выделить продукт, обладающий функциональными возможностями к реакциям коньюгации и, соответственно, с детоксикационными свойствами. Конкретно, извлекаются преимущественно глюкурониды, тропные к реакциям конъюгации. При выделении и очистки препарата происходит разрушение эфирной связи конъюгата, отделение его от токсического метаболита. При этом, токсический метаболит или его аналоги уже не могут вновь вступать в реакции коньюгации с отделенным глюкуронидом вне организма, поскольку процесс реконъюгации зависит, прежде всего, от ферментных систем, коферментов и субстратов, которые в комплексе присутствуют только в организме и конкретно в клетках печени. Заключительный этап получения препарата приводит к восстановлению его активности и растворимости, обеспечивающих функциональные возможности к детоксикации путем реакций конъюгации. Не менее важным является то, что полученный таким способом препарат обладает полифункциональными возможностями, которые заключаются в способности к реакциям коньюгации, практически со всеми представителями эндогенных метаболитов и ядами, с которыми вступает в реакции коньюгации глюкуроновая кислота и ее производные, механизм реакций с которыми доказан.

Таким образом, выбранный для использования в предполагаемом изобретении препарат высокомолекулярных производных D-глюкуроновой кислоты обладает широкими функциональными возможностями, биосовместим, доступен и экологически безопасен.

В связи с вышеизложенным можно считать оправданным использования биосовместимых высокомолекулярных производных глюкуроновой кислоты для лечебной коррекции ее дефицита, а также при патологических состояниях сопровождающихся интоксикацией различной этиологии.

Целью предлагаемого изобретения является применение высокополимерных биосовместимых производных глюкуроновой кислоты - гликозаминогликанов и протеогликанов как БАД для повышения эффективности проводимого лечения при заболеваниях, связанных интоксикацией различной этиологии, микробной контаминацией кишечника, а также с компенсаторно-восстановительной целью при дефиците этих веществ.

Технический результат достигается за счет использования функциональных особенностей биоадаптивного препарата высокомолекулярных производных глюкуроновой кислоты, конкретно гликозаминогликанов и протеогликанов, которые способны к реакции конъюгации с токсичными продуктами метаболизма для их перевода в связанную с глюкуроновой кислотой нетоксичную форму и последующим выведением образованного комплекса из организма.

Оценка эффективности предлагаемого способа получения БАД на основе протеогликанов и гликозаминогликанов (в дальнейшем БАДПГ) заключается в следующем.

Для проведения исследований были выбраны методики и методология, которые по нашему мнению, наиболее оптимальны для оценки экспериментов. Эти методики известны и успешно использованы в ранее опубликованном патенте (19), который был получен по сходному с предлагаемым изобретение вопросу, однако, касался перорального применения полиуронидов растительного происхождения.

Содержание гексуроновых кислот в полученном у животных биологическом материале определяли карбазоловым методом с последующим измерением светопоглощения при длине волны 530 нм (3). Определение билирубина в сыворотке крови проводили по методу (Jendrassik, Grof) (21) на автоматизированном анализаторе "Humalizer 3000" Human, Германия. Определение прямого билирубина в моче проводили качественной реакцией и полуколичественным определением по диазореакции (Jendrassik, Grof) с использованием тест полосок "DiruiH-10" с последующим качественным и полуколичественном определении на анализаторе "DiruiH-100", производитель - "DiruiIndustrialGroupCo.", Ltd, Китай.

Для стандартизации и повышения качествам лабораторных исследований на экспериментальных животных применено разработанное нами устройство для работы с мелкими лабораторными животными.

Изучение "острой" токсичности БАДПГ проведено методом Кербера (13, 14) на 20 белых крысах-самцах массой 180-220 г путем перорального введения 5 мл 3% раствора БАДПГ в дозе 3500 мг/кг массы тела. После одноразового введения за время наблюдения (в течение 14 дней) гибели животных не отмечалось, что позволило определить LD₅₀ при пероральном введении >3500 мг/кг. Согласно классификации токсических веществ (14) исследованный препарат относится к группе малотоксичных веществ.

Коэффициент корреляции (r) между содержанием гексуроновых кислот и прямого билирубина в сыворотке крови, а также характер зависимости и количественного выражения достоверности связи между двумя указанными признаками вычислен по методике (1).

На первом этапе было изучено влияние 3% раствора БАДПГ при пероральном введении на уровень гексуроновых кислот и билирубина в сыворотке крови и моче интактных животных (1 группа). Для этого использовали крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г. Во 2 и 3 группах животных исследовали те же показатели после введения БАДПГ. Забор материала для исследований проводили до введения БАДПГ (1 группа) и после, а именно: через 2 часа после завершения введения (2 группа) и снова через 24 часа (3 группа). Результаты исследования содержания билирубина приведены в таблице 2. (Содержание билирубина в биологических жидкостях животных (М±m).

Обращает внимание прогрессивное падение уровня прямого билирубина в сыворотке крови, значения которого после завершения введения БАДПГ снижаются до нерегистрируемых величин ко 2 часу (2 группа). Через 24 часа (3 группа) у животных количество прямого билирубина вновь повышалось, что можно объяснить выведением БПГ из организма и восстановления баланса с содержанием прямого билирубина в крови. При определении наличия билирубина в моче по качественной пробе и полуколичественному способу на тест-полосках, в каждой группе животных на протяжении всего периода исследования реакция на билирубин была отрицательной, что свидетельствовало о нормальном течение метаболических процессов в печени. Результаты исследования содержания гексуроновых кислот представлены в таблице 3. (Содержание гексуроновых кислот в биологических жидкостях животных (M±m).

