Тест-система для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к выявлению генома вируса чумы мелких жвачных.

Чума мелких жвачных животных (ЧМЖ) является эмерджентным заболеванием для Российской Федерации, т.к. ранее никогда не регистрировалась на территории страны. В связи со значительным социально-экономическим ущербом, негативным воздействием на продовольственную безопасность многих стран мира, ЧМЖ включена в число нотифицируемых заболеваний списка МЭБ. Высокая степень неблагополучия по данной болезни среди стран, близко граничащих с Россией, обуславливает необходимость наличия высокочувствительных методов диагностики, позволяющих оперативно проводить мониторинг эпизоотической ситуации в стране.

Возбудителем является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Morbillivirus, семейства Paramyxoviridae. Болезнь впервые зарегистрирована в 1942 г. в Кот-д'Вуар [1]. В естественных условиях к вирусу чувствительны овцы, козы, антилопы, горные овцы и козы. Крупный рогатый скот, буйволы и яки также восприимчивы, что подтверждается обнаружением антител в сыворотке крови в реакции нейтрализации. Однако случаи клинического проявления болезни у этих видов животных проявляются исключительно редко [2, 3].

Возбудитель является пантропным вирусом и передается аэрогенным и алиментарным путем, выделяется с выдыхаемым воздухом, выделениями изо рта, носа, глаз, половых органов.

Источник вируса - больные и переболевшие животные, трупы павших от ЧМЖ животных, контаминированные вирусом корма, вода, подстилка, инвентарь, одежда обслуживающего персонала. Тесный контакт между животными является основным условием передачи вируса ЧМЖ [4].

Основной путь заноса в благополучные регионы - ввоз/перемещение зараженных животных (в т.ч. при незаконной трассировке), а также через инфицированные продукты животного происхождения, при возврате транспортных средств после доставки животных в зараженные регионы или хозяйства, где не используются меры биологической безопасности.

Нозоареал ЧМЖ охватывает страны Африки и Евразии, включая европейскую часть Турции. Заболевание получило распространение в 55 странах: 35 странах Африки и 20 странах Евразии. По данным МЭБ за 30 летний период (1984-2013 гг.) было зарегистрировано свыше 38 тыс.вспышек заболевания. Наиболее сложная ситуация по ЧМЖ наблюдается в Турции и Иране. Первые случаи ЧМЖ в Иране были диагностированы в 1994 г. в провинции Элам на границе с Ираком. С тех пор заболевание регистрируется практически на всей территории страны.

Первые случаи регистрации вспышек ЧМЖ в Китае относятся к июлю 2007 г. Было зарегистрировано 273 вспышки ЧМЖ, при этом наибольшее их число имело место на востоке Китая, в том числе на территории провинций, непосредственно граничащих с Казахстаном, Кыргызстаном и Таджикистаном, а также с Забайкальским, Хабаровским и Приморским краями и Амурской областью Российской Федерации [5].

Для Российской Федерации опасность проникновения ЧМЖ наиболее высока для Северо-Кавказского и Южного Федеральных округов (уровень вероятности 0,4 - 0,6), а также для зон отгонно-пастбищного животноводства Уральского, Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (уровень вероятности 0,2-0,4) [6].

В Казахстане массовое распространение заболевания среди мелкого рогатого скота отмечали в южной части страны в 2003 г., тогда же из проб патологического материала, отобранного от больных овец, выделили высоковирулентный штамм «Кентау» вируса ЧМЖ. Вспышки на территории Казахстана диагностировали также в 2005 и 2006 гг. [7]. Так же вспышка ЧМЖ была официально зарегистрирована 12 января 2016 г. в Грузии.

Всего в 2016 г. (с января по март) в Грузии было выявлено три очага ЧМЖ. Благодаря проведению интенсивных противоэпизоотических мероприятий заболевание не получило распространения.

В Монголии ЧМЖ впервые зарегистрирована 24 августа 2016 г. в сумоне Мьянгад западного аймака Ховд. По состоянию на июнь 2017 г. новых очагов ЧМЖ в Монголии не отмечали, однако значительное опасение вызывают зарегистрированные в январе и феврале 2017 г. случаи выявления заболевания среди диких сайгаков в аймаке Ховд, с распространением на территорию соседнего аймака Говь-Алтай.

