ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ - ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генодиагностики, а именно к синтетическим праймерам, комплементарным высококонсервативной области гена N генома вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС), использующимся для выявления РНК вируса. Изобретение может быть использовано в ветеринарной вирусологии и генодиагностики.

Эпизоотическая (эпидемическая) диарея свиней (ЭДС) - остро протекающее, контагиозное заболевание свиней, характеризующееся изнурительной диареей, дегидратацией организма и высокой смертностью. Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, принадлежащий порядку Nidovirale, семейству Coronaviridae, подсемейству Coronavirinae. На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека NL63 и 229Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду Alphacoronavirus [2, 5].

Заболеванию подвержены свиньи всех возрастных групп, но наибольшей восприимчивостью обладают новорожденные поросята до двухнедельного возраста, среди которых смертность достигает от 30 до 100%. С послеотъемного возраста летальный исход среди свиней составляет 1-3% [4].

Высокая смертность поросят при заболевании эпизоотической диареей свиней обуславливают необходимость разработки экспресс-методов диагностики ЭДС с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая уже нашла широкое применение в диагностических исследованиях в ветеринарии.

Известны несколько методов лабораторной диагностики ЭДС, такие как метод флюоресцирующих антител (МФА), прямая электронная микроскопия, реакция иммуноферментного анализа (ИФА). В сомнительных случаях ставят биопробу на безмолозивных поросятах. Однако в некоторых случаях применение этих методов не дает четких результатов, например при исследовании разложившихся патматериалов или объектов ветсаннадзора. Кроме того, перед постановкой реакции требуется предварительное приготовление суспензии органов, что достаточно трудоемко [1, 3].

Аналогом изобретения на Российском рынке может служить тест-система "ЭДС" для выявления вируса эпидемической диареи свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН ЦЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва). В данной тест-системе используется стандартный Taq-man зонд. Преимуществом разработанного нами изобретения является использование зонда с внутренним гасителем флюоресценции, что позволяет увеличить чувствительность и специфичность реакции.

Целью изобретения является разработка более специфичного, чувствительного экспресс-метода для выявления вируса ЭДС с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров и TaqMan зонда, комплементарных к консервативной области гена N генома вируса, позволяющего амплифицировать фрагмент комплементарной ДНК размером 102 п. о.

Для достижения поставленной цели были подобраны и синтезированы (ООО «Евроген», г. Москва) специфические праймеры и зонд для идентификации возбудителя ЭДС, которые используются для синтеза кДНК и постановки ПНР:

Способ обнаружения РНК вируса ЭДС в пробах органов, образцах крови инфицированных свиней включает предварительный этап денатурации РНК и отжига праймеров при 94°C в течение 5 мин с последующим синтезом кДНК при 42°C в течение 30 мин. Реакция ПЦР включает 40 циклов амплификации: 94°C - 10 с, 60°C - 15 с, 72°C - 15 с. Затем проводят оценку и учет результатов реакции.

Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, чувствительность, а также сокращение времени проведения диагностической работы с целью выявления генома вируса эпизоотической диареи свиней.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление генома вируса ЭДС проводят методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, предусматривающим амплификацию кДНК вируса и учет результатов реакции. При наличии в исследуемых образцах вируса ЭДС синтезируется ДНК-фрагмент длиной 102 п.о. Результат считается положительным при Ct>33.

Существенным отличием заявляемого способа является то, что:

1. Данный способ позволяет определять наличие возбудителя у инфицированных животных на ранних сроках после заражения.

2. Применение данного способа позволяет сократить трудозатраты и время исследования.

Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров.

Для идентификации вируса эпизоотической диареи свиней методом полимеразной цепной реакции необходимо было определить участок генома, нуклеотидная последовательность которого позволяла бы дифференцировать данный вирус от других представителей рода Coronavirus и Rotaviridae и одновременно являлась бы достаточно консервативной для различных штаммов и изолятов вируса ЭДС. Проанализировав данные литературы, мы пришли к выводу, что геномом, подходящим для идентификации ЭДС, является ген N.

Подбор праймеров осуществляли на основе анализа нуклеотидных последовательностей штаммов и изолятов возбудителя ЭДС, имеющихся в базе данных GeneBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank]. Множественное выравнивание и анализ последовательностей осуществляли с помощью компьютерной программы «BioEdit 6.0». Для расчета праймеров был выбран участок высококонсервативной области гена N (233 п.о. - 335 п.о). Расчет и анализ олигонкулеотидов проводили с использованием компьютерной программы «OLIGO 6.0». Для подбора и анализа праймеров использовали референтную последовательность гена N штамма CV777 вируса эпизоотической диареи свиней (Porcine epidemic diarrhea virus strain CV777 nucleocapsid protein (N) gene, complete cds. - DQ355221.1).

Постановка реакции обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени.