Эти данные свидетельствуют о том, что после введения животными БАДПГ через 2 часа (2 группа) уровень гексуроновых кислот в биологических жидкостях повышается. Наибольшее, почти 3-х кратное увеличение отмечается в сыворотке крови (р<0,001), меньшее, но достоверное (р<0,01) в моче. Через 24 часа (3 группа) после введения БАДПГ показатели сохраняют стабильность и практически не изменяются. Эти данные указывают на целенаправленное положительное влияние примененного БАДПГ на печеночный метаболизм гексуроновых кислот и конкретно, конъюгацию билирубина.

На втором этапе в эксперименте у животных была создана искусственная модель нарушения метаболических процессов. Это достигалось тем, что белым крысам-самцам линии Вистар массой 180-220 г ежедневно, в течение 7 дней, перорально вводили раствор ацетата свинца (АС) в дозе 45 мг/кг массы тела (в пересчете на свинец) (4, 5, 6 группы). После этого животным вводили перорально 3% раствор БАДПГ, разведенный в 0,9% растворе хлористого натрия, в дозе 500 мг/кг. У животных в динамике эксперимента также изучали содержание гексуроновых кислот (в пересчете на глюкуроновую кислоту) и билирубина в сыворотке крови и моче. Забор крови для исследований проводили через 7 дней после завершения введения АС. При этом животным 4 группы исследования проводили до введения БАДПГ. Далее эксперимент продолжался введением БАДПГ как описано выше, при этом через 2 часа (5 группа) и 24 часа (6 группа) после завершения введения БАДПГ вновь производился забор проб биологических жидкостей для исследований. Результаты исследований приведены на таблице 2. Эти данные показывают, что после окончания 7 дневного введения раствора АС у животных 4 группы в крови существенно увеличивается содержание прямого и общего билирубина (р<0,001), (р<0,001) соответственно. Одновременно обнаруживается билирубин в моче, что свидетельствует о развитии гипербилирубинемии. Отмеченное, при этом, в 4 группе животных, содержание гексуроновых кислот в крови падает, более чем в 2 раза (р<0,05), а в моче - растет (р<0,01). Это можно объяснить известным влиянием свинца на блокирование трансфераз, катализирующих перенос глюкуронидной части с УДФГК на билирубин. В результате этого снижается образование глюкуронида-билирубина (прямого билирубина), и как следствие, в крови и в моче повышается содержание как несвязанного (непрямого) билирубина, так и прямого билирубина. Увеличение концентрации в крови связанного (прямого) глюкуронида - билирубина обусловлено блокадой его секреции в желчь. По этой же причине увеличивается и содержание глюкуроновой кислоты в моче. Поскольку с мочой выделяется преимущественно конъюгированный билирубин, его присутствие в моче указывает на конъюгированную гипербилирубинемию.

Свинцовая интоксикация и как ее следствие, развивающаяся у животных паренхиматозная желтуха и гипербилирубинемия определяются по многократно повышенному уровня прямого билирубина. Однако введение БАДПГ приводит к прогрессивному падению его содержания в сыворотке крови и исчезновению в моче уже в первые 2 часа после введения (5 группа). При сравнении с 4 группой (р<0,001) общий билирубин, уровень которого был многократно повышен у животных 4 группы, после введения БАДПГ практически не изменяется и его высокое содержание сохраняется на прежнем уровне (р>0,05). При этом у животных 5 и 6 групп также выявляется высокое содержание билирубина в моче, что можно объяснить ускоренным выведением коньюгированного билирубина - глюкуронида билирубина. Эти показатели хорошо коррелируют с данными литературы, приведенными выше. Одновременно с этим отмечено, что содержание гексуроновых кислот в сыворотке крови у животных 4 группы существенно меньше аналогичных значений у интактных животных 1 группы (р<0,05). Однако после введения БАДПГ уровень гексуроновых кислот существенно (почти 5-кратно) повышается в первые 2 часа (5 группа) (р<0,001), максимально нарастая к 24 часам (6 группа) (р<0,001). Такую динамику уровня гексуроновых кислот можно объяснить повышенным расходом БПГ на реакцию коньюгации с билирубином. Это, в значительно степени подтверждается вышеописанным прогрессивным снижением последнего в сыворотке крови (почти в 3 раза) после введения БАДПГ и сохранения значений на низком уровне в течение 2 часов наблюдения (5 группа). Тот факт, что через 2 часа (5 группа) содержание гексуроновых кислот в моче достигает максимального уровня (р<0,001), после чего снова снижается до прежнего уровня (при сравнении 4 и 6 групп р>0,05) свидетельствует о повышенной вовлеченности введенного БАДПГ в конъюгационный процесс. На эту связь указывает повышенное содержание прямого билирубина в сыворотке крови этих групп животных. Эти данные приведены в таблице 3.

Коэффициент корреляции (r) между содержанием гексуроновых кислот и прямого билирубина в сыворотке крови, а также характер зависимости и количественного выражения достоверности связи между двумя указанными признаками вычисленный по методике (1), показывает, что после введения БАДПГ наблюдается отрицательное значение коэффициента корреляции, что указывает на обратную корреляцию между содержанием гексуроновых кислот и прямого билирубина в сыворотке крови. Значения коэффициента, близкие к единице, свидетельствуют о высокой вероятности связи между этими показателями при применении препарата. Это, в свою очередь, дает основания утверждать об эффективности применения БАДПГ для дезинтоксикации.