Поскольку клинические признаки ЧМЖ не являются патогномоничными (специфичными), диагноз на ЧМЖ следует подтверждать лабораторными исследованиями [5]. Согласно руководству МЭБ диагноз на ЧМЖ может быть поставлен с помощью метода иммунодиффузии в агарозном геле, который является одним из самых простых и нетребовательных методов. Однако данный подход занимает много времени и недостаточно чувствителен, поскольку в случае мягкого течения заболевания количество антигена может быть недостаточно, в результате чего возможны ложноотрицательные результаты.

Наиболее распространенным лабораторным методом диагностики ЧМЖ является ИФА, который считается предпочтительным при недоступности молекулярных методов исследования или при неудовлетворительном состоянии биологических образцов. Данный метод также может быть рекомендован при проведении мониторинговых исследований сывороток крови с целью выявления циркуляции вируса у восприимчивого поголовья и оценки иммунитета. Однако в случае подозрения на наличие вируса необходимо использовать методы, выявляющие геном возбудителя.

Наиболее распространенными и надежными лабораторными методами обнаружения генома является ПЦР.

Целью изобретения является создание тест-системы для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Известен способ выявления шести вирусных патогенов овец и коз с помощью ПЦР в формате мультиплекс с детекцией продуктов реакции в электрофоретическом геле [8]. Недостатком данного способа является использование электрофореза, что является источником повышенных рисков кросс-контаминации ампликонами в лаборатории.

Известен способ детекции геномов 8 патогенов МРС, включая вирус ЧМЖ, с помощью ПЦР в режиме реального времени [9]. Недостатком этого способа является одновременная амплификация 8 локусов бактерий и вируса, что сказывается на чувствительности детекции нуклеиновой кислоты, находящейся в наименьшей концентрации, что может приводить к ложноотрицательным результатам.

Наиболее близким к заявляемому методу является метод ПЦР в режиме реального времени для детекции генома вируса ЧМЖ [10]. Недостатком данного метода является отсутствие валидационных характеристик, подтверждающих специфичность разработки на разных генотипах вируса ЧМЖ.

Таким образом, разработка надежного чувствительного и специфичного метода обнаружения генома всех возможных генетических вариантов вируса ЧМЖ, с возможностью исследования широкого спектра биологического материала (внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), является актуальной технической проблемой. Для ее решения была создана тест-система ПЦР-РВ, содержащая специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, а также осуществлен подбор условий проведения исследований с помощью разработанного диагностикума, обеспечивающий минимальный риск контаминации тестируемых образцов и исключающих субъективность при оценке результатов.

Изобретение относиться к тест-системе для специфичной идентификации генома всех генетических вариантов вируса чумы мелких жвачных методом ПЦР в режиме реального времени, состоящей из смеси олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, фермента Taq-полимеразы, обратной транскриптазы, положительного контроля и отрицательного контроля.

Флуоресценцию измеряют по каналу FAM. Пересечение кривой флуоресценции и линии порогового цикла (Ct), свидетельствует о наличии в образце генома вируса чумы мелких жвачных, причем, чем меньше показатель Ct, тем выше концентрация генома вируса ЧМЖ в исследуемом образце. Отсутствие пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией свидетельствует об отсутствии генома вируса чумы мелких жвачных в тестируемом материале.

Изобретение может быть использовано для выявления РНК вируса чумы мелких жвачных в пробах биологического материала, с целью проведения клинической и лабораторной диагностики, а также научно-исследовательских работ в области ветеринарии.

Техническим результатом изобретения является: высокая специфичность в отношении всех возможных генетических вариантов вируса чумы мелких жвачных; расширенный спектр пригодного для проведения исследований биологического материала (внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), без риска получения ложноположительных результатов; минимальные требования для постановки ПЦР-РВ, что дает возможность использования широкого спектра амплификаторов; сокращение времени тестирования проб на наличие генома вируса чумы мелких жвачных, в том числе и при проведении массовых исследований; расширение арсенала средств диагностики чумы мелких жвачных.

Представленный метод включает последовательности олигонуклеотидов, специфичные только для генотипов вируса чумы мелких жвачных и имеющие следующую нуклеотидную последовательность:

Знаком «+» отмечены нуклеотиды с модификацией LNA. Сущность изобретения заключается в том, что тест-система способна выявлять различные генетические варианты вируса чумы мелких жвачных. Высокая степень специфичности тест-системы подтверждена с помощью лабораторных исследований на панели проб гомологичных и гетерологичных вирусов.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлена линейность результатов ПЦР в режиме реального времени при тестировании 10-кратных разведений выделенной РНК вируса чумы мелких жвачных (штамм «ВНИИЗЖ») (Фиг. 1).

Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, находящегося на 5'-конце флуорофор FAM, а на 3'-конце - гасителя BHQ1. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизируется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.

Набор для выявления генома вируса чумы мелких жвачных в ПЦР-РВ состоит из следующих компонентов:

№1 реакционная смесь, объем 450 мкл - 2 пробирки;

№2 фермент Taq-ДНК-полимераза, объем 14 мкл - 1 пробирка;

№3 фермент обратная траскриптаза, объем 10 мкл - 1 пробирка;

№4 отрицательный контрольный образец, объем 100 мкл - 1 пробирка.

№5 положительный контрольный образец, объем 150 мкл - 1 пробирка;

В качестве отрицательного контроля используется деионизованная вода, а в качестве положительного контроля - вирусная РНК, что позволяет контролировать не только процесс амплификации, но и процесс обратной транскрипции.

ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией проводится в программируемом амплификаторе в одну стадию с использованием смеси, включающей на одну реакцию: реакционную смесь (№1), ферментов Taq-ДНК-полимеразы (№2) и обратной транскриптазы (№3). Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все компоненты реакции, встряхнуть их на шейкере, затем центрифугировать несколько секунд на низкоскоростной центрифуге.

Смесь для проведения реакции готовят в пробирке в расчете на одну реакцию следующим образом:

- реакционная смесь №1 17 мкл, - фермент Taq-ДНК-полимераза №2 0,25 мкл, - фермент обратная транскриптаза №3 0,125 мкл

Приготовленную в отдельных пробирках смесь для проведения реакции переносят по 17 мкл в пробирки соответствующего объема и вносят 8 мкл суммарной РНК. В соответствующие пробы вносят также выделенные образцы нуклеиновой кислоты отрицательного и положительного контролей. Общий объем смеси - 25 мкл.

Пробирки устанавливают в амплификатор для постановки ПЦР в режиме реального времени, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (FAM), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.

Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 1.

Если регистрируемое значение Ct≤35, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается положительным.

Если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается отрицательным.

Если регистрируемое значение Ct находится в пределах от 35 до 37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается сомнительным, и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается положительным; если значение Ct≤37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается отрицательным.

Результат считается достоверным только в случае, если:

- для положительного контроля амплификатором на канале FAM регистрирует значение порогового цикла амплификации - Ct≤35;

- для отрицательного контроля амплификатором не регистрирует какого-либо значений порогового цикла на канале FAM.

Результат считается недостоверным (не подлежат учету) в случае, если:

- для образца положительного контроля регистрируется значение Ct>35;

- для образца отрицательного контроля регистрируется какое-либо значение Ct.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Оценка специфичности тест-системы.

Для оценки специфичности тест-системы использовались следующие образцы генома различных генотипов вируса чумы мелких жвачных и гетерологичных вирусов: штамм «ВНИИЗЖ» вируса ЧМЖ, штамм «Nigerial975» вируса ЧМЖ, штамм «Morocco2008» вируса ЧМЖ, вируса ЧМЖ штамма «Ethiopia1994», вируса заразного узелкового дерматита КРС штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» (диагностический), вируса оспы овец штамма «Афганский». Результаты оценки специфичности изложены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что разработанная тест-система специфично выявляет различные штаммы вируса чумы мелких жвачных.

Работу с нуклеиновой кислотой проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» [11].

Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «РИБО-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва).

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе по описанной выше программе.

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.

При тестировании специфичности тест-системы с использованием нуклеиновых кислот различных генотипов вируса ЧМЖ и гетерологичных вирусов ложноположительных и ложноотрицательных результатов не выявлено (Таблица 2).

Пример 2. Оценка чувствительности тест-системы.

Для оценки чувствительности тест-системы использовали 10-кратные последовательные серийные разведения выделенной РНК вируса чумы мелких жвачных с титром 4,17 lg ТЦД₅₀/см³. Тест-система выявляла вирусную РНК с чувствительностью 0,17 lg ТЦД₅₀/см³. Для оценки эффективности амплификации было проведено 3 повторных эксперимента, и полученные средние значения Ct для каждого разведения использовались для вычисления эффективности реакции. Полученные данные приведены на графическом изображении (Фиг. 1), на нем представлен график линейной регрессии, согласно которой значение эффективности амплификации (Е) составило 98,3%.

Пример 3. Оценка воспроизводимости тест-системы.