Проводят отжиг праймеров, для чего в предварительно промаркированные пробирки объемом 0,2 мл вносят по 8 мкл РНК, по 1 мкл каждого праймера и 5 мкл бидистиллированной воды.

Денатурацию РНК и отжиг праймеров проводят в амплификаторе при температуре 94°C в течение 5 минут.

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный контроль (с водным раствором РНК вируса ЭДС) и отрицательный контроль (с бидистиллированной водой). Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Фермент добавляют в последнюю очередь.

Пробы инкубируют при температуре 42°C 30 минут в амплификаторе. После окончания инкубации кДНК используют для дальнейшего анализа или хранят при -20°C 2 недели.

В отдельной пробирке объемом 0,2 мл готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Фермент добавляют в последнюю очередь.

В реакции ПЦР используют 5 мкл кДНК, полученной в ходе реакции обратной транскрипции.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует кДНК других бактерий и вирусов. Тест-система показала диагностическую специфичность и чувствительность на уровне 100%.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Выявление фрагментов генома вируса ЭДС включает в себя следующие этапы.

Выделение РНК из вируссодержащего материала (методами нуклеосорбции или с использованием коммерческих наборов).

Проведение реакции обратной транскрипции. На N количество образцов изготовляют реакционную смесь для обратной транскрипции согласно таблице 2. Обратная транскрипция проводится в течение 30 минут при температуре 42°C.

Продукт реакции обратной транскрипции используется как матрица в реакции ПЦР в режиме реального времени.

Постановка ПЦР в режиме реального времени. На N количество образцов изготовляют реакционную смесь согласно таблице 3. Амплификация и детекция флюоресценции производятся согласно температурным режимам, указанным в таблице 4.

Учет результатов амплификации. Образец считается положительным на наличие генома вируса ЭДС при значении Ct<33. Образцы, не пересекающие пороговую линию, и образцы со значением Ct>33 считаются отрицательными.

Источники информации

1. DeBouck, P. The diagnosis of coronavirus-like agent (CVLA) diarrhea in suckling pigs. / DeBouck P., Callebaut P., Pensaert M. // Curr. Top. Vet. Med. Anim. Sci. - 1981a. - V. 13. - P. 59-61.

2. Gonzales, J.M. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. / Gonzales J.M., Gomez-Puertas P., Cavanagh D., Gorbalenya A.E., Enjuanes L. // Arch. Virol. - 2003. - V. 148. - P. 2207-2235.

3. Guscetti, F. Immunohistochemical detection of porcine epidemic diarrhea virus compared to other methods. / Guscetti F, Bernasconi C, Tobler K, Van Reeth K, Pospischil A, Ackermann M. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. 5:412-414.

4. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea. / Pensaert M. // In: B.E. Straw et al. Diseases of Swine (9th Ed., Blackwell, Ames, 2006), P.367-372.

5. Sanchez, C.M. Antigenic homology among coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus/ / Sanchez С.М., Jimenez G., Laviada M.D., Correa I., Sune C., Bullido M.J., Gebauer F., Srnerdou C., Callebaut P., Escribano J.M., Enjuanes L. // Virology. - 1990. - V. 174. - P. 410-417.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и генодиагностики, а именно к синтетическим праймерам, комплементарным высококонсервативной области гена N генома вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС) и способу выявления ЭДС. Способ выявления вируса основан на постановке полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции с использованием праймеров 5′-accagcaaattgggtactg-3′, 5′-cctgttccgaggtagtagaa-3′ и TaqMan зонда 5′-FAM-ccgtggt(RTQ1)gagcgaattgaacaacc-3′. Далее проводят амплификацию РНК вируса. Затем осуществляют оценку проведения реакции, при этом результат реакции считается положительным, если Ct>33. Использование данных изобретений позволяет повысить чувствительность метода ПЦР. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и Taq-Man зонд, комплементарные высококонсервативной области гена N генома вируса эпизоотической диареи свиней, используемые для выявления РНК вируса ЭДС, имеющие следующий нуклеотидный состав:
Fw 5′ ACCAGCAAATTGGGTACTG 3′
Rw 5′ CCTGTTCCGAGGTAGTAGAA 3′
Ζ 5′ FAM-CCGTGGT(RTQ1)GAGCGAATTGAACAACC 3′

2. Способ выявления вируса ЭДС, включающий постановку полимеразной цепной реакции, амплификацию РНК вируса, отличающийся тем, что для постановки ПЦР используют праймеры и зонд по п. 1, далее проводят предварительную денатурацию вирусной РНК при 94°С в течение 4 мин, синтез кДНК проводят при 42°С в течение 30 мин, с 40 циклами амплификации при температуре денатурации 94°С 10 с, отжига 60°С 15 с, элонгации 72°С 15 с, затем проводят оценку результатов реакции, при этом результат реакции считается положительным, если Ct>33.