В случае использования глюкуроидных веществ, каким является БАДПГ, инактивация непрямого, токсичного билирубина достигается за счет восполнения дефицита субстрата для реакции конъюгации, которая завершается образованием глюкуронида билирубина, нетоксичного соединения. Этот комплекс беспрепятственно проходит через почечный барьер и не накапливается в организме, обеспечивая конечный этап детоксикации.

Не менее важным вопросом, который необходимо выделить является функциональные возможности известных, промышленно выпускаемых глюкуроидных препаратов, как на основе гликозаминогликанов, так и на основе их белковых производных протеогликанов.

Главным и основным отличием этих препаратов от используемого в предполагаемом изобретении БАДПГ, является то, что практически все они, без исключения, приготовлены из сырья растительного происхождения или животного происхождения, конкретно из тканей, но не биологических жидкостей парнокопытных или человека, что предопределяет их низкую биосовместимость. Более того, все эти препараты получены из сырья, представляющего классы гликозаминогликанов или протеогликанов, участвующих в построении основного вещества соединительной ткани. Это предопределяет их использование по назначению, связанному с лечением воспалительных процессов, в частности артритов, синовиитов, бурситов и пр., а также косметологических целях, по назначению, связанному с восстановительными операциями тканей и коррекцией вещества соединительной ткани. Главным отличием является то, что все действующие субстраты или компоненты этих препаратов не обладают функциональными способностями к конкретным реакциям коньюгации и не предназначены для детоксикации.

Напротив, предлагаемое использование полностью биосовместимого БАДПГ, имеет существенные преимущества. Прежде всего, следует отметить, что сырье для этого БАДПГ поступает в коньюгированном с эндогенными метаболитами состоянии, т.е. конкретно выделяется препарат, обладающий функциональными свойствами к реакциям коньюгации и, соответственно, с детоксикационными свойствами. В процессе обработки исходного сырья для получения препарата извлекаются преимущественно глюкурониды, тропные к реакциям конъюгации. При выделении и очистки препарата происходит разрушение эфирной связи конъюгата, отделение его от токсического метаболита. Последующий процесс приводит к восстановлению активной формы и растворимости препарата, обеспечивающих его функциональную способность к детоксикации путем реакций коньюгации. Не менее важным является то, что полученный таким способом препарат обладает полифункциональными возможностями, которые заключаются в способности к реакциям коньюгации не только с билирубином, но практически, со всеми представителями эндогенных метаболитов и ядами, с которыми вступает в реакции коньюгацииглюкуроновая кислота, механизм реакций с которыми доказан.

Анализ этих результатов позволяет с высокой степенью достоверности считать доказанным эффективное действие примененного БАДПГ на целенаправленное восстановление реакции конъюгации и соответственно существенное снижение уровня токсических веществ, в частности билирубина, в крови и моче при экспериментально созданной модели паренхиматозной желтухи.

Гелевая форма БАДПГ обладает высокой сорбционной активностью, что обусловливает выраженное бактерицидное действие препарата на сальмонеллы, шигеллы и другую патогенную микрофлору кишечника. Основная масса бактерий погибает в течение нескольких часов. При этом нормальная микрофлора кишечника не страдает.

Положительное влияние БАДПГ при острых кишечных инфекциях различной этиологии, в частности: энтерколитах, энтерита, вызванным лучевым поражением и других патологических состояниях проявляется в том, что попадая в тонкий кишечник, биокомпоненты БАДПГ снижают кислотность кишечного сока в сторону его нормализации, восстанавливая состав естественной микрофлоры и способствуют снижению количества гнилостной микрофлоры. Одновременно с этим, БАДПГ проявляет целенаправленное бактерицидное действие на патогенную микрофлору, а именно: гемолитическую кишечную палочку, клебсиеллу, грибки рода Candida. Механизм такого бактерицидного действия в определенной степени связан с высокими сорбционными свойствами БАДПГ которые проявляются в способности к прочной фиксации патогенной бактериальной и грибковой микрофлоры с последующим их выведением из организма. Следствием этого является прогрессивное снижение интоксикационного процесса, улучшение клинического состояния пациентов, нормализация лабораторных, биохимических, иммунологических и микробиологических показателей.

Восстановление моторики выделительной функции тонкого и толстого отделов кишечника способствует снижению нагрузки на основные системы детоксикации организма, преимущественно печени и почек, что приводит к ускорению вывода токсических веществ и соответственно устранению причин интоксикации. Важно отметить, что детоксикационное действие биокомпонентов БАДПГ обусловлено высоким, доминирующим содержанием высокомолекулярных производных глюкуроновой кислоты, которая является одним из основных звеньев печеночной детоксикации. Восстановление дефицита этих веществ в организме при попадании биокомпонентов БАДПГ в кровь способствует снижению уровня низко- и среднемолекулярных токсических веществ, в частности: билирубина, группы т.н. «средних молекул», патологических фосфолипидых фракций и ненасыщенных жирных кислот, холестерина, хиломикронов за счет их непосредственного связывания.

Для подтверждения заявленного в предлагаемом изобретении антимикробном эффекте БАДПГ были проведены следующие исследования.

Изучено влияние гелевой формы БАДПГ на связывание взвеси лифилизированных бактериальных клеток E. Coli in vitro. С этой целью готовилась композиция из 10% геля БАД и взвеси клеток E. Coli в концентрации 2 млрд. кл./1 мл. 0,9% раствора хлористого натрия в соотношении 10:1. Смесь экспонировали в течение 5 минут при температуре 36°С. Контролем служила взвесь туши с размерами микрочастиц от 1 до 10 микрон (Тушь черная, ЗАО «Гамма» РФ) в 0,9% растворе хлористого натрия, в концентрации 0,001 мг/мл раствора. Соотношение гелевой формы БАДПГ и раствора туши составило 10:1.