Воспроизводимость тест-системы определяли с помощью величины стандартного отклонения (SD) для каждой серии разведений, используя полученные значения Ct. SD варьировало от 0,04 до 0,67 на протяжении четырех 10-кратных разведений выделенной РНК. Коэффициент детерминированности r² составил 0,9915.

Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала вируса чумы мелких жвачных в биологических и культуральных образцах, с целью постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач, проведения мониторинга распространения вируса ЧМЖ среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зонда позволяет выявить генетический материал всех генетических вариантов вируса ЧМЖ методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».

1. Gargadennec L. & Lalarme A. La peste des petits ruminants // Bull. Serv. Zoo. A.O.F. - 1942. - 5: 15-21.

2. Libeau, G. & Lefevre, P.C. Comparison of rinderpest and peste des petits ruminants viruses using anti-nucleoprotein monoclonal antibodies. Vet. Microbiol. - 1990. - 25: 1-16.

3. Mitra-Kaushik, S., R. Nayak, and M. S. Shaila. Identification of a cytotoxic T-cell epitope on the recombinant nucleocapsid proteins of rinderpest and peste des petits ruminants viruses presented as assembled nucleocapsids // Virology. - 2001. - 279:210-220.

4. Kumar, N. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review / N. Kumar, S. Maherchandani, S.K. Kashyap, et al. // Viruses. - 2014. - 6: 2287-2327.

5. Office International des Epizooties (OIE). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2017. Chapter 2.07.10. Peste des petits ruminants (infection with peste des petits ruminants virus). Available http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/. No date.

6. Парилов С.В. Анализ и прогноз мировой эпизоотической ситуации по оспе овец и коз и чуме мелких жвачных животных в 2011 - 2015 гг. // Научный журнал Куб. ГАУ. - 2011. - 69 (05).

7. Koshemetov Zh., Sansyzbay A., Sandybayev N. et al. Peste des petits ruminants: Monitoring, diagnostic and spread on the territory of the Central Asia. Life Sci. J. - 2014.- 11(7):48 - 54.

8. Патент CN 105331742. Multiplex-PCR (polymerase chain reaction) kit for detecting six viruses of sheep and goats simultaneously.

9. Патент CN 108504780. Taqman fluorescence quantitative PCR kit and method for simultaneously detecting eight common sheep viruses and bacteria.

10. Сальников Н.И., Живодеров С.П., Янжиева Д.В., Кольцов А.Ю., Усадов Т.Р., Сухер М.М., Моргунов Ю.П., Луницин А.В. Тест-система для выявления генома вируса чумы мелких жвачных животных методом от-пцр в реальном времени. Сельскохозяйственная биология, 2019 -54 (2): 359-368.

11. МУ 1.3.2569-09 Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Разработана высокочувствительная тест-система, состоящая из готовой ПЦР смеси, Taq-ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы, положительного контроля и отрицательного контроля, позволяющая в кратчайшие сроки выявить геном вируса чумы мелких жвачных. Разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена М вируса ЧМЖ:

Знаком «+» отмечены нуклеотиды с модификациями LNA. Изобретение может быть использовано для выявления РНК всех генетических вариантов вирусов ЧМЖ в пробах широкого спектра патологического и биоматериала с целью постановки и уточнения клинической и лабораторной диагностике в ветеринарии. 2 табл., 3 пр., 1 ил.

1. Тест-система, включающая готовую ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена М вируса ЧМЖ:

Forward CCCAT/GGTG/AAGA/GGTCATCG

Reverse CT(A/C/T)CCGACT/GGGGGGAGA

probe FAM CC+TGGTC+TGGG+AGACAG BHQ1

фермент Taq-ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец; отличающаяся тем, что используются олигонуклеотидные праймеры и зонд в реакции ПЦР в режиме реального времени, состоящей из следующих этапов: обратная транскрипция 50°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 10 мин и термического циклирования при 94°С - 10 сек, 56°С - 20 сек; 72°С - 20 сек - 40 циклов, образец считается положительным на наличие генома вируса ЧМЖ, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие генома вируса ЧМЖ, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 37, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается сомнительным, необходимо повторить реакцию; при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается положительным, если значение Ct отсутствует/не регистрируется или более 37, образец считается отрицательным на наличие генома вируса ЧМЖ.

2. Тест-система по п. 1, обладающая чувствительностью 0,17 lg ТЦД₅₀/см³, позволяющая обнаружить и выявить геном/РНК вируса чумы мелких жвачных в расширенном спектре биологического материала.