Неожиданно установлено, что для устойчивого необратимого связывания гелевой формой БАДПГ бактериальных клеток достаточно 120-150 секунд, причем связывание наблюдалось практически незамедлительно с момента смешивания растворов. Это определялось по субъективному визуальному контролю прозрачности смеси сразу после смешивания и через 60, 150 и 300 секунд после экспозиции. При этом виде контроля наблюдалось несколько фаз состояния гелевой формы БАДПГ, а именно: первоначальное устойчивое состояние в течение, в среднем до 30 секунд, последующее образование видимых мелкодисперсных агрегатов в течение, в среднем, 60 секунд, с незначительным оседанием, и интенсивное оседание суспензии агрегатов после этого периода в течение, в среднем 300 секунд.

К окончанию этого периода процесс оседания и уплотнения агрегатов практически завершается. Надосадочная жидкость полностью освобождается от остатков единичных микроагрегатов и становится прозрачной. Эти данные представлены на Фиг 2. (изображение №4). Аналогичная картина в сроках экспозиции и осадочной реакцией наблюдалась с частицами туши. Эти данные также представлены на Фиг 1. (изображение №4).

Для объективного контроля проводилось нефелометрическое исследование образцов композиции гелевой формы БАДПГ с взвесью бактериальных клеток и туши в следующих временных интервалах: сразу после смешивания компонентов, и последующими через 60 сек., 120 сек, 180 сек, 240 сек. Исследования проводили на лазерном нефелометре «…» в одноразовых спектрофотометрических микрокюветах «Литопласт» производства Белорусь, объемом 4 мл. Данные представлены в таблице 4 (Изменение нефелометрического показателя (в %) в динамике фиксации БАДПГ), где показаны изменение нефелометрического показателя (в %) в динамике фиксации БАДПГ бактериальной взвеси (светлый фон) и туши (контроль) (черный фон). На Фиг. 1, 2. Показано, что фиксация бактерий и туши начинается практически сразу после смешивания компонентов заканчивается в интервале 150-300 сек. Как видно на изображении №4 Фиг. 2., надосадочная жидкость полностью освобождена от микроагрегатов геля с бактериальными клетками. Аналогично этому, на изображении №4 Фиг. 1. видно, что надосадочная жидкость полностью освобождена от микроагрегатов геля с частицами туши. Т.е. гелевая форма БАДПГ полностью, практически на 100% связала бактериальные клетки и микрочастицы туши.

Из представленных данных можно сделать вывод о том, что показания субъективного контроля и объективных показателей, основанных на нефелометрии полностью совпадают и однозначны. Их интерпретация дает возможность подтвердить факт селективного, прочного связывания гелевой формой исследованной БАДПГ как высоконцентрированной взвеси леофилизированных бактерий, так и индифферентных микрочастиц, конкретно, туши.

Таким образом, подтверждается способность гелевой формы БАДПГ к целенаправленному и высоконасыщенному связыванию бактериальных клеток с возможностью их дальнейшего выведения из организма. В пересчете на концентрацию и объем БАДПГ в одной микрокапсуле можно утверждать, что ее достаточно для связывания не менее 10 млрд. бактериальных клеток. При пероральном приеме 3-4 капсул в течение 2-6 часов будет фиксировано не менее 30-40 млрд. бактериальных клеток, что, несомненно, существенно уменьшит количество патогенной микрофлоры в кишечнике и снимет интенсивность интоксикации.

Способ реализуется следующим образом

Исходный раствор, расфасованный в стеклянную тару, объемом 120 мл, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в концентрации 1 гр./100 мл, в консерванте (0,1N раствор гидроксида натрия), в виде мелкодисперсной, быстро оседающей (в течение не более 5 минут) взвеси белого цвета, изготовлен и любезно предоставлен ООО «Медико-Биологические Системы», РФ, по ТУ 20.42.15-001-23245342-2017 «БИОГЕЛЬ НА ОСНОВЕ ПРОТЕОГЛИКАНОВ». Получен по технологическому процессу, разработанному на основании патента №2621311 «Способ получения протеогликана» автор Б.И. Асатуров. Состав исходного раствора представлен на стр. 24 «Результаты анализа биогеля на основе протеогликанов и гликозаминогликанов» и таблице 1.

Исходный 1% раствор, экспонируется в течение не менее 10-30 минут, предпочтительно, 20 минут, при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка. Затем надосадочная жидкость осторожно, максимально возможно полностью отделяется, осадок переносится в центрифужные стаканы и центрифугируется при 1000 об/мин в течение 30-60 секунд, предпочтительно, в течение 45 секунд. Центрифугат представляет осадок белого цвета имеющий четкую разделительную линию с надосадочной жидкостью, которая осторожно сливается. К осадку, имеющем рН 9,0-9,3 при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 7,8-8,2, предпочтительно, рН 8,0. При этом плотный осадок, изменяет свою консистенцию, превращается в полупрозрачный светлый, опалесцирующий биогель, который представляет концентрат, в общей массе - соотношение составляет 40-55% гель/раствор - 0,9% хлорид натрия. Полностью растворим в воде. По результатам анализов состав конечный продукт представляет гелевую форму с концентрацией протеогликанов и гликозаминогликанов до 80% об общей массы компонентов. Основная часть углеводных компонентов и их производных (аминосахара, ди- и моносахариды, комплексы с глюкуроновой кислотой), характерных для структурных единиц протеогликанов и гликозаминогликанов, в основном хондроитинсульфатов и кератансульфатов, обнаружены во фракции, которая представляет собой осадок, полученный в результате предварительной подготовки образца (центрифугирование). В данной фракции углеводные компоненты составляют до 80% от общего состава фракции. Детализация анализа образцов биогеля представлена в таблице 2.

Полученный концентрат биогеля по одному из вариантов получения БАДПГ расфасовывается в мягкие желудочно-резистентные капсулы, обеспечивающие высвобождение лекарственных средств в кишечном соке.

По второму варианту получения БАДПГ концентрат биогеля сублимируется до твердого состояния в течение не менее 10-14 часов, предпочтительно 12 часов, при -2 - -6°С, предпочтительно -4°С. После окончания сублимационной сушки плотный, твердый, хрупкий продукт светло-коричневого оттенка, размельчается в фарфоровой чашке и проводится через сетчатый фильтр с размером сетки 500 микрон. Порошок расфасовывается в твердые желудочно-резистентные капсулы. Готовый конечный продукт сохраняет свой состав и растворимость в течение не менее 6 месяцев.

Предлагаемый способ решает задачу получения из биологической жидкости - мочи парнокопытных животных или человека биоадптивных БАДПГ для применения в качестве средств, способствующих повышению эффективности лечебной терапии, а также профилактике развития тяжелых заболеваний организма различной этиологии. Получаемые БАДПГ преимущественно состоят из природных биологически активных веществ, таких как протеогликаны и гликозаминогликаны, которые биодаптивны, являются естественными и жизненно незаменимыми метаболитами организма млекопитающих. При реализации способа конечный продукт получается в порошкообразном состоянии или в виде концентрированного геля, сохраняет высокую биологическую активность, высокоочищен, не содержит вредных и опасных химических веществ, сбалансирован по органолептическим показателям, не обладает запахом и вкусом. Окончательная форма выпуска и применения БАДПГ находится в желудочно-резистентных капсулах, которые обеспечивают сохранность продукта от воздействия желудочного сока на структуру и биологические свойства протеогликанов и гликозаминогликанов (11). При этом собственная кислотность БАДПГ внутри капсул не превышает рН 8,2-8,3, что безопасно для пациента и не превышает кислотность кишечного сока толстой кишки, которая находится в пределах рН 8,5-8,6 (18).

Предполагаемое изобретение далее описано более подробно в примерах, которые, однако, не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Опыты проводили на 30 половозрелых белых крысах-самцах линии Вистар массой 180-220 г, разделенных на 3 группы по 10 животных в каждой (1, 2 и 3 группы). Все животные до и в течение эксперимента находились на стандартном режиме питания.

Первая группа животных - интактные. Животные 2 и 3 групп - контрольные группы. Животным второй группы перорально капельно, со скоростью 20 кап/мин, в течение 2,5 минут вводился согретый до +25°С 20% раствор БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия. После экспозиции в течение 2 часов всех животных декапитировали. Собранную кровь отстаивали в холодильнике при 1-0°С в течение 1 часа до образования сыворотки, после чего проводили исследования.

Животным третьей группы в перорально капельно, со скоростью 20 кап/мин, в течение 2,5 минут вводился согретый до +25°С 20% раствор БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия. После экспозиции в течение 24 часов всех животных декапитировали. Собранную кровь отстаивали в холодильнике при 1-0°С в течение 1 часа до образования сыворотки, после чего проводили исследования.

Мочу получали в накопителе применяемого нами устройства, выделяемым животным до декапитации. При этом, предварительно, за 4 часа до начала эксперимента, крысам создавали водную нагрузку в количестве 2-5% от веса животного путем внутрижелудочного введения 5 мл воды. Собранную мочу фильтровали через мелкосетчатый фильтр, не центрифугировали, и использовали для исследования.

Материалы для исследований - кровь и мочу животных получали следующим образом. Во всех случаях кровь получали после декапитации животного. Мочу получали в накопителе применяемого нами устройства, выделяемым животным до декапитации. При этом, исходя из рекомендаций (10) предварительно, за 4 часа до начала эксперимента, крысам создавали водную нагрузку в количестве 2-5% от веса животного путем внутрижелудочного введения 5 мл воды.

У животных всех групп изучали содержание гексуроновых кислот (в пересчете на глюкуроновую кислоту) в сыворотке крови и моче карбазоловым методом (3) Определение общего и прямого билирубина в сыворотке крови проводили по методу Jendrassik, Grof (21) на автоматизированном анализаторе "Humalizer 3000" Human, Германия. Определение прямого билирубина в моче проводили и использованием тест полосок "DiruiH-10" с последующим качественным и полуколичественном определении на анализаторе "DiruiH-100", производитель - "DiruiIndustrialGroupCo.", Ltd, Китай.

Полученные результаты биохимического анализа биологических жидкостей приведены в таблице 2. Вероятность различий результатов по отношению к контролю не превышает 0,05, что находится в пределах нормы и свидетельствует о статистической достоверности данных.

Пример 2.

Опыты проводили на 30 половозрелых белых крысах-самцах линии Вистар массой 180-220 г, разделенных на 3 группы по 10 животных в каждой (4, 5 и 6 группы). Все животные до и в течение эксперимента находились на стандартном режиме питания.

Экспериментальную модель нарушения метаболических процессов с развитием печеночно-клеточной недостаточности и гипербилирубинемии создавали по схеме, которая достигалась тем, что всем 30 животным 4, 5 и 6 групп - белым крысам-самцам линии Вистар массой 180-220 г ежедневно, в течение 7 дней, перорально вводили раствор ацетата свинца (АС) в дозе 45 мг/кг массы тела (в пересчете на свинец). Для получения указанного раствора навеску ацетата свинца массой 3,5313 г растворяли в 100 мл воды, перемешивали на магнитной мешалке, после чего переливали в мерную колбу вместимостью 250 мл. Для подавления гидролиза ионов свинца и ацетат ионов к полученному раствору прибавляли 0,2 мл 0,1 моль/л раствора уксусной кислоты до исчезновения мутной взвеси. Затем раствор доводили водой до верхней метки колбы. Один мл приготовленного раствора АС содержит 9 мг ионов свинца.

Материалы для исследований - кровь и мочу животных получали следующим образом. Во всех случаях кровь получали после декапитации животного. Собранную кровь отстаивали в холодильнике при 1-0°С в течение 1 часа до образования сыворотки, после чего проводили исследования.

Мочу получали в накопителе применяемого нами устройства, выделяемым животным до декапитации. Собранную мочу фильтровали через мелкосетчатый фильтр, не центрифугировали, и использовали для исследования. При этом, исходя из рекомендаций (10) предварительно, за 4 часа до начала эксперимента, крысам создавали водную нагрузку в количестве 2-5% от веса животного путем внутрижелудочного введения 5 мл воды.

У животных этой группы изучали содержание гексуроновых кислот (в пересчете на глюкуроновую кислоту) в сыворотке крови и моче карбазоловым методом (3). Определение общего и прямого билирубина в сыворотке крови проводили по методу (Jendrassik, Grof) (21) на автоматизированном анализаторе "Humalizer 3000" Human, Германия. Определение прямого билирубина в моче проводили и использованием тест полосок "DiruiH-10" с последующим качественным и полуколичественном определении на анализаторе "DiruiH-100", производитель - "DiruiIndustrialGroupCo.", Ltd, Китай.

Четвертая группа животных служила контролем для сравнения с 5 и 6 группами животных и им не вводился БАДПГ. После окончания введения в течение 7 дней АС, на восьмой день животных декапитировали.

Животным пятой группы после окончания введения в течение 7 дней АС, на восьмой день перорально капельно, со скоростью 20 кап/мин, в течение 2,5 минут вводился согретый до +25°С 20% раствор БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия. После экспозиции в течение 2 часов всех животных декапитировали. Собранную кровь и мочу исследовали.

Животным шестой группы после окончания введения в течение 7 дней АС, на восьмой день перорально капельно, со скоростью 20 кап/мин, в течение 2,5 минут вводился согретый до +25°С 20% раствор БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия. После экспозиции в течение 24 часов всех животных декапитировали. Собранную кровь и мочу исследовали.

Полученные результаты биохимического анализа биологических жидкостей приведены в таблице 2. Вероятность различий результатов по отношению к контролю не превышает 0,05, что находится в пределах нормы и свидетельствует о статистической достоверности данных.

Пример 3.

Изучение "острой" токсичности БАДГП проведено методом Кербера (13, 14) Опыты проводились на 20 белых крысах-самцах линии Вистар, массой 180-220 г путем перорального введения 5 мл 10% раствора БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия, в дозе 3500 мг/кг массы тела. После одноразового введения за время наблюдения в течение 14 дней, гибели животных не отмечалось. Это что позволило определить LD₅₀ при пероральном введении >3500 мг/кг. Согласно классификации токсических веществ (13, 14) исследованный препарат относится к группе малотоксичных веществ.

Пример 4.

Изучение "острой" токсичности препарата БАДГП проведено методом Кербера (13). Опыты проводились на 20 белых крысах-самцах массой 180-220 г путем введения в хвостовую вену 16 мл 3% раствора БАДПГ на 0,9% растворе хлористого натрия, согретого до 25С, в дозе 3500 мг/кг массы тела. После одноразового введения за время наблюдения в течение 14 дней гибели животных не отмечалось, что позволило определить LD₅₀ при пероральном введении >3500 мг/кг. Согласно классификации токсических веществ (13.14) исследованный препарат относится к группе малотоксичных веществ.

Пример 5.

Пример реализации способа получения БАД в виде гелевой формы протеогликанов и гликозаминогликанов.

Полученный по способу («Способ получения протеогликана». Патент 2621311 (2), 1% раствор, в количестве 100 мл, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в виде мелкодисперсной взвеси в консерванте (0,1N раствор гидроксида натрия), экспонировался в течение 20 минут, при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка. Затем надосадочная жидкость осторожно, максимально возможно полностью отделялась, осадок переносился в центрифужные стаканы и центрифугировался при 1000 об/мин в течение 45 секунд. Центрифугат представлял осадок белого цвета имеющий четкую разделительную линию с надосадочной жидкостью, которая осторожно сливалась. К осадку, имеющем рН 9,0-9,3 при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 8,0. При этом плотный осадок, изменял свою консистенцию, превращался в полупрозрачный светлый, опалесцирующий биогель, который представляет полностью растворимый в воде концентрат, в общей массе - соотношение составляет 40-55% гель/раствор - 0,9% хлорид натрия. По результатам анализов состав конечный продукт представлял гелевую форму протеогликанов и гликозаминогликанов с концентрацией до 80% об общей массы компонентов.

Полученный концентрат гелевой формы протеогликанов и гликозаминогликанов расфасовывался в желудочно-резистентные мягкие капсулы, объемом, в среднем 0,5 мл, после чего БАД использовалась по назначению.

Пример 6.

Пример реализации способа получения БАД в виде твердой формы порошка протеогликанов и гликозаминогликанов.

Полученный по способу («Способ получения протеогликана». Патент 2621311 (2), 1% раствор, в количестве 100 мл, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в виде мелкодисперсной взвеси в консерванте (0,1N раствор гидроксида натрия), экспонировался в течение 20 минут, при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка. Затем надосадочная жидкость осторожно, максимально возможно полностью отделялась, осадок переносился в центрифужные стаканы и центрифугировался при 1000 об/мин в течение 45 секунд. Центрифугат представлял осадок белого цвета имеющий четкую разделительную линию с надосадочной жидкостью, которая осторожно сливалась. К осадку, имеющем рН 9,0-9,3 при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 8,0. При этом плотный осадок, изменял свою консистенцию, превращался в полупрозрачный светлый, опалесцирующий биогель, который представляет полностью растворимый в воде концентрат, в общей массе - соотношение составляет 40-55% гель/раствор - 0,9% хлорид натрия. По результатам анализов состав конечный продукт представлял гелевую форму протеогликанов и гликозаминогликанов с концентрацией до 80% об общей массы компонентов.

Полученный концентрат гелевой формы протеогликанов и гликозаминогликанов сублимировался до твердого состояния в течение 12 часов, при -4°С. После окончания сублимационной сушки плотный, твердый, хрупкий продукт светло-коричневого оттенка, размельчался в фарфоровой чашке и пропускался через сетчатый фильтр с размером сетки 500 микрон. Порошок расфасовывался в твердые желудочно-резистентные желатиновые капсулы после чего БАД использовалась по назначению.

Предлагаемое изобретение было объяснено в приведенном выше описании в соответствии с приведенными примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения. Следует считать, что все варианты, включающие приведенную ниже формулу изобретения, находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Результаты анализа биогеля на основе протеогликанов и гликозаминогликанов

В данном исследовании в качестве основной задачи было поставлено обнаружение и подтверждение присутствия в образцах компонентов, относящихся к классу углеводов (моно- и дисахаридов) и их производных, в частности, глюкуроновой кислоты.

При этом необходимо учитывать, что в виде некоторых специфичных характеристик реакции неизбирательного химического дегликозилирования, в большей степени ожидаемо обнаружение свободной глюкуроновой кислоты, а также десульфатированных углеводных остатков, так как в ходе реакции большая часть тиоэфирных связей будет разрушено.

В результате проведенного анализа фракций образца 1 были сделаны следующие выводы:

1. Образец 1 представляет гелевую форму с концентрацией протеогликанов и гликозаминогликанов до 80% об общей массы компонентов.

2. Основная часть углеводных компонентов и их производных (аминосахара, ди- и моносахариды, комплексы с глюкуроновой кислотой), характерных для структурных единиц протеогликанов и гликозаминогликанов, в основном хондроитинсульфатов и кератансульфатов, обнаружены во фракции, которая представляет собой осадок, полученный в результате предварительной подготовки образца (центрифугирование). В данной фракции углеводные компоненты составляет до 80% от общего состава фракции.

В виду высокой комплексности и сложности анализируемых образцов, полная идентификация компонентов не проводилась.

В общей массе - соотношение 40-55% гель/растворитель.

Растворитель 0,9% хлорид натрия или 0,5% цитрат натрия.

Состав сухого остатка образца 1 представлен на таблице 1.

Образец 2. После сублимации гелевой формы, измельчения и пропускания через сетчатый фильтр с размерами сетки 500 микрон, представляет порошкообразную форму твердой консистенции. 100 мг твердой формы полностью растворяются в 10 мл 0,9% раствора NaCl при 20°С в течение 60 минут без перемешивания. Концентрация протеогликанов и гликозаминогликанов составляет до 80% от общей массы компонентов.

Литература

1. В.С. Асатиани. Новые методы биохимической фотометрии. М.: Наука, 1965. - С. 507-510.

2. Б.И. Асатуров. «Способ получения протеогликана». Патент №2621311 от 09.12.2015.

3. Е.Б. Берхин, Ю.И. Иванов. «Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена», Барнаул, 1972, стр. 6-10, 14-19, 108-116.

4. Биологически активное вещество, биологически активная добавка к пище. RU 2221456. Авторы: Макаров Н.В., Новиков В.И.

5. Биологически активная добавка к пище на основе денатурированного коллагена патент РФ №2489906 автор Николаева Т.И.

6. Биологически активная добавка «Геленк Нарунг», изготовленная в «ПроВиста АГ» («ProVista AG») в ФРГ (Свидетельство о государственной регистрации №77.99.23.3.У.3191.4.09).

7. Биологически активная добавка к пище «Супер Акулий Хрящ», изготовленная в ООО «АРТ Современные научные технологии» (Свидетельство о государственной регистрации №7.99.13.3.У.4569.6.10).

8. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З. и др. Фенольные биооксиданты. Новосибирск, 2003. С. 186-196.

9. Методические указания «Определение безопасности и эффективности БАД» (№2.3.2.721-98, введены в действие с 01.01.1999).

10. Методы исследований в профпатологии (биохимические). Руководство для врачей. / О.Г. Архипова, М.М. Шацкая, Л.С. Семенова и др. / Под ред. О.Г. Архиповой. - М.: Медицина, 1988. - 203 с.

11. Отраслевой стандарт ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения" (приложение).

12. Радиационный мониторинг жителей и их продуктов питания в Чернобыльской зоне Беларуси, 2002, Международная экспертиза проекта Института «Белрад» по радиационной защите населения, с. 80.

13. Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М.: Медицина, 1970.

14. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. В кн. Токсикология новых промышленных веществ. Вып. 13. М., 1973, с. 47-51.

15. Способ получения биологически активных добавок RU 2070399. Авторы патента: Зотов Е.А., Борисов О.А., Никульшин В.Н., Авдеев В.А., Соколов В.М.

16. Способ получения биологически активного пищевого полуфабриката и пищевой биологически активный продукт, полученный на его основе RU 2181018. Автор Борисенко Е.Г.

17. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Позняковский В.М. Биологически активные добавки в питании человека: учебник для последипломного образования врачей. Томск, 1999. 38 с.

18. Физиология человека. Глава 9. Пищеварение. Под редакцией Покровского В.М., Коротько Г.Ф. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: 2003. - 656 с.

19. Экзогенные биологически активные коньюгирующие вещества (RU 2240123). Автор Н.Ш. Кайшева.

20. Food, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective. Washington, DC: World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research, 1997.

21. Lo D.H., Wu T.W. Assessment of the fundamental accuracy of the Jendrassik and Grof total and direct bilirubin assays // Clin. Chem. 1983. Vol. 29. P. 31-

Источники, принятые во внимание

1. Способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты (варианты) (RU 2280041). Авторы: М.Б. Хазов, А.В. Рудаков, И.А. Федорищев.

2. Способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговицы (RU 2056851), 1996. Авторы: С.Н. Багров, Е.В. Ларионов, А.Ф. Панасюк.

3. Способ получения биологически активных веществ RU 2003262. Авторы патента: Кудряшева Александра Андреевна

4. М.Н. Порцель. Разработка технологии получения хондроитинсульфата из гидробионтов Баренцева моря и изучение его физико-химических свойств. Дисс. к.б.н., Мурманск, 2011.

Изобретение относится к производству биологически активных добавок (БАД) на основе протеогликанов и гликозаминогликанов. Способ получения БАД характеризуется тем, что раствор, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в виде мелкодисперсной взвеси в 0,1 N растворе гидроксида натрия в соотношении 1:200, концентрируют до консистенции геля. Для чего экспонируют в течение 20 минут при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка, затем надосадочную жидкость отделяют, осадок центрифугируют при 1000 об/мин в течение 45 секунд и надосадочную жидкость сливают. К осадку, имеющему рН 9,0-9,3, при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1 N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 8,0. После чего конечный осадок в виде геля сублимируют до твердого состояния в течение не менее 12 часов при -4°С и после окончания сублимационной сушки размельчают, проводят через сетчатый фильтр с размером сетки 500 микрон, а порошок расфасовывают в твердые желудочно-резистентные капсулы. Как вариант, конечный осадок в виде концентрированного геля, соотношение которого в общей массе составляет 40-55% гель/раствор - 0,9% хлорид натрия, помещают в желудочно-резистентные капсулы. Полученные БАД в виде желудочно-резистентных капсул вводят перорально. Изобретение позволяет использовать биосовместимые высокомолекулярные производные глюкуроновой кислоты при патологических состояниях, сопровождающихся интоксикацией различной этиологии, контаминацией патогенной микрофлоры кишечника, а также с гепатотропной и компенсаторно-восстановительной целью при дефиците этих веществ. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Способ получения биологически активной добавки, характеризующийся тем, что раствор, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в виде мелкодисперсной взвеси в 0,1 N растворе гидроксида натрия в соотношении 1:200, концентрируют до консистенции геля, для чего экспонируют в течение 20 минут при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка, после чего надосадочную жидкость отделяют, осадок центрифугируют при 1000 об/мин в течение 45 секунд и надосадочную жидкость сливают, а к осадку, имеющему рН 9,0-9,3, при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1 N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 8,0, после чего конечный осадок в виде геля сублимируют до твердого состояния в течение не менее 12 часов при -4°С и после окончания сублимационной сушки размельчают, проводят через сетчатый фильтр с размером сетки 500 микрон, а порошок расфасовывают в твердые желудочно-резистентные капсулы.

2. Способ получения биологически активной добавки, характеризующийся тем, что раствор, содержащий протеогликаны и гликозаминогликаны в виде мелкодисперсной взвеси в 0,1 N растворе гидроксида натрия в соотношении 1:200, концентрируют до консистенции геля, для чего экспонируют в течение 20 минут при комнатной температуре для полного оседания агрегатов и формирования устойчивого плотного осадка, после чего надосадочную жидкость отделяют, осадок центрифугируют при 1000 об/мин в течение 45 секунд и надосадочную жидкость сливают, а к осадку, имеющему рН 9,0-9,3, при осторожном перемешивании добавляют для нейтрализации 0,1 N раствор соляной кислоты, доводя раствор до значений рН 8,0, после чего конечный осадок в виде концентрированного геля, соотношение которого в общей массе составляет 40-55% гель/раствор - 0,9% хлорид натрия, помещают в желудочно-резистентные капсулы.

3. Способ применения биологически активной добавки по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что расфасованные в желудочно-резистентные капсулы протеогликаны и гликозаминогликаны вводят перорально для получения детоксикационного и антимикробного эффекта в кишечнике.

4. Способ применения по п. 3, отличающийся тем, что расфасованные в желудочно-резистентные капсулы протеогликаны и гликозаминогликаны вводят перорально для получения компенсационного восстановительного эффекта при дефиците протеогликанов и гликозаминогликанов в организме.

5. Способ применения п. 3. отличающийся тем, что расфасованные в желудочно-резистентные капсулы протеогликаны и гликозаминогликаны вводят перорально для получения гепатотропного эффекта при дефиците протеогликанов и гликозаминогликанов в организме.